CN114686389B - 一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法 - Google Patents
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-
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Abstract
本发明公开了一种提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强vgbS基因的转录水平，从分子水平上提高微生物发酵过程中的溶氧水平，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法。通过在茂原链霉菌IPIE中，利用TGase的启动子TGasep*过量表达vgbS基因，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株TGS105。增强vgbS基因的转录水平可以有效提高微生物发酵过程中的溶氧水平、有利于谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的是一类以异肽键[ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸]催化蛋白质或多肽链之间的酰基转移反应的转移酶，使Gln残基和Lys残基之间形成共价键，使得蛋白质或多肽发生交联，从而改变蛋白质的功能性质。TGase是一种外分泌蛋白，分子量为37.9kD，由331个氨基酸组成，在胞内以pre-pro-TGase的形式存在，通过跨膜运输，识别信号肽，以pro-TGase的前体蛋白的形式转运到胞外。Pro-TGase不具有催化活性，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP-TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM-TAP切割成为最终成熟的TGase。
基于TGase独特的蛋白交联功能，使其在很多领域中都发挥着重要的作用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高原料的来源及利用率；在生物技术领域，TGase通过对蛋白质进行特异性修饰，从而用于生化检测；在医药领域，因TGase修饰的蛋白结合反应条件温和、操作简单、对药用蛋白原有的性质影响较小等优点，使其可以催化PEG对蛋白进行位点特异性位点修饰，同时，研究发现在TGase的作用下，结合了抗体的细胞毒性药物比非靶向细胞毒性药物安全性高，并且具有更好的治疗效果。
微生物发酵是严格耗氧的过程，由于氧气在浓稠的发酵液中溶解度很低，所以溶氧成为提高产量的瓶颈性因素。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS105，以及一种通过增强vgbS基因的转录水平以提高TGase发酵水平的方法。本发明选择优化后的vgbS基因，通过在茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep*过量表达vgbS基因，可以有效提高微生物发酵过程中的溶氧水平，提升谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种茂原链霉菌IPIE，由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIE，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020197，保藏日期为2020年6月10日。
本发明还提供了一种高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS105，所述菌株通过增强vgbS基因的转录水平而获得的。
进一步地，该菌株由茂原链霉菌IPIE过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因后获得。
进一步地，该菌株通过在茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep*过量表达vgbS基因后获得。
所述菌株的vgbS基因过量表达。
“过量表达”指在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌)，增强vgbS基因的转录水平。
所述菌株含有启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因的表达盒。
所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。
所述vgbS编码基因的序列如下SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。
本发明还提供了所述的表达盒在高效筛选菌株TGS105中的应用。
本发明还提供了一种通过增强vgbS基因的转录水平以提高TGase发酵水平的方法，包括以下步骤：
第一步：设计并构建用于过量表达vgbS基因的整合型质粒载体pTDS105；
第二步：利用整合型质粒载体pTDS105(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有TGasep*启动子)，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌优化后的)，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS105；
第三步：将活化后的vgbS基因过量表达突变株TGS105的孢子接种于种子培养基中，25-35℃、180-220rpm(优选地，30℃、200rpm)培养20-24h(优选地，24h)，以8-15％(优选地，10％)的接种量转接至发酵培养基中，分别于25-35℃、180rpm和25-35℃、150rpm(优选地，30℃、180rpm和30℃、150rpm)的条件下发酵28-32h(优选地，28h)，收集发酵液并进行酶活检测。
步骤一中，所述载体pTDS105的构建方法是：通过PCR扩增得到1008bp的TGpr和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-Kp*的BamHI/EcoRI位点。
步骤三中，所述种子培养基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.5w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·7H2O 0.2w/v％，K2HPO4·3H2O 0.2w/v％，pH 7.4。
步骤三中，所述发酵培养基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.5w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.5w/v％，发酵促进剂0.1-0.3w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·7H2O 0.2w/v％，K2HPO4·3H2O 0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％，pH 7.4。
本发明还提供了一种高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS105的制备方法，包括以下步骤：
(1)：设计并构建用于过量表达vgbS基因的整合型质粒载体pTDS105；
(2)：利用整合型质粒载体pTDS105(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有TGasep*启动子)，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌优化后的)，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS105。
步骤(1)中，所述载体pTDS105的构建方法是：通过PCR扩增得到1008bp的TGpr和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-Kp*的BamHI/EcoRI位点。
本发明还提供了一种vgbS基因，所述vgbS编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种用于表达vgbS基因的基因序列，所述基因序列为TGase的启动子TGasep*的核苷酸序列或者与启动子TGasep*具有90％以上的同源性的核苷酸序列，所述启动子TGasep*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了质粒载体pTDS105的构建方法，通过PCR扩增得到1008bp的TGpr和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-Kp*的BamHI/EcoRI位点，得到质粒载体pTDS105。
本发明还提供了所述茂原链霉菌IPIE在筛选高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS105中的应用。
本发明还提供了所述谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105在提高谷氨酰胺转氨酶发酵产量中的应用。
本发明所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,XinranWang,Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and Engineeringof Post-PKS Modification Bottlenecks for Ansamitocin P-3Titer Improvement inActinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280.BiotechnologyJournal 2017,12,1700484》中记载；质粒pFMVA已经在SCI数据库《Tao Wang,Linquan Bai,Dongqing Zhu,Xuan Lei,Guang Liu,Zixin Deng and Delin You*:Enhancing Macrolide Productionin Streptomyces by Coexpressing Three Heterologous Genes.Enzyme and MicrobialTechnology,2012,50(1):5-9》中记载。
本发明所涉及的菌株茂原链霉菌IPIE由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2020197，保藏日期为2020.6.10。
本发明的有益效果在于，在茂原链霉菌IPIE中，利用整合型载体pDR3-T*，在茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个带有vgbS基因的拷贝，实验室摇瓶水平下较对照菌株(空白载体整合菌株)酶活分别提高12.47％和9.45％。通过本发明可提高TGase的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。
附图说明
图1为vgbS基因过量表达质粒构建示意图；
图2为vgbS基因增强表达突变株与对照菌株TGase发酵产量示意图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
实施例1
本实施例为制备vgbS基因过量表达的突变株TGS105的具体过程，具体包括以下步骤：
第一步：构建质粒pTDS105：以茂原链霉菌IPIE作为模板，使用在两端引入BamHI/NdeI酶切位点的引物TGpr-F/R，通过PCR扩增得到TGpr基因片段(1008bp)；以质粒pFMVA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物vgbS-F/R，通过PCR扩增得到vgbS基因片段(441bp)；BamHI/EcoRI双酶切后的质粒pDR3-K*位点插入酶切后的扩增片段TGpr(BamHI/NdeI)和vgbS(Nde I/EcoRI)，得到质粒pTDS105。
*第一步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：
BamHI识别位点： NdeI识别位点： EcoRI识别位点：
5'...G^GATCC...3' 5'...CA^TATG...3' 5'...G^AATTC...3'
3'...CCTAG^G...5' 3'...GTAT^AC...5' 3'...CTTAA^G...5'
*第一步所用到的引物序列为：
*第一步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：
PCR反应体系：DNA模板30ng，引物F/R 20pmol，50％DMSO 5L，dNTP 10nmol，缓冲液25L，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至30L；
PCR条件：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃15 s，72℃ 30s，循环30次；72℃ 10min。
第二步：利用整合型质粒载体pTDS105(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有TGasep*启动子)，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌优化后的)，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到vgbS基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：
将基因过量表达的质粒pTDS105转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中，将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有Apr、Kan和Chl三种抗生素的LB中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素；同时制备TDS0028孢子预萌发液，收集生长7天的茂原链霉菌IPIE的孢子，50℃热激10min后加2×YT培养基于37℃预萌发2h，然后用新鲜的LB培养基漂洗2次。
所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨1w/v％、酵母提取物0.5w/v％、NaCl 1w/v％，pH7.0；
所述2×YT培养基的组分为：胰蛋白胨1.6w/v％、酵母提取物1w/v％、NaCl 0.5w/v％，pH 7.0。
将茂原链霉菌IPIE孢子预萌发液与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的ISP4固体培养基上，于30℃培养箱倒置培养。16h后取出平板，分别将安普霉素(终浓度50μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度25μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在接合转移平板上，吹干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的高氏I号固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到vgbS基因加倍的突变株。
所述ISP4固体培养基的组分为：可溶性淀粉1w/v％、MgSO4·7H2O 0.1w/v％、(NH4)2SO40.2w/v％、FeSO4·7H2O 0.0001w/v％、K2HPO40.1 w/v％、NaCl 0.1w/v％、CaCO30.2w/v％、MnCl2·4H2O 0.0001w/v％、ZnSO4·7H2O 0.0001w/v％、琼脂2w/v％，pH 7.0-7.4；
所述高氏I号固体培养基的组分为：可溶性淀粉2w/v％、MgSO4·7H2O 0.05w/v％、KNO30.1w/v％、FeSO4·7H2O 0.001w/v％、K2HPO40.05 w/v％、NaCl 0.05w/v％、琼脂2w/v％，pH7.2-7.4。
*第二步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：
PCR体系：DNA模板10～100ng，引物F/R 10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液10μL，加纯水补齐至20μL；
所述2×Mix缓冲液的组分为：Taq DNA Polymerase(recombinant)0.05units/μL、MgCl24mM、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)0.4mM；
PCR条件：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，循环30次；72℃ 10min。
实施例2
本实施例为利用vgbS基因过量表达的突变株TGS105发酵产生TGase的过程。具体步骤如下：将vgbS过量表达的菌株TGS105涂布于高氏I号固体培养基上活化，30℃培养7d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，以10％的接种量转接至发酵培养基中，分别于30℃、180rpm和30℃、150rpm的条件下发酵28h，收集发酵液进行酶活检测。
实施例3
本实施例为利用比色法检测TGase的酶活的方法，具体为：取200μL稀释20倍的发酵液上清于两支试管中，其中一管加入200μL水作为对照，另一管加入2mL 37℃预热好的A液，37℃反应10min后，加入2mL B液终止反应。用1cm的石英比色皿，在分光光度计525nm处测定发酵液的吸光度。最终将OD525带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TGase的酶活。
其中，溶液配制方法如下：
A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物Na-CBZ-GLN-GLY于烧杯中，加350mL水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。
B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl3溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。
图2为vgbS基因增强表达突变株与对照菌株TGase相对发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下，30℃、180rpm的条件下进行发酵，突变株的产量对比野生型菌株提高12.47％；而30℃、150rpm的条件下进行发酵，突变株的产量对比野生型菌株提高9.45％。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏东汇生物科技有限公司
<120> 一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctggacc agcagaccat caacatcatc aaggccaccg tcccggtcct gaaggagcac 60
ggcgtcacca tcaccacgac cttctacaag aacctgttcg ccaagcaccc ggaggtccgc 120
ccgctgttcg acatgggccg ccaggagtcc ctggagcagc cgaaggccct ggcgatgacg 180
gtcctggcgg ccgcgcagaa catcgagaac ctgccggcca tcctgccggc ggtcaagaag 240
atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtg gccgccgcgc actacccgat cgtcggccag 300
gagctgctgg gcgcgatcaa ggaggtcctg ggcgacgccg ccaccgacga catcctggac 360
gcgtggggca aggcctacgg cgtgatcgcc gacgtgttca tccaggtgga ggccgacctg 420
tacgcccagg cggtcgagtg a 441
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgtcgtcct cctggcgatg atggcggcgg agggcacgtc cgtactgcgc aacgtgtacg 60
tgatcaaccg gggttacgag gacctggcgg accggctgaa ctcgatcggc gcccagatcg 120
agatcttccg ggacatctga cggacggatt ccgccgcacc ccgtctgaat tgcttctcgc 180
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ccctcggcag gccacgtccc aggggcactt ccggcgccga tcggccgtgg ctacgcggag 300
atcgcgtcga tggcggcgcc gcctcgggta ccggcgcggg gcgggaagcg ggagttcctc 360
cgcgaagtcg aagtcctcca aggcgagtcc aagcgccttc ccttgcccga ggccagcgcc 420
gaccctgctg cgtcgatgac ggacgcaggc gcaccgagtc ccgcggtctc gctcgcccgg 480
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ccagattcag ccctttcgtc acgttcgcca aaggagttgt tgttcttc 1008
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcggatccg cgtcgtcgtc ctcctggcga 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atatgaattc tcagagctga cgcagcagcg 30
Claims (5)
1.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述菌株TGS105通过增强vgbS基因的转录水平而获得的；
所述菌株TGS105通过在茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因后获得；
所述菌株TGS105的vgbS基因过量表达；所述vgbS编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述菌株TGS105含有启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因的表达盒；
所述茂原链霉菌IPIE的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIE，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2020197，保藏日期为2020年6月10日；
所述启动子TGasep*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。
3.一种增强vgbS基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，通过在茂原链霉菌IPIE中过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因，提高微生物发酵过程中的溶氧水平，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量；所述茂原链霉菌IPIE的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIE，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2020197，保藏日期为2020年6月10日；
具体步骤如下：
第一步：设计并构建用于过量表达vgbS基因的整合型质粒载体pTDS105；
第二步：利用整合型质粒载体pTDS105，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的来源于透明颤菌优化后的vgbS基因，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS105；所述重组突变株TGS105为如权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105；
第三步：将活化后的vgbS基因过量表达突变株TGS105孢子接种于种子培养基中，25-35℃、180-220rpm的条件下培养20-24h，以8-15％的接种量转接至发酵培养基中，分别于25-35℃、180rpm和25-35℃、150rpm的条件下发酵28-32h，收集发酵液并进行酶活检测。
4.如权利要求3所述的提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，
所述种子培养基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.5w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；
所述发酵培养基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO4·7H2O 0.1-0.5w/v％，K2HPO4·3H2O 0.1-0.5w/v％，发酵促进剂0.1-0.3w/v％，pH7.4。
5.如权利要求1或2所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105在提高谷氨酰胺转氨酶发酵产量中的应用。
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