CN111607547B - 一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用 - Google Patents
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Abstract
一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用,属于基因工程技术领域。为了提高链霉菌次级代谢产物产量,本发明提供了一种碳源吸收系统,所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因,其中启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示,吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。将上述碳源吸收系统转化入链霉菌获得工程菌株进行发酵。能够有效提高糖吸收效率,降低糖残留,及提高目标产物产量和得率;上述碳源吸收系统的微调表达使其与宿主的代谢行为适配,对于提高次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用。
背景技术
在链霉菌次级代谢产物工业发酵过程中,菌株对碳源底物利用率不高是一个共性问题。该问题严重影响了目标产物得率与单位发酵效价,进一步影响了产业化应用。链霉菌次级代谢产物生物合成在菌株生长稳定期大量合成,该阶段菌株初级代谢几乎停滞。特别是,链霉菌对碳源底物(主要为可溶性糖)的吸收速率在菌株进入稳定期后遍会出现急剧下降的现象。碳源是合成目标次级代谢产物的重要营养物质,宿主菌对碳源的摄入能力意味着下游生物转化可用材料的输入量多少。因此,链霉菌在生长稳定期对碳源的摄取能力对发酵过程中次级代谢产物的产量和效价有显著的影响。此外,增加链霉菌对发酵培养中碳源的摄入,也会减少发酵液中的碳源残留,降低下游产物分离、废水处理等过程的难度。因此,如何提高链霉菌菌株对碳源底物的吸收具有重要的研究价值。
发明内容
为了提高链霉菌次级代谢产物产量,本发明提供了一种碳源吸收系统,所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示,所述吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了含有上述碳源吸收系统的重组载体,优选地,所述重组载体的出发载体为pSET152。
本发明还提供了含有上述碳源吸收系统的重组菌,所述重组菌的出发菌株为以蔗糖和淀粉中的一种或两种为碳源的链霉菌(streptomyces)。
优选地,所述链霉菌为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)。
本发明还提供了上述碳源吸收系统在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
进一步地限定,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
本发明还提供了上述重组载体在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
进一步地限定,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
本发明还提供了上述重组菌在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
进一步地限定,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
有益效果
本发明提供了一种用于提高链霉素次级代谢产物的碳源吸收系统,经过基因工程改造构建制备重组菌,在发酵生产中,降低了发酵末期的糖残留,提高了米尔贝霉素,阿维菌素以及尼莫克丁产量。
附图说明
图1为微调糖吸收系统表达水平对米尔贝霉素效价的改善作用;a表示碳源吸收系统(TP2为目的基因)对米尔贝霉素A3/A4产量的影响,纵坐标为米尔贝霉素A3/A4产量;b表示碳源吸收系统(TP5为目的基因)对米尔贝霉素A3/A4产量的影响,纵坐标为米尔贝霉素A3/A4产量;c表示BC04和BC04TP5P2中葡萄糖消耗速率的比较(144-216h),纵坐标为葡萄糖消耗速率;d表示BC04和BC04TP5P2中果糖消耗速率的比较(144-216h),纵坐标为葡萄糖消耗速率;
图2为TP2和TP5在提高效价方面的普适性;a表示TP2和TP5对阿维菌素B1a产量的影响,纵坐标为阿维菌素B1a产量;b表示TP2和TP5对尼莫克丁产量的影响,纵坐标为尼莫克丁产量。
定义及缩写:
碳源吸收系统:特指由特定启动子控制的一个由三个基因组成的操纵子,这三个基因分别编码两个跨膜蛋白和一个底物识别蛋白。
微调:特指非组成型强启动子控制的基因过表达。
本发明所使用的出发菌株:
冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)为本实验室具有独立知识产权,能够生物合成商业化应用的米尔贝霉素A3/A4的工业化链霉菌BC04,该菌株记载在Zhang etal.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934-016-0552-1.
阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis),为阿维链霉菌NEAU1069,该菌株记载在Wang et al.Journal of Antibiotics(2011)64:591-594DOI 10.1038/ja.2011.48.
蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus),为蓝灰链霉菌NMWT1,该菌株记载在Li et al.China Life Sciences(2019)15:152DOI 10.1007/s11427-018-9442-9.
上述菌株公众可通过中国农业科学院植物保护研究所获得。
具体实施方式
本发明中所用试验试剂及设备等均可通过商业化途径购买获得,涉及的PCR扩增,酶切连接、转化等分子生物学实验操作如无特殊说明,均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。
实施例1.碳源吸收系统的构建。
本实施例中所述的碳源吸收系统由启动子和吸收碳源的基因通过限制性内切酶连接组成,所述启动子为启动子P2或者启动子P4,所述吸收碳源的基因为基因TP2或TP5。
以冰城链霉菌BC04基因组为模板,利用引物P2-F/P2-R扩增启动子P2(Psbi_07857)序列,如SEQ ID No.3所示;利用引物P4-F/P4-R扩增启动子P4(Psbi_06929)序列,如SEQ ID No.4所示。
以冰城链霉菌BC04基因组为模板,利用引物TP2-F/TP2-R扩增获得吸收碳源的基因TP2,所述TP2基因包含3个基因片段,所述3个基因片段在GenBank上的登录号分别为GeneID:11614576(编码跨膜蛋白)、11614577(编码跨膜蛋白)和11614578(编码底物识别蛋白),所述TP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
以冰城链霉菌BC04基因组为模板,利用引物TP5-F/TP5-R扩增获得吸收碳源的基因TP5,所述TP5基因包含3个基因片段,所述3个基因片段在GenBank上的登录号分别为GeneID:11612848(编码跨膜蛋白)、11612849(编码跨膜蛋白)和11612850(编码底物识别蛋白),所述TP5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2.含有实施例1所述的碳源吸收系统的重组载体的构建。
以冰城链霉菌BC04基因组为模板,利用引物P1-F/P1-R扩增启动子P1(Psbi_05102)序列,将P1启动子与实施例1中获得的TP2基因和EcoRⅠ,XbaⅠ酶切线性化的pSET152质粒骨架利用多片段一步法克隆试剂盒(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司)通过Gibson组装方法,得到启动子P1控制糖吸收系统的质粒P1-TP2,参照同样的方法得到启动子P1控制糖吸收系统的质粒P1-TP5。
将启动子P2与质粒P1-TP2分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接,得到启动子P2控制的糖吸收系统的重组载体P2-TP2。
将启动子P4与质粒P1-TP2分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接,得到启动子P4控制的糖吸收系统的重组载体P4-TP2。
将启动子P2与质粒P1-TP5分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接,得到启动子P2控制的糖吸收系统的重组载体P2-TP5。
将启动子P4与质粒P1-TP5分别经NotⅠ和SpeⅠ双酶切后连接,得到启动子P4控制的糖吸收系统的重组载体P4-TP5。
实施例3.合成链霉菌次级代谢产物的重组菌的构建。
将实施例2中制备的重组载体P2-TP2、P4-TP2和P2-TP5、P4-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中,分别得到用于合成米尔贝霉素的重组菌株BC04TP2P2和BC04TP2P4以及BC04TP5P2和BC04TP5P4。
将实施例2中制备的重组载体P2-TP2,P4-TP2,P2-TP5和P4-TP5分别通过接合转移导入阿维链霉菌NEAU1069中,分别得到用于合成阿维菌素的重组菌株NEAUTP2P2,NEAUTP2P4,以及NEAUTP5P2和NEAUTP5P4。
将实施例2中制备的重组载体P2-TP2,P4-TP2,P2-TP5和P4-TP5分别通过接合转移导入蓝灰链霉菌NMWT1中,分别得到用于合成尼莫克丁的重组菌株菌株ScyTP2P2,ScyTP2P4,ScyTP5P2和ScyTP5P4。
对比例1.参考实施例2以冰城链霉菌基因组为模板,利用相应引物扩增其他启动子序列P3(引物P3-F/P3-R),Psbi_05776;P5(引物P5-F/P5-R),Psbi_07859;P6(引物P6-F/P6-R),Psbi_07683;P7(引物P7-F/P7-R),Psbi_04217;P8(引物P8-F/P8-R),Psbi_06497;P9(引物P9-F/P9-R),Psbi_03836;P10(引物P10-F/P10-R),Psbi_05396,将质粒P1-TP2和这些启动子均以NotⅠ和SpeⅠ酶切后连接,得到质粒P3-TP2、P5-TP2、P6-TP2、P7-TP2、P8-TP2、P9-TP2、P10-TP2,上述质粒统一记为Pn-TP2;同样,将上述酶切过的启动子片段分别连入酶切后的线性质粒P1-TP5,分别得到质粒P3-TP5、P5-TP5、P6-TP5、P7-TP5、P8-TP5、P9-TP5、P10-TP5,上述质粒统一记为Pn-TP5。
然后,参考实施例3的方法将上述制备的质粒Pn-TP2和Pn-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中得到BC04TP2Pn和BC04TP5Pn。
对比例2.重复实施例2的重组载体构建过程,与实施例2不同的是,本对比例中所述的启动子为组成型启动子PhrdB,分别控制TP2和TP5基因表达,以质粒pSET152::PhrdBmilR(Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI 10.1186/s12934-016-0552-1)为模板,利用引物PhrdB-F/PhrdB-R扩增启动子片段,将质粒P1-TP2和hrdB启动子均以NotⅠ和SpeⅠ酶切后连接,得到利用组成型启动子hrdB控制TP2的质粒Ph-TP2。同样,将酶切过的hrdB启动子连入酶切后的线性质粒P1-TP5,得到利用组成型启动子hrdB控制TP5的质粒Ph-TP5。
参照实施例3的方法将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入冰城链霉菌BC04中,分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的菌株BC04TP2Ph和BC04TP5Ph;将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入阿维链霉菌NEAU1069中,分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的阿维链霉菌菌株NEAUTP2Ph和NEAUTP5Ph;将质粒Ph-TP2和Ph-TP5分别通过接合转移的方法导入蓝灰链霉菌NMWT1中,分别得到组成型启动子hrdB控制糖吸收系统TP2和TP5表达的蓝灰链霉菌菌株ScyTP2Ph和ScyTP5Ph。
表1菌株和质粒
表2引物
表3启动子序列
实施例4.发酵生产次级代谢产物米尔贝霉素,阿维菌素及尼莫克丁和结果分析。
利用实施例3制备得到的重组菌株BC04TP2P2、BC04TP2P4、BC04TP5P2、BC04TP5P4和对比例1中制备的重组菌BC04TP2Pn,BC04TP5Pn发酵生产次级代谢产物米尔贝霉素,具体过程为:将上述各重组冰城链霉菌菌株在SKYM培养基(0.4%蔗糖,0.1%脱脂奶粉,0.2%酵母浸粉,0.5%麦芽浸粉,2%琼脂)上28℃培养9天后,进冰城链霉菌SSPY种子培养基(1%蔗糖,0.1%脱脂奶粉,0.5%酵母膏,0.35%蛋白胨,0.05%K2HPO4·3H2O,PH 7.2),28℃250rpm培养46h后以6%的接种量接入发酵培养基(8%蔗糖,0.1%脱脂奶粉,2%黄豆饼粉,0.01%FeSO4·7H2O,0.1%K2HPO4·3H2O,0.3%CaCO3,PH 7.0),28℃250rpm培养9天后取0.5ml发酵液,用1.5ml乙醇浸泡旋转过夜,离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件,色谱柱:安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相B在15min内以1.0ml/min流速从0到100%梯度变化(流动相A:乙腈-水-甲醇(350:50:100,v/v/v);流动相B:甲醇);吸收波长242nm。
利用实施例3制备得到的NEAUTP2P2、NEAUTP2P4、NEAUTP5P2、NEAUTP5P4,对比例2制备的NEAUTP2Ph,NEAUTP5Ph,发酵生产次级代谢产物阿维菌素,具体过程为:将上述用于合成阿维链霉菌的重组菌株在MS培养基上28℃培养7天后,进阿维链霉菌种子培养基(3%玉米淀粉,0.4%酵母浸粉,0.8%黄豆饼粉,1%花生饼粉,0.003%CoCl2·6H2O,PH 7.0),28℃250rpm培养40h后以6%的接种量接入发酵培养基,28℃250rpm培养10天后取0.5ml发酵液,用1.5ml甲醇浸泡旋转过夜,离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件,色谱柱:安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为90%甲醇;吸收波长246nm。
利用实施例3制备得到的ScyTP2P2、ScyTP2P4、ScyTP5P2和ScyTP5P4,对比例2制备的ScyTP2Ph,ScyTP5Ph发酵生产次级代谢产物尼莫克丁,具体过程为:将上述用于合成蓝灰链霉菌的重组菌株在ISP3培养基上28℃培养9天后,进种子培养基250rpm培养46h后以6%的接种量接入发酵培养基,28℃250rpm培养9天后取0.5ml发酵液,用1.5ml乙醇浸泡旋转过夜,离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件,色谱柱:安捷伦SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为85%甲醇;吸收波长240nm。
结果分析:
本发明利用不同活性强度的启动子控制碳源吸收系统表达TP2和TP5时,强度适中的启动子比强度强的启动子更有利于米尔贝霉素滴度的提高,只有当启动子强度合适时,米尔贝霉素产量和得率才能达到最高(图1)。结果同样表明,强度合适的启动子比组成型启动子PhrdB对阿维菌素和尼莫克丁的效价改善效果更好(图2)。该结果表明,微调碳源吸收系统的表达对提高次级代谢产物产量具有重要意义。
本发明共用10个不同活动强度的启动子以及组成型启动子PhrdB控制碳源吸收系统,构建相应工程菌株。发酵结果表明,在链霉菌BC04中不同启动子过表达碳源吸收系统TP2和TP5,导致最高的米尔贝霉素产量为3161和3321mg/L,分别比BC04提高了30.3%和36.9%(图1中a,b)。进一步分析最高米尔贝霉素产量的工程菌BC04TP5P2发酵液中的残留糖。结果表明,与出发菌株BC04相比,在发酵后期的葡萄糖和果糖消耗率分别提高了82.4%和52.8%(图1中c,d),同时该菌株的得率提高了36.8%。
基于上述结果,选择Psbi_07857(P2)和Psbi_06929(P4)在阿维链霉菌和蓝灰链霉菌中微调两组碳源吸收系统。在NEAUTP5P4中,阿维菌素B1a的最高滴度增加到5092mg/L(图2中a)。同样,在ScyTP5P2中,尼莫克丁的最高滴度提高到499mg/L(图2中b)。过表达TP5使阿维菌素B1a和尼莫克丁的得率分别提高了44.6%和52.5%。
上述结果证明:(1)本发明所提出的碳源吸收系统均能够有效提高糖吸收效率,降低糖残留,及增加米尔贝霉素产量和得率;(2)该碳源吸收系统还能够提高另外两种链霉菌的次级代谢产物阿维菌素以及尼莫克丁,预示这两组碳源吸收系统在链霉菌次级代谢产物发酵中的重要应用价值;(3)微调碳源吸收系统的表达使其与宿主的代谢行为适配,对于提高次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。
核苷酸序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种碳源吸收表达系统、重组菌及应用
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3248
<212> DNA
<213> TP2基因
<400> 1
atgaccgtcg ccgccagcag ccctccttcg cgtctgccgt tgcgcggcgc cgagggagtc 60
acagcgaaac gcaaagcccg caaggtccgg gagcgcggag acggagccct cgcggccctc 120
ttcatcgccc ccgccctgct gggctttctg gtcttcctgc tctggccgac gctgcgcggc 180
atctatctga gtttcacccg cttcaacctg ctcaccccgg ccaagtgggt cggcttggac 240
aactacatac gcatggtcca cgacccgatc ttctgggact cgctcaaggt caccgtcgag 300
tacgtggtca tcaacatcgg cgtccagacg gtgtcggcgc tggtgatcgc ggtgctgctg 360
cagcggctga cgcagtcggc ggtgctgcgc gggatcgtgc tggccccgta cctcatgtcg 420
aacgtggtcg cgggcgttgt ctggctgtgg atgctcgaca accagctcgg cataggcaac 480
gagatcatcc agagcctggg cctcgaccgc gtcccgttcc tggccgacga gacctgggcg 540
atccccacca tcgccctgat caacgtatgg cggcacgtcg gctacaccgc gctcctgctc 600
ttcgccggtc tccaggcgat cccgaacgac atgtacgagg cggccaaggt cgacggcgcg 660
agcgaatggc gcatgttctg gcggatcacc atgccgctgc tgcgcccggt gctggcggtc 720
gtcctgatca tgacggtgat cggttcgttc caggtcttcg acacggtcgc cgtgacgacc 780
tcgggcggtc ccgccaacgc caccaacgtg ctccagtact acatctacgg ctccgccttc 840
ggccgcttcc agttcggcta cgcctcggcg atgtccgtcg ccctgttggc cgtcctcagc 900
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catgaccccg ttcgcggtgt tcttcctgcg gcagttcttc atgaacgtgc cccgcgaggt 1560
cgaggaggcc gcgctcctcg acggcgccgg caaggtccgc gtcttcttcc gggtgatgct 1620
gcccatggcg tccaccccga tcctcaccct ggccgtgctg acgtacatca cctcctggaa 1680
cgactacttc tggccgttgc tggtgtccta cagcgacagc tcccgggtgc tcaccgtggc 1740
gttggccatt ttccgcgcgc agacgccgca gaccggcacc gactggtccg gcctgatggc 1800
ggcgactctc atcgccgcac tcccgatgct ggtgctcttc ggcctgttcg cgcgccgcat 1860
cgtcaactcc atcggcttca ccgggatcaa gtaaggggac agtgatgcga attcgtaagg 1920
tggtggcgct ggccggggcg ctcacgctgt ccctgctgac aggctgcgcg aagggcgatt 1980
cggccgggtc gtccgggaac acggtgacgt actggctctg ggactccagc cagttgcccg 2040
cctaccaggc ctgtgccgag ggcttcgaaa agcagaaccc gggcctccat gtcaaaatca 2100
cgcagatggg ctggggggac tactggacca agctcaccgc gagcttcatc gcgggcacac 2160
agccggacgt gttcaccgac cacatccaga agttcgggca gttcgccgac ctcgacgtgc 2220
ttcaaccgct ggacgacctc ggcatcaacg agtccgacta ccagtcgggg ctggcgtcca 2280
gctgggtcgg ccaggacggc caccgctacg gctccccgaa ggactgggac accgtcgcgc 2340
tgttctacaa caagaagatg gctcacgcgg ccgggctgac cgccgaagag ctgaacagcc 2400
tctcctggaa cccgaaggac ggcggcacct tcgagaaggc catcgcccac ctcaccatcg 2460
acaagtacgg caagcgcggc gacgaaccgg gcttcgacaa gcaccatgtc aaggtgtatg 2520
gcctggccac cggaggggca ggcgacagcg acgggcagac ccagtggagc aacttcaccg 2580
cctccgccgg ctggacctac accgacaaga aacggtgggg cacgaagtac cagtacgaca 2640
gcaagacctt ccagtcggtc atcacgtggt acttcgggct ggtgaagaag ggctatctcg 2700
ccccgttcac cgcctacagc gagggcgcga acccgcccaa cgcccagatg ggctcgggca 2760
gggcggcgac cgccttcgac ggcgcctgga tgatctccac gtacgacggc ctcaagggcg 2820
tgaaggtcag caccgccttc acccccgtcg gcccgaccgg caagcgggcg acgatgatga 2880
acggcctcgc cgactcgatc accaagaacg cccgcaacaa gcggggcgcg aagaagtggg 2940
tgaagtatct ggcctcgaac gagtgccaga agacggtcgg cacctacggc atcgtctttc 3000
ccgccactcc cgaaggcacg aacgccgcgg tcgccgctta caagaagaag ggcatcgacg 3060
tcaccgcctt caccaggccg gtcgccgaca agaaggactt caccaccttc tccttcccga 3120
tcaccgacta cgccgcggat gtgtacgcgc tgatgcaccc cgccatgcag gacgtctacg 3180
ccaacgacgc acccgtgagc ggcctcggca aaaccaacga ccagatcaac ttcatcctcg 3240
gccagtga 3248
<210> 2
<211> 3280
<212> DNA
<213> TP5基因
<400> 2
gtgaccctcg cggccgtggc gacgctgggc gccgggttac tcgcgggctg tgccgacgac 60
ggcgatgacg agaccggctc gtccggcggt ggcaagggcg gcaacaaggg cgggacgacg 120
atcacggtcg gcaccttcgg cgtcttcggc tacaagcagg ccgggcttta tgacgagtac 180
atgaagctcc accccgatat caacatcgag gaaacgtcga tcgagcggaa cgagaactac 240
tatccgcagc tgctgaccca cctgggcgcg ggcagcggcc tggccgacat ccaggccatc 300
gagatcgcca atatcacgga gatcaccacc acccaggccg acaagttcgt cgacctctcc 360
aaggcgcccg gggtcaagaa ggacaactgg ctctcctgga agtgggccca ggccaccacc 420
aaggacggca ggacgatcgg cctgggcacc gacatcggcc cgatggccat ctgctaccgc 480
aaggacctct tccagcaggc cgggctgccc accgaccgcg acaaggtcgc caagctgtgg 540
gcaggcgact ggaacaagta catcgagacc ggcaagcagt acatgaagaa ggcgccgggc 600
gacaccgcct tcgtggactc cgccggcggt gtctacaacg cggtgatctc cagcaacgcc 660
aagcgctact acgacgagag cggcaaggtc atctacaagg acagcccggc cgtgaaggag 720
gcgtggaacc tcgcgaccac cgcgtcggag gacaagctga ccgccaagct ccagcagttc 780
cagaagtcct gggaccaggc gtactcgaac ggcaagttcg ccaccgtctc ctgcccgccg 840
tggatgctcg gccacatcaa ggagaaagcc ggggacaagg ccaaggacaa gtgggacgtg 900
gccgcggcgc ccaagcccgg caactggggc gggtccttca tcggcgtgcc gaaggcgtcc 960
aagcaccagg aagaggcgat gaagctcgcc gcctggctga ccgcccccga gcagcaggcc 1020
aagctcttcg agaagcaggc cagctggccg agcgcccagg ccgcgtacag cctgcccacg 1080
gtggccgacg ccaagcaccc gtacttcggc aacgcgccca tcggcaagat cttcgccgag 1140
gccgcgaagg gcatcccgac ccaggtcctc ggtccgaagg accagatcat cgggtcgaac 1200
atcgccgaca tcgggctgct ccaggtggac cagcagggca agtcccccaa ggacgcctgg 1260
aaggccgcca ccaagacgat cgacaacgca ctggaccagt gagcccggga tgacaccccc 1320
ttccggtttc actgctggta cggccgcgcc ccccacaggg caggggggcg cggccccgcg 1380
cgccgtggcc gccaaggccc ccgatccggg cgaggagcgg cggcgcgccc ggcgcagccg 1440
ccgctaccgc tgggacatca agtactcgcc gtacgccttc gtcgccccgt tcttcctctt 1500
cttcgcggtc ttcgggctct tcccgctgct ctacacgggc tgggcctcgc tgcaccgggt 1560
ggagctgacc gaccccaccc atatggagtg ggcggggtgg cacaactact cccggctgtg 1620
ggacgacgaa ttcttctgga acgcgctgca gaacaccttc accatcgggg tgatctcgac 1680
cgtcccgcag ctgctgatgg cgctgggcct cgcgcatctg ctgaactaca agctgcgcgg 1740
ctcgatgttc ttccgggtgg cgatcctcac cccgtacgcc acctcggtgg ccgccgcgac 1800
gctggtgttc gtgctgctct tcgggcgcga ctacggcatg atcaactggg cgctcgggct 1860
ggtcgggatc gacaacatcg actggcagaa cggcacctgg acctcgcagc tcgcggtgtc 1920
cgccatcgtc atctggcggt ggaccggcta caacgcgctg atctatctgg ccgccatgca 1980
ggccgtgccc agcgatctgt acgagtcggc ggcgctggac ggcgcctcgc gctggcagca 2040
gttcctccac gtcaccatcc cctcgctgcg gcccacgatc ctcttcacga tcgtggtctc 2100
gacgatcggg gccacccagc tcttcggtga gccgctgctg ttcaacggcg gcgccggggc 2160
ctccggaggg cccgaccacc agtaccagac gctcggcctg tacctgtacg agcagggctg 2220
gaccaacctc cacctcggcc gggcctccgc gatcgcctgg acgatgttcc tgatcctgct 2280
gctgatcgcc gccgccaacg cgatcgtggc ccgacggctg cgcaagagcc agtgagttgc 2340
ccgagggaga accatgagcg ctgttatctc ttccggtagg gccgccaagg ccaccaaggg 2400
cggaaagagc ccggggagtc ccggcggaaa ggtgagcaag ggggccaagg gcgccggccg 2460
acagctgcac ggcggcaaga tcacctatgc cgtgctgacc ctgttcacca tcggctcgct 2520
cttcccgctg gtgtggacgg ccatcgccgc ctcccgcacc agcacccggc tcgccgagac 2580
gccaccgccc ttctggttcg gcggcaatct cttcaagaac ctggacgcgg cgtggaacga 2640
cgtcaacatg ggcgccgcgc tgctcaacac caccatggtg gccgggacca tcgcggcagg 2700
caccgtgctg ttctccacca tcgccggctt cgcgttcgcc aagctgcgct tccggttcaa 2760
gaatctgctg ctgatgctga ccatcgggac gatgatggtg ccgccccagc tcagcgtggt 2820
cccgctgtac atggccatcg ccaagctgca gtggaccgac cagttgcagg cggtcatcct 2880
gcccacgctg gtcagcgcct tcggggtgtt cttcatgcgg cagtatctga cccaggcgct 2940
gccgaccgag ctgatcgagg ccgcgcgcgt ggacggcgcc agcagtctgc ggatcatctg 3000
gcacatcgtc ttcccggtgg cgcgtccggc catggccgtg ctgggtatgc tcaccttcgt 3060
ccaggcgtgg aacgacttct tctggcccat catcgccctc acccaggccg gcaacccgac 3120
cgtgcaggtg gctctcacgg gcctcggccg cggctatacc gtcgaccagt cgctgatcat 3180
ggctggggcg ctgctcggta ccctgccgct gctgatcgcc ttcgtcctct tcggcaagca 3240
gatcgtcgga ggcatcatgc agggcgcggt caagggctga 3280
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> P2(Psbi_07857)序列
<400> 3
cgctacggcg agcggctgct ggtgcaccac tgggacaacg cactccaggg gccgcgcacc 60
gtcgccgcca atgtggtcgg cagccggacc gcgcatttca ccggttcggt ctacgacccg 120
gtgccgtatt tctggtccga gcagttcggc cgcttcgtgc agtacgcggg ccaccacgcc 180
gccgccgacg aactcgtctg gcgcggcgac ccggagggcg cggcctggtc ggtgtgctgg 240
ctgcgcgacg gggcgctggt cgccctgctg gccgtcggcc gtccgcgcga tctggcccag 300
ggccgcaagc tgatcgagca gggctcccgg ctggaccgcg ccctcgccgc ggacccgtcg 360
gtgccgctca agtcggcggt cctgtgaccc tcggcgcgcc ccggcggtga cccggccgag 420
gcgcggctgg cggtggcgtc acggcaccga tgcccggtgc ccgactaccc actgtcagtc 480
ccagatggca ggcttgtccc 500
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> P4(Psbi_06929)序列
<400> 4
ttacgtcagg cgggcacgat gttctcggcc tgcgggccct tctggccctg ggtgacgtcg 60
aacgagacct tctggccctc gtggagctcg cggaagccct gggcagcgat gttcgagtag 120
tgggcgaaga cgtccgcgcc gccgccgtcc tgctcgatga agccgaagcc cttttccgcg 180
ttgaaccact tcacggtgcc agttgccatg tcattctcct tcgatagggg cagaactgga 240
atccgaacct tacggatccc gtgtcgccgc aatgacccca tccggaatga ccggaaaaac 300
aaaatgcacc tgaccgctac atctgtcagg cgcacataaa gttcatgggt accaaaactg 360
caactgccta acacgctagc acgtgcggcg acggaacggg gggaaccacg ccacccggtt 420
gtgcgcttcc cgccgggcat ccggtgtggg accctggccc caccggctcc cttcctccct 480
cctctccctg ctgaggtcct 500
<210> 5
<211> 500
<212> DNA
<213> P1(Psbi_05102)
<400> 5
gttcacggtg accagcggcg aggtcggcgg gcaggacggg caggacgggc agggcgggca 60
gtctggtcaa gatggccggt ccggccaggg cagccagggc ggccagtccg gtcagtccgg 120
ccagggcgat ggaaccggaa ccagaggcgg aaccgcgagc ggaggccgga gcggggccgg 180
gcaatcgggg cagggcggtg acgccgccca gggtgcgccg ggcaatcgga gcacccccgg 240
cccccagagc gtacggcgga cgctgggggt ggcctccacc atcgagctgt acgacttcgg 300
cgcaccggcc gccgtgacgc tccctaaatc atcggatatt tacacaggaa gggttggatc 360
cccccagacc tagccagcgc atgccgttca gccccgtgaa atggtccatc cgtgccatgc 420
gcggagtgtg taccgatccc tacgctggga agccgctgct cggaagtgct cgcagatgct 480
cgcaggagga ggtgaaacac 500
<210> 6
<211> 500
<212> DNA
<213> P3(Psbi_05776)
<400> 6
acagggccgc ggcgggtgtc gaccggcgat attcagccaa acttccgtgg cgctcttgat 60
cggcttacgg aagcctcgcg gtggtttgcg accgccttgc gccggcctgg cggcggccgc 120
gacggcagcc cggcgggaag tcctcacccc gcacgacacc tgacggtacg tcagtccggg 180
aggcggcatc cgcctcccgg accgctccgc cacccgcggg gaatgaggcg gcggcgtccc 240
ccagcccact gattccgtac agcgggccga cccacgcagg atccatcgaa acgttcccgc 300
gaaccctgag acagagcgca cggacaggcg cacagccaca cacagcagga gcacacaccc 360
cgctccgcac gtccgttcgt acaagaatct cgccatccgg gacaccacct cttaacggtc 420
gggatgcggc gaactacgct gggtttacga atgccccgcg cctatgccgg ggcggccgtc 480
ggtgctgtcg aggggtacgc 500
<210> 7
<211> 500
<212> DNA
<213> P5(Psbi_07859)
<400> 7
atcgggcggt ccacccacgc accggccgag gcggaggccg cggccgtcga gccgggcgtc 60
gactacttct gcaccgggcc ctgctggccc acccccacca agccggggcg gtccgccccg 120
ggcctgtcgc tggtgcgcca cacggccgcc ctgaagcccg ctcggccctg gttcgccatc 180
ggcggaatcg acgcctcgaa cctggacgag gtgctggagg cgggcgcgcg gcggatcgtc 240
gtggtgcggg cgatcaccga ggccgaggac cccggcgcgg ccaccgccga gctggccaag 300
cgggtgcgcg ctcgcgacct gtgagagatg tgccggcccg ctcggtgtcg gctcggcgtc 360
ggcaaagtgt ccgcagtacg gaccaagacc cggcgaaagg ggcataacgt cgctgcccgc 420
tgtccgtgtg ccgcaccgct ggctaacctt cccgtatggc ccttggcaca gcctccacca 480
ggacagatcg cgcgcggaca 500
<210> 8
<211> 500
<212> DNA
<213> P6(Psbi_07683)
<400> 8
tgtcgccgtg cacaccgccg atatacgcgg tcacatcgag attcacgatg tcgccgtcgc 60
gcagcacggt cgaatccggg atgccgtggc agatgacctc gttgacggaa gagcacagcg 120
acttggggaa accgcggtag cccagcgtcg aggggtacgc gccgtggtcg cacagatact 180
catgcgccac ccggtccagc tcatccgtgg tgacccccgg cgcgatccgg ctcgcggcct 240
ccgccatcgc ccgcgcggcg atcccgcccg cgatccgcat ccgctcgatc gtttcggcgt 300
cctgcacctc cgatcccgta tacggcgtcg ggccctcttt gccgacgtac tcggggcggg 360
ggatcgaggc ggggaccggg cgggtgggag agagctttcc cgggacaaga agcgactggc 420
cagacatgtc agcgagtgta tcggcggcgc atcgggcagc atggcgggaa acagggagag 480
acaagggcgg gagggccgcg 500
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> P7(Psbi_04217)
<400> 9
gccacgctcc gtatacagag agtctgccag tcactcatgg cgaccctccg cacttcgagg 60
tgccggaccc tcgtccgggc cgtcggcttc gtcgtacgag ggcaggcggg cgcccctgct 120
ctcagcgatc cgcaacacgt cgcgcagcgc ctcacacagc cgttccgcga ggaagcggag 180
ttctcgcgcg tctgccttgg gggcgtccag cagcgcccgg gcgtgatgga ggagtttcgc 240
acccatcgac acctgcacgg cctcgatcgc atccgcgcgt cggctcagcg ggctgtcccc 300
gtcgtccgac gccaggtaac acggcttgcc gtcggggtcc gaccacggca gcaggcgcag 360
cccggtactc acgttcatca gctccattga ggttcgttca cgctgtgtgg cgctttcctc 420
acagagtggt ggctgttctg gctacgctgc tagcagggcg agcctgacca cgcacctttc 480
aactcgggga gtcacagccc 500
<210> 10
<211> 500
<212> DNA
<213> P8(Psbi_06497)
<400> 10
gggccggggg cagccggctg gtggtcgcgg gccgtgagtc gggcggggtg cagcggctgc 60
agtacgtcga gacggacggc tcgccggctg acgtgccggc cgtgcccggg ccgaacgggg 120
tggaggcggt cgcggccttc gaggggcaga accggccgtt gatcgccgag acgacgaacg 180
acgggattgt gcggctgccg ccgaatacgg actggaagac cgtggccaag gaggggtcgc 240
ttccggtgta tccggggtaa cggctcgcct tcgctgcctc tgcctctgcc tctgcctctg 300
cctctgcctt cgcctccgac tcgacctggc ccccgccctg gacctggtcc tcggccgact 360
gggcgtcgac cggttggctg tcaacaggat gggggcgcgt tcacccggat gggcgcggcc 420
acaccgtggt tggcccgcag ttatccacag ggttgtccac aggagtggcg gggctgtgag 480
ggtgacgcga cagtgggccc 500
<210> 11
<211> 500
<212> DNA
<213> P9(Psbi_03836)
<400> 11
cgggtccgcc gcggcgagcg gctgaccctg acggtcacgg tcaccaccgc ctcccgcccc 60
aacttccacg gcgtcctgcc gcgcctggcc cacctcgacg tgatccgcgg cgcggtccgc 120
ggcccggcgc gcgaccgcga tgcatggcgc gccccggaca cccgcgtcgt acacaccgcg 180
gacgtatccg gccgcaccgg cacgtacacc ctgcggatcc ccctggccag ggccgatgag 240
tccggctacc tccggctccg cggcagcgac ggcaaccgcc acggcacagg cctgctgggc 300
gcggccgtgg acccgcacgg cccgatcccg cacaagccgg gcgacggcga cccgtgggcg 360
gacacctggt gctacacgaa cccgatcttc atcgaggtga cgggctgagg ggagaaggcg 420
gaatcgccgg gccggggtct gcgttgacgt aaatgaggaa ccgcccggaa ccgcgcacgc 480
ctaccgcagg aggattcccc 500
<210> 12
<211> 500
<212> DNA
<213> P10(Psbi_05396)
<400> 12
gggtggaact cgtcgccgaa ctcgtagccg gggccaccgg tgccgttgcc cagcgggtca 60
ccgccctgga tcatgaagcc gctgatcacg cggtggaaga cggtgccgtc gtacagcttc 120
tccttggccc gcttgccggt cgccgggtgg gtccactcac gggtgccctc ggcgagctcc 180
acgaagttct tgaccgtctt gggggcgtgg ttcggcagca gccggaccac gatgtcgcca 240
ttgttcgtct tcagggtggc gtagagctgc tcagccacga tctaccttcc atagttttca 300
ttgcggtccc ttgatcctcg cacggacgcc gcgacgacgc gtacccacga agcggcgcgc 360
ggcacacacg attcataccg gcccggacgg gaacccgtac gtgccccgga tgcccggccg 420
cgcgtgcccg gcaccctgca tacaggcatg atcgtcacaa acaggcatga tctttcatga 480
aacggaaagg ggaggatccc 500
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> TP2-F
<400> 13
cgcaggagga ggtgaaacac gcggccgcat gaccgtcgcc gccagcagcc ct 52
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> TP2-R
<400> 14
aacagctatg acatgattac gaattctcac tggccgagga tgaagttgat c 51
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> TP5-F
<400> 15
cgcaggagga ggtgaaacac gcggccgcgt gaccctcgcg gccgtggcga 50
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> TP5-R
<400> 16
aacagctatg acatgattac gaattctcag cccttgaccg cgccctgcat g 51
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> PhrdB-F
<400> 17
ggactagttc tagaccgcct tccgccg 27
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> PhrdB-R
<400> 18
ataagaatgc ggccgcgaac aacctctcgg aacgttgaaa a 41
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> P1-F
<400> 19
ggctgcaggt cgactctaga actagtgttc acggtgacca gcggcgaggt c 51
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> P1-R
<400> 20
gtgtttcacc tcctcctgcg agcat 25
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> P2-F
<400> 21
ggactagtcg ctacggcgag cggctgctgg tgc 33
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> P2-R
<400> 22
ataagaatgc ggccgcggga caagcctgcc atctgggact g 41
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> P3-F
<400> 23
ggactagtac agggccgcgg cgggtgtcga ccg 33
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> P3-R
<400> 24
ataagaatgc ggccgcgcgt acccctcgac agcaccgacg g 41
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> P4-F
<400> 25
ggactagttt acgtcaggcg ggcacgatgt tct 33
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> P4-R
<400> 26
ataagaatgc ggccgcagga cctcagcagg gagaggaggg a 41
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> P5-F
<400> 27
ggactagtat cgggcggtcc acccacgcac cgg 33
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> P5-R
<400> 28
ataagaatgc ggccgctgtc cgcgcgcgat ctgtcctggt g 41
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> P6-F
<400> 29
ggactagttg tccgcgcgcg atctgtcctg gtg 33
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> P6-R
<400> 30
ataagaatgc ggccgccgcg gccctcccgc ccttgtctct c 41
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> P7-F
<400> 31
ggactagtgc cacgctccgt atacagagag tct 33
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> P7-R
<400> 32
ataagaatgc ggccgcgggc tgtgactccc cgagttgaaa g 41
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> P8-F
<400> 33
ggactagtgg gccgggggca gccggctggt ggt 33
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> P8-R
<400> 34
ataagaatgc ggccgcgggc ccactgtcgc gtcaccctca c 41
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> P9-F
<400> 35
ggactagtcg ggtccgccgc ggcgagcggc tga 33
<210> 36
<211> 41
<212> DNA
<213> P9-R
<400> 36
ataagaatgc ggccgcgggg aatcctcctg cggtaggcgt g 41
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> P10-F
<400> 37
ggactagtgg gtggaactcg tcgccgaact cgt 33
<210> 38
<211> 41
<212> DNA
<213> P10-R
<400> 38
ataagaatgc ggccgcggga tcctcccctt tccgtttcat g 41
Claims (10)
1.一种碳源吸收系统,其特征在于,所述碳源吸收系统含有启动子和吸收碳源的基因,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示,所述吸收碳源的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述的碳源吸收系统的重组载体。
3.含有权利要求1所述的碳源吸收系统的重组菌,其特征在于,所述重组菌的出发菌株为以蔗糖和淀粉中的一种或两种为碳源的链霉菌(streptomyces)。
4.根据权利要求3所述的重组菌,其特征在于,所述链霉菌为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)或蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)。
5.权利要求1所述的碳源吸收系统在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
7.权利要求2所述的重组载体在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
9.权利要求3或4所述的重组菌在提高链霉素次级代谢产物产量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述次级代谢产物包括米尔贝霉素、阿维菌素和尼莫克丁。
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