CN114540397B

CN114540397B - 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法

Info

Publication number: CN114540397B
Application number: CN202210225250.XA
Authority: CN
Inventors: 白林泉; 刘先; 步建国
Original assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-03-07
Also published as: CN114540397A

Abstract

本发明公开了一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，是通过在茂原链霉菌C2中，利用强启动子kasOp*分别过量表达调控蛋白基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961，得到TG酶产量提高的突变株。增强调控蛋白基因的表达可以强化正调控，由此来提高TG酶产量。本发明实施例中所得的工程菌株LX‑55、LX‑56、LX‑58的TG酶发酵终产量较野生菌株分别提高33.33％、16.65％、69.76％。通过本发明可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

Description

增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，尤其涉及一种通过增强正调控基因的表达，强化对谷氨酰胺转氨酶(TG酶)的正调控，提高TG酶发酵水平的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TG酶是外分泌蛋白，在胞内为pre-pro-MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro-TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP-TGase，再经丝氨酸蛋白酶 SM-TAP切割成为最终成熟的TG酶。TG酶作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块，提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TG酶制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。在TG酶发酵过程中，茂原链霉菌调控途径并不明确，是工业上限制TG酶产量提高的关键因素。在本发明中，通过亲和层析和质谱鉴定，找到了正调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341和SMDS_3961。过量表达正调控蛋白编码基因可以明显提高TG酶产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。本发明通过过量表达茂原链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4036、 SMDS_2341、SMDS_3961，可以增强对TG酶的正调控，最终可明显提高TG酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明涉及一种过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，过表达茂原链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341或 SMDS_3961；强化对TG酶的正调控，进而提高TG酶产量。

作为一个实施方案，所述调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341和SMDS_3961的依次序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3所示。

作为一个实施方案，所述方法包括如下步骤：

S1、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_4036的整合型质粒载体I；

S2、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_2341的整合型质粒载体II；

S3、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_3961的整合型质粒载体III；

S4、整合型质粒载体I-III分别通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌C2中进行位点特异性重组；

S5、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，分别得到基因过量表达的重组突变株。依次记为LX-55、LX-56、LX-58。

作为一个实施方案，所述方法还包括所述重组突变株发酵获得TG酶的步骤。

作为一个实施方案，所述发酵包括：将活化后的所述重组突变株的孢子接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％接种量转接至发酵培养基中，30℃、200rpm条件下发酵30h，收集发酵液并进行酶活检测。

作为一个实施方案，所述种子培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2w/v％。

作为一个实施方案，所述发酵培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％。

第二方面，本发明还涉及一种用于过表达调控蛋白编码基因的整合型质粒载体，所述载体包含源于茂原链霉菌C2的调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341或 SMDS_3961。

第三方面，本发明还涉及各整合型质粒载体的构建方法；

A1、质粒载体I的构建步骤是：通过PCR扩增分别得到(282bp)含有SMDS_4036 基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型载体(ΦC31整合位点，pSET152 衍生，带有kasOp*启动子)的NdeI/EcoRI位点。

步骤A1中，PCR引物序列如SEQ ID NO.4、NO.5所示。

A2、质粒载体II的构建步骤是：通过PCR扩增分别得到(3303bp)含有SMDS_2341 基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型载体(ΦC31整合位点，pSET152 衍生，带有kasOp*启动子)的NdeI/EcoRI位点。

步骤A2中，PCR引物序列如SEQ ID NO.6、NO.7所示。

A3、所述质粒载体III的构建步骤是：通过PCR扩增分别得到(1212bp)含有SMDS_3961基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型载体(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)的NdeI/EcoRI位点。

步骤A3中，PCR引物序列如SEQ ID NO.8、NO.9所示。

第四方面，本发明还涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株，在茂原链霉菌 C2中分别过量表达序列依次如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3所示的调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961。

第五方面，本发明还涉及一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株，将如前所述的整合型质粒载体，或如前所述方法构建得到的整合型质粒载体分别接合转移导入受体菌茂原链霉菌C2中进行位点特异性重组获得所述菌株。

本发明所涉及的菌株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)C2由江苏东汇生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020194，保藏日期为2020年6月10日。

本发明从上游胞内产物合成调控的角度出发，从源头上增加酶原合成，进而实现高产。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)在茂原链霉菌C2中，过量表达调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341、 SMDS_3961，本发明所得到的工程菌株的TG酶产量大幅提高。

2)本发明通过增强正调控来提高TG酶发酵水平，最终TG酶发酵产量分别提高了33.33％、16.65％、69.76％；通过本发明可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为基因SMDS_4036过表达质粒构建示意图；

图2为基因SMDS_2341过表达质粒构建示意图；

图3为基因SMDS_3961过表达质粒构建示意图；

图4为基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961过表达突变株与空载对照菌株的 TG酶发酵产量对比示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备调控蛋白编码基因过表达突变株(LX-55、LX-56、LX-58)的具体过程。具体包括以下步骤：

步骤一：质粒I的构建，如图1。以茂原链霉菌C2基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_4036-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_4036基因片段(282bp)。在整合型载体pLQ646(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp* 启动子)的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒I。

本发明所涉及的质粒pLQ646已经在SCI数据库文献《Xinran Wang,Rufan Wang,Qianjin Kang,Linquan Bai*:The Antitumor Agent Ansamitocin P-3 Binds to CellDivision Protein FtsZ in Actinosynnema pretiosum.Biomolecules,2020,10,699》中记载。

步骤二：质粒II的构建，如图2。以茂原链霉菌C2基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_2341-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_2341基因片段(3303bp)。在整合型载体(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒II。

步骤三：质粒III的构建，如图3。以茂原链霉菌C2基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_3961-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_3961基因片段(1212bp)。在整合型载体(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒III。

*上述步骤一至三中涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：

NdeI识别位点： EcoRI识别位点：

5'...CA^TATG...3' 5'...G^AATTC...3'

3'...GTAT^AC...5' 3'...CTTAA^G...5'

*上述步骤中所用到的引物序列如表1所示：

表1引物序列表

*步骤一至三中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；

PCR条件：95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 30s-2min；循环30次；72℃ 10min。

步骤四：分别将第一至三步构建得到的过量表达的质粒载体I、II、III通过接合转移导入茂原链霉菌C2中进行位点特异性重组，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SMDS_4036、SMDS_2341和SMDS_3961基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：

将质粒载体I、II、III分别转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应 ET12567(pUZ8002)接种于含有1‰Apr、Kan和Chl三种抗生素的LB中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时刮取茂原链霉菌C2新鲜孢子(约7d培养物)到2×YT溶液中，50℃热激10min，加入孢子预萌发液，37℃预萌发2h，用2×YT溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的 ISP4MYM固体培养基上，于30℃培养箱倒置培养。16h后取出平板，分别将安普霉素 (终浓度50μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度50μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在ISP4MYM固体培养基上，将固体培养基晾干后至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其转接于含有1‰安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的ISP4MYM固体培养基上扩大培养得到单菌落。通过菌丝体PCR验证筛选得到 SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961基因加倍的突变株。

ISP4MYM培养基配置方法如下：

ISP4(Difco)37g，甘露醇1g/L，酵母提取物1g/L，麦芽提取物2.5g/L，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。

*步骤四中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10～100ng，引物10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液 10μL，加纯水补齐至20μL；

PCR条件：95℃ 10min；95℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 30s-2min；循环30次；72℃ 10min。

*上述步骤中所用到的引物序列如表1所示。

实施例2

本实施例为利用调控蛋白编码基因过量表达突变株LX-55、LX-56、LX-58发酵产生TG酶的过程。具体步骤如下：将调控蛋白编码基因过量表达突变株LX-55、LX-56、LX-58 涂布于固体ISP4MYM培养基上活化，30℃培养5-7d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，按10％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200 rpm条件下发酵30h，收集发酵液进行酶活检测。

表2种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为利用比色法检测TG酶的酶活的方法。具体为：取100μL发酵液上清于试管中，其中一管加入100μL Tris-HCl作为对照，加入1mL 37℃预热好的A液，37℃反应10min后，加入1mL B液终止反应。用1cm的石英比色皿，在紫外分光光度计525 nm处测定反应液的吸光度。最终将OD₅₂₅带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TG 酶的酶活。

其中，溶液配制方法如下：

A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物Na-CBZ-GLN-GLY于烧杯中，加350mL水，调节pH为6.0，加水定容至400 mL。

B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl₃溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。

图4为基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961过量表达突变株与空载对照菌株的TG酶发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下突变株的产量对比野生型菌株分别提高33.33％、16.65％、69.76％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

泰兴市东圣生物科技有限公司

<120> 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法

<130> KAG48357

<141> 2022-02-24

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 282

<212> DNA

<213> Streptomyces mobaraensis C2

<400> 1

atgaaccgca gtgagctggt ggccgctctg gccgaccgtg ccgaggtgac ccgcaaggac 60

gccgacgccg ttctggccgc cctcgccgag accgtcggtg aggtcgtcgc caagggcgac 120

gagaaggtga ccatccccgg cttcctgacc ttcgagcgca cccaccgtgc cgctcgcacc 180

gcccgtaacc cgcagacggg cgagccgatc cagatcgctg ccggttacag cgtgaaggtc 240

tccgcgggct ccaagctcaa ggaagccgcg aagggcaagt aa 282

<210> 2

<211> 3303

<212> DNA

<213> Streptomyces mobaraensis C2

<400> 2

atgcagaact cgctgaccgc gctgcggcag gaccaccgcg cggaagtcga gggcctgctg 60

gagcgggcga tcggggagga ggtgcggcgg tcgggtgggc gtgtcgacgg tgatgtgctg 120

ctgcggcggg cgcgcgagga gttggacgcg ctggcccggg cggcggccga ggagtacgcg 180

gcgtacgtcc gggcgctgga cgaggaggcc gcggccgtcg ggccgttgtc cgcgcgcttg 240

tcgggggccg cgctcggtac gcccatgctg gtgacggccg tgacggcggt gacggccctc 300

ggggccgatc tggggtacgg gacgtccacg ggcaccgccg tcagcacggc ggtggcggtg 360

gccctcgcgg gctccgtggc gacgctcgcg aagctgacgg ccggccattg gccggcccgt 420

caccgacggg ccgggctgcg cggacagccg ggcggggcag agcagttgag acttcagtgg 480

cggacggcgg tggaggtacg gggtatccgg ccgttcctcg accggcagcg gatgcttcag 540

ggagcgaaca acggcaaaag cccggcgggg agcaagccgg ggacgggcgg ttcgtcgcga 600

gggccgcaac tgcgcggcgg cgaccgcagc gcgatggccc ggcagcgcag cctcctggcc 660

cgttccttcg atgatctccc gcaggacgac ggggtgttcg ccgggcgtaa ggcccaggtg 720

gaccggatcg cccagtgggt gcgccaggcc cgggcgagca ccgagacgaa accgacggtc 780

gtggtgctgc acggtccgcc gggggtgggc cggtccgcgt tggcgctgcg cgccgcacat 840

caactgcggg atcagttccg gggcgcctgc ctggtggatc tgcgcggcga gagccaggag 900

gagccgccgc tgccgacccg cgacgcgctg ctgcacctgc tcaaccggct cggcgcccct 960

cgcgaccagt tgcttttccg ggaacgctcc tcgcgcgagc agcacctcag gcggctgtcc 1020

gaggtgtacc acaagcacct cgcccggctg ccggtgacga tcgtgctgga cgacgcgtcc 1080

gacgcggagc aggtgcgcgc cctggtgccc gaccggtcgg agagcctggt gctggtcacc 1140

tcccgcgagc cgctggagct gccgaccgag ttggaggcgt gggtgcacca gctggaggtc 1200

ggcccgctgg acgaggcggg cgcggaggaa ctgctgcgct cggtcaccgc gccggaggag 1260

gaacgcgagg acggcaccgc acaggaggac gaactgtacg acgcccagtc gctcacccgc 1320

gtaagggagt tgtgcggcgg tctgccgctg gccctgcgag tggccgggtc ctcgctcggc 1380

gcgcggacgc cgcgcgcgct ggccgtggag ctggaggcgg cgggccagaa cggtccggtg 1440

gaacgggccc tgtggctgcg ctacatggac cagggagagg acgcccggcg gctgctgcgg 1500

cggctcgcgc tggccggccg ggcgtccctg ggcgcggccg ccgcggcggc cctgctcgcg 1560

gccgacggcc aggaggcgac gcagcggctg acggagctgg cacgggccgg gctgatcgaa 1620

ccggtgcgcc ccgggcgcta ccggatgcac gatctggtac gggacttcgc gcacgcgcgg 1680

ctgcacgagg aagaggatcc cggggagcgg ggggcggccc aggagcggct gatccgcagt 1740

tatgccgagc tcgccgacac ggtcatccga atggtggacg gcaagacgtc gacgcgcgcg 1800

gacatgttct cccaaggcgc ggccggaggc cacggattcc cgtcgctgga cgcggccctg 1860

cgctggctgg acgacgagtc gagtttcatc acggccgcgc tccggcacgc ggagggcgtc 1920

gaccagtcgg cggtgctgca cctgctgggc gccctgtgcg actactgcct gctccgcggg 1980

gacctttacc ggctcggcga gctgagcgag ctgacgcagg ccacggaccg ggagttgctg 2040

acccgctccg tgcagtggcg cacgggtgtg gccgcccggc agctcggtga gctggacact 2100

tcccggacga cgctgacgtc ggtggtggac ctgtacctcg acgcccagca ccacgcgggc 2160

gcggcacggg ccctgcgcga cctgggcatc accctccagc accaggggaa cctcaaggag 2220

gccgcggcga agctgcgaga ggcgctggag ttgcaggcgg cccccgagct gagcggtgac 2280

cgggcgtgga cgatgcacgc gctggccgcg gtggagcgcg accgcggccg gctggcggag 2340

gcgctggacc tgctggccgt ggcgctggag ctgcaccggg agagcgaaag cctgcacggc 2400

caggcgtggg cgcacttcca gctgggccag gtacggctgc gcatgggccg ccccgagccg 2460

gcggaggccg agctgcgcca ggcgctggag ctgtacgggc ggacgcagga cggtcggggc 2520

gcggcgtggg ccctcaccca gctggcgcgg ggccggctga tagccgggga cgcggcggcg 2580

gccgtggagg gtctccggca ggccgtctcc cggcaccggg agcacgagga cgcgcggggt 2640

gaggcgtgga ccctgttcta cctgggccag gccctggagg agctgggcga tctgccggcc 2700

gcgctgcggg agctggaacg ggcccggacg atgttcaacc ggatgcgtga cgtgtacggg 2760

ctggcctgtg cccgtcacca ctcggcgcgg gtcacccgcg accagcgggc ggcccagacg 2820

gggagcctgc ggaacagcgg tttcgcccgg cagctgctcc aggacgcgcg gctggacttc 2880

cagcgggtgg gcgtcgcgca cggcgaggcg tggtcgtgcc tggagctggc ggtggtcgac 2940

gcggggaacg ggaggctgga gcaggcgctg gagctgacgg aggaggcgga gcggctgttc 3000

accgggttcg gcgaccggcg cggcgagagc tgggcgcgtt tcctgcgctg caccttgctg 3060

ccgttcgtgt caccgggcgg ctcggtggtg ggcgcggccg tcgccgggga ggacctggcc 3120

cgcctgcggc gcgagctgcg gggtgcggac tgggccgtgg acccggctct ggagcagtac 3180

gcggaggcgt acgcgctggt gctggagcgc ggggtggagc cggagaccgg gtggcaggcg 3240

tggcgcctgg gcatggtgcc gggacggcgg gcacgggagg tgatggccgt gctgccgcgt 3300

tga 3303

<210> 3

<211> 1212

<212> DNA

<213> Streptomyces mobaraensis C2

<400> 3

atgagtgagt ggcccgaagt gcggaacaac gaccgccggt acccgtatgg aggcgacggc 60

gggcgcccgc gcgcgtccca gggcggaccg ccgccgcagt acggacagcc cggccggtcc 120

ggcgcgcccg gtggccaccg tgacgacggt tacaacaccg gccaggtcta cgggcacggc 180

ggcggcccgg ccgcgccgcg cggcggcggg cccggccgga cgagccggcc gaactggcgc 240

aagcggatca ccataggtct gctcgccttc ctcgccgtgg tgctggtggt ctccgtgagc 300

acctacttct gggccgactc gaagctgcgc cgcgaggtcg acctcgggaa ggtggaggag 360

cgcccgccgg gcggcgaggg cacgaactac ctgatcgtcg gctcggacag ccgggaggga 420

ctgtccgacg aggacaagaa ggaactgcac accgggtcgg ccgacggcaa gcgcaccgac 480

tcgatgatga tcctgcatac cggtgacaac ggcaccacca tgctcagcct cccccgggac 540

tcgtacgtca cgatcccggc cttcaccggg cagaagaccg gcaagcggtt ccccgcctcc 600

acccacaagc tcaaccaggc gtatgcggac ggcggtcccg aactgctcgt ccgcaccatc 660

gagttcaaca ccgggctgcg catcgaccac tacgcggaga tcggcttcgg cgggttccgc 720

agcctggtcg actcgctcgg cggggtcgac atgtgcctgg acaagccgat caaggaccgt 780

gactcgggcg ccgacctcaa ggccggctgc cagacgctgg acggcaagca gtcgctggcc 840

ttcgtccgcc agcgccacca ggaggccgac caggacctcg gccggatgcg caaccagcag 900

aagttcctga acaccctcgc caagcaggcg gcctcgccgt ccaccgtgct caacccgttc 960

accctctacc cggtgatcgg ctccggcctc gacaccctgg tcgtcgacga cgacatggag 1020

ctgtgggacc tgacgtcgat gttctgggcg atgaagggtg tcacgggcgg cgacggcaag 1080

cagatgacgg tgccgatagg caacgccaac ctggccacgc gcggcgacgg cgtcgcggtg 1140

aagtgggacc cggtcaagtc gaagcagctc ttcgagcagc tcaagaagga cgagaaggtc 1200

acggtgggat ag 1212

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

attacatatg atgaaccgca gtgagctggt 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atatgaattc ttacttgccc ttcgcggctt 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

attacatatg atgcagaact cgctgaccgc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atatgaattc tcaacgcggc agcacggcca 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

attacatatg atgagtgagt ggcccgaagt 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atatgaattc ctatcccacc gtgaccttct 30

Claims

1.一种过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，其特征在于，在保藏编号为CCTCC NO. M 2020194的茂源链霉菌C2基因组中过表达调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341或SMDS_3961；所述调控蛋白编码基因SMDS_4036、SMDS_2341、SMDS_3961的序列依次如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3所示。

2.如权利要求1所述的过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_4036的整合型质粒载体I；

S2、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_2341的整合型质粒载体II；

S3、构建用于过表达调控蛋白基因SMDS_3961的整合型质粒载体III；

S4、整合型质粒载体I-III分别通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌C2中进行位点特异性重组；

S5、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，分别得到基因过量表达的重组突变株。

3.如权利要求2所述的过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，其特征在于，所述方法还包括所述重组突变株发酵获得TG酶的步骤；所述发酵包括：将活化后的所述重组突变株的孢子接种于种子培养基中，30°C、200 rpm条件下培养24 h，按10%接种量转接至发酵培养基中，30°C、200 rpm条件下发酵30 h，收集发酵液并进行酶活检测。

4.如权利要求3所述的过表达调控蛋白编码基因以提高TG酶发酵水平的方法，其特征在于，所述种子培养基包括甘油2w/v%，酵母提取物0.6w/v%，鱼粉蛋白胨2.5w/v%，MgSO₄•7H₂O 0.2w/v%，K₂HPO₄•3H₂O 0.2w/v%；

所述发酵培养基包括甘油2w/v%，酵母提取物0.6w/v%，鱼粉蛋白胨2.5w/v%，MgSO₄•7H₂O0.2w/v%，K₂HPO₄•3H₂O 0.2w/v%，发酵促进剂0.1w/v%。

5.一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株，其特征在于，在保藏编号为CCTCC NO.M 2020194的茂源链霉菌C2中分别过量表达序列如SEQ ID NO.1所示的调控蛋白编码基因SMDS_4036、序列如SEQ ID NO.2所示的调控蛋白编码基因SMDS_2341、或序列如SEQ IDNO.3所示的调控蛋白编码基因SMDS_3961。