CN113980982B - 增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法。通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中，利用强启动子kasOp*分别增强表达安丝菌素体内靶标蛋白APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，得到高产安丝菌素的突变株HQG‑01、HQG‑02、HQG‑03和HQG‑04。与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株HQG‑01、HQG‑02、HQG‑03和HQG‑04发酵产量分别提高了24.1％、66.5％、71.5％和93.5％，实验室摇瓶发酵水平分别达到57.1mg/L、76.6mg/L、78.9mg/L和89mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；尤其涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的转录水平以提高安丝菌素发酵水平的方法；通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中利用强启动子kasOp*增强表达内源的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，可以提高珍贵束丝放线菌的生物量，降低其胞内毒性，解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高安丝菌素产量。
背景技术
安丝菌素是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体-药物偶联物(ADC)。目前，衍生于安丝菌素的多种ADC药物已经进入不同的临床检定阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine(即T-DM1)已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真菌、酵母、昆虫等其它真核生物的生长与繁殖。
在安丝菌素的产生菌ATCC 31280的发酵过程中，安丝菌素会对细胞的生长和生理活动造成影响，此时，细胞的自身防护机制将会响应安丝菌素的进一步合成。通过化学蛋白质组学信息，我们找到了四个参与了安丝菌素合成相关的基因：APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307。增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达可以提高产生菌的生物量，降低安丝菌素对宿主的毒性，解除对安丝菌素合成的抑制，最终提高安丝菌素的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；本发明通过增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达水平以提高安丝菌素发酵水平，获得的高产安丝菌素的突变菌株(HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04)，基于增强表达内源安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，最终提高安丝菌素的产量。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一方面，本发明提供一种提高安丝菌素发酵水平的方法，在珍贵束丝放线菌中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株，发酵获得安丝菌素；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765、APASM_6307中的一种或几种，其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
作为本发明的一个实施方案，所述珍贵束丝放线菌包括Actinosynnemapretiosum subsp.pretiosumATCC 31280。
进一步的，所述安丝菌素高产菌株由珍贵束丝放线菌ATCC 31280增强表达来源于珍贵束丝放线菌ATCC 31280的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765或APASM_6307后获得。
作为本发明的一个实施方案，在ATCC 31280中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于增强表达基因APASM_0666的整合型质粒I；
S2，设计并构建用于增强表达基因APASM_1807的整合型质粒II；
S3，设计并构建用于增强表达基因APASM_5765的整合型质粒Ш；
S4，设计并构建用于增强表达基因APASM_6307的整合型质粒IV；
S5，通过接合转移将整合型质粒I、II、Ш、IV分别导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并挑取菌丝体通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因表达突变株。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取882bp的APASM_0666基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。
作为本发明的一个实施方案，使用引物APASM_0666-F/R，通过PCR扩增得到APASM_0666基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取861bp的APASM_1807基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。
作为本发明的一个实施方案，使用引物APASM_1807-F/R，通过PCR扩增得到APASM_1807基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取729bp的APASM_5765基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。
作为本发明的一个实施方案，使用引物APASM_5765-F/R，通过PCR扩增得到APASM_5765基因片段。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从ATCC 31280基因组中获取993bp的APASM_6307基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。
作为本发明的一个实施方案，使用引物APASM_6307-F/R，通过PCR扩增得到APASM_6307基因。
作为本发明的一个实施方案，受体菌株为珍贵束丝放线菌Actinosynnemapretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280。所述基因增强表达突变株依次记为HQG-01、HQG-02、HQG-03、HQG-04。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵包含下列步骤：将安丝菌素体内靶标蛋白基因增强表达突变株(HQG-01、HQG-02、HQG-03或HQG-04)在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后收集发酵液并进行萃取。作为一个具体实施例，将安丝菌素高产菌株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后收集发酵液并进行萃取。作为具体对比示例，将野生型ATCC 31280与基因增强表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体在一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后收集发酵液并进行萃取。
作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基包括0.4w/v％的酵母提取物、1w/v％的麦芽提取物、0.4w/v％的葡萄糖、1.6-2％的琼脂粉。作为具体示例，所述固体培养基包括0.4w/v％的酵母提取物、1w/v％的麦芽提取物、0.4w/v％的葡萄糖、1.6-2％的琼脂粉。
作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.5w/v％、蔗糖10.3w/v％。二级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.8w/v％、蔗糖10.3w/v％、异丁醇0.05v/v％、异丙醇0.05v/v％。作为具体示例，所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.5w/v％、蔗糖10.3w/v％；二级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.8w/v％、蔗糖10.3w/v％、异丁醇0.05v/v％、异丙醇0.05v/v％。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基包括酵母提取物1.6w/v％、麦芽提取物1w/v％、蔗糖10.3w/v％、淀粉2.5w/v％、异丁醇0.5v/v％、异丙醇1.2v/v％、MgCl22mmol/L。作为具体示例，所述发酵培养基包括酵母提取物1.6w/v％、麦芽提取物1w/v％、蔗糖10.3w/v％、淀粉2.5w/v％、异丁醇0.5v/v％、异丙醇1.2v/v％、MgCl2 2 mmol/L。
本发明还涉及一种高产安丝菌素的珍贵束丝放线菌，在珍贵束丝放线菌中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及高产安丝菌素的突变菌株HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04。其技术要点是：所述菌株的安丝菌素体内靶标蛋白基因的增强表达。
本发明还涉及一种用于增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因的整合型质粒载体，所述载体包含靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307；其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)通过在珍贵束丝放线菌中分别增强表达靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，可以增加珍贵束丝放线菌的生物量，降低其胞内毒性、解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高安丝菌素产量；
2)本发明中通过在珍贵束丝放线菌中增强表达靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，得到高产菌株；与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04发酵产量分别提高了24.1％、66.5％、71.5％和93.5％，实验室摇瓶发酵水平分别达到57.1mg/L、76.6mg/L、78.9mg/L和89mg/L。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为增强表达基因APASM_0666的质粒构建示意图；
图2为增强表达基因APASM_1807的质粒构建示意图；
图3为增强表达基因APASM_5765的质粒构建示意图；
图4为增强表达基因APASM_6307的质粒构建示意图；
图5为靶标蛋白基因增强表达突变株与野生型ATCC 31280安丝菌素发酵产量示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,XinranWang,Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and engineeringof post-PKS modification bottlenecks for ansamitocin P-3 titer improvement inActinosynnema pretiosum subsp.pretiosumATCC 31280.BiotechnologyJournal 2017,12,1700484》中记载。
本发明所涉及的菌株ATCC 31280已在文献《Wenqin Pan,Qianjin Kang,LeiWang,Linquan Bai*&Zixin Deng:Asm8,a specific LAL-type activator of 3-amino-5-hydroxybenzoate biosynthesis in ansamitocin production.Science China LifeSciences 2013(7):601-608》中记载。
实施例
本实施例为获取安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307增强表达突变株HQG-01、HQG-02、HQG-03、HQG-04的具体过程。具体操作步骤如下：
步骤一：质粒pLQ-1556的构建
以珍贵束丝放线菌ATCC 31280基因组DNA(GenBank assembly accession:GC A_018139085.1)作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物APASM_0666-F/R，通过PCR扩增得到APASM_0666基因片段(882bp)。在质粒pDR3-K*(强启动子kasOp*包含在质粒pDR3-K*中)的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/Eco RI)，得到质粒pLQ-1556。
步骤二：质粒pLQ-1562的构建
以珍贵束丝放线菌ATCC 31280基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物APASM_1807-F/R，通过PCR扩增得到APASM_1807基因片段(861bp)。在质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pLQ-1562。
步骤三：质粒pLQ-1554的构建
以珍贵束丝放线菌ATCC 31280基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物APASM_5765-F/R，通过PCR扩增得到APASM_5765基因片段(729bp)。在质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pLQ-1554。
步骤四：质粒pLQ-1553的构建
以珍贵束丝放线菌ATCC 31280基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物APASM_6307-F/R，通过PCR扩增得到APASM_6307基因片段(993bp)。在质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(NdeI/EcoRI)，得到质粒pLQ-1553。
图1示意了在pDR3-K*中插入目标基因APASM_0666的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ-1556转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567(pUZ8002)于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备ATCC 31280新鲜菌丝体(约16小时培养物)，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的YMG固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12小时后取出平板，分别将安普霉素(终浓度100μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度100μg/mL)两种抗生素加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在YMG固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5天后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的YMG固体培养基上扩大培养，挑取菌丝体，采用kasOp-F和APASM_0666-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株HQG-01。
图2示意了在pDR3-K*中插入目标基因APASM_1807的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1652转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567(pUZ8002)于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备ATCC 31280新鲜菌丝体(约16小时培养物)，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的YMG固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12小时取出平板，分别将安普霉素(终浓度100μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度100μg/mL)两种抗生素加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在YMG固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5天后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的YMG固体培养基上扩大培养，挑取菌丝体，采用kasOp-F和APASM_1807-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株HQG-02。
图3示意了在pDR3-K*中插入目标基因APASM_5765的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1653转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567(pUZ8002)于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备ATCC 31280新鲜菌丝体(约16小时培养物)，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的YMG固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12小时后取出平板，分别将安普霉素(终浓度100μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度100μg/mL)两种抗生素加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在YMG固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5天后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的YMG固体培养基上扩大培养，挑取菌丝体，采用kasOp-F和APASM_5765-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株HQG-03。
图4示意了在pDR3-K*中插入目标基因APASM_6307的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因增强表达的质粒pLQ1654转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567(pUZ8002)于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备ATCC 31280新鲜菌丝体(约16小时培养物)，用LB溶液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的YMG固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12小时后取出平板，分别将安普霉素(终浓度100μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度100μg/mL)两种抗生素加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在YMG固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5天后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有安普霉素和萘啶酮酸两种抗生素的YMG固体培养基上扩大培养，挑取菌丝体，采用kasOp-F和APASM_6307-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株HQG-04。
上述步骤一、二、三、四中所涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：
上述步骤一、二、三、四中所用到的引物序列如表1所示：
表1
| 引物名称 | 碱基序列 |
| APASM_0666-F | GGAATTC CATATG ATGGGTGAGAAGCTGCGG SEQ ID NO.5 |
| APASM_0666-R | CCG GAATTC TCACACCGTCACCCTCTC SEQ ID NO.6 |
| APASM_1807-F | GGAATTC CATATG GTGCTGGAACGGCTCAAC SEQ ID NO.7 |
| APASM_1807-R | CCG GAATTC CTACTCCTTCTCCACAGG SEQ ID NO.8 |
| APASM_5765-F | GGAATTC CATATG GTGCAGTTGATCGCGAAG SEQ ID NO.9 |
| APASM_5765-R | CCG GAATTC TCCAGCCCGCTGGTGGCG SEQ ID NO.10 |
| APASM_6307-F | GGAATTC CATATG ATGCGGGTGCTGGTTACA SEQ ID NO.11 |
| APASM_6307-R | CCG GAATTC TCAGCGGGCCAGGGAGGC SEQ ID NO.12 |
| kasOp-F | GTGCGGTGTTGTAAAGTCGT SEQ ID NO.13 |
上述步骤一、二、三、四中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：
PCR反应体系：DNA模板30ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，25mM Mg2+2μL，缓冲液3μL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；
PCR条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；68℃1-2min；循环30次；68℃10min。
步骤五，利用HPLC检测安丝菌素的发酵产量
采用安捷伦公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，并采用DAD紫外吸收检测器测定254nm下的色谱吸收峰。
其中，HPLC参数如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18,2.1×150mm,3.5μm；
流动相流速：1mL/min；
流动相：水溶液和HPLC级甲醇梯度洗脱。
柱温：室温。
图5为增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307后安丝菌素发酵水平检测结果。结果表明增强表达这些基因之后，安丝菌素发酵水平有明显的提高，和野生型ATCC 31280相比，本发明所得到的高产菌株HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04发酵产量分别提高了24.1％、66.5％、71.5％和93.5％，实验室摇瓶发酵水平分别达到57.1mg/L、76.6mg/L、78.9mg/L和89mg/L。
综上所述，本发明通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中，利用强启动子kasOp*分别增强表达安丝菌素体内靶标蛋白APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，得到高产安丝菌素的突变株HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04。增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的转录水平可以增加珍贵束丝放线菌的生物量、降低其胞内毒性、解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高安丝菌素产量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法
<130> KAG47936
<141> 2021-10-15
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 882
<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum ssp. pretiosum ATCC 31280
<400> 1
atgggtgaga agctgcggct gatggcggtg cacgcgcacc ccgacgacga gtcgagcaag 60
ggcgcggcca cgatggccaa gtacgtcgcc gagggtcacg aggtcatggt ggtgacctgc 120
accggcggtg aggcgggcag catcctgaac cccgcgatgg accggcccga ggtgctcgcc 180
aacatgggtg agatccgcag ggcggagatg gcgcgcgccg cggagatcct gggcatccag 240
caccgctggc tcgggttcgt cgactccggc ctcccggagg gcgacccgct gcccccgctg 300
cccgagggct gcttcgccct cgtgccgctg gaggagtcgg tgcccccgct ggtggaggtg 360
atcagggagt tccggccgca cgtcatcgtc acgtacgacg agaacggcgg gtacccgcac 420
cccgaccaca tccgctgcca cgaggtctcg atcgccgcgt tcgacgcggc gggcgacccg 480
gacgcgcacc ccgagctggg tgagccgtgg cagccgctca agctctacta ctcgcacggc 540
ttctcgcggg ccaagctgac cgccttccac gaggcgatcc tggccagggg cgaggagtcg 600
ccctacgccg agtggctgtc cggctggaac aaggaccagc ccgacgtcat ggagcgggtc 660
accacgcagg tcgagtgcgc ggactacttc ccgcagcgcg acgcggccct gctggcccac 720
gccacccaga tcgacccggc gagccgctgg ttcgcggtgc cgctggagct ccagcgcgag 780
ctgtggccga ccgaggagta cgagctccac cggtcgctgg tcgacagcac cgtgccggag 840
gacgacctgt tcgcggggat tcgggagagg gtgacggtgt ga 882
<210> 2
<211> 861
<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum ssp. pretiosum ATCC 31280
<400> 2
gtgctggaac ggctcaacga ggccatggac cgcatcgagg aggccctgcc gggcgaggtc 60
gacgtcgcgg agctggcgcg gatcgcgctg acctccgagc accacctgcg gcggatgttc 120
tcggcgctgg ccgggatgcc gctgtcggag tacgtgcggc ggcgcaggct cacgctcgcg 180
gcggcggagg tggtggcggg ggagcgcacc ctgctggaca tcgccgtcga ccacggctac 240
gcctccaacg aggcgttcac cagggctttc cgcgccgtgc acggcgtggg gcccggtgcg 300
gtcaggcgga ccggggcggc gctcagctcg cagtcgagga tggccttccg cctcgtcatc 360
gaggggagca gcgacatgcg gtaccggatc gtggaacggg cggagttcgc cgtcgtcggg 420
cgcaaggcca gggtgcccct ggtccacaag gggatgaacc cgcacatcgc ggacttcatc 480
aaggggctcg acaaggcgga gttcgccgag atcaagaagc tcaacaacga ggagccgagc 540
ggggtcgtcg gggtcagcgc cgacctggac ccgtcccgcg cggagggcac cgagctggac 600
tactaccacg gggtggccag ctcgctgccg gtcccggagg ggctggacgc gctcccggtg 660
gccgccggga cgtgggcggt gttctccagc accggggagt tcccgagggc gctgcaggag 720
atgtggcggg acgtgttcac ccagtggttc ccgtcgaacc cgtaccgcag ccgccccggc 780
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attcctgtgg agaaggagta g 861
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<211> 729
<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum ssp. pretiosum ATCC 31280
<400> 3
gtgcagttga tcgcgaagac ggagttcttc cccccgtctg acgtcccgtg gtcgaccgac 60
gccgagggcg gcgaggcgct cgccgagttc gcgggccgcg cgtgctacca gtcctggtcc 120
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ctcacccacg agctgatccg gcaccgccac ttctcgtact cgcagctctc gcagcgctac 300
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cacgcccgct tcctggccgc cgccgaggcc agcgtcgccg cctacaacga cctgctcaag 420
ggccttgagg agaagttctc cgacgtgccc agcgcgaccc tgcgccgcaa gcaggcccgg 480
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cgcgccctgg ccatcgagtg cctgcgccac ctgcagaagg ccgcccccgg cgccttcgcg 660
gacttcgcca tcacctcgct cgccgacggc accgaggtcg cctccagccc gctggtggcg 720
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<212> DNA
<213> Actinosynnema pretiosum ssp. pretiosum ATCC 31280
<400> 4
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gtgggcggcg cctacccggc ctacgccgac gccgaggtcg tggtgctgga caagctgacc 120
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gtgcacttcg ccgccgagtc gcacgtcgac cggtcgatct cggggtccgc cgacttcgtg 300
ctcaccaacg tcctgggcac ccagacgatg ctccaggcgg cgctggaggc cgaggtctcg 360
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aactacggtc cgtatcaatt cccggaaaag gtcatcccgc tgttcgtcac caacctggtg 600
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<400> 5
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 13
gtgcggtgtt gtaaagtcgt 20
Claims (5)
1.一种提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，在珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株，发酵获得安丝菌素；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中增强安丝菌素体内靶标蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于增强表达基因APASM_0666的整合型质粒I；
所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取882bp的APASM_0666基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点；
S2，通过接合转移将整合型质粒I导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并挑取菌丝体通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因增强表达突变株。
3.如权利要求1所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述发酵包含下列步骤：将活化后的安丝菌素体内靶标蛋白基因增强表达突变株菌丝体接种于一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后收集发酵液并进行萃取。
4.如权利要求3所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，
所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.5w/v％、蔗糖10.3w/v％；
所述二级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.8w/v％、蔗糖10.3w/v％、异丁醇0.05v/v％、异丙醇0.05v/v％；
所述发酵培养基包括酵母提取物1.6w/v％、麦芽提取物1w/v％、蔗糖10.3w/v％、淀粉2.5w/v％、异丁醇0.5v/v％、异丙醇1.2v/v％、MgCl2 2mmol/L。
5.一种产安丝菌素的珍贵束丝放线菌，其特征在于，在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666，其序列如SEQ ID NO.1所示。
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