CN112522174B - 一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法 - Google Patents

一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种敲除负调控基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法。采用本发明方法，通过在游动放线菌中，分别敲除负调控蛋白基因ACPL_5445和ACPL_3989，得到阿卡波糖高产突变菌株。通过本发明敲除负调控蛋白基因，可以促进阿卡波糖生物合成基因的表达，最终明显提高阿卡波糖产量。与出发菌株相比，本发明所得的高产菌株发酵产量分别提高了13％和8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.62g/L和3.47g/L。

Description

一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体说是涉及一种敲除负调控基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法；通过在游动放线菌中敲除负调控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖产量。
背景技术
目前，患糖尿病人数在全球范围内持续增长。2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病总数的90％以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。目前用于治疗糖尿病的经典降糖药主要有促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。
阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶抑制剂的代表药物，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。在2017年版本的《中国2型糖尿病防治指南》中，阿卡波糖被列入治疗2型糖尿病的一线用药。
阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌SE50及其基因工程改造后的高产菌株SE50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌SE50的基因组上成簇分布，组成acb基因簇。迄今为止，涉及阿卡波糖生物合成途径中相关转录调控因子及其调控机制的研究仍旧很少。在本发明的研究中，挖掘到与acb基因簇转录调控相关的基因ACPL_5445和ACPL_3989，敲除这两个调控蛋白基因，可以提高阿卡波糖生物合成基因的转录水平，从而提高阿卡波糖的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过敲除负调控基因来提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过在游动放线菌中敲除负调控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖产量。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖的发酵产量。是在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，获得阿卡波糖高产突变株。对所述突变株进行发酵培养，获得阿卡波糖。
作为本发明的一个实施方案，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_5445，其序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的一个实施方案，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_3989，其序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_5445的同源重组质粒I；
S2，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_3989的同源重组质粒II；
S3，通过接合转移将同源重组质粒I、II分别导入受体菌株(QQ-2)中进行同源重组；
S4，进行安普霉素抗性验证，之后进行双交换筛选并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，得到基因敲除的突变株。
作为本发明的一个实施方案，所述同源重组质粒I的构建包括：通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取1474bp的ACPL_5445基因左侧片段以及1646bp的ACPL_5445基因右侧片段，在质粒pLQ752的XbaI/HindIII位点插入左右两侧基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物ACPL_5445-LF/LR，PCR扩增得到ACPL_5445左侧1474bp基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物ACPL_5445-RF/RR，PCR扩增得到ACPL_5445右侧1646bp基因片段。
作为本发明的一个实施方案，所述同源重组质粒II的构建包括：通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取1563bp的ACPL_3989基因左侧片段以及1788bp的ACPL_3989基因右侧片段，在质粒pLQ752的XbaI/HindIII位点插入左右两侧基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物ACPL_3989-LF/LR，PCR扩增得到ACPL_3989左侧1563bp基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物ACPL_3989-RF/RR，PCR扩增得到ACPL_3989右侧1788bp基因片段。
作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌包括游动放线菌QQ-2。
作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌(QQ-2)中敲除负调控蛋白基因，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养30～36小时；按照10％～15％的接种量转接至二级种子培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养24～28小时；按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中于28℃～30℃、180～220rpm的转速下培养90～96小时后收取发酵液。作为一个具体示例，在游动放线菌QQ-2中敲除负调控蛋白基因，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养32小时；按照10％的接种量转接至二级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养24小时；按照15％的接种量转接至发酵培养基中于30℃、220rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
作为本发明的一个实施方案，所述基因敲除突变株为基因敲除突变株WXM-06、基因敲除突变株WXM-07
作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为3％～5％的蔗糖、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.5％～1％的酪蛋白水解物、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化钾和0.005％～0.01％的硫酸亚铁。作为一个具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁。
作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％～2％的葡萄糖、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的麦芽提取物、1％～2％的甘油、0.5％～1％的蛋白胨、0.5％～1％的酵母提取物、0.1％～0.2％的磷酸氢二钾和0.1％～0.2％的酪蛋白水解物。作为一个具体示例，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物。
作为本发明的一个实施方案，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％～5％的黄豆饼粉、1％～2％的麦芽糖、1％～2％的葡萄糖、1％～2％的甘油、1％～2％的可溶性淀粉和0.25％～0.5％的碳酸钙。作为一个具体示例，所述二级种子培养基含有质量体积比为4％的黄豆饼粉、1.5％的麦芽糖、1％的葡萄糖、1％的甘油、1％的可溶性淀粉和0.25％的碳酸钙。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基含有质量体积比为5％～10％的麦芽糖、1％～5％的葡萄糖、0.1％～0.5％的谷氨酸、0.1％～0.5％的磷酸氢二钾、0.05％～0.1％的氯化铁、1％～5％的黄豆饼粉和0.1％～0.5％的碳酸钙。作为一个具体示例，所述发酵培养基含有质量体积比为5％的麦芽糖、3％的葡萄糖、0.3％的谷氨酸、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化铁、1％的黄豆饼粉和0.25％的碳酸钙。
本发明具有如下有益效果：
1)通过在游动放线菌中，利用同源重组载体pLQ752，通过敲除负调控基因ACPL_5445/ACPL_3989，可以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，进而提高阿卡波糖的发酵产量。
2)通过在游动放线菌QQ-2中敲除负调控基因ACPL_5445/ACPL_3989，使阿卡波糖产量分别提高了13％和8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.62g/L和3.47g/L。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为敲除基因ACPL_5445的质粒构建示意图；
图2为敲除基因ACPL_3989的质粒构建示意图；
图3为调控蛋白基因敲除突变株与出发菌株阿卡波糖发酵产量示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pLQ752已经在SCI数据库文献《Zhao QQ,Xie HX,Peng Y,Wang XR,Bai LQ.Improving acarbose production and eliminating the by-productcomponent C with an efficient genetic manipulation system of Actinoplanessp.SE50/110.Synthetic and Systems Biotechnology,2017,2(4):302-309》中公开。
本发明所涉及菌株游动放线菌QQ-2已经在SCI数据库文献《Zhao QQ,Xie HX,PengY,Wang XR,Bai LQ.Improving acarbose production and eliminating the by-productcomponent C with an efficient genetic manipulation system of Actinoplanessp.SE50/110.Synthetic and Systems Biotechnology,2017,2(4):302-309》中公开。
实施例
本实施例为获取敲除负调控蛋白基因ACPL_5445和ACPL_3989突变株WXM-06、WXM-07的具体过程。具体操作步骤如下：
步骤一：质粒pLQ1455的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物ACPL_5445-LF/LR，PCR扩增得到ACPL_5445左侧1474bp基因片段,使用引物ACPL_5445-RF/RR，PCR扩增得到ACPL_5445右侧1646bp基因片段，通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pLQ752的XbaI/HindIII位点插入来自ACPL_5445基因左侧1474bpPCR片段和ACPL_5445基因右侧1646bpPCR片段得到质粒PLQ1455。在37℃条件下，采用XbaI和HindIII两种限制性内切酶进行酶切处理，可以观察到3000bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤二：质粒pLQ1456的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物ACPL_3989-LF/LR，PCR扩增得到ACPL_3989左侧1563bp基因片段,使用引物ACPL_3989-RF/RR，PCR扩增得到ACPL_3989右侧1788bp基因片段，通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pLQ752的XbaI/HindIII位点插入来自ACPL_3989基因左侧1563bp PCR片段和ACPL_3989基因右侧1788bpPCR片段得到质粒PLQ1456。在37℃条件下，采用XbaI和HindIII两种限制性内切酶进行酶切处理，可以观察到3000bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
图1示意了基因ACPL_5445敲除的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因敲除的质粒pLQ1455转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600为0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备野生型菌株SE50/110的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取30mg/mL安普霉素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般5～7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，松弛两轮后取菌丝体稀释10倍后，用孢子过滤器过滤后稀释至10-4-10-6，涂布于含50μg/mL 5-氟胞嘧啶的固体培养基(含质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁)中，培养4～5天后挑取单菌落，培养后提取基因组，采用ACPL_5445-YZ-F和ACPL_5445-YZ-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因敲除突变株。
图2示意了基因ACPL_3989敲除的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因敲除的质粒pLQ1456转化进入宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E.coli ET12567于含有30μg/mL安普霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1％的比例转接一次并培养4-5小时至OD600为0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备野生型菌株SE50/110的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2～3次后，与之前制备的宿主菌E.coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱培养36小时后取出平板，分别取30mg/mL安普霉素和50mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40μL加入1mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般5～7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，松弛两轮后取菌丝体稀释10倍后，用孢子过滤器过滤后稀释至10-4-10-6，涂布于含50μg/mL 5-氟胞嘧啶的固体培养基(含质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁)中，培养4～5天后挑取单菌落，培养后提取基因组，采用ACPL_3989-YZ-F和ACPL_3989-YZ-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因敲除突变株。
上述步骤一、二中所用到的引物序列如表1所示：
表1
引物名称 碱基序列
ACPL_5445-LF GCTCTAGAGTTGGACCACCACGTTGGAC SEQ ID NO.3
ACPL_5445-LR GTGAATTCCTGGATCGAC TTGGTGTTCG SEQ ID NO.4
ACPL_5445-RF GTGAATTCGTCAAGGACAAGCAGGACGTC SEQ ID NO.5
ACPL_5445-RR GCAAGCTTGTGTTGTCCAGCTCCTCGAC SEQ ID NO.6
ACPL_3989-LF GCACTAGTGGAACTGCAGGAGTCCTTCC SEQ ID NO.7
ACPL_3989-LR GTGAATTCCGTACGACCAGAAGGTGGTC SEQ ID NO.8
ACPL_3989-RF GTGAATTCCCTCGATGTACGTCTCGGTG SEQ ID NO.9
ACPL_3989-RR GC AAGCTT GCTCGATGAACAGGTTGGC SEQ ID NO.10
ACPL_5445-YZ-F CTCTCTTGACGCGCACGATG SEQ ID NO.11
ACPL_5445-YZ-R CTGGTACACGGTGCTGATCC SEQ ID NO.12
ACPL_3989-YZ-F CGCATGTTCTAGCCGTGAAG SEQ ID NO.13
ACPL_3989-YZ-F GCTGATCGAGACGGACTACC SEQ ID NO.14
步骤三，ACPL_5445和ACPL_3989基因敲除突变株的发酵培养
将出发菌株与基因敲除突变株WXM-06和WXM-07在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养32小时；按照10％的接种量转接至二级种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养24小时；按照15％的接种量转接至发酵培养基中于30℃、220rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
所述固体培养基含有质量体积比为3％的蔗糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的酪蛋白水解物、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾和0.005％的硫酸亚铁；所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5％的葡萄糖、1％的麦芽糖、1％的麦芽提取物、1％的甘油、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.1％的磷酸氢二钾和0.1％的酪蛋白水解物；所述二级种子培养基含有质量体积比为4％的黄豆饼粉、1.5％的麦芽糖、1％的葡萄糖、1％的甘油、1％的可溶性淀粉和0.25％的碳酸钙；所述发酵培养基含有质量体积比为5％的麦芽糖、3％的葡萄糖、0.3％的谷氨酸、0.1％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化铁、1％的黄豆饼粉和0.25％的碳酸钙。
步骤四，利用HPLC检测阿卡波糖的发酵产量
使用Agilent公司的ZORBAX NH2柱进行色谱分析，采用DAD紫外检测器测定210nm下的色谱吸收峰，流动相流速为1mL/min；流动相A：35％磷酸盐，流动相B：65％乙腈。柱温：室温。
图3为敲除负调控基因ACPL_5445、ACPL_3989后阿卡波糖发酵水平检测结果。结果表明敲除这些基因之后，阿卡波糖的发酵水平有明显的提高，和出发菌株相比阿卡波糖的发酵产量分别提高约13％和8％，实验室摇瓶发酵终产量达到3.62g/L和3.47g/L。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法
<130> KAG45756
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110 (Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 1
gtgcgcgtga agttgatggc ggcggcgctg acgggcatgc tggccgtgtc cgcgctcgcc 60
ggttgcggca gcaagagcga cgacgccggt tccggttcgg cgaactccgg cgggagcggc 120
aagaagctgg tcctcggctt ctcccaggtc ggtgcggaga gtggctggcg caccgcgaac 180
accaagtcga tccaggaggc ggcggccgcc gcgggcttcg agctcaaatt ctcggacgcc 240
cagggcaagc aggagaacca gatctccgcg atccgcagct tcatcaccca gcacgtggac 300
gtcatcgcgt tctcgccggt ggtcacctcc ggctgggact cggtgctcaa ggacgccaag 360
gacgccggca tcccggtgat cctgaccgac cgtgcggtcg actcgcagga cctctccctc 420
tacaagagct tcctcggctc ggacttcgtc aaggagggca aggaggccgg cgactggctg 480
gtcaagcagt acgagggcaa gtcggacccg gtgaacgtgg tcgagctgtc cggcaccacc 540
ggttcggccc cggcgatcga ccggcagaag ggcttcgccc aggcgatcac ggccaacccg 600
aacatcaaga tcgtcaagtc gcagaccggt aacttcaccc gggccgaggg caagacgacg 660
atgcaggcga tcctccagtc caccccgaag atcgacgtgc tgtacgccca caacgacgac 720
atgggcctgg gcgccatcga ggcgatcgag gcggccggca agaagcccgg caaggacatc 780
aagatcatca cggtggacgc ggtccacgac ggtatgcagg ccctgtccga cggcaagatc 840
aactacatcg tggagtgcag cccgctcctc ggcccgcagc tgatggacct ggccaagaag 900
gtcaaggaca agcaggacgt cccgcagcgt gtcctcaccg aggagaccac cttcacccag 960
gagcaggcca aggccgcgct tccgacccgc aagtactga 1031
<210> 2
<211> 2610
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110 (Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 2
gtgtccattg acctgatcgc ggattcaccc ggtatatctg agcacgacgc ggacggttcc 60
ctactcgcct cgaagttcac ggtcccggcc gcgccgccgt tcatggtggc ccggccggga 120
ctgctggacc gggtgagtga cggcgtccgc ggcccggtga cactggtcac cgggctggcc 180
ggcagcggga agacgcagct gctggcctcc tgggcgcggt cgcgcgccgt gccctggccg 240
atcggctggg tcacctgcga gaacggggac gagccggcga ccaccttctg gtcgtacgtc 300
ctggagggac tgcgccgcgc cggggtgccg gctccggaac cggccgtgcc cggcgccgcg 360
gcgagccggg cggtgctcgc ccggctcgcc gccgtgatcg accagcagcc caccccggtg 420
gtgctgatcc tggacggcgc cgcccagctg cccggccggg actgggcggc cggcctggag 480
ttcctgctcg cccacgcgcc ggggttgcgg gtggtcctcg cgggccggtg ggacccgccg 540
ctgccgctgt accgctaccg cctggccggg cagttgcgcg aggtgcgcgg cgccgacctg 600
gcgttcaccg ccgaggagac ggcccggctg atggagctgc acggcgtgcc gctggccggg 660
ccggacctga ccgcgctggt cgagcacacc gaggggtggg cggccgggat ccggctctgc 720
gcctgcgcga tgcagggcag cgccgacgtc acccggatgg tcgccaccat ctccggcgac 780
gagtcgacca tcgccgagta cttcatcggg gaggtgctgc gtacccagcc gccggcgatc 840
cgccggttcc tgctggagac cagcgtgctg gacaccttct ccgcggacct ggccgccacg 900
gtcaccgccc ggcccgacgc ggcccggctg ctcgccgcgc tgacccggga gaacgccttc 960
atccagccgg tcggcgacgg caccgacctg taccgctacc accggctctt cgccgaactg 1020
ttgcgcgccc agctgacctg gctcgaaccg gaccaggtga cggtgctgca ccagcgggcc 1080
gcgggctggc tgtcgcgcaa cggacggctc gccgacgcgg tcgggcacgc ggtcgaggcc 1140
ggcgactggg gcgccgcggc ggccctggtg atcgaggact tcgccatcgg ccggttgatc 1200
gtggaaggca ccgccgggcg gctcggagga ctgctcgccg cgctgcccga gaacctcgac 1260
ctgcccgagg tggtgatggt gcgggccgcg ctggcctggg gcgacgcccg gctggacgcc 1320
gcgcgtgagc tgttcgcgct ggccggcaac ctgctcgcga cccggggcgg cgactgcggg 1380
gagggcatga ccctgagcag cttcgtgatg caactgctgc tgctggccgg cggcccggac 1440
ccggagcggg tggccgaact cgccccggtc gcgaccgcgt tcctggccgt ggcgccgatc 1500
cgcaaactgg cccggcaccc ggagctgcgg gccgtgctgc tggccgccga ggggaccgcg 1560
agcagcgccg ccggcgacgt gaccggcgcg gtcgaggtgc tgaccgacgc ggtggccgcc 1620
gtcccgcccg gcgacgaggc actcaaggtg gactgcctgc gactgctcgc ggtgctggag 1680
gcgcaccgcg gccggctggg ccgagccgag aacgccgcac gacaggccgt cgacctggcc 1740
gggcagtgcg ggctgccggc cgggcgccgg ccgatcgccg cccaggtggc cctggcctgg 1800
gtggccctgg aacgcttcga catcgaggcc gccgaccggc acctgcgcgg tgccggcgcc 1860
ggcaccgatc cggtggcggc cgcggcgtac gccgtggtcc ggtcccggcg cctgcaggtc 1920
cgcggcgagc tgcgcagcgc gctgaacgtg ctgaccccgg tccccggcgc gccggcctgg 1980
ctgcgccggg agatcgagct gggtcgcgcc cggctgctgc tgggcgcggg ccggctggac 2040
gacgcggccg cggtgctggc cgactgcccg cagccgtccc cggacgtcgc ggtggtgcag 2100
gccgcgctgg ccctggcccg cggcgaatcc gaccgggcgc acgaggtggc ccgcacggtc 2160
gccgacgccg caggggtgac ggcgccggtg gccctggacg cctggctgct gctggcgatg 2220
ctggcggcca gttcggacga cgagaccggc gcgcgggagg cgctgcgccg ggcgttgcgg 2280
gtggccggcc cggagaacgt ccggcggccg atccaccagg tctgggggac gctgcgccgg 2340
gtgctgcgcg acgacgagaa gctcgccgcg gtcggcgggc cgcagccggg ctcggcggtc 2400
gccgagccgg tgctggtgga ggcgctgagc aagcgggagc tggacgtgct gcgcgggatg 2460
gccgagatgc tgccgaccga ggagatcgcc gcctcgatgt acgtctcggt gaacaccgtc 2520
aagacgcacg tccgcagcat cctgcgcaag ctctccgcgt cccggcgcaa cgaggcggtg 2580
cgccgggcgc gggccctcaa tctgctttag 2696
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctagagt tggaccacca cgttggac 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgaattcct ggatcgactt ggtgttcg 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgaattcgt caaggacaag caggacgtc 29
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaagcttgt gttgtccagc tcctcgac 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcactagtgg aactgcagga gtccttcc 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgaattccg tacgaccaga aggtggtc 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgaattccc tcgatgtacg tctcggtg 28
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaagcttgc tcgatgaaca ggttggc 27
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctcttgac gcgcacgatg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggtacacg gtgctgatcc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcatgttct agccgtgaag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctgatcgag acggactacc 20

Claims (5)

1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌SE50/110中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，获得阿卡波糖高产突变株；
所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_5445，其序列如SEQ ID NO.1所示；
或，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_3989，其序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_5445的同源重组质粒I；
S2，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_3989的同源重组质粒II；
S3，通过接合转移将同源重组质粒I、II分别导入受体菌株中进行同源重组；
S4，进行安普霉素抗性验证，之后进行双交换筛选并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，得到基因敲除的突变株。
3.如权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养30~36小时；按照10%~15%的接种量转接至二级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养24~28小时；按照10%~15%的接种量转接至发酵培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养90~96小时后收取发酵液。
4.如权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述固体培养基含有质量体积比为3%~5%的蔗糖、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.5%~1%的酪蛋白水解物、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化钾和0.005%~0.01%的硫酸亚铁；所述发酵培养基含有质量体积比为5%~10%的麦芽糖、1%~5%的葡萄糖、0.1%~0.5%的谷氨酸、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化铁、1%~5%的黄豆饼粉和0.1%~0.5%的碳酸钙。
5.如权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5%~2%的葡萄糖、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的麦芽提取物、1%~2%的甘油、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.1%~0.2%的磷酸氢二钾和0.1%~0.2%的酪蛋白水解物；所述二级种子培养基含有质量体积比为4%~5%的黄豆饼粉、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的葡萄糖、1%~2%的甘油、1%~2%的可溶性淀粉和0.25%~0.5%的碳酸钙。
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US20140349346A1 (en) * 2011-12-08 2014-11-27 Bayer Intellectual Property Gmbh New actinomycete integrative and conjugative element from actinoplanes sp. se50/110 as plasmid for genetic transformation of related actinobacteria
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Improving acarbose production and eliminating the by-product component C with an efficient genetic manipulation system of Actinoplanes sp.SE50/110;白林泉;《Synth Syst Biotechnol》;20171127;第2卷(第4期);第3.5节第1段，图3d *
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