CN108441459B - 一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用 - Google Patents

一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产两性霉素的重组结节链霉菌及其应用，所述重组结节链霉菌是将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示的透明颤菌血红蛋白(Vhb)、S‑腺苷甲硫氨酸合成酶(Metk)、两性霉素合成基因簇调控因子(AmphRIV)、次级代谢产物全局调控因子(AraC)以及红霉素强启动子ermE*p序列导入结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050获得。通过导入并过表达上述基因，使重组结节链霉菌中，两性霉素B产量提高约45％，副产物两性霉素A产量降低60％，并缩短在发酵过程中菌体生长周期，达到提升生产效率的目的。

Description

一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种通过基因工程手段提高两性霉素B，降低两性霉素A，缩短菌株发酵周期的方法，特别涉及一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用。
背景技术
两性霉素B(Amphotericin B，AmB)属于多烯大环内酯类抗生素，具有抗真菌活性。上个世纪中叶，从奥里诺科河三角洲的土样中分离并鉴定出产生菌，结节链霉菌(Streptomyces nodosus)。近期研究发现，真菌Penicillium nalgiovense也可产生AmB，但产量极低并未实际用于生产。AmB作为七烯大环内酯类抗生素其结构有如下特点：具有7个共轭多稀的大环内酯，C8位羟基、C16位羧基以及C19的海藻糖胺基团。AmB主要用于治疗真菌感染，通过与敏感真菌细胞膜上的甾醇相结合，改变细胞膜的通透性，引起细胞内重要物质渗漏，而使真菌细胞死亡。AmB特别适用于具有生命威胁的全身性真菌感染，如毛霉病、孢子丝菌病和曲霉病等。近期研究发现AmB还有抗病毒、抗寄生虫的能力，如抗朊病毒和美洲利什曼原虫病等。
AmB分子式为C47H73NO17，熔点170℃，旋光度+420，在405、382、362、345、283、273、263、225nm紫外波长下具有吸收峰。AmB为黄色或橙黄色粉末，有引湿性，几乎无臭无味，在光照下宜破坏其结构而导致活性丧失。不溶于水、无水乙醇，在二甲基亚砜(DMSO)中溶解，在二甲基甲酰胺(DMF)中微溶，在甲醇中极微溶解，其溶解度(pH 6-7)均低于1mg/L。结节链霉菌能够同时产生两性霉素A(AmA)和AmB两种成分，AmA的抗菌活力低未在临床应用，两者结构式如图1。
两性霉素作为链霉菌代谢途径中的次级代谢产物，在生长发酵的过程中涉及到大量基因的转录调控，很多内源基因和外源基因对菌体生长和次级代谢产物产量起到重要影响。内源基因中，合成基因簇的AmphH、AmphG是两性霉素合成基因簇的ABC转运蛋白，能够结合与水解ATP，利用ATP的能量跨膜转运各类生物分子，例如糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢物等等；合成基因簇的AmphRIV是两性霉素合成基因簇的转录调控因子，能够对相应的合成基因簇产生调控作用，同时还可以影响氨基酸代谢、核酸辅酶代谢、DNA复制重组修复、呼吸和能量代谢、碳水化合物代谢等；AraC是链霉菌全局调控因子，属于AraC/XylS家族的转录调控蛋白，以转录激活因子的形式参与到碳代谢、形态分化和次级代谢等各类调控过程。
其他外源基因中，红霉素启动子ermE*p作为强启动子已广泛应用于各类链霉菌的基因表达。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因(Metk)用于合成SAM，SAM可作为次级代谢产物的甲基供体，是嘧啶、腺苷、以及多种蛋白、小分子物质甲基化的来源，还可作为抗生素生产基因的转录激活因子，增强Metk基因的表达有助于提升菌体次级代谢产物的合成。透明颤菌血红蛋白基因(Vhb Sequence ID:JN418989.1)发现于透明颤菌(Vitreoscilla)中，能够合成血红蛋白，具有与氧结合并传递的能力。除应用于大肠杆菌、假单胞菌、酵母菌、霉菌外，也成功应用于链霉菌生产莫能菌素(27.9％)、放线红霉素(10倍)、头孢菌素(3.2倍)等。VHb蛋白作用机制的假说首先由Jounalhan B提出，认为血红蛋白能够与自由氧分子进行不可逆结合，并通过氧合物的形式，扩散转移促进氧传递与释放。首先在细菌的质壁空间与氧结合，加速氧在低氧条件下向胞内传递，结合载体VHb-O2为细胞膜的呼吸链提供更多氧气，因此加速了ATP的合成，提高了菌体整个能量代谢水平，特别是在AmB合成过程中，对耗氧量消耗较大，加强细胞自身获氧能力对进一步提升结节链霉菌合成AmB的能力具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一种高产两性霉素的重组结节链霉菌及其构建方法和应用，通过在结节链霉菌中有效表达影响次级代谢产物的内源基因和外源基因，使结节链霉菌合成两性霉素更加高效，提高有效成分AmB产量，降低副产物两性霉素A产量，并缩短在发酵过程中菌体生长周期，达到提升生产效率和产量目的。
本发明所采用的技术方案是
本发明提供一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌，所述重组结节链霉菌是将外源基因导入结节链霉菌获得的；所述外源基因包括透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC、红霉素强启动子ermE*p、ABC转运蛋白基因AmphH、ABC转运蛋白基因AmphG中的2种或多种。
进一步，所述外源基因由透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC、红霉素强启动子ermE*p组成。
进一步，所述透明颤菌血红蛋白基因Vhb核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，两性霉素转录调控因子基因AmphRIV核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，全局调控因子基因AraC核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示，所述红霉素强启动子ermE*p核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。
进一步，所述外源基因由红霉素强启动子ermE*p、ABC转运蛋白基因AmphH和ABC转运蛋白基因AmphG组成。
进一步，所述ABC转运蛋白基因AmphH核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，ABC转运蛋白基因AmphG核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述外源基因由透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC、红霉素强启动子ermE*p、ABC转运蛋白基因AmphH、ABC转运蛋白基因AmphG组成。
进一步，结节链霉菌为结节链霉菌(Streptomyces nodosus)CCTCC NO：M2017426，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2017年7月17号，保藏编号CCTCC NO：M2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请(申请号201710962492.6)中公开。
本发明还提供一种所述高产两性霉素B的重组结节链霉菌在产两性霉素B中的应用，所述应用方法为：将重组结节链霉菌接种至发酵培养基，28℃、220rpm发酵培养完全，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得两性霉素B；所述发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。
进一步，所述重组结节链霉菌发酵前，先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养方法为：将重组结节链霉菌接种至种子培养基中，28℃、220rpm培养46h，获得种子液；所述种子培养基组成：蛋白胨20g/L，NaCl8g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 1g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。
本发明所述重组载体导入宿主菌方法为种属间接合转移方法：
1)将PCR克隆获得的各类基因及强启动子ermE*p插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到各类重组载体pJTU1278；
2)将步骤1)中得到的重组载体转化入大肠杆菌JM109，对得到的转化子进行测序，将测序无误的载体导入供体菌大肠杆菌ET12567/pUZ8002；
3)将步骤2)中得到的含有重组载体的供体菌大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pJTU1278重组载体，通过接合转移方法转化到受体菌中，得到各类产AmB的基因工程菌。
本发明通过在结节链霉菌中过表达透明颤菌血红蛋白(Vhb)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(Metk)、两性霉素转录调控因子(AmphRIV)、两性霉素ABC转运蛋白(AmphH和AmphG)及全局调控因子(AraC)等基因，提高AmB产量，降低AmA含量，缩短菌株发酵周期。
与现有技术相比，本发明取得的技术优势：
1、通过基因工程、代谢工程的技术手段对出发菌株进行改造，提升菌株的质量和生产能力，无需改变原有的发酵生产工艺，例如培养基成分、发酵关键参数和产品制备纯化工艺等。
2、通过增强表达上述基因，使重组结节链霉菌AmB产量提高45％，副产物两性霉素A产量降低60％，并缩短在发酵过程中菌体生长周期，达到提升生产效率的目的，如以同一发酵罐计算，4罐/月提高至5罐/月，产能产值增加25％以上。
3、两性霉素作为微生物发酵抗生素类药物，药物的纯度和质量在生产中至关重要。本发明不仅能提高目标产物产量，还可以降低副产物含量与缩短发酵时间，药物的纯度和质量得到明显改进，有效提升了企业在工业化大生产中的总体效率。
附图说明
图1AmB与AmA结构式。
图2实施例1中pJTU1278载体图谱。
图3实施例2中pJTU-ermE*p-AmphRIV重组载体构建过程及图谱。
图4实施例5中pJTU-VMR4A重组载体图谱。
图5实施例6中pJTU-VMR4HGA重组载体图谱。
图6实施例1-6中涉及到的各类重组载体图谱。
图7实施例8中高效液相色谱(HPLC)检测AmB与AmA。
图8实施例7中摇瓶发酵过程pH变化趋势图。
图9实施例7中摇瓶发酵过程干重变化趋势图。
图10实施例7中摇瓶发酵过程葡萄糖变化趋势图。
图11实施例7中摇瓶发酵过程AmB变化趋势图。
图12实施例9中摇瓶发酵过程AmB变化趋势图。
图13实施例10中摇瓶发酵过程AmB变化趋势图。
图14实施例1-6中涉及到的重组结节链霉菌AmB摇瓶发酵结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1载体pJTU1278接合转移转化受体菌结节链霉菌
A)含载体的E.coil ET12567/puz8002供体菌的准备：
将载体pJTU1278导入E.coil ET12567/puz8002感受态细胞中，利用氨苄青霉素(Amp+，100μg/mL)、氯霉素(Cm+，25μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，通过测序结果证明载体pJTU1278转化入E.coilET12567/puz8002。具体操作如下：
E.coil ET12567/puz8002感受态制备方法如下：
从菌株的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃、200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到20mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，2500rpm，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500rpm，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/EP管，-80℃保藏。
含载体pJTU1278的E.coil ET12567/puz8002供体菌的制备：
取1支上述的E.coil ET12567/puz8002感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278载体质粒，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃、200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于含Kan+(终浓度50μg/mL)+Cm+(终浓度25μg/mL)+Amp+(终浓度100μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养14h。至长出含重组载体pJTU1278的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入10×pfu Buffer 1μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，M13正反引物各0.1μL，pfu DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
将已导入pJTU1278质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度25μg/mL)、Amp+(终浓度100μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度25μg/mL)、Amp+(终浓度100μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.3-0.7。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬，4℃保存备用。
其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min。
B)受体菌Streptomyces nodosus的制备
将Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC NO.M 2017426)接种在GYM平板或斜面培养物上，28℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL 2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL 2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min。
GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂18g，自来水定容至1L，pH 7.2，121℃灭菌20min。
C)供、受体菌接合过程：
将步骤B)500μL热激完的孢子悬液与步骤A)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。28℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续28℃培养10天，至出现转化子。
将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酸和终浓度25μg/mL硫链丝菌素抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050中，最终获得重组基因工程菌，即重组结节链霉菌ZJB2016050-pJTU1278。
其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，用氢氧化钠调至pH 7.2，121℃灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
其中M13验证PCR操作如步骤A)所述。
其中16S rDNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取3μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，16S正反引物各0.1μL，Phanta Max DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
其中16S rRNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中所用引物如下：
16S-8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
实施例2携带ermE*p-AmphRIV基因的结节链霉菌基因工程菌构建
A)以结节链霉菌CCTCC NO.M 2017426基因组为模板，设计针对两性霉素基因簇调控因子基因(AmphRIV,GenBank accession No.CP009313.1SNOD_02710)引物amphRIV-F和amphRIV-R，amphRIV-F为针对AmphRIV基因的正向引物，amphRIV-R为针对AmphRIV的反向引物，从模板中克隆扩增出AmphRIV片段大小777bp左右，经测序分析确认，与目的片段相符，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，胶回收纯化此片段备用。
B)以红霉素强启动子(ermE*p)为模板(GenBank accession No.HM756283.1)，设计引物ermE*p-F和ermE*p-R，ermE*p-F为针对ermE*p基因的正向引物，ermE*p-R为针对ermE*p的反向引物，从模板中克隆扩增出ermE*p，片段大小212bp左右，经测序分析确认，与目的片段相符，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，胶回收纯化此片段备用。
C)将载体pJTU1278用KpnI和XbaI核酸内切酶双酶切，将胶回收后的基因载体片段与步骤B)ermE*p基因和步骤A)AmphRIV基因无缝连接。得到重组质粒载体命名为pJTU1278-ermE*p-AmphRIV，示意图见图3。
按照实施例1的接合转移方法，将构建的pJTU1278-ermE*p-AmphRIV质粒导入Streptomyces nodosus ZJB16050(CCTCC M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-ermE*p-AmphRIV。
其中克隆PCR体系：加入基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：95℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中无缝连接过程：将5×CE II Buffer 4μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的载体DNA1μL和DNA片段各1μL，加入Exnase II酶2μL，加入ddH2O 10μL，37℃反应1小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
ermE*p-F CGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGACGTCCATGCGAGTGTC
ermE*p-R TGGGGGTGTACTCCGCATAAGCTTTGGGGTCCTCCTGTG
amphRIV-F CACAGGAGGACCCCAAAGCTTATGCGGAGTACACCCCCA
amphRIV-R GTGCTTGACATTGGGGGATCCTCAGTCCTTGATGAAGTC
实施例3携带ermE*p-AraC基因的结节链霉菌基因工程菌构建
A)以结节链霉菌CCTCC NO.M 2017426基因组为模板，设计针对全局调控因子基因(AraC,GenBank accession No.CP009313.1SNOD_12635)引物araC-F和araC-R，araC-F为针对AraC基因的正向引物，araC-R为针对AraC的反向引物，从模板中克隆扩增出araC片段大小1227bp，经测序分析确认，与目的片段相符，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，胶回收纯化此片段备用。
B)以重组质粒载体pJTU1278-ermE*p-AmphRIV为模板，设计针对强启动子与pJTU1278载体的引物pE-F和pE-R，从模板中克隆扩增出pJTU1278-ermE*p片段大小为9598bp左右，胶回收纯化此片段备用。
其中克隆PCR程序与无缝连接过程与实施例2中相同，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-ermE*p-AraC。
按照实施例1的接合转移方法，将构建的pJTU1278-ermE*p-AraC质粒导入Streptomyces nodosus ZJB16050(CCTCC M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-ermE*p-AraC。
所用引物如下：
araC-F CACAGGAGGACCCCAAAGCTTATGAGCCACGACTCCACC
araC-R GTGCTTGACATTGGGGGATCCCTACGGTGCGCTGCGCTG
pE-F CAGCGCAGCGCACCGTAGGGATCCCCCAATGTCAAGCAC
pE-R GGTGGAGTCGTGGCTCATAAGCTTTGGGGTCCTCCTGTG
实施例4携带ermE*p-AmphH-AmphG基因的结节链霉菌基因工程菌构建
以结节链霉菌CCTCC NO.M 2017426基因组为模板，设计针对转运蛋白H(AmphH,GenBank accession No.CP009313.1SNOD_02670)引物amphH-F和amphH-R，转运蛋白G(AmphG,GenBank accession No.CP009313.1SNOD_02675)引物amphG-F和amphG-R。从模板中克隆扩增出AmphH片段大小1824bp，AmphG片段大小1821bp，经测序分析确认，与目的片段相符，AmphH核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，AmphG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，胶回收纯化两片段备用。
其中载体片段、克隆PCR程序与无缝连接过程与实施例2中相同，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-ermE*p-AmphH-AmphG。
按照实施例1的接合转移方法，将构建的pJTU1278-ermE*p-AmphH-AmphG质粒导入Streptomyces nodosus ZJB16050(CCTCC M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-ermE*p-AmphH-AmphG。
所用引物如下：
amphH-F CACAGGAGGACCCCAAAGCTTATGGCCCCGTCGGTG
amphH-R ACTCGCATGGACGTCGGATCCTCAGGAACGTCCGGCGCC
amphG-F GGCGCCGGACGTTCCTGAGGATCCGACGTCCATGCGAGT
amphG-R GTGCTTGACATTGGGGGATCCTCAGCCGACCGTCACATC
实施例5携带ermE*p-Vhb-ermE*p-MetK-ermE*p-AmphRIV-ermE*p-AraC基因(VMR4A)的结节链霉菌基因工程菌构建
(1)以实施例2方法构建的重组质粒载体pJTU1278-ermE*p-Vhb为模板，设计针对ermE*p和Vhb基因的引物Evhb-F和Evhb-R，从模板中克隆出片段大小659bp，测序分析确认后，胶回收纯化基因片段备用。
(2)以实施例2方法构建的重组质粒载体pJTU1278-ermE*p-MetK为模板，设计针对ermE*p和metK基因的引物EmetK-F和EmetK-R，从模板中克隆出片段大小1427bp，测序分析确认后，胶回收纯化基因片段备用。
(3)以实施例2方法构建的重组质粒载体pJTU1278-ermE*p-AmphRIV为模板，设计针对ermE*p和AmphRIV基因的引物EamphRIV-F和EamphRIV-R，从模板中克隆出片段大小995bp，测序分析确认后，胶回收纯化基因片段备用。
(4)以实施例3方法构建的重组质粒载体pJTU1278-ermE*p-AraC为模板，设计针对ermE*p和AraC基因的引物EaraC-F和EaraC-R，从模板中克隆出片段大小1445bp，测序分析确认后，胶回收纯化基因片段备用。
(5)将步骤(1)-(4)的基因片段无缝连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-VMR4A，其中载体片段、克隆PCR程序与无缝连接过程与实施例2中相同。
(6)按照实施例1的接合转移方法，将构建的pJTU1278-VMR4A质粒导入Streptomyces nodosus ZJB16050(CCTCC M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-VMR4A。
所用引物如下：
Evhb-F CGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAGACGTCCATGCGAGTGTC
Evhb-R CACTCGCATGGACGTCGGATCCTCACTCGACCGCCTG
EmetK-F CAGGCGGTCGAGTGAGGATCCGACGTCCATGCGAGTG
EmetK-R GGACACTCGCATGGACGTCGGATCCCTACAGCCCCACTGC
EamphRIV-F GCAGTGGGGCTGTAGGGATCCGACGTCCATGCGAGTGTCC
EamphRIV-R TTCATCAAGGACTGAGAATTCGACGTCCATGCGAGTGTCC
EaraC-F GGACACTCGCATGGACGTCGAATTCTCAGTCCTTGATGAA
EaraC-R GTGCTTGACATTGGGGGATCCCTACGGTGCGCTGCGCTGG
实施例6
携带ermE*p-Vhb-ermE*p-MetK-ermE*p-AmphRIV-ermE*p-AmphHAmphG-
ermE*p-AraC基因(VMR4HGA)的结节链霉菌基因工程菌构建
以实施例4中重组质粒载体ermE*p-AmphH-AmphG为模板，设计针对ermE*p，AmphH和AmphG基因的引物EamphHG-F和EamphHG-R，从模板中克隆出片段大小4087bp左右，测序分析确认后，胶回收纯化基因片段备用。
其中载体片段、克隆PCR程序与无缝连接过程与实施例2中相同，其他基因克隆片段与实施例5相同，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-VMR4HGA。
按照实施例1的接合转移方法，将构建的pJTU1278-ermE*p-VMR4HGA质粒导入Streptomyces nodosus ZJB16050(CCTCC M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-ermE*p-VMR4HGA，
携带ermE*p-Vhb-ermE*p-MetK-ermE*p-AmphRIV-ermE*p-AmphHAmphG-
ermE*p-AraC基因。
所用引物如下：
EamphHG-F TTCATCAAGGACTGAGAATTCGACGTCCATGCGAGTGTCC
EamphHG-R ACTCGCATGGACGTCGAATTCTCAGCCGACCGTCACATCG
实施例7摇瓶发酵生产AmB
(1)种子液培养：
将实施例1中Streptomyces nodosus ZJB2016050菌株或平板上的单菌落接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液。
种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO31g，加水定容至1L，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(2)发酵培养
500mL规格摇瓶装样100mL发酵培养基，发酵时按体积浓度2％接种种子液，28℃，220rpm发酵培养168h。发酵过程中，其发酵液中pH变化如图8，菌体干重变化如图9，葡萄糖含量变化如图10。
发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0，121℃灭菌20min。
上述菌株通过摇瓶发酵生产，按照实施例8方法检测，所得发酵液中AmB含量为5158.6mg/L，AmB发酵变化如图11。
实施例8AmB的HPLC检测方法
取实施例7方法获得的发酵液1mL，与9mL DMSO混合，室温下萃取20～30分钟，12000rpm离心5min，取上清用0.45μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。
检测方法：色谱柱为C18柱(150×4.6mm)，柱温25℃，流速1mL/min，进样量20μL，色谱保留时间30min，前15min检测波长为304nm，后15min检测波长为405nm。AmB的出峰时间为20.44min，AmA的出峰时间为10.04min。HPLC检测结果如图7所示。
其中流动相配制方法：1.1g EDTA-Na2和4.1g醋酸钠用蒸馏水定容至1L，取此溶液900mL与700mL乙腈、400mL甲醇混合，乙酸调至pH 5.0。
实施例9多基因过表达(VMR4A)对结节链霉菌产两性霉素作用
将实施例5所得的携带VMR4A基因的重组结节链霉菌ZJB2016050-ermE*p-vhb-ermE*p-metK-ermE*p-amphRIV-ermE*p-araC(VHR4A)，按照实施例7所述方法进行摇瓶发酵试验。同样条件下，以实施例1中重组结节链霉菌ZJB2016050-pJTU1278和结节链霉菌ZJB2016050作为对照。
导入多基因过表达透明颤菌血红蛋白(vhb)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(metk)、两性霉素转录调控因子(amphRIV)和全局调控因子(araC)的基因工程菌，AmB的发酵周期与原始菌株Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC M 2017426)相比缩短36h，与对照菌株ZJB2016050-pJTU1278缩短48h，AmB的产量从4536.9mg/L提高45％为6584.6mg/L，副产物AmA产量降低60％，如图12所示。
实施例10多基因过表达(VMR4HGA)对结节链霉菌产两性霉素作用
将实施例6所得的携带VMR4A基因的重组结节链霉菌
ZJB2016050-ermE*p-vhb-ermE*p-metK-ermE*p-amphRIV--ermE*p-amphHamphG-ermE*p-araC(VMR4HGA)，按照实施例7所述方法进行摇瓶发酵试验。同样条件下，以实施例1中重组结节链霉菌ZJB2016050-pJTU1278和结节链霉菌ZJB2016050作为对照。
导入多基因过表达透明颤菌血红蛋白(vhb)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(metk)、两性霉素ABC转运蛋白(amphH和amphG)、两性霉素转录调控因子(amphRIV)和全局调控因子(araC)的基因工程菌，AmB的发酵周期与原始菌株Streptomyces nodosus ZJB2016050相比缩短24h，与对照菌株ZJB2016050-pJTU1278缩短36h，AmB的产量从4536.9mg/L提高28％为5834.2mg/L，副产物AmA产量降低55％，如图13所示。
实施例11重组结节链霉菌摇瓶发酵生产AmB
将实施例1-6中Streptomyces nodosus ZJB2016050、ZJB2016050-pJTU1278、ZJB2016050-ermE*p-AmphRIV、ZJB2016050-ermE*p-metK、ZJB2016050-ermE*p-vhb、ZJB2016050-ermE*p-amphG、ZJB2016050-ermE*p-AmphH-AmphG、
ZJB2016050-ermE*p-araC、ZJB2016050-ermE*p-VMR4A、
ZJB2016050-ermE*p-VMR4HGA菌株接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，按照实施例6所述方法获得种子液。按照实施例7所述方法进行摇瓶发酵，按照实施例8方法检测，综合比较了所有重组基因工程菌，摇瓶发酵获得AmB的产量，产量分别为5125mg、4543mg、5635mg、5546mg、5264mg、5081mg、5444mg、5237mg、6623mg、5845mg，如图14所示。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 441
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgctggacc agcagaccat caacatcatc aaggccaccg tcccggtcct gaaggagcac 60
ggcgtcacca tcaccacgac cttctacaag aacctgttcg ccaagcaccc ggaggtccgc 120
ccgctgttcg acatgggccg ccaggagtcc ctggagcagc cgaaggccct ggcgatgacg 180
gtcctggcgg ccgcgcagaa catcgagaac ctgccggcca tcctgccggc ggtcaagaag 240
atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtg gccgccgcgc actacccgat cgtcggccag 300
gagctgctgg gcgcgatcaa ggaggtcctg ggcgacgccg ccaccgacga catcctggac 360
gcgtggggca aggcctacgg cgtgatcgcc gacgtgttca tccaggtgga ggccgacctg 420
tacgcccagg cggtcgagtg a 441
<210> 2
<211> 1209
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gtgtcccgtc gcctgttcac ctcggagtcc gtgaccgaag gtcaccccga caagatcgct 60
gaccagatca gcgacaccat tctcgatgcg cttctgcgtg aggacccgac ctcccgggtc 120
gccgtggaga cgctgatcac caccggcctg gtgcatgtgg ccggcgaggt caccaccaag 180
gcctacgcgg acatcgccac gctggtgcgc aacaagatcc tcgagatcgg ttacgactcc 240
tccaagaagg gcttcgacgg cgcctcctgc ggtgtctcgg tgtcgatcgg ttcccagtcc 300
ccggacatcg cccagggtgt ggacacggcg tacgagacgc gtgtcgaggg cgacgacgac 360
gagctggacc ggcagggcgc cggtgaccag ggcctgatgt tcggttatgc gacggacgag 420
acgccgaccc tgatgccgct gccgatcttc ctggcccacc ggctgtccaa gcggctgtcg 480
gacgtccgca agaacggcac gatcccctat cttcgcccgg acggaaagac ccaggtcacc 540
atcgagtacg acggcgacaa ggcggcccgt ctcgacacgg tggtggtctc ctcgcagcac 600
gccagcgaca tcgacctgga gtccctgctg gcccccgaca tccgcgagtt cgtggtggag 660
ccggagctga gggcgctgct ggacgacggc atcaagctgg agaccgacgg ctaccggctg 720
ctggtcaacc cgaccggccg tttcgagatc ggcggcccga tgggtgacgc gggtctgacc 780
ggtcggaaga tcatcatcga cacctacggc ggtatggccc ggcacggcgg cggcgccttc 840
tccggcaagg acccgtccaa ggtggaccgc agcgccgcct acgcgatgcg ctgggtggcc 900
aagaacgtgg tcgccgcggg actggccgcc cgctgcgagg tccaggtcgc ctacgccatc 960
ggcaaggccg agccggtggg cctgttcgtg gagaccttcg gcacggccaa ggtggacgcc 1020
gagaagatcg agcacgcgat cgccgaggtc ttcgacctcc gcccggccgc gatcatccgc 1080
gacctcgacc tgctgcgccc gatctactcc cagaccgccg cgtacggcca cttcggccgt 1140
gagctccccg acttcacctg ggagcgcacc gaccgggtgg acgcgctgcg caaggcagtg 1200
gggctgtag 1209
<210> 3
<211> 777
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
atgcggagta cacccccaca gccccccact gcacgaaggg cgatcatgcc gcaggtcatc 60
aactcaggac gtgagaaggg ctccgtcgcg tccaccccca ccgatcggga aaagagccga 120
gcacgcgacc ttgtcctcga ggacggcaag gcgccgggga ccgagctgct cggccggagc 180
agcagcatca gcctggcccg tctcgaccag gccctgacca tccagcaggc aagcgaggga 240
ttcttctggc agttcggcgg ctcgtccgcg gagctgtgcg gccggacctt cagcgacctg 300
gtccacccca gtgtccagca gccgctgatg cggcagttct ccggcctcat cgagggccgg 360
cgcgaccgct tcgccaccga tgtcatcgcg gtgggacggg acgacgcgac cttcaccgtc 420
cccctgacgg ccctcatggt gcgcggcggg ctcccggacg agtcctcgat cctggtcatg 480
atgcccggcg cggaagccga gtcggccgac tcggaggtcg tcagcggacg cagcaagaag 540
ctcctgagcc cgatcgacgc ccggatactc gaaggcatag cctccggcct ctccacgatc 600
ccgctcgcct cacgactgca tctgagccgg cagggcatcg agtaccacgt gacctgtctg 660
ctgcggaagc tccgggtgcc gaaccgggcc gcgctggtct cccgcgcgta ctccatgggg 720
gtgttgaagg tcggcgtctg gccgccgaag gtggtccagg acttcatcaa ggactga 777
<210> 4
<211> 1824
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atggccccgt cggtgcgctg gccgactccg ttccaacggg cggctgcggg ccgccgtcaa 60
ccggggtgtc attccgtgct gttgagactc atgcgcacac aactgcgccc ctatgccggg 120
tccgttgtcg ctctggtcgt tttgcatctg gtgcagatcc tcggcacgct gctgctgccg 180
acgctgggcg ccgcactcat cgacgaggga gtcgtccgcc acgacagcga ccgcatcggc 240
accatcggcg ccacgatggc cgtggtggcg ctggtgcaga tcgccgcggc gctgggtgcc 300
gcggcgctgg gcgcacgcac ctccaccgct ctcggccggg atctgcggtc cgcggtcttc 360
cgccgggtgc tggacttctc cgcccgtgag atcggccggt tcggcactcc gtccctgctg 420
acccgttcgg tgaacgacgt ccagcaggtg cagaacctcg cccagtccgg cctcggcatc 480
ttcgtggcgg ctcccctgat gtgcctgggc agtgtgctgc tcgcgctgcg ccaggatgtg 540
acgctggccc tgatcctggt cccgatggtg ctggtggtgg ccgtctgctt cggtctgctg 600
ctgtcccgga tggccgcgct gtacgcccgg ctccagcaga cgctggaccg tatcgggcga 660
ctgctgcggg agcgcatcac cggggtgcgt gtggtgcgtt ccttcgcccg cgacgcccat 720
gagggcgagc gcttcacccg caccaacgag gaactcctcg gcctgtccct gggggtgggc 780
cggctcatcg cggtgatgct gccgtcggtg ctgctgctga tgaacctctt caccctgggg 840
ctgctgtggg tgggggcccg ccggatcgac tcgggcagca tgcagatcgg tgcgctcagc 900
gccttcctca gctatctgtc gctcatcctg atgtccgtgg tgatgctcgc cttcgtgttc 960
ctgaacgtgc cgcgggcccg ggtgtgcgcg gagcggatca cggaggtcct ccaggcggag 1020
accgatgtcg tcccgcccgc ctcgccgcgg cccatggcgg gtcccgccgg gcaggtcgag 1080
ctggtgggcg ccgagttccg ctacccaggt gccgagaacg ccgtgctgcg ggatctgtcg 1140
ctgacgctgc ggcccggtga gcgggtcgcg gtcctcggca gcaccggctc cggcaagacc 1200
acgctgctgc atctgatcct gcggctggtc gacgtcaccg cgggcgaggt gcggatcggc 1260
ggcaccgatg tgcgcgaact ggacccgtcg gtgctggccg ccgccgtggg ctatgtgccg 1320
cagcgtccgt atctgttcgc cgggaccgtc gcgagcaatc tgcgcttcgg ccggccggac 1380
gccacggacg aggagctgtg ggaggtgctg cggatcgccc aggcggacgg cttcgtgacc 1440
cggctcggcg gcctcgacac ggagatcgct cagggcggca ccaccgtctc cggcggtcag 1500
cgccagcggc tggcgatcgc acgggcgctg ctgcgccgcc ccgccatcta tctcttcgac 1560
gactccttct cggcgctcga ccagagcacg gaggcggcgc tacggaaggc cctggtgccc 1620
tacaccgagg gcgccaccgt gatcaccgtg gcgcagcgcg tcgcctccgt gcgcgacgcc 1680
gaccggatcg tcctcctgga ccagggcggc atcgccgcca ccggcaccca tgacgcgctg 1740
ctgcgcgaca gtcccaccta ccgcgagatc gcgctctccc agcgcacccg agaggaaacc 1800
gctcatggcg ccggacgttc ctga 1824
<210> 5
<211> 1821
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
atggcgccgg acgttcctga ggagcacgaa gaggagcggg agtcggagca gccggtccgc 60
cggctcgccg ctctgctgcg cccgcaccgc cggtcggtgg gcctcgccct cacggcgggt 120
gtcgtcggca tcctcctcaa cgccttcggc ccgctgctgc tgggccgggt caccgacctg 180
atcgccgacg gcgtcctcgg gcacggcgga ccggccccgg gcgtcgactt cggggcgctc 240
ggcagactgc tgatgatcct gctggtgctg tatgtggtgg catcggtgtt catgctggtc 300
cagaactggc tggtggcctc ggtggtccgc ctgctcatcc acgacctgcg gcaccgggcg 360
caggagaagc tggcgcggct gccgctgcgc tacttcgacc ggaagccggc gggcgagacg 420
ctcagccgcg gcacggacga cgtcgacaac ctccagcaga ccctccagca gaccctgacc 480
gatctgatca gctcggtgtt ctcgctggtc atcatgttgt ccctgatgct gatcatctcg 540
ccctcgctgg ccggggtgat gctgctgagc gtcccggtgt cggggctgct cgccgcctgg 600
atcagcaagc gggcccagcc gcagtacgcg gcccagtggt ccgcgagcgg caagctgacc 660
gcgcatgtcg aggagatgtg cgccgggcac gcgctggtca aggccttcga ccggcgggcg 720
gaggccgagc agcgcttcga cgagcgcaac gaggcggtgt accgggccgg ttcgggggcg 780
cagttcgcgt ccggcgcgat cgagcccgtg atgatgttcg tcgccaacct cggctatgtc 840
gcggtcgccg tcgtcggcgc ctggaaggtc gtcaacggct cactgacgct gggcgatgtg 900
caggcgttca tcctgtacgc acggcagttc agccagccga tcgtggagat cgcctcggtc 960
gcgggccgcc tccagtccgg ggtggcctcc gcgcagcggg tgttcacgct gctggacgcg 1020
ccggagcagg agcccgagcc ggaccgcccg ctcgcggtgg aacgcgtcga gggccgggtg 1080
gagttccagg acgtgtcgtt ccgctactcc cccgacaccc cgctcatcga gggtctttcg 1140
ctgtccgtgg aacccggcag cacggtggcg gtcgtcggac cgagcggcgc cggcaagacc 1200
acggtcgcca atctgctgat gcgcttctac gagatcgact cgggccgcat cctgctggac 1260
ggcaccgaca ccgccgcgat gaaccgcgac gacctgcggt cccgcttcgg cctcgtcctc 1320
caggacacct ggctgttcaa gggcacgatc gccgagaaca tcgcctacgg gtccccgggc 1380
gcgacccgcg ccgacatcgt ggaggcggcc cgcgcgacct acgccgaccg gttcatccgc 1440
accctgtcgc aggggtacga cacggtcctg gacgacgagt cgggcggtgt cagcgccggg 1500
gagaagcagc tgatcacggt cgcgagggcg ttcctcgccc ggccggccgt gctcgtcctg 1560
gacgaggcga ccagctccgt ggacacccgt accgagctgc tgatccagcg ggccatgaat 1620
accctgcggg cgggccggac gagctttgtg atcgcgcacc gtctgtccac catcagggac 1680
gccgatgtca tcgtcgtgat ggagtccggc cggatcgtcg agcagggcac ccatgaccag 1740
ctcatcgacg cccagggagc ctacgcccgg ctgcacgccg cccgcgccga cgcgcccgcc 1800
gccgatgtga cggtcggctg a 1821
<210> 6
<211> 1227
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
atgagccacg actccaccgc cacgccggac ggagcggccc ggaaactgtc cgggcgacgc 60
cgcaaggaga tcgtcgcggt gctgctgttc agcggcggcc ccattttcga gagttccata 120
ccgctgtcgg tgttcggggt tgaccgccag gacgccggag tgccgcgcta ccgactgctg 180
gtggccgccg gcgaggaagg cccgctgcgg accacagggg gcctggaact cagcgcgccg 240
ttcggcctgg aggccgtctc acgggcgggc accgtcgtcg tgccggcctg gcggtcgatc 300
accgcgccgc cgccgcagga ggcgctcgac gcactgcgcc gggcgcatga agaaggcgcc 360
cgcatcgtgg ggttgtgcac cggcgccttc gtactggccg ccgccggact gctggacgga 420
cggccggcca ccacgcactg gatgtacgcg ccgaccctgg ccaagcgcta tccgtcggtg 480
catgtcgatc cgcgcgagct gttcgtggac gacggagacg tgctgacgtc ggccggcaca 540
gcggccggca tcgacctctg cctccatatc gtgcgcaccg accacggcaa cgaggcggcc 600
ggggcgctcg cccgccggct ggtggtcccg ccgcgccgca ccggaggcca ggagcgctac 660
ctcgaccggt ctttacctga ggagatcggc gccgacccgc tcgcggaggt cgtcgcctgg 720
gcgctggagc accttcacga gcagttcgat gtggagacgc tggcggcgcg ggcgtacatg 780
agccgacgga cgttcgaccg gcgcttccgg tcgctcaccg gcagcgcgcc gctgcagtgg 840
ctgatcaccc agcgggtgct gcaggcgcag cggctcctgg agacctccga ctactcggtg 900
gacgaggtcg ccggacgctg cggcttccgc tccccggtgg cgctgcgcgg gcacttccgc 960
cgtcagctcg gctcctcgcc ggccgcgtac cgggccgctt accgggcacg ccggccggga 1020
agcgaccggc cgggggacac ggacggcacc ccggtgccca cggtgcagcc ggtcccgcag 1080
gatacggccc aggtccccct gcagacccgc cgcacggcga ccgcgctcgg cacggccgcg 1140
tccctgacca cggaccacgg caagcacgta ccggaactgt acgcgaccag ccgccccggc 1200
ctgcccggcc agcgcagcgc accgtag 1227
<210> 7
<211> 212
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
gacgtccatg cgagtgtccg ttcgagtggc ggcttgcgcc cgatgctagt cgcggttgat 60
cggcgatcgc aggtgcacgc ggtccatctt gacggctggc gagaggtgcg gggaggatct 120
gaccgacgcg gtccacacgt ggcaccgcga tgctgttgtg ggccaatcgt gccggttggt 180
aggatacaga accactccac aggaggaccc ca 212

Claims (7)

1.一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌是将外源基因导入结节链霉菌（Streptomyces nodosus）CCTCC NO：M 2017426获得的；所述外源基因包括透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC和红霉素强启动子ermE*p。
2.如权利要求1所述高产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述外源基因由透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC、红霉素强启动子ermE*p组成。
3.如权利要求1所述高产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述透明颤菌血红蛋白基因Vhb核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，两性霉素转录调控因子基因AmphRIV核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，全局调控因子基因AraC核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述红霉素强启动子ermE*p核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。
4.如权利要求1所述的高产两性霉素B的重组结节链霉菌，其特征在于所述外源基因由透明颤菌血红蛋白基因Vhb、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因MetK、两性霉素转录调控因子基因AmphRIV、全局调控因子基因AraC、红霉素强启动子ermE*p、ABC转运蛋白基因AmphH、ABC转运蛋白基因AmphG组成。
5.权利要求1所述高产两性霉素B的重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将重组结节链霉菌接种至发酵培养基，28 ℃、220 rpm发酵培养完全，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得两性霉素B；所述发酵培养基组成：葡萄糖70 g/L，牛肉膏8 g/L，大豆蛋白粉8 g/L，棉子粉10 g/L，CaCO3 10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述重组结节链霉菌发酵前，先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度2%的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养方法为：将重组结节链霉菌接种至种子培养基中，28 ℃、220 rpm 培养46 h，获得种子液；所述种子培养基组成：蛋白胨20 g/L，NaCl 8 g/L，葡萄糖15 g/L，酵母粉10 g/L，CaCO3 1 g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。
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