CN106148215B - 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素a4的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7522,通过培养它制备米尔贝霉素A4的方法。本发明的链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7522于2014年9月16日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏登记号为CGMCC NO.9671,命名为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。其在含有可同化碳源和氮源的营养培养基中,并在通氧的条件下通过发酵可生产米尔贝霉素A4。本发明提高了A4在发酵液中的含量,发酵单位大幅提高,具备很好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的链霉菌、通过发酵培养该菌生产米尔贝霉素A4的方法。
背景技术
米尔贝霉素是微生物天然产物农药,已有数据表明它是当今世界上最优良的杀螨剂之一。美国环保署认定其为低危险性杀虫剂,荷兰批准其为“GNO”(作物生产中的天然产物)。它属生态友好型农药,适用于有机农业病虫害的综合防治,在发达国家已成为一种受欢迎的杀虫杀螨剂。
米尔贝霉素是日本三共公司以二斑叶螨作为试虫,从微生物的发酵液中筛选出的具有抗虫活性的代谢产物(US3,950,360)。经过大量基础研究,1983年米尔贝霉素(milbemycin)A3和A4组分的混合物(A3:A4=3:7)被用作杀螨剂,米尔贝霉素A3和A4结构如式I所示。1990年,1%的米尔贝霉素乳油(milbeknock)在日本作为杀螨剂用于茶叶、茄子。1993年,1%的米尔贝霉素乳油用作梨、桃、西瓜、草莓、茄子、花卉的杀虫剂也在日本登记。当前,米尔贝霉素已在日本、欧美等多个国家登记,并且作为安全、对环境友好的杀虫杀螨剂被美国环保局推荐使用。
日本三共公司是米尔贝霉素的原研厂,其1980年发表的文献中表明米尔贝霉素A3+A4的含量仅仅只有150mg/L左右(Yo Takiguchi et al,The J.of Antibiotics,1980,OCT,1120-1127)。后经过菌种诱变和发酵条件优化,1990年米尔贝霉素A3+A4的含量达到530mg/L(Koicchi Nonaka et al,Actinomycetol.1990,13:32-41)。国内米尔贝霉素研发启动较晚,主要集中在东北农业大学项文胜课题组,目前也取得了较大的突破,如在2011年发表的文献中米尔贝霉素A3+A4的单位含量最高达到了1595mg/L(Zhang Baoxin et al,African J Biotechnol10(37):7225-7235),在中国专利CN 103468625 A中米尔贝霉素A3+A4的单位含量提高至2237mg/L。
米尔贝霉素发酵液组分复杂,米尔贝霉素A3,A4为主要成分,另外还含有其他结构类似物。通常情况下米尔贝霉素发酵液中米尔贝霉素A3和A4的比例大约为1:2,因此现有的商业化产品也是A3,A4的混合组分。导致这一结果最主要的原因在于要从A3,A4比例相近的发酵液中单独分离出A3,A4单组分难度较大,影响最终收率。实现A4的单一组分生产,可进一步推动米尔贝霉素A4单组分在其他领域的应用。而得到单组分最有效的方法是获得能够生产单一组分的新菌种,并进一步提高发酵单位。
发明内容
鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种能提高米尔贝霉素A4单位产量的微生物菌种,该菌种的特点在于其发酵液中米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比大于80%,且米尔贝霉素A4的单位产量可以达到大于4000ug/ml,米尔贝霉素A3+A4的单位产量可以达到大于5000ug/ml,发酵单位高,杂质含量低。
本发明的链霉菌HS7522的微生物菌种于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,中国科学院微生物研究所),保藏号为CGMCC NO.9671,分类命名为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus),并登记入册,证明存活。
本发明的链霉菌HS7522主要生物学特征为:ISP1上菌落颜色白色,ISP2上菌落卵石灰,ISP3上亮象牙色,圆形,中间稍凸起,多皱,直径大小为中型(约6mm左右),除ISP1外,孢子量丰富,基内菌丝发达,菌丝与培养基结合紧密,不易挑起。在ISP1,ISP2培养基上无色素产生,在ISP3上有土黄灰色色素产生。
本发明描述了链霉菌HS7522的形态学和分子水平上的特征,经过和已知米尔贝霉素生产菌进行形态学和分子水平的比较,可以认定链霉菌HS7522属吸水链霉菌。链霉菌HS7522与Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA同源性99.5%,与Streptomycesbingchenggensis BCW-1同源性99.9%。本菌株与多数米尔贝生产菌在形态上最大的差异在于其他菌种如Streptomyces sp.CGMCC 7677的菌落在生产平板上会分泌金黄泪珠体于菌落表面。而HS7522在同样的培养基上颜色鼠灰,表面无泪珠(见附图1)。
本发明的还提供了一种采用链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)制备米尔贝霉素的方法。该方法包括采用链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)在含有可同化的碳、氮源的营养培养基里,进行有氧发酵的过程。
优选的实施方案中,上述可同化的碳源优选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
优选的实施方案中,上述可同化的氮源优选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、脱脂奶粉,全脂奶粉,黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
优选的实施方案中,所述发酵培养的温度优选为20℃-40℃,优选25℃-35℃,培养基pH为6.0-8.0,优选7.0左右;培养时间为300-360小时;通氧量为0.5-1.0vvm。
所述发酵方式为液体深层发酵。
米尔贝霉素可以通过以下方法进行检测:
取发酵液0.5ml,加入4.5ml 75%乙醇,混合均匀,3000rpm、15分钟离心,取上层液进样。
HPLC柱:Zorbex RX-C8;150mm*4.6mm;5μm
紫外吸收波长:240nm
温度控制:摄氏22度
HPLC流动相条件:梯度洗脱
进样量:10μl
本发明采用的米尔贝霉素产生菌为链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)、链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)自发的突变株或通过常规的诱变得到的突变株。
本发明的主要优点在于:
1.本发明提供了一种生产米尔贝霉素的新菌链霉菌HS7522及其生产米尔贝霉素的方法。本发明链霉菌HS7522的特点在于其发酵液中米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比大于80%,且米尔贝霉素A4的单位产量可以达到大于4000ug/ml,米尔贝霉素A3+A4的单位产量可以达到大于5000ug/ml,发酵单位高,杂质含量低。
2.由于本发明所述的链霉菌HS7522通过发酵方法提高米尔贝霉素A4在发酵产物中的比例,降低了制备米尔贝霉素A4单一组分的难度,有利于降低生产成本和扩大米尔贝霉素A4单组分的应用范围。
3.提高了米尔贝霉素A4发酵单位。本发明所述的链霉菌HS7522生产米尔贝霉素A4的效价较原始菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677大幅提高,有利于实现产业化生产。
附图说明:
图1:本发明链霉菌HS7522菌株的菌落形态与链霉菌Streptomycesmilbemycinicus NO.CGMCC 7677对比图,其中B为链霉菌Streptomyces milbemycinicusNO.CGMCC 7677菌落形态,A为本发明链霉菌HS7522菌落形态。
图2:本发明链霉菌HS7522在实施例6的50L发酵罐中生产米尔贝霉素A3和A4的发酵曲线。
图3:本发明链霉菌HS7522在实施例6条件下产生的米尔贝霉素A4的HPLC图谱,米尔贝霉素A4含量为4100mg/L,A3含量962mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为81%。
具体实施方式
实施例1:菌株来源
本发明链霉菌Streptomyces hygroscopicus HS7522系在米尔贝霉素产生菌种Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677(见中国专利CN103789339A)的基础上,通过多轮的诱变选育(包括NTG,EMS,UV等诱变手段)得到的米尔贝霉素A4高比例菌种。该菌种与原始菌种相比,其外观形态发生了较大的变化,属于形态突变株。
链霉菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677菌株在ISP3斜面培养基中28℃培养10-12天后,在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下,在磨口试管中磨碎菌丝体并悬浮于无菌水中,制得菌悬液,采用NTG(亚硝基胍),EMS(甲基磺酸乙酯),UV(紫外线)诱变处理。
称取NTG晶体10mg,溶解在10ml无菌Tris缓冲液(pH8.0)中,再用移液管加入1ml菌悬液,置于28℃培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。将处理过的菌悬液经适当稀释涂布于ISP3平板上。未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于ISP3平板作为对照。28℃培养10天后,检查菌落数,并计致死率。
取10-1或10-2梯度的单细胞菌悬液5ml-10ml到带一根回形针的平板内(直径9cm),置UV诱箱内,置磁力搅拌器上,开盖于UV15W,30cm处照射数分钟(一般2-5分钟),边照边搅拌,照后用黑布包好.然后用生理盐水(0.9%氯化钠溶液)稀释10-2—10-7,分别涂ISP3平板得诱变组。
吸取1ml EMS溶于2ml无水乙醇中,再加入22ml,pH7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液。取10-1或10-2梯度的单细胞菌悬液5ml到带一根回形针的平板内,加入5ml,4.0%EMS溶液,最后EMS溶液浓度为2.0%,置磁力搅拌器上,搅拌处理20分钟至60分钟。诱变平板内加入10ml5%的硫代硫酸钠即可中止反应,用生理盐水依次稀释10-2—10-7,涂ISP3平板得诱变组。
挑选经过多轮上述单个或组合诱变后的单菌落不少于10000株,进行摇瓶发酵,HPLC检测米尔贝霉素的产量。经过多轮诱变,筛选出突变菌株Streptomyceshygroscopicus HS7522。
实施例2:链霉菌HS7522菌种培养特征
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》中的有关内容进行实验。
采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、营养琼脂、YMS和查氏十种培养基,28℃培养7~10天后,观察菌丝体的颜色及色素情况(培养特征见表1)。
表1 链霉菌HS7522在10种培养基上的培养特征
备注:表1中“/”为不产生色素。
实施例3:生理生化试验
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》中的有关内容进行实验。除温度实验外,均为28℃培养7~10天。
1)碳源的利用:采用ISP9作为基础培养基,各种碳源的终浓度均为1.0%。(结果见表2)
2)无机氮源的利用:采用ISP9作为基础培养基,硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1%。(结果见表2)
3)降解试验和NaCl耐受实验(结果见表7)采用基础培养基为GYEA(pH6.8),各种降解物的浓度见表3。(结果见表3)
4)氧化酶和过氧化氢酶试验(结果见表4)、pH试验(结果见表5)和温度试验(结果见表6)均采用YMS培养基。
表2 链霉菌HS7522菌株的碳源和氮源的利用情况
表3 链霉菌HS7522菌株的降解试验结果
表4 链霉菌HS7522菌株主要的生理生化特征
表5 链霉菌HS7522菌株生长的pH试验
表6 链霉菌HS7522菌株生长的温度试验
表7 链霉菌HS7522菌株对NaCl的耐受性
备注:表2-7中,0:无生长;1:生长很弱;2:能生长,有少量孢子;3:生长良好,有大量孢子;4:生长最好,有丰富孢子;+:阳性;-:阴性。
实施例4:16S rDNA序列分析
收集在ISP2上生长好的本发明菌丝体,接于含玻璃珠的TSB液体培养基中,置于28℃的培养箱中,250r/min震荡培养2-4d。离心收集菌丝体,用无菌水洗涤2次后保存于4℃备用。
(1)菌丝体1000rpm离心1min。
(2)加终浓度为3-4mg/ml的溶菌酶溶液(菌丝体体积:溶菌酶溶液体积=1:5-10),37℃水浴1-3hr。
(3)加50-100ug/ml蛋白酶K及1%SDS,37℃水浴0.5-3h。
(4)加等体积的中性酚/氯仿,振荡30sec,12000rpm离心5min。
(5)上清加1/10体积的3M NaAc溶液和等体积的异丙醇,混匀。室温放置5min,12000rpm离心5min。
(6)沉淀用70%乙醇洗涤2遍,干燥后溶于TE/RNase。
(7)将提取的基因组作为模板,采用通用引物进行PCR扩增。
上游引物27F为5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物1495R为5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
反应在PCR扩增仪上进行。其程序是:95℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性45s,72℃延伸90s,进行30个循环,72℃延伸10min。反应体系如下:
用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物进行纯化。扩增产物经凝胶电泳回收,并连接到T载体后进行测序,获得了该菌株16S rDNA一级结构的序列。通过在Genebank数据库中进行相似性搜索(blast),结果显示与Streptomyces sp.NRRL573916s rRNA同源性99.5%,与Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.9%。
表8 链霉菌HS7522和相关菌株的同源性
链霉菌HS7522与已知的米尔贝霉素产生菌的比较
据CN101100651A报道,米尔贝霉素产生菌冰城链霉菌(streptomycesbingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734在高氏一号培养基上菌落表面灰色(有黑色吸水斑),菌落背面黄灰色,有黄褐色色素产生。而本发明链霉菌HS7522在高氏一号培养基上菌落表面白色,菌落背面米褐色,无色素产生。
据US3950360报道,米尔贝霉素产生菌Streptomyces NRRL NO.5739在ISP2培养基上气生菌丝灰色,背面黄褐色,菌落表面有许多黄色泪珠,有黄色色素产生;在ISP4培养基上气生菌丝灰色,背面土黄,菌落表面也有许多黄色泪珠,有明亮的橄榄绿会色素产生,能够利用阿拉伯糖和木糖。而本发明链霉菌HS7522在SP2培养基上气生菌丝卵石灰,背面米红色,菌落表面无泪珠,无色素产生;在ISP4培养基上气生菌丝象牙色,背面象牙色,菌落表面无泪珠,无色素产生,不能利用阿拉伯糖和木糖。
综上所述,本发明链霉菌HS7522属于链霉菌属,但它不同于已知的米尔贝霉素产生菌Streptomyces NRRL NO.5739,菌冰城链霉菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734,链霉菌HS7522是一株全新的菌种。
实施例5:制备米尔贝霉素A4
(1)斜面菌丝体的制备与培养
斜面孢子培养基配方(g/L):酵母抽提物2,麦芽抽提物2,蔗糖10,脱脂奶粉1.2,琼脂20,消前pH 7.0-7.2,试管30×200mm,装量20mL,经121℃灭菌20分钟后,冷却到50-60℃摆斜面,接入一环菌丝体经28±1℃培养10天后,菌丝成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L):酵母抽提物5,蛋白胨5,蔗糖20,脱脂奶粉3,磷酸氢二钾0.8,消前pH6.8-7.2,摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL,经121℃灭菌20分钟。菌体接种量为105-106c.f.u./mL,培养温度28±1℃,250rpm,摇床振荡培养48小时。
(3)米尔贝霉素A4发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L):酵母抽提物5,蔗糖100,脱脂奶粉11,黄豆饼粉10,棉籽饼粉14,磷酸氢二钾1,七水硫酸亚铁0.1,硫酸锌0.02,碳酸钙5,硫酸铜0.05,钼酸钠0.5,摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL,经121℃灭菌20分钟。将种子液以10%(体积百分比)的接种量接入,在28±1℃,250rpm摇床振荡培养14天,发酵结束后,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4含量为3900mg/L,A3含量为967mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为80.1%。实施例6:制备米尔贝霉素A4
(1)种子罐种子液的制备
在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5,同时添加0.25%的泡敌作消泡剂),灭菌采用蒸汽灭菌,121℃条件下30分钟,待冷却后,接入200ml摇瓶种子液,培养温度28±1℃,搅拌转速150rpm,通气量1vvm,培养48小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例5相同,但要添加0.25%泡敌作为消泡剂,发酵罐50L,投料体积为35L,消前pH7.0-7.6,于121℃下蒸汽灭菌25分钟,冷却后,接入约3.5L种子罐培养液,发酵温度28±1℃,搅拌桨转速底限150rpm,与溶氧关联,溶氧不低于35%。通气量为0.6vvm,发酵培养14天,放罐,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4含量为4100mg/L,A3含量为962mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为81%。
实施例7:制备米尔贝霉素A4
(1)种子罐种子液的制备
在15T种子罐中投入8T的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5,同时添加0.25%的泡敌作消泡剂),灭菌采用蒸汽灭菌,121℃条件下35分钟,消后体积10T,待冷却后,接入2L摇瓶种子液,培养温度28±1℃,搅拌转速100rpm,通气量0.8vvm,培养48小时。
(2)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基的配方与前述实施例5相同,但要添加0.3%泡敌作为消泡剂,发酵罐70T,投料体积为55T,消前pH6.8-7.6,于121℃下蒸汽灭菌35分钟,冷却后,接入约6T种子罐培养液,发酵温度28±1℃,搅拌桨转速底限50rpm,与溶氧关联,溶氧不低于35%。通气量为0.5vvm,发酵培养14天,放罐,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4含量为4020mg/L,A3含量为961mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为80.7%。
实施例8:制备米尔贝霉素A4
种子培养基配方(g/L):酵母浸粉5,蛋白胨5,蔗糖40,磷酸氢二钾0.5,消前pH7.0-7.4。摇瓶装液量为250mL三角瓶装25mL,经121℃灭菌20分钟。从实施例5中的斜面上挖取1×2cm面积的菌块接入种子瓶中,28±1℃下培养45hr。取上述种子培养液2.5mL接入发酵培养基:酵母膏12,糖蜜200,脱脂奶粉11,黄豆饼粉11,棉籽饼粉11,磷酸氢二钾1,七水硫酸亚铁0.1,硫酸锌0.02,碳酸钙5,硫酸铜0.05,钼酸钠0.5,摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL,经121℃灭菌20分钟,在28±1℃,250rpm摇床振荡培养14天,发酵结束,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4的含量为3960mg/L,A3含量为929mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为81%。
实施例9:制备米尔贝霉素A4
种子液按实施例8进行,然后2.5mL种子液接入发酵培养基:蛋白胨10,蔗糖140,玉米浆10,黄豆饼粉10,麸质粉15,磷酸氢二钾1,七水硫酸亚铁0.1,硫酸锌0.02,碳酸钙5,硫酸铜0.05,钼酸钠0.5,摇瓶装液量为250mL三角瓶装30mL,经121℃灭菌20分钟,在28±1℃,250rpm摇床振荡培养14天,发酵结束后,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4的含量为4100mg/L,A3含量为900mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为82%。对比实施例1:本发明链霉菌HS7522与原始菌CGMCC 7677生产米尔贝霉素的对比实验
(1)斜面,种子,发酵培养基组成和培养条件同实施例5,菌种采用原始菌CGMCC7677,进行五组平行发酵培养,发酵结束后,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4的平均含量为729mg/L,A3的平均含量为297mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为71%。
(2)斜面,种子,发酵培养基组成和培养条件同实施例5,菌种采用本发明链霉菌HS7522,进行五组平行发酵培养,发酵结束后,发酵液经HPLC测定,测得米尔贝霉素A4的平均含量为4016mg/L,A3的平均含量为942mg/L,米尔贝霉素A4的含量占A3和A4总含量的百分比为81%。
Claims (7)
1.一种链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)HS7522,其保藏编号为CGMCC NO.9671且具有生产米尔贝霉素A4的能力。
2.根据权利要求1所述的链霉菌HS7522在生产米尔贝霉素A4中的应用。
3.一种发酵生产米尔贝霉素A4的方法,其特征在于:包括采用权利要求1所述的链霉菌HS7522在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里,进行有氧发酵的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物质的组合。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐之一或上述物质的组合。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述蛋白胨为胰蛋白胨。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述发酵培养的温度为20℃-40℃,培养基pH为6.0-8.0,培养时间为300-360小时。
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