CN112812975A - 一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法，涉及微生物培养技术领域，所述培养基以水为溶剂，每升由包括以下重量的原料制备得到：麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾2.5～3.5g、硫酸镁1～2g、葡萄糖15～25g、维生素B1 5～15mg和琼脂15～20g。采用本发明提供的培养基相较于PDA培养基培育，缩短了桑黄母种培育的时间。

Description

一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法。
背景技术
桑黄是一种著名的药用真菌，桑黄的药用记载源于两千多年前的《神农本草经》中的【桑耳】，桑黄名称最早出自于唐初甄权所著《药性论》。现代分类学研究表明桑黄是一类药用真菌的统称，分类学家发现桑黄孔菌属(Sanghuangporus)已知种为15个种。现代研究发现″桑黄″含有多种化合物，如多糖、萜类、酚类、黄酮类等药理功效显著的物质。研究证实桑黄多糖能够缓解疼痛、食欲不振、体重减轻及疲劳倦怠等癌症特有的症状，提高生活品质。″桑黄″的现代药理活性主要有抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、保肝、降低血脂、预防和治疗类风湿性关节炎、抑制尿酸和抗过敏等。子实体形态特征：菌盖木质，扁半球形或马蹄形，(2～12)cm×(3～21)cm，厚1.5～10cm，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，幼期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱；边缘钝，淡咖啡色，下侧无子实体；菌肉深咖啡色，木质；菌管多层，层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝；管口褐色；孢子近球形，光滑，(5～6)cm×(4～5)μm；菌丝不分枝，无横隔，直径3～5μm。近些年来随着对桑黄的药理药化的研究深入，野生桑黄产量减少，人工栽培桑黄越来越受到关注。桑黄作为药用大型真菌在我国北方和南方都可以进行人工栽培，但由于气候环境的不同，栽培方法上存在差别，管理也不同。作为桑黄生产的原始材料，桑黄母种是桑黄生产的根本，目前桑黄菌种的制作方式方法主要以固体菌种为主，在PDA培养基上采用带有菌丝的菌块菌种进行培养，制作出的菌种时间长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法，采用本发明提供的培养基相较于PDA培养基培育，缩短了桑黄母种培育的时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种培育桑黄母种的培养基，所述培养基以水为溶剂，每升由包括以下重量的原料制备得到：
麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾2.5～3.5g、硫酸镁1～2g、葡萄糖15～25g、维生素B15～15mg和琼脂15～20g。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述麸皮和黄豆粉煮汁、过滤，得到滤液；
2)将所述步骤1)得到的滤液与磷酸氢二钾、硫酸镁、葡萄糖、琼脂、维生素B1、水混合后灭菌，得到培养基。
优选的，所述步骤2)灭菌的条件包括：121℃灭菌30～40min。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的培养基培育桑黄母种的方法，包括以下步骤：将斜面上的桑黄菌种接种于上述技术方案所述培养基上，在29～31℃下暗培养1～3d，再在27～28℃下暗培养6～8d后，在光照强度为180～220lux、26～27℃下培养0.5～1.5d，得到桑黄母种。
优选的，将斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮去除，留下斜面培养基，将所述斜面培养基接种于上述技术方案所述培养基上。
优选的，利用接种铲去除斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮。
优选的，利用接种铲和接种钩将所述斜面培养基切割成规格为2～3mm的方块，将所述方块接种于上述技术方案所述的培养基上。
优选的，在试管中培育桑黄母种，每根试管中接种所述方块1～2个。
优选的，所述试管的规格包括20×200mm、22×200mm或25×200mm。
优选的，所述桑黄包括杨树桑黄。
本发明提供了一种培育桑黄母种的培养基及其制备方法和培育方法，所述培养基以水为溶剂，每升由包括以下重量的原料制备得到：麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾2.5～3.5g、硫酸镁1～2g、葡萄糖15～25g、维生素B15～15mg和琼脂15～20g。采用本发明提供的培养基相较于PDA培养基培育，缩短了桑黄母种培育的时间。
具体实施方式
本发明提供了一种培育桑黄母种的培养基，所述培养基以水为溶剂，每升由包括以下重量的原料制备得到：麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾2.5～3.5g、硫酸镁1～2g、葡萄糖15～25g、维生素B15～15mg和琼脂15～20g；优选每升由包括以下重量的原料制备得到：麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁1.5g、葡萄糖20g、维生素B110mg和琼脂15～20g。在本发明中，所述麸皮优选是指干燥无霉变的小麦麸皮。本发明对所述黄豆粉的来源和粒径没有特殊限定，采用常规培养微生物使用的黄豆粉即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述麸皮和黄豆粉煮汁、过滤，得到滤液；
2)将所述步骤1)得到的滤液与磷酸氢二钾、硫酸镁、葡萄糖、琼脂、维生素B1、水混合后灭菌，得到培养基。
在本发明中，所述麸皮和黄豆粉混合煮汁或者单独煮汁皆可。在本发明中，所述煮汁的温度优选为100℃，煮汁的时间优选为15～20min。本发明对所述过滤的方法没有特殊限定，采用常规过滤的方法即可。
在本发明中，所述灭菌的条件优选包括：121℃灭菌30～40min。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的培养基培育桑黄母种的方法，包括以下步骤：将斜面上的桑黄菌种接种于上述技术方案所述培养基上，在29～31℃下暗培养1～3d，再在27～28℃下暗培养6～8d后，在光照强度为180～220lux、26-27℃下培养0.5～1.5d，得到桑黄母种。
在本发明中，所述桑黄菌种优选在30℃下暗培养2d，再在28℃下暗培养7d后，在光照强度为200lux、26-27℃下培养培养1d，得到桑黄母种。在本发明中，在29～31℃下可可以促进桑黄菌丝萌发，在27～28℃培养至长满试管，菌丝长满试管后在180～220lux光照下照刺激菌丝颜色变黄，变粗壮。
在本发明中，所述桑黄菌种优选包括杨树桑黄。在本发明中，所述斜面上的桑黄菌种采用常规方法在试管斜面上培养得到即可，无特殊限定。
本发明优选将斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮去除，留下斜面培养基，将所述斜面培养基接种于上述技术方案所述培养基上。本发明优选利用接种铲去除斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮。本发明优选利用接种铲和接种钩将所述斜面培养基切割成规格为2～3mm的方块，将所述方块接种于上述技术方案所述的培养基上。采用上述方法避免因桑黄菌丝老化形成菌皮难以钩取菌种块问题，减少了污染。本发明优选在试管中培育桑黄母种，每根试管中接种所述方块1～2个。在本本发明中，所述试管的规格优选包括20×200mm、22×200mm或25×200mm。
本发明制备的桑黄母种可以直接用于生产二级菌或三级菌。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
培育桑黄母种的培养基的原料：黄豆粉5g、麸皮10g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂粉15g和维生素B1 10mg。
制备方法：将黄豆粉和麸皮煮汁，使用纱布过滤掉渣子，加水定容至1000ml，加入琼脂粉，待琼脂融化后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1搅拌均匀，121℃高温高压灭菌30min。
研究材料：采用广泛用于栽培的桑黄菌株(sanghuangporus vaninii)作为试验菌株。
试验方法：将供试桑黄菌株在直径为9cm的培养皿中培养，至于温度28恒温温培养箱培养，待桑黄菌丝长满平板后，制作培育桑黄母种的培养基的培养皿(直径9cm)，用直径为5mm的琼脂打孔器，打出相同大小的接种块，接入培养皿中心位置，每个菌株5次重复，放入28℃恒温培养箱培养，待菌丝萌发后，每天测量1次菌丝直径(cm)，计算平均值。当菌丝长至培养皿边缘时候，计算菌丝平均生长速度(cm·d-1)。
在培养基中菌丝24h后开始萌发，培养第10天长满培养皿，培养至13天培养皿中菌落颜色由淡黄变黄，气生菌丝较少，菌丝没有老化。平均生长速率为0.9cm/d。
对比例1
(PDA)培养基原料为：200g马铃薯、20g葡萄糖、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂粉15g和维生素B1 10mg。
制备方法：将马铃薯煮汁，使用纱布过滤掉渣子，加水定容至1000ml，加入琼脂粉，待琼脂融化后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1搅拌均匀，121℃高温高压灭菌30min。
研究材料：采用广泛用于栽培的桑黄菌株(sanghuangporus vaninii)作为试验菌株。
试验方法：将供试桑黄菌株在直径为9cm的培养皿中培养，至于温度28℃恒温培养箱培养，待桑黄菌丝长满平板后，制作培养基的培养皿(直径9cm)，用直径为5mm的琼脂打孔器，打出相同大小的接种块，接入培养皿中心位置，每个菌株5次重复，放入28℃恒温培养箱培养，待菌丝萌发后，每天测量1次菌丝直径(cm)，计算平均值。当菌丝长至培养皿边缘时候，计算菌丝平均生长速度(cm·d-1)。
在培养基中菌丝24h后开始萌发，培养第12天长满培养皿，当培养至13天培养皿中菌落颜色变黄。生长速率为0.75cm/d。
对比例2
培养基原料为：玉米粉5g、麸皮10g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B1 10mg和琼脂粉15g。
制备方法：将玉米粉和麸皮煮汁，使用纱布过滤掉渣子，加水定容至1000ml，加入琼脂粉，待琼脂融化后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1搅拌均匀，121℃高温高压灭菌30min。
研究材料：采用广泛用于栽培的桑黄菌株(sanghuangporus vaninii)作为试验菌株。
试验方法：将供试桑黄菌株在直径为9cm的培养皿中培养，至于温度28℃恒温培养箱培养，待桑黄菌丝长满平板后，制作培养基的培养皿(直径9cm)，用直径为5mm的琼脂打孔器，打出相同大小的接种块，接入培养皿中心位置，每个菌株5次重复，放入28℃恒温培养箱培养，待菌丝萌发后，每天测量1次菌丝直径(cm)，计算平均值。当菌丝长至培养皿边缘时候，计算菌丝平均生长速度(cm·d-1)。
在培养基中菌丝24h后开始萌发，培养第11天长满培养皿，当培养至13天培养皿中菌落颜色变黄。生长速率为0.82cm/d。
对比例3
培养基原料为：酵母膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg、琼脂粉15g。
制备方法：按照配方称取1000ml水煮沸，加入琼脂粉，待琼脂融化后，倒入两杯中加水定容至1000ml后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母膏、硫酸镁和维生素B1搅拌均匀，121℃高温高压灭菌30min。
研究材料：采用广泛用于栽培的桑黄菌株(sanghuangporus vaninii)作为试验菌株。
试验方法：将供试桑黄菌株在直径为9cm的培养皿中培养，至于温度28℃恒温培养箱培养，待桑黄菌丝长满平板后，制作培养基的培养皿(直径9cm)，用直径为5mm的琼脂打孔器，打出相同大小的接种块，接入培养皿中心位置，每个菌株5次重复，放入28℃恒温培养箱培养，待菌丝萌发后，每天测量1次菌丝直径(cm)，计算平均值。当菌丝长至培养皿边缘时候，计算菌丝平均生长速度(cm·d-1)。
在培养基中菌丝24h后开始萌发，培养第9天长满培养皿，当培养至11天培养皿中菌落颜色变黄。生长速率为1cm/d。
在培养基中菌丝24h后开始萌发，培养至第9天长满培养皿，当培养至第11天菌丝开始产生色素，菌落颜色变深黄色，菌丝老化，气生菌丝增多，生长速率为1cm/d。
由实施例1和对比例1～3可以得出，菌丝长势对比例3＞实施例1＞对比例2＞对比例1，虽然在实施例1提供的培养基中菌丝生长速度不是最快，但是菌丝活力较好，能够保存时间长不易老化，用于大规模生产更适合。
实施例2
桑黄种与实施例1相同；
培育桑黄母种的培养基的原料：黄豆粉5g、麸皮10g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂粉15g和维生素B110mg。
将黄豆粉和麸皮煮汁使用纱布过滤掉渣子，加水定容至1000ml，加入琼脂粉，待琼脂融化后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1搅拌均匀，装入试管(试管规格20×200mm)，每个试管装液量为1/3，塞上棉花塞，121℃高温高压灭菌30min，灭菌后当灭菌锅温度降低至80℃，摆斜面试管，在平台上放宽度为2cm的方木条，将试管口一端摆放在木条上，使得页面距离试管口5cm左右，冷却至形成固体培养基，在无菌室内超净工作台接种，将保留的桑黄试管种使用接种钩将菌种钩取适当大小转移至斜面试管中心位置，接种后放入培养箱内黑暗培养，待菌丝长满试管斜面后，进行母种的扩繁。
扩繁方法：在无菌室内超净工作台操作，利用接种铲将试管斜面表层的桑黄菌丝体和菌皮全部剔除，留下培养基，使用接种铲将培养基横切成宽度为3mm的长条，再使用接种钩纵切成宽度为3mm，使得菌种块大小为边长为3mm的方块，用接种钩将方块接种斜面试管1个，接种后放入恒温培养箱暗培养在30℃培养2天，后降低温度至28℃暗培养培养7天长满试管，后再光照强度为200lux散射光照下培养1天，使得菌种颜色由淡黄色变黄色，菌丝变粗壮。
实施例3
麸皮12g，黄豆粉6g，其余条件同实施例2。
用接种钩将方块接种斜面试管，接种后放入恒温培养箱暗培养，在31℃培养2天，后降低温度至27.5℃培养7天长满试管后，再光照强度为200lux的条件下培养1天，使得菌种颜色由淡黄色变黄色，菌丝变粗壮。
对比例4
桑黄母种扩繁全程的培育温度为28℃，暗培养，其余条件同实施例2，需要13d长满试管。
实施例4
进行PDA培养基(制作方法同对比例1)制作母种和培育桑黄母种的培养基，及接种方法制作母种的污染率对比试验
试验方法：同时接种100只试管(试管规格20×200mm)接种操作过程中，选用长满培养基的斜面试管桑黄菌种(与实施例1相同)作为接种种源，在接种过程中由于PDA培养基采用传统方法(即接入带有菌丝块的菌种)接种，导致在切割菌种过程中较为困难，由于桑黄菌丝易形成菌皮，因此不宜切割，用时较多，反复钩取增加了杂菌污染的几率；培育桑黄母种的培养基采用与实施例1相同的的方法，首先培养基弹性好，易于切割，通过去掉表层的桑黄菌丝皮，可以方便将培养基切割成小块，操作方便快捷，接种速度快，减少了菌种停留在空气中的时间，降低杂菌污染几率。在相同的条件下(与实施例2相同)进行接种培养，PDA组接种时间为45分钟，钩取菌种块困难，发明组接种时间20分钟，接种容易；同时在本发明的培养条件下培养，PDA组长满试管时间为14天，本发明组10天；其中在培养期间PDA组杂菌污染数量为15管，污染率为15％，发明组污染数量为2管，污染率为2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种培育桑黄母种的培养基，其特征在于，所述培养基以水为溶剂，每升由包括以下重量的原料制备得到：
麸皮10～12g、黄豆粉5～6g、磷酸氢二钾2.5～3.5g、硫酸镁1～2g、葡萄糖15～25g、维生素B15～15mg和琼脂15～20g。
2.权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述麸皮和黄豆粉煮汁、过滤，得到滤液；
2)将所述步骤1)得到的滤液与磷酸氢二钾、硫酸镁、葡萄糖、琼脂、维生素B1、水混合后灭菌，得到培养基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)灭菌的条件包括：121℃灭菌30～40min。
4.一种利用权利要求1所述的培养基培育桑黄母种的方法，其特征在于，包括以下步骤：将斜面上的桑黄菌种接种于权利要求1所述培养基上，在29～31℃下暗培养1～3d，再在27～28℃下暗培养6～8d后，在光照强度为180～220lux、26～27℃下培养0.5～1.5d，得到桑黄母种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮去除，留下斜面培养基，将所述斜面培养基接种于权利要求1所述培养基上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用接种铲去除斜面上的桑黄菌种的菌丝体和菌皮。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用接种铲和接种钩将所述斜面培养基切割成规格为2～3mm的方块，将所述方块接种于权利要求1所述的培养基上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在试管中培育桑黄母种，每根试管中接种所述方块1～2个。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述试管的规格包括20×200mm、22×200mm或25×200mm。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述桑黄包括杨树桑黄。
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