CN102875225A - 桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株桑黄菌株及液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法。所述培养基的配方为：葡萄糖20-30g/L，酵母粉2-6g/L，KH₂PO₄1-3g/L，MgSO₄·7H₂O0.3-0.7g/L，V_B110mg/L，水1L，pH自然。发酵条件：温度28-32℃，摇速140-180rpm，接种量20%-30%，培养天数9-11d；离心，收集发酵液，用蒸馏水洗涤沉淀，获得菌丝体；然后进行胞内、胞外多糖提取。能显著提高桑黄的菌丝体产量和胞内、外多糖含量，而桑黄多糖的得率比用一般热水浸提法提取的多糖高6.34%。通过动物试验证明提取的桑黄多糖具有显著的抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等生物活性。

Description

桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法

技术领域

本发明具体涉及一种桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法。

背景技术

桑黄（Phellinus igniarius），中药名，由于通常生长在桑属（Morus L.）植物上且子实体为黄褐色的缘故而得名，有“森林黄金”之美称。桑黄是一种大型珍贵的多年生药用真菌，以子实体入药，在我国，应用桑黄治病从明朝开始到至今已经有2000多年的历史了。在古代，民间就流传有“桑树生黄，幸得之，百病可医”的说法及“如果得到附生于桑树上的黄色疙瘩（桑黄），死人也可复活”的传说。中医认为桑黄性寒、味微苦、味辛，归肝、膀胱经。本品辛行甘和，人血分以化瘀，瘀血循经而行出血止，有化瘀之功效，能利五脏、软坚、排毒、止血、活血和胃止泻等。民间用于治痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、疮窟积聚、癖软、脱肛泻血、带下、经闭、脾虚泄泻等。同时民间把它作为一种治疗肝病、癌症的绝药。

近几年来, 随着现代分析与检测方法的不断改进及新方法的开发，对桑黄的研究也进入了一个新的阶段。其药用价值也引起了各国科学家们的关注。随着越来越多国家对桑黄的人工栽培、生物学特性、所含多糖、多糖分子结构及其药理作用等方面开展的广泛而深入的研究，而且由于桑黄是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排在第一位的药用菌，其在抗肿瘤、提高免疫功能以及治疗疾病等方面都有明显的作用，所以其具有广阔的市场前景。

但是由于桑黄对生长环境、温度、湿度要求极高，加之生长周期长，极难发现，因而天然的桑黄数量非常稀少，货源奇缺，价格昂贵。同时由于外商需求量大，经济效益高，致使各产地对桑黄进行掠夺性开采，野生子实体孢子无法形成。在我国东北地区该资源已经难以恢复，西北也即将枯竭。再加上我国天然的桑黄数量本来就非常稀少，子实体的人工栽培尚处于起步阶段，所以要想形成稳定的医药工业产品来源，就必须充分挖掘桑黄的自然资源，深入开展桑黄菌种的分离培养，以利于分离出生长周期短、抗污染能力强、多糖产量高及其药理作用好的桑黄菌种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法，能显著提高桑黄的菌丝体产量和胞内、外多糖含量。

首先提供了一种用于桑黄菌株液体发酵的培养基，所述培养基的配方为：葡萄糖20-30 g/L，酵母粉2-6 g/L，KH₂PO₄ 1-3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3-0.7 g/L，V_B1 10 mg/L，水1L，pH自然。

更优选地，所述培养基的配方为：葡萄糖25 g/L，酵母粉6 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，V_B1 10 mg/L，水1L，pH自然。

利用上述的培养基发酵产桑黄多糖的方法，其发酵条件：温度28-32 ℃，摇速140-180 rpm，接种量20%-30 %，培养天数9-11 d；离心，收集发酵液，用蒸馏水洗涤沉淀，获得菌丝体；然后进行胞内、胞外多糖提取。

所述胞内多糖的提取：将烘干后的菌丝体研磨粉碎，过40目筛后，称取1 g菌丝体粉，加入10-30 ml蒸馏水，80-100℃热水浸提0.5-3h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞内粗多糖溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。

所述胞外多糖的提取：将发酵液浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞外粗多糖溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。

更优选地，发酵条件：温度28 ℃，摇速160 rpm，接种量25 %，培养天数10 d。

最佳胞内多糖提取工艺：料水比w/v=1:30，浸提温度90 ℃，浸提时间0.5 h，浸提次数3次。

    本发明用于优化的桑黄菌株为裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）ph.l 0003+1，于2012年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址: 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC M 2012284）。

 本发明的优点：一是能显著提高桑黄的菌丝体产量和胞内、外多糖含量，经过优化培养基配方，优化发酵条件，优化多糖提取工艺等步骤得到桑黄的菌丝产量比通用真菌培养基培养出的菌丝产量高275.90 %，胞内多糖含量高101.18%，胞外多糖含量高23.13%；而桑黄多糖的得率比用一般热水浸提法提取的多糖高6.34 %。二是通过动物试验证明提取的桑黄多糖具有显著的抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等生物活性。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线图。

图2为腹部明显肿大的腹水小鼠。

图3为从小鼠腹腔中抽取的腹水。

图4为右前肢腋下肿瘤明显长大的小鼠。

图5为剥离的肿瘤。

图6为桑黄菌种ph.l 0003+1培养平板。

具体实施方式

桑黄菌种筛选

1实验材料

1.1  供试菌株

三株桑黄菌种，编号分别为ph.l 0001，ph.l 0003，ph.l 0003+1，来源于福建农林大学菌物研究中心。

1.2 培养基

PDA固体培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，pH自然，加水定容到1 L。

通用真菌培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨4 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，VB₁ 10 mg，pH自然，加水定容到1 L。

1.3 受试动物

KM小鼠，雌性，体重(20±2) g左右，SPF级；移植性小鼠肿瘤S-180腹水型；全价营养鼠饲料均购自福建医科大学动物实验中心。

2 试验方法

2.1 活化菌种

用PDA固体斜面培养基活化三株桑黄菌种。在超净工作台中，从原试管中挑取0.1cm³左右的菌块至新的PDA固体斜面培养基上，编号，放置于25℃恒温培养箱中活化培养至菌丝长满管。

2.2 测定生长速度

在超净工作台中，将活化后的三株菌种分别从试管中挑取0.1cm³左右的菌块至新的PDA固体平板培养基上，编号，每组设置4个重复，放置于25℃恒温培养箱培养，当平板培养基上的菌丝长至半径为1cm时开始测定三株菌种的生长速度，直至菌丝长满平板培养基。

菌种平均生长速度=∑（每天测量的菌丝半径－前一天测量的菌丝半径）（cm）/ 测量天数（d）

2.3 测定液体培养基中的菌丝体产量

在容量为5L的三角瓶中装入1L的真菌通用液体培养基，在超净工作台中，将一根长满菌丝的试管中的培养基捣碎接入一瓶真菌通用液体培养基中，每个菌种设置4个重复，放置于25℃，120 rpm恒温摇床上培养10天。10天后，用纱布滤去培养液，收集不同菌种的菌丝体与培养皿中，编号，再将菌丝体置于60℃的烘箱中烘干至恒重，最后称取不同菌种菌丝体的干重。

2.4 测定胞内、胞外多糖含量

2.4.1 测定胞内多糖含量

（1）提取粗多糖

将烘干后不同菌种的菌丝体研磨粉碎，过40目筛后，分别称取1 g不同菌种菌丝体粉末，加入30 mL蒸馏水，100℃热水浸提3h。再真空抽滤，利用旋转蒸发仪将体积浓缩为原来的1/5左右。然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，-80℃放置24 h，再冷冻干燥12 h，收集干燥物，称重并记录。

（2）绘制葡萄糖标准曲线

A．0.01 %葡萄糖标准液的配制

精确称取105 ℃干燥恒重的标准葡萄糖50.08 mg，定容于100 mL容量瓶中，配制成0.05 %的葡萄糖标准液母液；取上述母液10 mL定容于50 mL容量瓶中，配制成0.01 %葡萄糖标准液。

B．5 %苯酚溶液的配制

精确称取5.0012 g重蒸酚，定容于100 mL容量瓶中，配制成5.0012 %的苯酚溶液。此溶液需现配现用。

C．葡萄糖标准曲线的制备

分别吸取葡萄糖标准液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，置于不同的具塞试管中，编号，分别加蒸馏水至2.0 mL，另以2.0 mL蒸馏水作为空白对照，再分别加入5.0012 %的苯酚溶液1.0 mL摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，振荡混匀后，置于冰浴中20 min后取出置于室温30 min，利用紫外分光光度计于490 nm处测定吸光值，记录数据，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

（3）测定多糖含量

分别称取5.0 mg不同菌种的胞内多糖样品定容于25 mL容量瓶中，编号，每个菌种设置4个重复，然后再分别吸取不同菌种的多糖样品液1.0 mL，按上述方法操作，最后记录数据，计算多糖含量。

2.4.2 测定胞外多糖含量

（1）提取粗多糖

将过滤后的培养液利用旋转蒸发仪将体积浓缩为原来的1/5左右。然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，-80℃放置24 h，再冷冻干燥12 h，收集干燥物，称重并记录。

（2）测定多糖含量

分别称取5.0 mg不同菌种的胞外多糖样品定容于25 mL容量瓶中，编号，每个菌种设置3个重复，然后再分别吸取不同菌种的多糖样品液1.0 mL，按上述方法操作，最后记录数据，计算多糖含量。

2.5 测定抑瘤率

2.5.1 小鼠S₁₈₀荷瘤模型的建立

根据卫生部编写的保健食品功能学评价程序和检验方法^[78]建立模型。S₁₈₀细胞经传代培养后，在细胞的指数生长期收集细胞，1000 rpm离心5 min后，沉淀细胞用PBS缓冲液洗涤，1000 rpm离心5 min，重复2次，收集沉淀细胞，用无菌生理盐水稀释，调整到2-3×10⁶ /mL。然后随机选取5只健康的KM小鼠，每只用0.3 mL上述细胞悬液进行腹腔注射。观察接种小鼠的腹水生长情况。

2.5.2 试验动物分组和灌胃

将18只健康的雌性KM小鼠随机分成3组，分别为ph.l 0001组，ph.l 0003组，ph.l 0003+1组，每组6只。从上述5只腹部肿大的小鼠中各抽取1 mL腹水，用无菌生理盐水按照1:1的比例稀释上述腹水，每只小鼠用0.2 mL的腹水稀释液进行右前肢腋下的皮下注射，在皮下注射后24 h内每组小鼠用不同菌种的多糖溶液进行灌胃，灌胃剂量为600 mg/Kg^.d，每天1次，连续灌胃10 d。另设肿瘤对照组，每天以等体积的生理盐水灌胃。每组小鼠自由进食与饮水。

2.5.3 测定抑瘤率

接种肿瘤后每天定时灌胃，观察小鼠的生长情况，10 d后，停止灌胃24 h后脱椎处死小鼠，称量每组小鼠的体重，用解剖器械小心切开肿瘤表面皮肤，充分暴露瘤块组织，沿肿瘤包膜小心剥离肿瘤组织，将剥下的瘤块置于无菌滤纸上吸尽瘤块周围残留血迹，称取并记录瘤重，计算肿瘤生长抑制率。

抑瘤率=（对照组平均瘤重-灌胃组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100 %

3  结果与分析

3.1 三株桑黄菌种的生长速度

通过每天测量三株桑黄菌种的半径，记录并计算它们的平均生长速度（如表1）。根据平均生长速度公式算出三株桑黄菌种的平均生长速度（如表1），从数据中可以看出ph.l 0001和ph.l 0003+1这两株桑黄菌种的平均生长速度比ph.l 0003快，而ph.l 0001和ph.l 0003+1的平均生长速度相差不多。

表1 三株桑黄菌种的生长速度

注：大写字母表示为1%的极显著水平

3.2 三株桑黄菌种的菌丝产量

 通过计算得到三株桑黄菌种的菌丝平均产量（如表2），从表2中数据可以看出ph.l 0003+1这株桑黄菌种的菌丝平均产量较之其余两株更高为2.492g/L。

表2 三株桑黄菌种的菌丝产量

注：大写字母表示为1%的极显著水平

3.3三株桑黄菌种的胞内、胞外多糖含量

根据上述胞内、胞外多糖的提取方法，先绘制出的葡萄糖标准曲线如图1，可得标准曲线方程为：Y=4.7095X+0.0041(R²=0.9939)，其中Y轴为490 nm处吸光度值，X轴为标准葡萄糖含量。再根据葡萄糖标准曲线求出三株桑黄菌种的胞内、胞外多糖含量（如表3）。从表3的数据可知ph.l 0003+1这株桑黄菌种的胞内、胞外多糖含量较之其余两株更高，分别为107.13 mg/g和94.27 mg/100 mL。

 

表3 三株桑黄菌种的胞内、胞外多糖含量

注：大写字母表示为1%的极显著水平

3.4 三株桑黄菌种多糖的抑瘤率

根据上述方法建立的小鼠S₁₈₀荷瘤模型的腹水生长情况良好，大约8天后接种细胞悬液的小鼠腹部明显肿大（如图2）。从小鼠腹部抽取出来的腹水呈淡粉色（如图3），是含有少量血液的腹水，将腹水稀释液接种到小鼠右前肢腋下大约5天后，小鼠右前肢腋下肿瘤明显长大（如图4），而第11天处死肿瘤小鼠后，从小鼠的右前肢腋下剥离的肿瘤如图5。

       

根据陈奇等著作的规定，如果试验结束后肿瘤对照组小鼠的平均瘤重小于1 g或20 %的小鼠瘤重小于0.5 g，表示其肿瘤生长不良。灌胃期间试验组小鼠的死亡率超过20 %或平均体重下降超过15%，表示药物具有毒性。若试验组的抑瘤率大于30 %，则表示该药物具有体内抗肿瘤作用。结合上述标准和表4的数据，可以看出三组给药小鼠的体重与肿瘤对照组比较无明显差异，而且各组小鼠无死亡情况，说明桑黄多糖没有毒性。而肿瘤对照组小鼠的平均瘤重大于1 g，给药组小鼠的平均瘤重大于500 mg，表示每组的肿瘤都生长良好。在三组的抑瘤率中，ph.l 0003+1这株桑黄菌种的胞内多糖对肿瘤的抑制率明显高于高于另外两株，抑制率为35.14 %，所以可以认为ph.l 0003+1这株桑黄菌种的多糖具有体内抗肿瘤作用。

表4 三株桑黄菌种多糖对小鼠S₁₈₀肉瘤体内生长的影响（

±s, n=6）

注：大写字母表示为1%的极显著水平

3.5 筛选最优菌种

综合以上各项指标可以发现，ph.l 0003+1这株桑黄菌种的各项指标中都比其余两株突出，如ph.l 0003+1的菌丝产量是ph.l 0001的2.61倍（P<0.01）和ph.l 0003的1.35倍（P<0.01），胞内多糖含量分别是ph.l 0001的1.59倍（P<0.01）和ph.l 0003的1.39倍（P<0.01），胞外多糖含量分别是ph.l 0001的1.37倍（P<0.01）和ph.l 0003的2.80倍（P<0.01），而肿瘤抑制率更是ph.l 0001的5.19倍（P<0.01）和ph.l 0003的51.68倍（P<0.01）。因此，从ph.l 0001，ph.l 0003和ph.l 0003+1三株桑黄菌种中筛选出的最优菌种为ph.l 0003+1（如图6）。

将ph.l 0003+1裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）ph.l 0003+1，于2012年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址: 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC M 2012284）。

实施例一：选用ph.l 0003+1桑黄菌种进行试验。将不同的氮源（牛肉膏4 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母粉4 g/L，黄豆粉50 g/L，玉米粉50 g/L，麸皮50 g/L，酒石酸铵0.32 g/L，硫酸铵0.32 g/L，硝酸钠0.32 g/L），碳源（葡萄糖20 g/L，麦芽糖20 g/L，果糖20 g/L，蔗糖20 g/L，乳糖20 g/L，玉米粉20 g/L，大米粉20 g/L，可溶性淀粉20 g/L），碳氮比（1:1，3:1，5:1，8:1，10:1，12:1，20:1），无机盐（KH₂PO₄ 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，FeSO₄ 0.1 g/L，ZnSO₄ 0.1 g/L，MnSO₄ 0_.1 g/L，CaCl₂ 0.5 g/L）和维生素（硫胺素10 mg/L，核黄素10 mg/L，尼古丁酸10 mg/L，叶酸10 mg/L，抗坏血酸10 mg/L，生物素10 mg/L）通过单因素筛选和正交试验（表5），得到有利于菌丝体生长和明显提高胞内、外多糖含量的最佳液体发酵培养基配方：葡萄糖25 g/L，酵母粉6 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，V_B1 10 mg/L。其菌丝产量达到5.72 g/L，比通用真菌培养基培养出的菌丝产量高129.72%，胞内多糖含量高28.99%，胞外多糖含量高55.61%。

表5  正交试验因素与水平

实施例二：将不同的温度（22.5 ℃，25 ℃，28℃，30℃，32℃，37℃）、摇速（100 rpm，120 rpm，140 rpm，160rpm，180 rpm，200 rpm）、接种量（5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %）、发酵天数（5 d，6 d，7 d，8 d，9 d，10 d，11 d，12 d）和pH值（pH 4.5，pH 5.5，pH6.5，pH 7.5，pH 8.5，pH 9.5）通过单因素筛选和正交试验（表6），得到有利于菌丝体生长和明显提高胞内、外多糖含量的最佳液体发酵条件：温度28 ℃，摇速160 rpm，接种量25 %，培养天数10 d，pH值自然。其菌丝产量达到9.36 g/L，比通用真菌培养基培养出的菌丝产量高275.90 %，胞内多糖含量高101.18%，胞外多糖含量高23.13%。

表6正交试验因素与水平

实施例三：通过热水浸提法正交试验（表7），得到提取桑黄多糖的最佳工艺为：料水比1:30，浸提温度90 ℃，浸提时间0.5 h，浸提次数3次。得到的桑黄多糖含量为230.47mg/g，比用一般热水浸提法提取的多糖高6.34 %

表7   正交试验因素与水平

实施例四：将各项优化后提取出的桑黄多糖进行生物活性试验，分别测定胞内、外多糖的抑瘤率（表8），对小鼠脾脏指数，胸腺指数（表9），SOD活性和MDA含量（表10）的影响。结果证明其多糖具有显著的抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等生物活性。

表8  桑黄多糖对小鼠S₁₈₀肉瘤体内生长的影响（

±s, n=6）

注：大写字母表示为1%的极显著水平

表9 桑黄多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠免疫器官的影响（

±s, n=6）

表10  不同组小鼠肝脏蛋白浓度和肝脏中的SOD、MDA含量（

±s, n=6）

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种用于桑黄菌株液体发酵的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：葡萄糖20-30 g/L，酵母粉2-6 g/L，KH₂PO₄ 1-3 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3-0.7 g/L，V_B1 10 mg/L，水1L，pH自然。

2.根据权利要求1所述的用于桑黄菌株液体发酵的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：葡萄糖25 g/L，酵母粉6 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，V_B1 10 mg/L，水1L，pH自然。

3.利用权利要求1或2所述的培养基发酵产桑黄多糖的方法，其特征在于：发酵条件：温度28-32 ℃，摇速140-180 rpm，接种量20%-30 %，培养天数9-11 d；离心，收集发酵液，用蒸馏水洗涤沉淀，获得菌丝体；然后进行胞内、胞外多糖提取。

4.根据权利要 3所述的培养基发酵产桑黄多糖的方法，其特征在于：所述胞内多糖的提取：将烘干后的菌丝体研磨粉碎，过40目筛后，称取1 g菌丝体粉，加入10-30 ml蒸馏水，80-100℃热水浸提0.5-3h，抽滤，浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞内粗多糖溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。

5.根据权利要 3所述的培养基发酵产桑黄多糖的方法，其特征在于：所述胞外多糖的提取：将发酵液浓缩至原体积的1/5，然后加3倍体积的无水乙醇，4℃静置12 h，10000 rpm，4℃离心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞外粗多糖溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。

6.根据权利要 3所述的培养基发酵产桑黄多糖的方法，其特征在于：发酵条件：温度28 ℃，摇速160 rpm，接种量25 %，培养天数10 d。

Images