CN108410791A - 桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用 - Google Patents

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信文娟
董调雅
肖毓
朱方剑
姚瑶
闻佳涛
方明春
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Abstract

本发明的发明人经过研究发现，桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用。具体地，所述桑黄提取物为桑黄水提物。将桑黄水提取物添加至桑黄发酵培养基中，直至桑黄在培养基中的浓度为4～8g/L。

Description

桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用
技术领域
本发明属于桑黄发酵领域，具体涉及桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用。
背景技术
桑黄菌是一类具有重要药用价值的十分珍贵的大型真菌，为担子菌亚门(Basidiomyctina)。生长于日本，菲律宾，澳大利亚，中国和北美等少数地方。桑黄往往寄生于桑树的枯木之上，子实体为多年生，木质。在中国，桑黄菌的使用从汉朝起至今已经有2000多年的历史了。《本草纲目》记载桑黄能“利五脏，宜肠胃气，排毒气”，民间把它作为一种治肝病、癌症的灵丹妙药，被誉为"菌种极品"。
由于桑黄自身生长的特殊性，造成天然的桑黄数量非常稀少，自然界中可供药用的资源有限，难以成为稳定的工业产品来源，对桑黄产业的发展十分不利。
桑黄人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，也不利于工业化大规模生产。因此采用液体发酵培养获得菌丝体显得尤为重要。研究表明，液体发酵培养获得菌丝体的各种活性成分均类似于子实体。而且，在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器中(发酵罐或大三角瓶)处于最适温度、最适酸碱度，最适碳、氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，在短时问内就可以获得大量菌丝体，具有生产时间短，效率高，成本低等优点。同时，还会在发酵液中产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、甙类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种生理活性物质。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官疾病具有预防治疗作用,并具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。
在现有生产技术和文献报道中，桑黄发酵菌丝体的得率不高，且没有对菌丝体的生物活性作为评价桑黄菌丝体的指标。
发明内容
本发明的发明人经过研究发现，桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用。具体地，所述桑黄提取物为桑黄水提物。
在本发明一个优选地实施例中，所述应用方法为：将桑黄水提物添加至桑黄发酵培养基中，直至桑黄在培养基中的浓度为4～8g/L。
在本发明提供的一个具体的实施例中，所述桑黄提取物通过以下制备方法得到：将桑枝干燥后切片，粉碎，加入水浸泡，煮沸，过滤收集滤液，重复提取多次合并滤液用纱布过滤，得所需水提物。
添加桑枝提取物提高菌丝体得率和生物活性，添加麸皮可延迟菌丝体老化，提高菌丝体得率。另外将菌丝体的生物活性作为桑黄的指标。当添加桑枝水提物时，菌丝体生物量可达3.5％。所以本发明具有菌丝体生物量高、生物活性高、质量可控、已经用于中试生产等优点
本发明还提供一种包含桑枝水提物桑黄发酵培养基，在本发明一个具体的实施方式中，该培养基按重量份比包括以下组份：葡萄糖10-15份，蔗糖15-20份，玉米粉15-25份，豆粕10-20份，酵母粉0-10份、麸皮粉5-10份、MgSO4·7H2O 0.25-1份、CaCl2 2份、VB1 0.1-0.5份，桑枝水提物的浓度为4-8份。
本发明提供的发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖10-15，蔗糖15-20，玉米粉15-25，豆粕10-20，酵母粉0-10、麸皮粉5-10、MgSO4·7H2O 0.25-1、CaCl2 2、VB1 0.1-0.5，桑枝水提物的浓度为4-8g/L。利用此培养基摇床发酵工艺参数：接种量5-15％；培养温度24-30℃，摇床转速140-180rpm。利用本发明的培养基配方和工艺参数，可以大大提高桑黄菌丝体生物量及生物活性，菌丝体生物量最高可达3.0％，其他生物活性指标分别为：腺苷0.26％、多糖2.24％、麦角甾醇0.37％、甘露醇12.45％。
具体实施方式
实施例1碳源筛选
1.1培养基
摇瓶种子培养基：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO42g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
碳源筛选基础培养基：蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
1.2试验方法
一级液体菌种培养：在500mL三角瓶中装150mL摇瓶种子培养基，取培养好的斜面母种接入三角瓶，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min培养7-10d,，即得一级液体菌种。
二级液体菌种培养：在500mL三角瓶中装150mL摇瓶种子培养基，吸取一级液体菌种，接种量15-30％。置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养2-3d。
摇瓶发酵培养：取培养好的二级液体菌种，按照接种量为10％，分别接种于5种不同碳源培养基(即在碳源筛选基础培养基中分别添加蔗糖、葡萄糖、乳糖、玉米粉、麦芽糖，添加量为20-30g/L)，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养7-10d，3次平行试验，分析不同碳源对桑黄菌丝体生长的影响，获得两种最佳碳源。
1.3碳源筛选实验结果
实验选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米粉和麦芽糖作为不同碳源添加，培养成熟后测定菌丝体中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量，参见表1.3。
表1.3不同碳源培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
核苷酸：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中腺苷、鸟苷和尿苷的含量与其他碳源相比显著性增加，其中腺苷分别比葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖增加了50.0％、39.5％、67.9％和52.4％；鸟苷分别增加了55.9％、89.4％、55.4％和76.4％；尿苷分别增加了33.0％、24.0％、52.8％和42.6％。
麦角甾醇：以玉米作为碳源培养的菌丝体中含量明显高于乳糖和麦芽糖，分别提高了14.5％和15.6％，而与葡萄糖、蔗糖相比则差异不明显，其中比蔗糖增加了1.28％，但比葡萄糖却下降了8.67％。
甘露醇：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中甘露醇的含量明显高于以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖作为碳源培养基，分别增加了15.2％、11.4％、16.9％和20.7％。
多糖：以麦芽糖作为碳源培养中多糖含量最高，分别比葡萄糖、蔗糖、乳糖和玉米粉增加了65.1％、57.7％、46.5％和46.4％；而以玉米粉作为碳源培养中多糖含量与葡萄糖、蔗糖相比增加明显，分别增加了34.9％和21.2％，与乳糖相比没有显著性差异。
总氮：以玉米粉作为碳源培养的菌粉中总氮含量与葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖培养基相比有明显增加趋势，分别增加了18.0％、15.2％、24.5％和23.3％。
根据以上数据分析，以玉米粉作为碳源培养的菌粉中核苷、甘露醇的含量与葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖相比有明显优势，而对于麦角甾醇的含量玉米粉培养基优势不显著但仍有增加的趋势；以麦芽糖作为碳源培养的中多糖的菌粉含量优势显著，明显高于其他碳源培养基。
实施例2氮源筛选
2.1培养基
摇瓶种子培养基：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO42g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
氮源筛选基础培养基：葡萄糖15-25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，VB10.1g/L，PH 6.0。
2.2试验方法
一级液体菌种与二级液体菌种培养方法与2.1一样。摇瓶发酵培养：取培养好的二级液体菌种，按照接种量为10％，分别接种于6种不同氮源培养基(即在氮源筛选基础培养基中分别添加豆粕、蛋白胨、酵母粉、尿素、牛肉膏和麸皮，添加量为10-25g/L)，置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min，培养7-10d，3次平行试验，分析不同碳源对桑黄菌丝体生长的影响，获得两种最佳氮源。
2.3氮源筛选实验结果
2.3.1相同培养时间下的氮源筛选实验结果
实验选取豆粕、蛋白胨、酵母粉、尿素、牛肉膏和麸皮六种作为不同氮源添加，培养相同时间后测定菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量(表2.3.1)。
表2.3.1氮源一次筛选培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
注：“/”表示生物量太少无法测定
根据表可以看出，以蛋白胨、尿素和牛肉膏作为氮源的培养基中与豆粕、酵母粉和麸皮相比，菌株长势明显受到抑制甚至停止生长，得率显著性降低。
麦角甾醇：以豆粕作为氮源培养的菌粉中腺苷和麦角甾醇的含量要明显高于酵母粉和麸皮，其中腺苷分别增加了12.9％和40.6％；麦角甾醇分别增加了27.3％和44.5％。
甘露醇：以麸皮为氮源培养的菌粉中甘露醇的含量明显高于其他两种氮源，分别比豆粕以及酵母粉高出12.1％和17.5％。
总氮：以豆粕为氮源的菌粉中总氮含量最高，分别比酵母粉以及麸皮增加了16.4％和61.7％；而以酵母粉为氮源的菌粉中多糖含量与其他两个氮源相比，显著性增加，分别比豆粕以及麸皮增加了45.5％和15.0％。
2.3.2相同成熟度下的氮源筛选实验结果
根据2.3.1实验，发现不同氮源培养基下菌株生长成熟度相差很大，因此设定以菌株培养成熟度为发酵终点来进行第二次氮源筛选实验。实验选取豆粕、、酵母粉和麸皮三种作为不同氮源添加，培养成熟后测定菌株中核苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖以及总氮的百分含量(表2.3.2)
表2.3.2氮源二次筛选培养下菌粉中各项生物指标的百分含量
以豆粕为氮源的菌粉中腺苷和麦角甾醇与其他两种相比显著性增加，其中腺苷分别比酵母粉、麸皮增加了27.1％、64.8％；麦角甾醇分别增加了19.0％、56.0％。
以豆粕和酵母粉为氮源培养的菌粉中总氮含量明显高于麸皮，分别增加了69.5％和70.6％，而豆粕与酵母粉则不显著；以酵母粉为氮源培养的菌粉中多糖含量最高，分别比豆粕和麸皮增加了41.9％和59.3％。
综上分析可知，以豆粕作为氮源培养的菌粉中腺苷、麦角甾醇和总氮含量最高，与其他氮源相比具有显著优势，而以酵母粉作为氮源培养的菌粉中多糖含量优势显著，明显高于其他氮源。甘露醇的含量并没有显示出任何趋势，每种氮源中含量相差不大。所以选取豆粕和酵母粉为复合氮源。
实施例3碳源最佳组合以及碳氮比的筛选
3.1正交实验
3.1.1实验方案
根据碳氮源筛选结果，实验选择玉米粉、蔗糖和葡萄糖三种碳源作为复合碳源，选择豆粕、酵母粉两种氮源作为复合氮源，应用SPSS软件设计正交试验，正交因素和水平见表3.1.1，5因素+4水平，确定碳氮源最佳组合和最佳配比。
表3.1.1正交试验因素及含量(g/L)
实验培养基的碳氮比按照上述配置，每组均需加入MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO41g/L，PH 6.0，置于26-32℃恒温摇床下，转速14-180r/min培养。
3.1.2实验结果
表3.1.2列举了碳氮比筛选培养下菌粉中各项生物指标含量(％)
表3.1.2
利用SPSS软件分析，确定出碳氮比最佳两组方案：
A组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖10-15g/L，玉米粉10-15g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0，
B组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖15-20g/L，玉米粉15-25g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0，
以上培养基在121℃灭菌30min，接种后置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min培养至发酵成熟，重复三次。
3.2正交实验验证
3.2.1实验方案
根据碳氮配比结果，实验选择A、B两组进行验证，三个平行，三次重复，选择出最佳方案。
3.2.2实验结果
表3.2.1碳氮比正交验证试验中菌粉中各项生物指标含量(％)
利用SPSS软件分析，A组和B组在多糖上有显著差异，B组显著高于A组，其他指标没有显著性差异，所以选择B组：葡萄糖10-15g/L，蔗糖15-20g/L，玉米粉15-25g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉10-15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，PH 6.0。
实施例4无机盐以及维生素微量元素的筛选
4.1正交试验
4.1.1实验方案
以实施例3得出来的碳氮最佳配比组合配制无机盐和维生素微量元素筛选液体培养基。维生素中添加MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L。采用L9(34)正交设计，确定无机盐和维生素种类，及其最优加入量，完善液体培养基的组分。加入的无机盐、维生素种类及其质量分别见表4.1和表4.2。
表4.1 L9(34)正交试验因素及含量(g/L)
表4.2 L9(34)正交试验因素及水平(g/L)
培养基在121℃灭菌30min，接种后置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180 r/min培养至发酵成熟，重复三次。
4.1.2实验结果
表4.5微量无机盐筛选培养下菌粉中各项生物指标含量(％)
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
1 0.188 5.218 0.216 12.917 2.957
2 0.247 1.991 0.272 12.735 3.237
3 0.244 1.547 0.287 13.134 3.343
4 0.236 1.716 0.278 12.888 3.423
5 0.184 4.814 0.198 13.067 2.463
6 0.237 1.528 0.288 13.037 3.297
7 0.220 1.721 0.311 12.515 3.020
8 0.222 1.641 0.280 12.895 3.537
9 0.201 3.733 0.192 12.164 2.820
利用SPSS软件分析，结果如下：
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
主次顺序 DBCA DBAC DBCA ACDB DCAB
优化组合 A1B3C2D3 A1B1C1D1 A3B3C3D2 A1B2C1D3 A1B3C1D3
其中CaCl2对得率影响显著，其他均没有显著性。根据因素影响主次顺序和所需生物指标，确定出无机盐最佳组合：KH2PO4 0g/L、MgSO4·7H2O0-1g/L、(NH4)3C6H5O7 0g/L、CaCl2 0-2g/L。将最佳组合进行实验验证，三个平行，三次重复，结果如下：
表4.6微量无机盐验证下菌粉中各项生物指标含量(％)
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
0.188 1.666 0.212 9.045 3.415
表4.7维生素筛选下菌粉中各项生物指标含量(％)
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
1 0.209 3.373 0.244 12.622 2.930
2 0.172 3.537 0.243 12.593 2.757
3 0.205 2.701 0.254 11.333 2.527
4 0.184 3.785 0.221 11.924 2.680
5 0.190 3.313 0.264 11.778 2.833
6 0.185 3.605 0.238 11.968 2.827
7 0.190 3.469 0.278 11.806 2.737
8 0.204 2.772 0.292 11.189 2.817
9 0.195 2.810 0.270 12.348 3.050
利用软件分析，结果如下：
其中VB1对麦角甾醇影响显著性高，其他均没有显著性。根据因素影响主次顺序和所需生物指标，得出维生素最佳组合：A3B1C1，即VB1 0-0.5g/L、VB6 0g/L、VC 0g/L。将最佳组合进行实验验证，三个平行，三次重复，结果如下：
表4.8维生素验证下菌粉中各项生物指标含量(％)
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
0.23 1.78 0.29 10.77 2.56
实施例5不同比例的麸皮粉和酵母粉对桑黄液体发酵的影响
5.1实验方法
在酵母粉筛选试验中发现，添加麸皮粉能抑制菌丝的老化，使其继续生长，因此设定实验，比较不同麸皮粉和酵母粉的添加量(二者添加量为0-15g/L)对桑黄液体发酵的影响。此实验以碳氮最佳配比组合为基础培养基，再添加不同比例的麸皮粉：酵母粉＝0:1，1:0，1:1,1:2，2：1，培养基在121℃灭菌30min，接种后置于26-28℃恒温摇床下，转速140-160r/min培养至发酵成熟。每组三个平行，重复三次，最终确定适宜的组合。
5.2实验结果
表5.2不同比例的麸皮粉和酵母粉对桑黄各项生物指标含量(％)的影响
由结果可知，通过方差齐性检验，是满足条件的。得率、多糖、腺苷是有差别的。综合考虑各因素，选取最佳组合是麸皮5-10g/L、酵母粉0-10g/L。
实施例6不同浓度的桑枝水提物对桑黄的生物量影响
6.1实验方法
桑枝水提物制备：将桑枝干燥后切片，粉碎，加入一定量水浸泡0.5h，煮沸30min，过滤收集滤液，重复提取两次，合并两次滤液，用8层纱布过滤，得所需水提物。
培养基组分(g/L)：葡萄糖10-15g/L，蔗糖15-20g/L，玉米粉15-25g/L，豆粕10-20g/L，酵母粉0-10、麸皮粉5-10、MgSO4·7H2O 1、CaCl2 2、VB1 0.5，pH6.0,121℃灭菌30min。在此培养基的基础上添加了不同浓度桑枝水提物(0-10g/L)，接种后置于26-32℃恒温摇床下，转速140-180r/min培养至发酵成熟。每个浓度三个平行，重复三次，分析桑枝水提物对桑黄菌丝体生长的影响并确定最适浓度。
6.2实验结果
表6.1不同浓度的桑枝水提物对桑黄的各项生物指标(％)的影响
生物指标 腺苷 多糖 麦角甾醇 甘露醇 菌丝体得率
1 0.30 1.14 0.32 12.43 3.13
2 0.28 1.22 0.35 11.38 3.08
3 0.30 1.27 0.37 11.83 3.07
4 0.30 1.15 0.34 12.13 3.21
5 0.30 1.87 0.35 12.39 4.01
6 0.27 0.91 0.36 11.86 3.23
由结果可知，通过方差齐性检验，是满足条件的。另外，实验中发现，添加桑枝水提物的桑黄菌丝体衰老慢，但是由于摇瓶的营养物质是有限的，可能抑制了菌丝的继续生长，在此条件下，得率可能没有达到最大值了。不同浓度的菌丝的多糖和得率差别明显，所以选取二者最高的浓度4-8g/L。

Claims (6)

1.桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用。
2.根据权利要求1所述桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用，其中，所述桑黄提取物为桑黄水提物。
3.根据权利要求1或2所述桑枝提取物在延迟桑黄发酵菌丝体老化的应用，其中，所述应用方法为：将桑黄水提物添加至桑黄发酵培养基中，直至桑黄在培养基中的浓度为4～8g/L。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的桑枝提取物在桑黄发酵培养基中的应用，其中，所述桑黄提取物通过以下制备方法得到：将桑枝干燥后切片，粉碎，加入水浸泡，煮沸，过滤收集滤液，重复提取多次，合并滤液，用纱布过滤，得所需水提物。
5.一种桑黄发酵培养基，其特征在于：所述培养基包括桑枝提取物。
6.根据权利要求1所述的桑黄发酵培养基，其中，所述桑黄提取物为桑黄水提物，且桑黄在培养基中的浓度为4～8g/L。
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