CN106148216B - 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素a3的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7523，通过培养它制备米尔贝霉素A3的方法。本发明的链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7523于2014年9月16日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC NO.9672，命名为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。其在含有可同化碳源和氮源的营养培养基中，并在通氧的条件下通过发酵可生产米尔贝霉素A3。本发明提高了A3在发酵液中的含量，发酵单位大幅提高，具备很好的工业应用价值。

Description

一种链霉菌及其生产米尔贝霉素A3的方法
技术领域
本发明涉及一种新的链霉菌、通过发酵培养该菌生产米尔贝霉素A3的方法。
背景技术
米尔贝霉素是微生物天然产物农药，已有数据表明它是当今世界上最优良的杀螨剂之一。美国环保署认定其为低危险性杀虫剂，荷兰批准其为“GNO”(作物生产中的天然产物)。它属生态友好型农药，适用于有机农业病虫害的综合防治，在发达国家已成为一种受欢迎的杀虫杀螨剂。
米尔贝霉素是日本三共公司以二斑叶螨作为试虫，从微生物的发酵液中筛选出的具有抗虫活性的代谢产物(US3,950,360)。经过大量基础研究，1983年米尔贝霉素(milbemycin)A3和A4组分的混合物(A3：A4＝3：7)被用作杀螨剂，米尔贝霉素A3和A4结构如式I所示。1990年，1％的米尔贝霉素乳油(milbeknock)在日本作为杀螨剂用于茶叶、茄子。1993年，1％的米尔贝霉素乳油用作梨、桃、西瓜、草莓、茄子、花卉的杀虫剂也在日本登记。当前，米尔贝霉素已在日本、欧美等多个国家登记，并且作为安全、对环境友好的杀虫杀螨剂被美国环保局推荐使用。
由于米尔贝霉素发酵液组分复杂，分离难度较大，因此米尔贝霉素通常情况下是以A3和A4混合组分使用和申报，单一组分的生产与使用则鲜有报导。其最主要的原因在于从A3，A4比例相近的发酵液中单独分离出A3，A4单组分难度较大，影响最终收率。以A3为例，发酵液中A3的含量低于30％，欲获得A3单组分，则需要损失大量的A4。实现A3或者A4的单一组分生产，可进一步推动米尔贝霉素单组分在其他领域的应用。而得到单组分最有效的方法是获得成能够生产单一组分的新菌种。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能提高米尔贝霉素A3单位产量的微生物菌种，该菌种的特点在于其发酵液中米尔贝霉素A3组分的含量占米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4总含量的百分比大于70％，且米尔贝霉素A3的单位产量可以达到大于3000ug/ml，杂质含量低。
本发明的链霉菌HS7523的微生物菌种于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.9672，分类命名为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，并登记入册，证明存活。
本发明的链霉菌HS7523主要生物学特征为：ISP1，ISP2，ISP3菌落颜色白色，圆形，中间稍凸起，多皱，直径大小为中型(约6mm左右)，有少量孢子，基内菌丝发达，菌丝与培养基结合紧密，不易挑起。在ISP1，ISP2培养基上无色素产生，在ISP3上有米褐色色素产生。
本发明描述了链霉菌HS7523的形态学和分子水平上的特征，经过和已知米尔贝霉素生产菌进行形态学和分子水平的比较，可以认定链霉菌HS7523属吸水链霉菌。链霉菌HS7523与Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA同源性99％，与Streptomycesbingchenggensis BCW-1同源性99％。链霉菌HS7523菌株与其它米尔贝生产菌在形态上最大的差异在于其他菌种如Streptomyces sp.CGMCC 7677的菌落在生产平板上会分泌金黄泪珠体于菌落表面，且有色素产生。而链霉菌HS7523在同样的培养基上颜色灰白，表面无泪珠，无色素产生(见附图1)。
本发明还提供了一种采用链霉菌HS7523(CGMCC NO.9672)制备米尔贝霉素的方法。该方法包括采用链霉菌HS7523(CGMCC NO.9672)在含有可同化的碳、氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的过程。
优选的实施方案中，上述可同化的碳源优选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
优选的实施方案中，上述可同化的氮源优选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
优选的实施方案中，所述发酵培养的温度优选为20℃-40℃，更优优选25℃-35℃，培养基pH为6.0-8.0之间，优选7.0左右；培养时间为300-360小时；通氧量为0.5-1.0vvm。
所述发酵方式为液体深层发酵。
米尔贝霉素可以通过以下方法进行检测：
取发酵液0.5ml，加入4.5ml 75％乙醇，混合均匀，3000rpm、15分钟离心，取上层液进样。
HPLC柱：Zorbex RX-C8；150mm*4.6mm；5μm
紫外吸收波长：240nm
温度控制：摄氏22度
HPLC流动相条件：梯度洗脱
进样量：10μl
本发明采用的米尔贝霉素产生菌为链霉菌HS7523(CGMCC NO.9672)、链霉菌HS7523(CGMCC NO.9672)自发的突变株或通过常规的诱变得到的突变株。
本发明的主要优点在于：
1.本发明提供了一种生产米尔贝霉素的新菌链霉菌HS7523及其生产米尔贝霉素的方法。本发明菌链霉菌HS7523的特点在于其发酵液中米尔贝霉素A3的含量占米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4总含量的百分比大于70％，且米尔贝霉素A3的单位产量可以达到大于3000ug/ml，杂质含量低。
2.由于本发明所述的链霉菌HS7523通过发酵方法提高米尔贝霉素A3在发酵产物中的比例，降低了制备米尔贝霉素A3单一组分的难度，有利于降低生产成本和扩大米尔贝霉素A3单组分的应用范围。
3.提高了米尔贝霉素A3发酵单位。本发明所述的链霉菌HS7523生产米尔贝霉素A3的效价较原始菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677大幅提高，有利于实现产业化生产。
附图说明：
图1：本发明链霉菌HS7523菌株的菌落形态与链霉菌Streptomycesmilbemycinicus NO.CGMCC 7677对比图，其中A为链霉菌Streptomyces milbemycinicusNO.CGMCC 7677菌落形态，B为本发明链霉菌HS7523菌落形态。
图2：本发明链霉菌HS7523在实施例6的50L发酵罐中生产米尔贝霉素A3和A4的发酵曲线。
图3：本发明发明链霉菌HS7523在实施例6条件下产生的米尔贝霉素A3的HPLC图谱，米尔贝霉素A4的含量为1246mg/L，A3含量为3050mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为71％。
具体实施方式
实施例1：菌株来源
本发明链霉菌Streptomyces hygroscopicus HS7523系在米尔贝霉素产生菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677(见中国专利CN103789339A)的基础上，通过多轮的诱变选育(包括NTG，EMS，UV等诱变手段)得到的米尔贝霉素A3高产菌种。该菌种与原始菌种相比，其外观形态发生了较大的变化，属于形态突变株。
链霉菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677菌株在ISP3斜面培养基中28℃培养10-12天后，在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下，在磨口试管中磨碎菌丝体并悬浮于无菌水中，制得菌悬液，采用NTG(亚硝基胍)，EMS(甲基磺酸乙酯)，UV(紫外线)诱变处理，具体方法如下：
称取NTG晶体10mg，溶解在10ml无菌Tris缓冲液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml菌悬液，置于28℃培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。将处理过的菌悬液经适当稀释涂布于ISP3平板上。未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于ISP3平板作为对照。28℃培养10天后，检查菌落数，并计致死率。
取10-1或10-2梯度的单细胞菌悬液5ml-10ml到带一根回形针的平板内(直径9cm)，置UV诱箱内，置磁力搅拌器上，开盖于UV15W，30cm处照射数分钟(一般2-5分钟)，边照边搅拌，照后用黑布包好，然后用生理盐水(0.9％氯化钠溶液)稀释10-2—10-7，分别涂ISP3平板得诱变组。
吸取1ml EMS溶于2ml无水乙醇中，再加入22ml，pH7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液。取10-1或10-2梯度的单细胞菌悬液5ml到带一根回形针的平板内，加入5ml，4.0％EMS溶液，最后EMS溶液浓度为2.0％，置磁力搅拌器上，搅拌处理20分钟-60分钟。诱变平板内加入10ml5％的硫代硫酸钠即可中止反应，用生理盐水依次稀释10-2—10-7，涂ISP3平板得诱变组。
挑选经过多轮上述单个或组合诱变后的单菌落不少于10000株，进行摇瓶发酵，HPLC检测米尔贝霉素的产量。经过多轮诱变，筛选出突变菌株Streptomyceshygroscopicus HS7523。
实施例2：链霉菌HS7523菌种培养特征
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》中的有关内容进行实验。
采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、营养琼脂、YMS和查氏十种培养基，28℃培养7～10天后，观察菌丝体的颜色及色素情况(培养特征见表1)。
表1链霉菌HS7523在10种培养基上的培养特征
备注：表1中“/”为不产生色素。
实施例3：链霉菌HS7523生理生化试验
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》中的有关内容进行实验。除温度实验外，均为28℃培养7～10天。
1)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％。(结果见表2)
2)无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％。(结果见表2)
3)降解试验和NaCl耐受实验(结果见表7)采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度见表3。(结果见表3)
4)氧化酶和过氧化氢酶试验(结果见表4)、pH试验(结果见表5)和温度试验(结果见表6)均采用YMS培养基。
表2链霉菌HS7523菌株的碳源和氮源的利用情况
碳源 生长情况 碳源 生长情况 无机氮源 生长情况
D-葡萄糖 4 水杨苷 4 硫酸铵 +
D-棉子糖 4 D-乳糖 3 硝酸钾 -
D-木糖 0 半乳糖 4
D-山梨醇 2 肌醇 2
L-阿拉伯糖 0 甘露醇 3
甘油 4 甘氨酸 0
麦芽糖 4 木聚糖 4
D-果糖 1 菊粉 4
D-蔗糖 4 鼠李糖 2
表3链霉菌HS7523菌株的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果* 降解物 降解物浓度 结果
腺嘌呤 0.5％ 4，+ 酪蛋白 1.0％ 4，-
鸟嘌呤 0.5％ 4，- 酪氨酸 1.0％ 4，-
黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-40 1.0％ 2，+
木聚糖 0.4％ 4，- Tween-60 1.0％ 3，+
次黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-80 1.0％ 4，+
表4链霉菌HS7523菌株主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 + 牛奶胨化 - 纤维素利用 -
淀粉水解 + 硝酸盐还原 + 过氧化氢酶 -
牛奶凝固 - 硫化氢产生 -
V.P实验 - M.R实验 -
表5链霉菌HS7523菌株生长的pH试验
pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
生长情况 0 0 4 4 4 4 4 4 4
表6链霉菌HS7523菌株生长的温度试验
温度(℃) 7 14 28 37 45
生长情况 0 3 3 2 0
表7链霉菌HS7523菌株对NaCl的耐受性
NaCl浓度 1％ 4％ 7％ 10％
菌株生长情况 3 0 0 0
备注：表2-7中：0：无生长；1：生长很弱；2：能生长，有少量孢子；3：生长良好，有大量孢子；4：生长最好，有丰富孢子；+：阳性；-：阴性。
实施例4：16S rDNA序列分析及与已知的米尔贝霉素产生菌的比较
收集在ISP2上生长好的本发明菌丝体，接于含玻璃珠的TSB液体培养基中，置于28℃的培养箱中，250r/min震荡培养2-4d。离心收集菌丝体，用无菌水洗涤2次后保存于4℃备用。
(1)菌丝体1000rpm离心1min。
(2)加终浓度为3-4mg/ml的溶菌酶溶液(菌丝体体积:溶菌酶溶液体积＝1:5-10)，37℃水浴1-3hr。
(3)加50-100ug/ml蛋白酶K及1％SDS，37℃水浴0.5-3h。
(4)加等体积的中性酚/氯仿，振荡30sec，12000rpm离心5min。
(5)上清加1/10体积的3M NaAc溶液和等体积的异丙醇，混匀。室温放置5min，12000rpm离心5min。
(6)沉淀用70％乙醇洗涤2遍，干燥后溶于TE/RNase。
(7)将提取的基因组作为模板，采用通用引物进行PCR扩增。
上游引物27F为5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物1495R为5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
反应在PCR扩增仪上进行。其程序是：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸90s，进行30个循环，72℃延伸10min。反应体系如下：
用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物进行纯化。扩增产物经凝胶电泳回收，并连接到T载体后进行测序，获得了该菌株16S rDNA一级结构的序列。通过在Genebank数据库中进行相似性搜索(blast)，结果显示与Streptomyces sp.NRRL 573916s rRNA同源性99％，与Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.5％，结果见表8。
表8链霉菌HS7523和相关菌株的同源性
链霉菌HS7523与已知的米尔贝霉素产生菌的比较
据US3950360报道，米尔贝霉素产生菌Streptomyces NRRL NO.5739在ISP2培养基上气生菌丝灰色，背面黄褐色，菌落表面有许多黄色泪珠，有黄色色素产生；在ISP4培养基上气生菌丝灰色，背面土黄，菌落表面也有许多黄色泪珠，有明亮的橄榄绿会色素产生，能够利用阿拉伯糖和木糖。而本发明链霉菌HS7523在SP2培养基上气生菌丝白色，背面米色，菌落表面无泪珠，无色素产生；在ISP4培养基上气生菌丝白色，背面象牙色，菌落表面无泪珠，无色素产生，不能利用阿拉伯糖和木糖。
据CN101100651A报道，米尔贝霉素产生菌冰城链霉菌(streptomycesbingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734在高氏一号培养基上菌落表面灰色(有黑色吸水斑)，菌落背面黄灰色，有黄褐色色素产生。而本发明链霉菌HS7523在高氏一号培养基上菌落表面中间白，周围电视灰4，菌落背面电视灰4，无色素产生。
综上所述，本发明链霉菌HS7523属于链霉菌属，但它不同于已知的米尔贝霉素产生菌Streptomyces NRRL NO.5739，菌冰城链霉菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734，链霉菌HS7523是一株全新的菌种。
实施例5：制备米尔贝霉素A3
(1)斜面菌丝体的制备与培养
斜面孢子培养基配方(g/L)：酵母抽提物2，麦芽抽提物2，蔗糖8，脱脂奶粉1，琼脂20，消前pH 7.0-7.2，试管30×200mm，装量20mL，经121℃灭菌20分钟后，冷却到50-60℃摆斜面，接入一环菌丝体经28±1℃培养10天后，菌丝成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：酵母抽提物5，蛋白胨5，蔗糖20，脱脂奶粉2，磷酸氢二钾0.5，消前pH7.0-7.2，摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL，经121℃灭菌20分钟。菌体接种量为105-106c.f.u./mL，培养温度28±1℃，250rpm，摇床振荡培养48小时。
(3)米尔贝霉素A3发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：酵母抽提物5，蔗糖120，脱脂奶粉10，黄豆饼粉10，棉籽饼粉14，磷酸氢二钾1，七水硫酸亚铁0.1，硫酸锌0.02，碳酸钙5，硫酸铜0.05，钼酸钠0.5，摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL，经121℃灭菌20分钟。将种子液以10％(体积百分比)的接种量接入，在28±1℃，250rpm摇床振荡培养14天，发酵结束后，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的含量为1206mg/L，A3含量为3100mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为72％。
实施例6：制备米尔贝霉素A3
(1)种子罐种子液的制备
在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5，同时添加0.25％的泡敌作消泡剂)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下30分钟，待冷却后，接入200ml摇瓶种子液，培养温度28±1℃，搅拌转速150rpm，通气量1vvm，培养48小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例5相同，但要添加0.25％泡敌作为消泡剂，发酵罐50L，投料体积为35L，消前pH7.2-7.6，于121℃下蒸汽灭菌25分钟，冷却后，接入约3.5L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌桨转速底限150rpm，与溶氧关联，溶氧不低于35％。通气量为0.6vvm，发酵培养14天，放罐，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的含量为1246mg/L，A3含量为3050mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为71％。
实施例7：制备米尔贝霉素A3
(1)种子罐种子液的制备
在15T种子罐中投入8T的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5，同时添加0.25％的泡敌作消泡剂)，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下35分钟，消后体积10T，待冷却后，接入2L摇瓶种子液，培养温度28±1℃，搅拌转速100rpm，通气量0.8vvm，培养48小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例5相同，但要添加0.3％泡敌作为消泡剂，发酵罐70T，投料体积为55T，消前pH7.2-7.6，于121℃下蒸汽灭菌35分钟，冷却后，接入约6T种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌桨转速底限50rpm，与溶氧关联，溶氧不低于35％。通气量为0.5vvm，发酵培养14天，放罐，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的含量为1413mg/L，A3含量为3300mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为70％。
实施例8：制备米尔贝霉素A3
种子培养基配方(g/L)：酵母膏10，蛋白胨5，蔗糖40，脱脂奶粉2，磷酸氢二钾0.5，消前pH7.0-7.2。摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL，经121℃灭菌20分钟。从实施例5中的斜面上挖取1×2cm面积的菌块接入种子瓶中，28±1℃下培养45hr。取上述种子培养液2.5mL接入发酵培养基(g/L)：酵母膏10，糖蜜200，脱脂奶粉11，黄豆饼粉11，棉籽饼粉11，磷酸氢二钾1，七水硫酸亚铁0.1，硫酸锌0.02，碳酸钙5，硫酸铜0.05，钼酸钠0.5，摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL，经121℃灭菌20分钟，在28±1℃，250rpm摇床振荡培养14天，发酵结束后，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的含量为1054mg/L，A3含量为3000mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为74％。
实施例9：制备米尔贝霉素A3
种子液的制备与培养同实施例8，取2.5mL种子液接入发酵培养基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖140，玉米浆10，黄豆饼粉10，麸质粉15，磷酸氢二钾1，七水硫酸亚铁0.1，硫酸锌0.02，碳酸钙5，硫酸铜0.05，钼酸钠0.5，摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL，经121℃灭菌20分钟，在28±1℃，250rpm摇床振荡培养14天，发酵结束后，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的含量为1146mg/L，A3含量为3100mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为73％。对比实施例1：本发明链霉菌HS7523与原始菌CGMCC 7677生产米尔贝霉素的对比实验
(1)斜面，种子，发酵培养基组成和培养条件同实施例5，菌种采用原始菌CGMCC7677，进行五组平行发酵培养，发酵结束后，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的平均含量为748mg/L，A3的平均含量为251mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比25％。
(2)斜面，种子，发酵培养基组成和培养条件同实施例5，菌种采用本发明链霉菌HS7523，进行五组平行发酵培养，发酵结束后，发酵液经HPLC测定，测得米尔贝霉素A4的平均含量为1114mg/L，A3的平均含量为3012mg/L，米尔贝霉素A3的含量占A3和A4总含量的百分比为73％。

Claims (7)

1.一种链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7523，其保藏编号为CGMCC NO.9672且具有生产米尔贝霉素A3的能力。
2.根据权利要求1所述的链霉菌HS7523，在生产米尔贝霉素A3中的应用。
3.一种发酵生产米尔贝霉素A3的方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的链霉菌HS7523在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨、脱脂奶粉、全脂奶粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白胨为胰蛋白胨。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为20℃-40℃，培养基pH为6.0-8.0，培养时间为300-360小时。
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