CN108660180A - 一种用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法 - Google Patents

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彭晓国
信文娟
董调雅
肖毓
朱方剑
姚瑶
闻佳涛
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Abstract

本发明提供一种用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法，述筛选方法包括如下具体步骤：步骤1)选取不同的碳源、氮源分别加入不同的桑黄发酵培养基中；步骤2)培养相同时间后，通过测定桑黄菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的碳源；通过测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的氮源；步骤3)选用步骤2)得到的氮源和碳源，采用正交试验，测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖的百分含量；确定碳氮源最佳组合和最佳配比。骤4)验证步骤3)中得到的最佳组合和最佳配比；所述步骤3)中采用SPSS软件设计进行正交试验。

Description

一种用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法
技术领域
本发明属于桑黄发酵领域，具体涉及用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法。
背景技术
桑黄菌是一类具有重要药用价值的十分珍贵的大型真菌，为担子菌亚门(Basidiomyctina)。生长于日本，菲律宾，澳大利亚，中国和北美等少数地方。桑黄往往寄生于桑树的枯木之上，子实体为多年生，木质。在中国，桑黄菌的使用从汉朝起至今已经有2000多年的历史了。《本草纲目》记载桑黄能“利五脏，宜肠胃气，排毒气”，民间把它作为一种治肝病、癌症的灵丹妙药，被誉为"菌种极品"。
由于桑黄自身生长的特殊性，造成天然的桑黄数量非常稀少，自然界中可供药用的资源有限，难以成为稳定的工业产品来源，对桑黄产业的发展十分不利。
桑黄人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，也不利于工业化大规模生产。因此采用液体发酵培养获得菌丝体显得尤为重要。研究表明，液体发酵培养获得菌丝体的各种活性成分均类似于子实体。而且，在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器中(发酵罐或大三角瓶)处于最适温度、最适酸碱度，最适碳、氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，在短时问内就可以获得大量菌丝体，具有生产时间短，效率高，成本低等优点。同时，还会在发酵液中产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、甙类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种生理活性物质。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官疾病具有预防治疗作用，并具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。
在现有生产技术和文献报道中，桑黄发酵菌丝体的得率不高，且没有对菌丝体的生物活性作为桑黄的指标。目前关于桑黄发酵菌丝体的碳氮源选择方法单一，并没有建立一套完整的碳氮源筛选方法。
发明内容
本发明提供一种用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法，述筛选方法包括如下具体步骤：
步骤1)选取不同的碳源、氮源分别加入不同的桑黄发酵培养基中；
步骤2)培养相同时间后，通过测定桑黄菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的碳源；通过测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的氮源；
步骤3)选用步骤2)得到的氮源和碳源，采用正交试验，测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖的百分含量；确定碳氮源最佳组合和最佳配比。
步骤4)验证步骤3)中得到的最佳组合和最佳配比；所述步骤3)中采用SPSS软件设计进行正交试验。
本发明创造性通过采用相关生物指标筛选方法来选出苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的碳源；通过测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的氮源；并进一步创造性地根据生物指标的含量比使用正交试验选用合适的碳氮比例，研究人员可寻找出适合菌丝生长的最佳碳氮源种类以及配比，大大提高桑黄菌丝体生物量及生物活性，菌丝体生物量最高可达3.0％，且由于选用了合适的生物指标，其得到的培养基组分和配比更具有真实性和可靠性。
具体实施方式
实施例1碳源筛选
1.1培养基
摇瓶种子培养基：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO42g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
碳源筛选基础培养基：蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
1.2试验方法
一级液体菌种培养：在500mL三角瓶中装150mL摇瓶种子培养基，取培养好的斜面母种接入三角瓶，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min培养7-10d,，即得一级液体菌种。
二级液体菌种培养：在500mL三角瓶中装150mL摇瓶种子培养基，吸取一级液体菌种，接种量15-30％。置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养2-3d。
摇瓶发酵培养：取培养好的二级液体菌种，按照接种量为10％，分别接种于5种不同碳源培养基(即在碳源筛选基础培养基中分别添加蔗糖、葡萄糖、乳糖、玉米粉、麦芽糖，添加量为20-30g/L)，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养7-10d，3次平行试验，分析不同碳源对桑黄菌丝体生长的影响，获得两种最佳碳源。
1.3碳源筛选实验结果
实验选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米粉和麦芽糖作为不同碳源添加，培养成熟后测定菌丝体中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量，参见表1.3。
表1.3不同碳源培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
核苷酸：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中腺苷、鸟苷和尿苷的含量与其他碳源相比显著性增加，其中腺苷分别比葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖增加了50.0％、39.5％、67.9％和52.4％；鸟苷分别增加了55.9％、89.4％、55.4％和76.4％；尿苷分别增加了33.0％、24.0％、52.8％和42.6％。
麦角甾醇：以玉米作为碳源培养的菌丝体中含量明显高于乳糖和麦芽糖，分别提高了14.5％和15.6％，而与葡萄糖、蔗糖相比则差异不明显，其中比蔗糖增加了1.28％，但比葡萄糖却下降了8.67％。
甘露醇：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中甘露醇的含量明显高于以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖作为碳源培养基，分别增加了15.2％、11.4％、16.9％和20.7％。
多糖：以麦芽糖作为碳源培养的多糖含量最高，分别比葡萄糖、蔗糖、乳糖和玉米粉增加了65.1％、57.7％、46.5％和46.4％；而以玉米粉作为碳源培养中多糖含量与葡萄糖、蔗糖相比增加明显，分别增加了34.9％和21.2％，与乳糖相比没有显著性差异。
总氮：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中总氮含量与葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖培养基相比有明显增加趋势，分别增加了18.0％、15.2％、24.5％和23.3％。
根据以上数据分析，以玉米粉作为碳源培养的菌粉中核苷、甘露醇的含量与葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖相比有明显优势，而对于麦角甾醇的含量玉米粉培养基优势不显著但仍有增加的趋势；以麦芽糖作为碳源培养的中多糖的菌粉含量优势显著，明显高于其他碳源培养基。
实施例2氮源筛选
2.1培养基
摇瓶种子培养基：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO42g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
氮源筛选基础培养基：葡萄糖15-25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
2.2试验方法
一级液体菌种与二级液体菌种培养方法与2.1一样。摇瓶发酵培养：取培养好的二级液体菌种，按照接种量为10％，分别接种于6种不同氮源培养基(即在氮源筛选基础培养基中分别添加豆粕、蛋白胨、酵母粉、尿素、牛肉膏和麸皮，添加量为10-25g/L)，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养7-10d，3次平行试验，分析不同碳源对桑黄菌丝体生长的影响，获得两种最佳氮源。
2.3氮源筛选实验结果
2.3.1相同培养时间下的氮源筛选实验结果
实验选取豆粕、蛋白胨、酵母粉、尿素、牛肉膏和麸皮六种作为不同氮源添加，培养相同时间后测定菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量(表2.3.1)。
表2.3.1氮源一次筛选培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
注：“/”表示生物量太少无法测定
根据表可以看出，以蛋白胨、尿素和牛肉膏作为氮源的培养基中与豆粕、酵母粉和麸皮相比，菌株长势明显受到抑制甚至停止生长，得率显著性降低。
麦角甾醇：以豆粕作为氮源培养的菌粉中腺苷和麦角甾醇的含量要明显高于酵母粉和麸皮，其中腺苷分别增加了12.9％和40.6％；麦角甾醇分别增加了27.3％和44.5％。
甘露醇：以麸皮为氮源培养的菌粉中甘露醇的含量明显高于其他两种氮源，分别比豆粕以及酵母粉高出12.1％和17.5％。
总氮：以豆粕为氮源的菌粉中总氮含量最高，分别比酵母粉以及麸皮增加了16.4％和61.7％；而以酵母粉为氮源的菌粉中多糖含量与其他两个氮源相比，显著性增加，分别比豆粕以及麸皮增加了45.5％和15.0％。
2.3.2相同成熟度下的氮源筛选实验结果
根据2.3.1实验，发现不同氮源培养基下菌株生长成熟度相差很大，因此设定以菌株培养成熟度为发酵终点来进行第二次氮源筛选实验。实验选取豆粕、、酵母粉和麸皮三种作为不同氮源添加，培养成熟后测定菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量(表2.3.2)
表2.3.2氮源二次筛选培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
以豆粕为氮源的菌粉中腺苷和麦角甾醇与其他两种相比显著性增加，其中腺苷分别比酵母粉、麸皮增加了27.1％、64.8％；麦角甾醇分别增加了19.0％、56.0％。
以豆粕和酵母粉为氮源培养的菌粉中总氮含量明显高于麸皮，分别增加了69.5％和70.6％，而豆粕与酵母粉则不显著；以酵母粉为氮源培养的菌粉中多糖含量最高，分别比豆粕和麸皮增加了41.9％和59.3％。
综上分析可知，以豆粕作为氮源培养的菌粉中腺苷、麦角甾醇和总氮含量最高，与其他氮源相比具有显著优势，而以酵母粉作为氮源培养的菌粉中多糖含量优势显著，明显高于其他氮源。甘露醇的含量并没有显示出任何趋势，每种氮源中含量相差不大。所以选取豆粕和酵母粉为复合氮源。
实施例3碳源最佳组合以及碳氮比的筛选
3.1正交实验
3.1.1实验方案
根据碳氮源筛选结果，实验选择玉米粉、蔗糖和葡萄糖三种碳源作为复合碳源，选择豆粕、酵母粉两种氮源作为复合氮源，应用SPSS软件设计正交试验，正交因素和水平见表3.1.1，5因素+4水平，确定碳氮源最佳组合和最佳配比。
表3.1.1正交试验因素及含量(g/L)
实验培养基的碳氮比按照上述配置，每组均需加入MgSO4·7H2OMgSO4 0.5g/L，KH2PO41g/L，PH 6.0，置于26-32℃恒温摇床下，转速14-180r/min培养。
3.1.2实验结果
表3.1.2列举了碳氮比筛选培养下菌粉中各项生物指标含量(％)
表3.1.2
利用SPSS软件分析，确定出碳氮比最佳两组方案：
A组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖10-15g/L，玉米粉10-15g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0，
B组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖15-20g/L，玉米粉15-25g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0，
以上培养基在121℃灭菌30min，接种后置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min培养至发酵成熟，重复三次。
3.2正交实验验证
3.2.1实验方案
根据碳氮配比结果，实验选择A、B两组进行验证，三个平行，三次重复，选择出最佳方案。
3.2.2实验结果
表3.2.1碳氮比正交验证试验中菌粉中各项生物指标含量(％)
利用SPSS软件分析，A组和B组在多糖上有显著差异，B组显著高于A组，其他指标没有显著性差异，所以选择B组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖15-20g/L，玉米粉15-25g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0。

Claims (2)

1.一种用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法，其特征在于：所述筛选方法包括如下具体步骤：
步骤1)选取不同的碳源、氮源分别加入不同的桑黄发酵培养基中；
步骤2)培养相同时间后，通过测定桑黄菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的碳源；通过测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量选用合适的氮源；
步骤3)选用步骤2)得到的氮源和碳源，采用正交试验，测定桑黄菌株中腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖的百分含量；确定碳氮源最佳组合和最佳配比。
步骤4)验证步骤3)中得到的最佳组合和最佳配比。
2.根据权利要求2所述的用于制备桑黄发酵培养基的碳氮源筛选方法，其特征在于：所述步骤3)中采用SPSS软件设计进行正交试验。
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