CN111607547B - 一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用 - Google Patents

Abstract

一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用，属于基因工程技术领域。为了提高链霉菌次级代谢产物产量，本发明提供了一种碳源吸收系统，所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因，其中启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。将上述碳源吸收系统转化入链霉菌获得工程菌株进行发酵。能够有效提高糖吸收效率，降低糖残留，及提高目标产物产量和得率；上述碳源吸收系统的微调表达使其与宿主的代谢行为适配，对于提高次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。

Description

一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用。

背景技术

在链霉菌次级代谢产物工业发酵过程中，菌株对碳源底物利用率不高是一个共性问题。该问题严重影响了目标产物得率与单位发酵效价，进一步影响了产业化应用。链霉菌次级代谢产物生物合成在菌株生长稳定期大量合成，该阶段菌株初级代谢几乎停滞。特别是，链霉菌对碳源底物(主要为可溶性糖)的吸收速率在菌株进入稳定期后遍会出现急剧下降的现象。碳源是合成目标次级代谢产物的重要营养物质，宿主菌对碳源的摄入能力意味着下游生物转化可用材料的输入量多少。因此，链霉菌在生长稳定期对碳源的摄取能力对发酵过程中次级代谢产物的产量和效价有显著的影响。此外，增加链霉菌对发酵培养中碳源的摄入，也会减少发酵液中的碳源残留，降低下游产物分离、废水处理等过程的难度。因此，如何提高链霉菌菌株对碳源底物的吸收具有重要的研究价值。

发明内容

为了提高链霉菌次级代谢产物产量，本发明提供了一种碳源吸收系统，所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示，所述吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有上述碳源吸收系统的重组载体，优选地，所述重组载体的出发载体为pSET152。

本发明还提供了含有上述碳源吸收系统的重组菌，所述重组菌的出发菌株为以蔗糖和淀粉中的一种或两种为碳源的链霉菌(streptomyces)。

优选地，所述链霉菌为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)。

本发明还提供了上述碳源吸收系统在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

进一步地限定，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

本发明还提供了上述重组载体在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

进一步地限定，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

本发明还提供了上述重组菌在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

进一步地限定，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

有益效果

本发明提供了一种用于提高链霉素次级代谢产物的碳源吸收系统，经过基因工程改造构建制备重组菌，在发酵生产中，降低了发酵末期的糖残留，提高了米尔贝霉素，阿维菌素以及尼莫克丁产量。

附图说明

图1为微调糖吸收系统表达水平对米尔贝霉素效价的改善作用；a表示碳源吸收系统(TP2为目的基因)对米尔贝霉素A3/A4产量的影响，纵坐标为米尔贝霉素A3/A4产量；b表示碳源吸收系统(TP5为目的基因)对米尔贝霉素A3/A4产量的影响，纵坐标为米尔贝霉素A3/A4产量；c表示BC04和BC04TP5P2中葡萄糖消耗速率的比较(144-216h)，纵坐标为葡萄糖消耗速率；d表示BC04和BC04TP5P2中果糖消耗速率的比较(144-216h)，纵坐标为葡萄糖消耗速率；

图2为TP2和TP5在提高效价方面的普适性；a表示TP2和TP5对阿维菌素B_1a产量的影响，纵坐标为阿维菌素B_1a产量；b表示TP2和TP5对尼莫克丁产量的影响，纵坐标为尼莫克丁产量。

定义及缩写：

碳源吸收系统：特指由特定启动子控制的一个由三个基因组成的操纵子，这三个基因分别编码两个跨膜蛋白和一个底物识别蛋白。

微调：特指非组成型强启动子控制的基因过表达。

本发明所使用的出发菌株：

冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)为本实验室具有独立知识产权，能够生物合成商业化应用的米尔贝霉素A3/A4的工业化链霉菌BC04，该菌株记载在Zhang etal.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934-016-0552-1.

阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)，为阿维链霉菌NEAU1069，该菌株记载在Wang et al.Journal of Antibiotics(2011)64:591-594DOI 10.1038/ja.2011.48.

蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)，为蓝灰链霉菌NMWT1，该菌株记载在Li et al.China Life Sciences(2019)15:152DOI 10.1007/s11427-018-9442-9.

上述菌株公众可通过中国农业科学院植物保护研究所获得。

具体实施方式

本发明中所用试验试剂及设备等均可通过商业化途径购买获得，涉及的PCR扩增，酶切连接、转化等分子生物学实验操作如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。

实施例1.碳源吸收系统的构建。

本实施例中所述的碳源吸收系统由启动子和吸收碳源的基因通过限制性内切酶连接组成，所述启动子为启动子P2或者启动子P4，所述吸收碳源的基因为基因TP2或TP5。

以冰城链霉菌BC04基因组为模板，利用引物P2-F/P2-R扩增启动子P2(P_{sbi_07857})序列，如SEQ ID No.3所示；利用引物P4-F/P4-R扩增启动子P4(P_{sbi_06929})序列，如SEQ ID No.4所示。

以冰城链霉菌BC04基因组为模板，利用引物TP2-F/TP2-R扩增获得吸收碳源的基因TP2，所述TP2基因包含3个基因片段，所述3个基因片段在GenBank上的登录号分别为GeneID:11614576(编码跨膜蛋白)、11614577(编码跨膜蛋白)和11614578(编码底物识别蛋白)，所述TP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

以冰城链霉菌BC04基因组为模板，利用引物TP5-F/TP5-R扩增获得吸收碳源的基因TP5，所述TP5基因包含3个基因片段，所述3个基因片段在GenBank上的登录号分别为GeneID:11612848(编码跨膜蛋白)、11612849(编码跨膜蛋白)和11612850(编码底物识别蛋白)，所述TP5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2.含有实施例1所述的碳源吸收系统的重组载体的构建。

以冰城链霉菌BC04基因组为模板，利用引物P1-F/P1-R扩增启动子P1(P_{sbi_05102})序列，将P1启动子与实施例1中获得的TP2基因和EcoRⅠ，XbaⅠ酶切线性化的pSET152质粒骨架利用多片段一步法克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司)通过Gibson组装方法，得到启动子P1控制糖吸收系统的质粒P1-TP2，参照同样的方法得到启动子P1控制糖吸收系统的质粒P1-TP5。

将启动子P2与质粒P1-TP2分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接，得到启动子P2控制的糖吸收系统的重组载体P2-TP2。

将启动子P4与质粒P1-TP2分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接，得到启动子P4控制的糖吸收系统的重组载体P4-TP2。

将启动子P2与质粒P1-TP5分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接，得到启动子P2控制的糖吸收系统的重组载体P2-TP5。

将启动子P4与质粒P1-TP5分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接，得到启动子P4控制的糖吸收系统的重组载体P4-TP5。

实施例3.合成链霉菌次级代谢产物的重组菌的构建。

将实施例2中制备的重组载体P2-TP2、P4-TP2和P2-TP5、P4-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中，分别得到用于合成米尔贝霉素的重组菌株BC04TP2P2和BC04TP2P4以及BC04TP5P2和BC04TP5P4。

将实施例2中制备的重组载体P2-TP2，P4-TP2，P2-TP5和P4-TP5分别通过接合转移导入阿维链霉菌NEAU1069中，分别得到用于合成阿维菌素的重组菌株NEAUTP2P2，NEAUTP2P4，以及NEAUTP5P2和NEAUTP5P4。

将实施例2中制备的重组载体P2-TP2，P4-TP2，P2-TP5和P4-TP5分别通过接合转移导入蓝灰链霉菌NMWT1中，分别得到用于合成尼莫克丁的重组菌株菌株ScyTP2P2，ScyTP2P4，ScyTP5P2和ScyTP5P4。

对比例1.参考实施例2以冰城链霉菌基因组为模板，利用相应引物扩增其他启动子序列P3(引物P3-F/P3-R)，P_{sbi_05776}；P5(引物P5-F/P5-R)，P_{sbi_07859}；P6(引物P6-F/P6-R)，P_{sbi_07683}；P7(引物P7-F/P7-R)，P_{sbi_04217}；P8(引物P8-F/P8-R)，P_{sbi_06497}；P9(引物P9-F/P9-R)，P_{sbi_03836}；P10(引物P10-F/P10-R)，P_{sbi_05396}，将质粒P1-TP2和这些启动子均以NotⅠ和SpeⅠ酶切后连接，得到质粒P3-TP2、P5-TP2、P6-TP2、P7-TP2、P8-TP2、P9-TP2、P10-TP2，上述质粒统一记为Pn-TP2；同样，将上述酶切过的启动子片段分别连入酶切后的线性质粒P1-TP5，分别得到质粒P3-TP5、P5-TP5、P6-TP5、P7-TP5、P8-TP5、P9-TP5、P10-TP5，上述质粒统一记为Pn-TP5。

然后，参考实施例3的方法将上述制备的质粒Pn-TP2和Pn-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中得到BC04TP2Pn和BC04TP5Pn。

对比例2.重复实施例2的重组载体构建过程，与实施例2不同的是，本对比例中所述的启动子为组成型启动子PhrdB，分别控制TP2和TP5基因表达，以质粒pSET152::P_hrdBmilR(Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934-016-0552-1)为模板，利用引物PhrdB-F/PhrdB-R扩增启动子片段，将质粒P1-TP2和hrdB启动子均以NotⅠ和SpeⅠ酶切后连接，得到利用组成型启动子hrdB控制TP2的质粒Ph-TP2。同样，将酶切过的hrdB启动子连入酶切后的线性质粒P1-TP5，得到利用组成型启动子hrdB控制TP5的质粒Ph-TP5。

参照实施例3的方法将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中，分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的菌株BC04TP2Ph和BC04TP5Ph；将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入阿维链霉菌NEAU1069中，分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的阿维链霉菌菌株NEAUTP2Ph和NEAUTP5Ph；将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入蓝灰链霉菌NMWT1中，分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的蓝灰链霉菌菌株ScyTP2Ph和ScyTP5Ph。

表1菌株和质粒

表2引物

表3启动子序列

实施例4.发酵生产次级代谢产物米尔贝霉素，阿维菌素及尼莫克丁和结果分析。

利用实施例3制备得到的重组菌株BC04TP2P2、BC04TP2P4、BC04TP5P2、BC04TP5P4和对比例1中制备的重组菌BC04TP2Pn，BC04TP5Pn发酵生产次级代谢产物米尔贝霉素，具体过程为：将上述各重组冰城链霉菌菌株在SKYM培养基(0.4％蔗糖，0.1％脱脂奶粉，0.2％酵母浸粉，0.5％麦芽浸粉，2％琼脂)上28℃培养9天后，进冰城链霉菌SSPY种子培养基(1％蔗糖，0.1％脱脂奶粉，0.5％酵母膏，0.35％蛋白胨，0.05％K₂HPO₄·3H₂O，PH 7.2)，28℃250rpm培养46h后以6％的接种量接入发酵培养基(8％蔗糖，0.1％脱脂奶粉，2％黄豆饼粉，0.01％FeSO₄·7H₂O，0.1％K₂HPO₄·3H₂O，0.3％CaCO₃，PH 7.0)，28℃250rpm培养9天后取0.5ml发酵液，用1.5ml乙醇浸泡旋转过夜，离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件，色谱柱：安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相B在15min内以1.0ml/min流速从0到100％梯度变化(流动相A：乙腈-水-甲醇(350：50：100，v/v/v)；流动相B：甲醇)；吸收波长242nm。

利用实施例3制备得到的NEAUTP2P2、NEAUTP2P4、NEAUTP5P2、NEAUTP5P4，对比例2制备的NEAUTP2Ph，NEAUTP5Ph，发酵生产次级代谢产物阿维菌素，具体过程为：将上述用于合成阿维链霉菌的重组菌株在MS培养基上28℃培养7天后，进阿维链霉菌种子培养基(3％玉米淀粉，0.4％酵母浸粉，0.8％黄豆饼粉，1％花生饼粉，0.003％CoCl2·6H2O，PH 7.0)，28℃250rpm培养40h后以6％的接种量接入发酵培养基，28℃250rpm培养10天后取0.5ml发酵液，用1.5ml甲醇浸泡旋转过夜，离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件，色谱柱：安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为90％甲醇；吸收波长246nm。

利用实施例3制备得到的ScyTP2P2、ScyTP2P4、ScyTP5P2和ScyTP5P4，对比例2制备的ScyTP2Ph，ScyTP5Ph发酵生产次级代谢产物尼莫克丁，具体过程为：将上述用于合成蓝灰链霉菌的重组菌株在ISP3培养基上28℃培养9天后，进种子培养基250rpm培养46h后以6％的接种量接入发酵培养基，28℃250rpm培养9天后取0.5ml发酵液，用1.5ml乙醇浸泡旋转过夜，离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件，色谱柱：安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为85％甲醇；吸收波长240nm。

结果分析：

本发明利用不同活性强度的启动子控制碳源吸收系统表达TP2和TP5时，强度适中的启动子比强度强的启动子更有利于米尔贝霉素滴度的提高，只有当启动子强度合适时，米尔贝霉素产量和得率才能达到最高(图1)。结果同样表明，强度合适的启动子比组成型启动子P_hrdB对阿维菌素和尼莫克丁的效价改善效果更好(图2)。该结果表明，微调碳源吸收系统的表达对提高次级代谢产物产量具有重要意义。

本发明共用10个不同活动强度的启动子以及组成型启动子P_hrdB控制碳源吸收系统，构建相应工程菌株。发酵结果表明，在链霉菌BC04中不同启动子过表达碳源吸收系统TP2和TP5，导致最高的米尔贝霉素产量为3161和3321mg/L，分别比BC04提高了30.3％和36.9％(图1中a，b)。进一步分析最高米尔贝霉素产量的工程菌BC04TP5P2发酵液中的残留糖。结果表明，与出发菌株BC04相比，在发酵后期的葡萄糖和果糖消耗率分别提高了82.4％和52.8％(图1中c，d)，同时该菌株的得率提高了36.8％。

基于上述结果，选择P_{sbi_07857}(P2)和P_{sbi_06929}(P4)在阿维链霉菌和蓝灰链霉菌中微调两组碳源吸收系统。在NEAUTP5P4中，阿维菌素B_1a的最高滴度增加到5092mg/L(图2中a)。同样，在ScyTP5P2中，尼莫克丁的最高滴度提高到499mg/L(图2中b)。过表达TP5使阿维菌素B1a和尼莫克丁的得率分别提高了44.6％和52.5％。

上述结果证明：(1)本发明所提出的碳源吸收系统均能够有效提高糖吸收效率，降低糖残留，及增加米尔贝霉素产量和得率；(2)该碳源吸收系统还能够提高另外两种链霉菌的次级代谢产物阿维菌素以及尼莫克丁，预示这两组碳源吸收系统在链霉菌次级代谢产物发酵中的重要应用价值；(3)微调碳源吸收系统的表达使其与宿主的代谢行为适配，对于提高次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。

核苷酸序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用

<130>

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3248

<212> DNA

<213> TP2基因

<400> 1

atgaccgtcg ccgccagcag ccctccttcg cgtctgccgt tgcgcggcgc cgagggagtc 60

acagcgaaac gcaaagcccg caaggtccgg gagcgcggag acggagccct cgcggccctc 120

ttcatcgccc ccgccctgct gggctttctg gtcttcctgc tctggccgac gctgcgcggc 180

atctatctga gtttcacccg cttcaacctg ctcaccccgg ccaagtgggt cggcttggac 240

aactacatac gcatggtcca cgacccgatc ttctgggact cgctcaaggt caccgtcgag 300

tacgtggtca tcaacatcgg cgtccagacg gtgtcggcgc tggtgatcgc ggtgctgctg 360

cagcggctga cgcagtcggc ggtgctgcgc gggatcgtgc tggccccgta cctcatgtcg 420

aacgtggtcg cgggcgttgt ctggctgtgg atgctcgaca accagctcgg cataggcaac 480

gagatcatcc agagcctggg cctcgaccgc gtcccgttcc tggccgacga gacctgggcg 540

atccccacca tcgccctgat caacgtatgg cggcacgtcg gctacaccgc gctcctgctc 600

ttcgccggtc tccaggcgat cccgaacgac atgtacgagg cggccaaggt cgacggcgcg 660

agcgaatggc gcatgttctg gcggatcacc atgccgctgc tgcgcccggt gctggcggtc 720

gtcctgatca tgacggtgat cggttcgttc caggtcttcg acacggtcgc cgtgacgacc 780

tcgggcggtc ccgccaacgc caccaacgtg ctccagtact acatctacgg ctccgccttc 840

ggccgcttcc agttcggcta cgcctcggcg atgtccgtcg ccctgttggc cgtcctcagc 900

gcgatcaccg tcatccagta ccggatcacc cgggccggcc agaccgacct cggctgacgg 960

aagagagaga tccgacatgg ctgccgtggc aacgaccacc accgtacggc gcgtccggcg 1020

caggccctcc ctcgggcggg ccctggcctg gactgtgatg gccgcgatcg tgctcatcac 1080

cctgctgccc ttctactgga tcctgcgcac cgcgctgtcc accaacagcg cgctcgtcgc 1140

ccaccccggc gacccgctac ccgtggacct caccggcggc ggcttcgcac gcgccctggg 1200

cctgcagtcc accgaggagg cgatcgccca gggcggctcg ggcggcgggc tggcgttctg 1260

gcgctatctg ttgaactcgg tgatcgtctc cacgctgatc gccgtctgcc aggtcttctt 1320

ctcgtccatg gccgcgtacg ccttcgcacg cctgcggtgg cggggccggg acaaggtgtt 1380

cggcctcttc ctggccgggc tgatggtacc cgcgatcttc accctgctgc cgaacttcgt 1440

gctcatcaag caactcgggc tggtggacac gctgctcggg atcgccctgc cgaccatgtt 1500

catgaccccg ttcgcggtgt tcttcctgcg gcagttcttc atgaacgtgc cccgcgaggt 1560

cgaggaggcc gcgctcctcg acggcgccgg caaggtccgc gtcttcttcc gggtgatgct 1620

gcccatggcg tccaccccga tcctcaccct ggccgtgctg acgtacatca cctcctggaa 1680

cgactacttc tggccgttgc tggtgtccta cagcgacagc tcccgggtgc tcaccgtggc 1740

gttggccatt ttccgcgcgc agacgccgca gaccggcacc gactggtccg gcctgatggc 1800

ggcgactctc atcgccgcac tcccgatgct ggtgctcttc ggcctgttcg cgcgccgcat 1860

cgtcaactcc atcggcttca ccgggatcaa gtaaggggac agtgatgcga attcgtaagg 1920

tggtggcgct ggccggggcg ctcacgctgt ccctgctgac aggctgcgcg aagggcgatt 1980

cggccgggtc gtccgggaac acggtgacgt actggctctg ggactccagc cagttgcccg 2040

cctaccaggc ctgtgccgag ggcttcgaaa agcagaaccc gggcctccat gtcaaaatca 2100

cgcagatggg ctggggggac tactggacca agctcaccgc gagcttcatc gcgggcacac 2160

agccggacgt gttcaccgac cacatccaga agttcgggca gttcgccgac ctcgacgtgc 2220

ttcaaccgct ggacgacctc ggcatcaacg agtccgacta ccagtcgggg ctggcgtcca 2280

gctgggtcgg ccaggacggc caccgctacg gctccccgaa ggactgggac accgtcgcgc 2340

tgttctacaa caagaagatg gctcacgcgg ccgggctgac cgccgaagag ctgaacagcc 2400

tctcctggaa cccgaaggac ggcggcacct tcgagaaggc catcgcccac ctcaccatcg 2460

acaagtacgg caagcgcggc gacgaaccgg gcttcgacaa gcaccatgtc aaggtgtatg 2520

gcctggccac cggaggggca ggcgacagcg acgggcagac ccagtggagc aacttcaccg 2580

cctccgccgg ctggacctac accgacaaga aacggtgggg cacgaagtac cagtacgaca 2640

gcaagacctt ccagtcggtc atcacgtggt acttcgggct ggtgaagaag ggctatctcg 2700

ccccgttcac cgcctacagc gagggcgcga acccgcccaa cgcccagatg ggctcgggca 2760

gggcggcgac cgccttcgac ggcgcctgga tgatctccac gtacgacggc ctcaagggcg 2820

tgaaggtcag caccgccttc acccccgtcg gcccgaccgg caagcgggcg acgatgatga 2880

acggcctcgc cgactcgatc accaagaacg cccgcaacaa gcggggcgcg aagaagtggg 2940

tgaagtatct ggcctcgaac gagtgccaga agacggtcgg cacctacggc atcgtctttc 3000

ccgccactcc cgaaggcacg aacgccgcgg tcgccgctta caagaagaag ggcatcgacg 3060

tcaccgcctt caccaggccg gtcgccgaca agaaggactt caccaccttc tccttcccga 3120

tcaccgacta cgccgcggat gtgtacgcgc tgatgcaccc cgccatgcag gacgtctacg 3180

ccaacgacgc acccgtgagc ggcctcggca aaaccaacga ccagatcaac ttcatcctcg 3240

gccagtga 3248

<210> 2

<211> 3280

<212> DNA

<213> TP5基因

<400> 2

gtgaccctcg cggccgtggc gacgctgggc gccgggttac tcgcgggctg tgccgacgac 60

ggcgatgacg agaccggctc gtccggcggt ggcaagggcg gcaacaaggg cgggacgacg 120

atcacggtcg gcaccttcgg cgtcttcggc tacaagcagg ccgggcttta tgacgagtac 180

atgaagctcc accccgatat caacatcgag gaaacgtcga tcgagcggaa cgagaactac 240

tatccgcagc tgctgaccca cctgggcgcg ggcagcggcc tggccgacat ccaggccatc 300

gagatcgcca atatcacgga gatcaccacc acccaggccg acaagttcgt cgacctctcc 360

aaggcgcccg gggtcaagaa ggacaactgg ctctcctgga agtgggccca ggccaccacc 420

aaggacggca ggacgatcgg cctgggcacc gacatcggcc cgatggccat ctgctaccgc 480

aaggacctct tccagcaggc cgggctgccc accgaccgcg acaaggtcgc caagctgtgg 540

gcaggcgact ggaacaagta catcgagacc ggcaagcagt acatgaagaa ggcgccgggc 600

gacaccgcct tcgtggactc cgccggcggt gtctacaacg cggtgatctc cagcaacgcc 660

aagcgctact acgacgagag cggcaaggtc atctacaagg acagcccggc cgtgaaggag 720

gcgtggaacc tcgcgaccac cgcgtcggag gacaagctga ccgccaagct ccagcagttc 780

cagaagtcct gggaccaggc gtactcgaac ggcaagttcg ccaccgtctc ctgcccgccg 840

tggatgctcg gccacatcaa ggagaaagcc ggggacaagg ccaaggacaa gtgggacgtg 900

gccgcggcgc ccaagcccgg caactggggc gggtccttca tcggcgtgcc gaaggcgtcc 960

aagcaccagg aagaggcgat gaagctcgcc gcctggctga ccgcccccga gcagcaggcc 1020

aagctcttcg agaagcaggc cagctggccg agcgcccagg ccgcgtacag cctgcccacg 1080

gtggccgacg ccaagcaccc gtacttcggc aacgcgccca tcggcaagat cttcgccgag 1140

gccgcgaagg gcatcccgac ccaggtcctc ggtccgaagg accagatcat cgggtcgaac 1200

atcgccgaca tcgggctgct ccaggtggac cagcagggca agtcccccaa ggacgcctgg 1260

aaggccgcca ccaagacgat cgacaacgca ctggaccagt gagcccggga tgacaccccc 1320

ttccggtttc actgctggta cggccgcgcc ccccacaggg caggggggcg cggccccgcg 1380

cgccgtggcc gccaaggccc ccgatccggg cgaggagcgg cggcgcgccc ggcgcagccg 1440

ccgctaccgc tgggacatca agtactcgcc gtacgccttc gtcgccccgt tcttcctctt 1500

cttcgcggtc ttcgggctct tcccgctgct ctacacgggc tgggcctcgc tgcaccgggt 1560

ggagctgacc gaccccaccc atatggagtg ggcggggtgg cacaactact cccggctgtg 1620

ggacgacgaa ttcttctgga acgcgctgca gaacaccttc accatcgggg tgatctcgac 1680

cgtcccgcag ctgctgatgg cgctgggcct cgcgcatctg ctgaactaca agctgcgcgg 1740

ctcgatgttc ttccgggtgg cgatcctcac cccgtacgcc acctcggtgg ccgccgcgac 1800

gctggtgttc gtgctgctct tcgggcgcga ctacggcatg atcaactggg cgctcgggct 1860

ggtcgggatc gacaacatcg actggcagaa cggcacctgg acctcgcagc tcgcggtgtc 1920

cgccatcgtc atctggcggt ggaccggcta caacgcgctg atctatctgg ccgccatgca 1980

ggccgtgccc agcgatctgt acgagtcggc ggcgctggac ggcgcctcgc gctggcagca 2040

gttcctccac gtcaccatcc cctcgctgcg gcccacgatc ctcttcacga tcgtggtctc 2100

gacgatcggg gccacccagc tcttcggtga gccgctgctg ttcaacggcg gcgccggggc 2160

ctccggaggg cccgaccacc agtaccagac gctcggcctg tacctgtacg agcagggctg 2220

gaccaacctc cacctcggcc gggcctccgc gatcgcctgg acgatgttcc tgatcctgct 2280

gctgatcgcc gccgccaacg cgatcgtggc ccgacggctg cgcaagagcc agtgagttgc 2340

ccgagggaga accatgagcg ctgttatctc ttccggtagg gccgccaagg ccaccaaggg 2400

cggaaagagc ccggggagtc ccggcggaaa ggtgagcaag ggggccaagg gcgccggccg 2460

acagctgcac ggcggcaaga tcacctatgc cgtgctgacc ctgttcacca tcggctcgct 2520

cttcccgctg gtgtggacgg ccatcgccgc ctcccgcacc agcacccggc tcgccgagac 2580

gccaccgccc ttctggttcg gcggcaatct cttcaagaac ctggacgcgg cgtggaacga 2640

cgtcaacatg ggcgccgcgc tgctcaacac caccatggtg gccgggacca tcgcggcagg 2700

caccgtgctg ttctccacca tcgccggctt cgcgttcgcc aagctgcgct tccggttcaa 2760

gaatctgctg ctgatgctga ccatcgggac gatgatggtg ccgccccagc tcagcgtggt 2820

cccgctgtac atggccatcg ccaagctgca gtggaccgac cagttgcagg cggtcatcct 2880

gcccacgctg gtcagcgcct tcggggtgtt cttcatgcgg cagtatctga cccaggcgct 2940

gccgaccgag ctgatcgagg ccgcgcgcgt ggacggcgcc agcagtctgc ggatcatctg 3000

gcacatcgtc ttcccggtgg cgcgtccggc catggccgtg ctgggtatgc tcaccttcgt 3060

ccaggcgtgg aacgacttct tctggcccat catcgccctc acccaggccg gcaacccgac 3120

cgtgcaggtg gctctcacgg gcctcggccg cggctatacc gtcgaccagt cgctgatcat 3180

ggctggggcg ctgctcggta ccctgccgct gctgatcgcc ttcgtcctct tcggcaagca 3240

gatcgtcgga ggcatcatgc agggcgcggt caagggctga 3280

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> P2（Psbi_07857）序列

<400> 3

cgctacggcg agcggctgct ggtgcaccac tgggacaacg cactccaggg gccgcgcacc 60

gtcgccgcca atgtggtcgg cagccggacc gcgcatttca ccggttcggt ctacgacccg 120

gtgccgtatt tctggtccga gcagttcggc cgcttcgtgc agtacgcggg ccaccacgcc 180

gccgccgacg aactcgtctg gcgcggcgac ccggagggcg cggcctggtc ggtgtgctgg 240

ctgcgcgacg gggcgctggt cgccctgctg gccgtcggcc gtccgcgcga tctggcccag 300

ggccgcaagc tgatcgagca gggctcccgg ctggaccgcg ccctcgccgc ggacccgtcg 360

gtgccgctca agtcggcggt cctgtgaccc tcggcgcgcc ccggcggtga cccggccgag 420

gcgcggctgg cggtggcgtc acggcaccga tgcccggtgc ccgactaccc actgtcagtc 480

ccagatggca ggcttgtccc 500

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> P4（Psbi_06929）序列

<400> 4

ttacgtcagg cgggcacgat gttctcggcc tgcgggccct tctggccctg ggtgacgtcg 60

aacgagacct tctggccctc gtggagctcg cggaagccct gggcagcgat gttcgagtag 120

tgggcgaaga cgtccgcgcc gccgccgtcc tgctcgatga agccgaagcc cttttccgcg 180

ttgaaccact tcacggtgcc agttgccatg tcattctcct tcgatagggg cagaactgga 240

atccgaacct tacggatccc gtgtcgccgc aatgacccca tccggaatga ccggaaaaac 300

aaaatgcacc tgaccgctac atctgtcagg cgcacataaa gttcatgggt accaaaactg 360

caactgccta acacgctagc acgtgcggcg acggaacggg gggaaccacg ccacccggtt 420

gtgcgcttcc cgccgggcat ccggtgtggg accctggccc caccggctcc cttcctccct 480

cctctccctg ctgaggtcct 500

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> P1（Psbi_05102）

<400> 5

gttcacggtg accagcggcg aggtcggcgg gcaggacggg caggacgggc agggcgggca 60

gtctggtcaa gatggccggt ccggccaggg cagccagggc ggccagtccg gtcagtccgg 120

ccagggcgat ggaaccggaa ccagaggcgg aaccgcgagc ggaggccgga gcggggccgg 180

gcaatcgggg cagggcggtg acgccgccca gggtgcgccg ggcaatcgga gcacccccgg 240

cccccagagc gtacggcgga cgctgggggt ggcctccacc atcgagctgt acgacttcgg 300

cgcaccggcc gccgtgacgc tccctaaatc atcggatatt tacacaggaa gggttggatc 360

cccccagacc tagccagcgc atgccgttca gccccgtgaa atggtccatc cgtgccatgc 420

gcggagtgtg taccgatccc tacgctggga agccgctgct cggaagtgct cgcagatgct 480

cgcaggagga ggtgaaacac 500

<210> 6

<211> 500

<212> DNA

<213> P3（Psbi_05776）

<400> 6

acagggccgc ggcgggtgtc gaccggcgat attcagccaa acttccgtgg cgctcttgat 60

cggcttacgg aagcctcgcg gtggtttgcg accgccttgc gccggcctgg cggcggccgc 120

gacggcagcc cggcgggaag tcctcacccc gcacgacacc tgacggtacg tcagtccggg 180

aggcggcatc cgcctcccgg accgctccgc cacccgcggg gaatgaggcg gcggcgtccc 240

ccagcccact gattccgtac agcgggccga cccacgcagg atccatcgaa acgttcccgc 300

gaaccctgag acagagcgca cggacaggcg cacagccaca cacagcagga gcacacaccc 360

cgctccgcac gtccgttcgt acaagaatct cgccatccgg gacaccacct cttaacggtc 420

gggatgcggc gaactacgct gggtttacga atgccccgcg cctatgccgg ggcggccgtc 480

ggtgctgtcg aggggtacgc 500

<210> 7

<211> 500

<212> DNA

<213> P5（Psbi_07859）

<400> 7

atcgggcggt ccacccacgc accggccgag gcggaggccg cggccgtcga gccgggcgtc 60

gactacttct gcaccgggcc ctgctggccc acccccacca agccggggcg gtccgccccg 120

ggcctgtcgc tggtgcgcca cacggccgcc ctgaagcccg ctcggccctg gttcgccatc 180

ggcggaatcg acgcctcgaa cctggacgag gtgctggagg cgggcgcgcg gcggatcgtc 240

gtggtgcggg cgatcaccga ggccgaggac cccggcgcgg ccaccgccga gctggccaag 300

cgggtgcgcg ctcgcgacct gtgagagatg tgccggcccg ctcggtgtcg gctcggcgtc 360

ggcaaagtgt ccgcagtacg gaccaagacc cggcgaaagg ggcataacgt cgctgcccgc 420

tgtccgtgtg ccgcaccgct ggctaacctt cccgtatggc ccttggcaca gcctccacca 480

ggacagatcg cgcgcggaca 500

<210> 8

<211> 500

<212> DNA

<213> P6（Psbi_07683）

<400> 8

tgtcgccgtg cacaccgccg atatacgcgg tcacatcgag attcacgatg tcgccgtcgc 60

gcagcacggt cgaatccggg atgccgtggc agatgacctc gttgacggaa gagcacagcg 120

acttggggaa accgcggtag cccagcgtcg aggggtacgc gccgtggtcg cacagatact 180

catgcgccac ccggtccagc tcatccgtgg tgacccccgg cgcgatccgg ctcgcggcct 240

ccgccatcgc ccgcgcggcg atcccgcccg cgatccgcat ccgctcgatc gtttcggcgt 300

cctgcacctc cgatcccgta tacggcgtcg ggccctcttt gccgacgtac tcggggcggg 360

ggatcgaggc ggggaccggg cgggtgggag agagctttcc cgggacaaga agcgactggc 420

cagacatgtc agcgagtgta tcggcggcgc atcgggcagc atggcgggaa acagggagag 480

acaagggcgg gagggccgcg 500

<210> 9

<211> 500

<212> DNA

<213> P7（Psbi_04217）

<400> 9

gccacgctcc gtatacagag agtctgccag tcactcatgg cgaccctccg cacttcgagg 60

tgccggaccc tcgtccgggc cgtcggcttc gtcgtacgag ggcaggcggg cgcccctgct 120

ctcagcgatc cgcaacacgt cgcgcagcgc ctcacacagc cgttccgcga ggaagcggag 180

ttctcgcgcg tctgccttgg gggcgtccag cagcgcccgg gcgtgatgga ggagtttcgc 240

acccatcgac acctgcacgg cctcgatcgc atccgcgcgt cggctcagcg ggctgtcccc 300

gtcgtccgac gccaggtaac acggcttgcc gtcggggtcc gaccacggca gcaggcgcag 360

cccggtactc acgttcatca gctccattga ggttcgttca cgctgtgtgg cgctttcctc 420

acagagtggt ggctgttctg gctacgctgc tagcagggcg agcctgacca cgcacctttc 480

aactcgggga gtcacagccc 500

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> P8（Psbi_06497）

<400> 10

gggccggggg cagccggctg gtggtcgcgg gccgtgagtc gggcggggtg cagcggctgc 60

agtacgtcga gacggacggc tcgccggctg acgtgccggc cgtgcccggg ccgaacgggg 120

tggaggcggt cgcggccttc gaggggcaga accggccgtt gatcgccgag acgacgaacg 180

acgggattgt gcggctgccg ccgaatacgg actggaagac cgtggccaag gaggggtcgc 240

ttccggtgta tccggggtaa cggctcgcct tcgctgcctc tgcctctgcc tctgcctctg 300

cctctgcctt cgcctccgac tcgacctggc ccccgccctg gacctggtcc tcggccgact 360

gggcgtcgac cggttggctg tcaacaggat gggggcgcgt tcacccggat gggcgcggcc 420

acaccgtggt tggcccgcag ttatccacag ggttgtccac aggagtggcg gggctgtgag 480

ggtgacgcga cagtgggccc 500

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213> P9（Psbi_03836）

<400> 11

cgggtccgcc gcggcgagcg gctgaccctg acggtcacgg tcaccaccgc ctcccgcccc 60

aacttccacg gcgtcctgcc gcgcctggcc cacctcgacg tgatccgcgg cgcggtccgc 120

ggcccggcgc gcgaccgcga tgcatggcgc gccccggaca cccgcgtcgt acacaccgcg 180

gacgtatccg gccgcaccgg cacgtacacc ctgcggatcc ccctggccag ggccgatgag 240

tccggctacc tccggctccg cggcagcgac ggcaaccgcc acggcacagg cctgctgggc 300

gcggccgtgg acccgcacgg cccgatcccg cacaagccgg gcgacggcga cccgtgggcg 360

gacacctggt gctacacgaa cccgatcttc atcgaggtga cgggctgagg ggagaaggcg 420

gaatcgccgg gccggggtct gcgttgacgt aaatgaggaa ccgcccggaa ccgcgcacgc 480

ctaccgcagg aggattcccc 500

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> P10（Psbi_05396）

<400> 12

gggtggaact cgtcgccgaa ctcgtagccg gggccaccgg tgccgttgcc cagcgggtca 60

ccgccctgga tcatgaagcc gctgatcacg cggtggaaga cggtgccgtc gtacagcttc 120

tccttggccc gcttgccggt cgccgggtgg gtccactcac gggtgccctc ggcgagctcc 180

acgaagttct tgaccgtctt gggggcgtgg ttcggcagca gccggaccac gatgtcgcca 240

ttgttcgtct tcagggtggc gtagagctgc tcagccacga tctaccttcc atagttttca 300

ttgcggtccc ttgatcctcg cacggacgcc gcgacgacgc gtacccacga agcggcgcgc 360

ggcacacacg attcataccg gcccggacgg gaacccgtac gtgccccgga tgcccggccg 420

cgcgtgcccg gcaccctgca tacaggcatg atcgtcacaa acaggcatga tctttcatga 480

aacggaaagg ggaggatccc 500

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> TP2-F

<400> 13

cgcaggagga ggtgaaacac gcggccgcat gaccgtcgcc gccagcagcc ct 52

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> TP2-R

<400> 14

aacagctatg acatgattac gaattctcac tggccgagga tgaagttgat c 51

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> TP5-F

<400> 15

cgcaggagga ggtgaaacac gcggccgcgt gaccctcgcg gccgtggcga 50

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> TP5-R

<400> 16

aacagctatg acatgattac gaattctcag cccttgaccg cgccctgcat g 51

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> PhrdB-F

<400> 17

ggactagttc tagaccgcct tccgccg 27

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> PhrdB-R

<400> 18

ataagaatgc ggccgcgaac aacctctcgg aacgttgaaa a 41

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> P1-F

<400> 19

ggctgcaggt cgactctaga actagtgttc acggtgacca gcggcgaggt c 51

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> P1-R

<400> 20

gtgtttcacc tcctcctgcg agcat 25

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> P2-F

<400> 21

ggactagtcg ctacggcgag cggctgctgg tgc 33

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> P2-R

<400> 22

ataagaatgc ggccgcggga caagcctgcc atctgggact g 41

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> P3-F

<400> 23

ggactagtac agggccgcgg cgggtgtcga ccg 33

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> P3-R

<400> 24

ataagaatgc ggccgcgcgt acccctcgac agcaccgacg g 41

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> P4-F

<400> 25

ggactagttt acgtcaggcg ggcacgatgt tct 33

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> P4-R

<400> 26

ataagaatgc ggccgcagga cctcagcagg gagaggaggg a 41

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> P5-F

<400> 27

ggactagtat cgggcggtcc acccacgcac cgg 33

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> P5-R

<400> 28

ataagaatgc ggccgctgtc cgcgcgcgat ctgtcctggt g 41

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> P6-F

<400> 29

ggactagttg tccgcgcgcg atctgtcctg gtg 33

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> P6-R

<400> 30

ataagaatgc ggccgccgcg gccctcccgc ccttgtctct c 41

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> P7-F

<400> 31

ggactagtgc cacgctccgt atacagagag tct 33

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> P7-R

<400> 32

ataagaatgc ggccgcgggc tgtgactccc cgagttgaaa g 41

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> P8-F

<400> 33

ggactagtgg gccgggggca gccggctggt ggt 33

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> P8-R

<400> 34

ataagaatgc ggccgcgggc ccactgtcgc gtcaccctca c 41

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> P9-F

<400> 35

ggactagtcg ggtccgccgc ggcgagcggc tga 33

<210> 36

<211> 41

<212> DNA

<213> P9-R

<400> 36

ataagaatgc ggccgcgggg aatcctcctg cggtaggcgt g 41

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> P10-F

<400> 37

ggactagtgg gtggaactcg tcgccgaact cgt 33

<210> 38

<211> 41

<212> DNA

<213> P10-R

<400> 38

ataagaatgc ggccgcggga tcctcccctt tccgtttcat g 41

Claims (10)

1.一种碳源吸收系统，其特征在于，所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.含有权利要求1所述的碳源吸收系统的重组载体。

3.含有权利要求1所述的碳源吸收系统的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌株为以蔗糖和淀粉中的一种或两种为碳源的链霉菌(streptomyces)。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述链霉菌为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)。

5.权利要求1所述的碳源吸收系统在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

7.权利要求2所述的重组载体在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

9.权利要求3或4所述的重组菌在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。

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