CN112029701B

CN112029701B - 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用

Info

Publication number: CN112029701B
Application number: CN202011222278.5A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 吴洽庆; 冯进辉; 朱敦明; 李雪梅; 王玉; 张瑞; 刘祥涛
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN112029701A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及分枝杆菌基因工程菌及其在制备22‑羟基‑23，24‑双降胆甾‑4‑烯‑3‑酮中的应用。本发明所提供的基因工程菌株大大降低了其它产物如4‑AD，ADD的生成，选择性地产生22‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮，提高了生产效率和产品品质，效果十分显著。

Description

一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯- 3-酮中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

背景技术

甾体是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，通常在C-10和C-13位有甲基基团，在C-17位有烷基侧链。甾体作为一种细胞膜的组分，在生物体中具有重要的作用。一些甾体还具有激素和信号分子的作用。自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体激素药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。

根据《甾体化学进展》（周维善、庄治平主编，科学出版社2002年出版，ISBN 7-03-009607-X）报道，很多微生物包括诺卡氏菌（Nocardia）、分枝杆菌（Mycobacterium）、节杆菌（Arthrobocter）、和假单胞杆菌（Pseudomonas）等都可将甾体母核环戊烷多氢菲及侧链全部氧化成二氧化碳和水。代谢途径经Sih及其合作工作者（参考文献“SihCJ,WangKC,TaiHH. Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms. XIII. C22acidintermediates in the degradation of the cholesterol side chain. Biochemistry,1968, 7:796-807”）的研究阐述如图1所示。该过程表明，在微生物降解过程中可通过控制不同酶的活力，获得如4-AD（化合物15）、9-OH-AD，22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮等重要的中间体。17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶（Ltp2）最初被注释成一种脂质转移蛋白，Ltp2与水合酶（ChsH2）的DUF35结构域一起催化了由17-hydroxy-3-oxo-4-pregnene-20-carboxyl-CoA（17-HOPC-CoA）到雄烯二酮（4-AD）和丙酰辅酶A（Propionul-CoA）的反应（参考文献：Aggett R, Mallette E, Gilbert SE, et al. The steroidside-chain– cleaving aldolase Ltp2–ChsH2DUF35 isa thiolase superfamily memberwith a radically repurposedactive site, J Biol. Chem., 2019, 294: 11934-11943）。美国专利US 20110191875A1报道了通过在分枝杆菌中阻断DNA结合蛋白（CxgB）的活力，抑制了植物甾醇转化生产4-雄烯二酮（4-AD）过程中副产物22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的产生，推测乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）也参与到了植物甾醇转化生产22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的代谢途径中。

Ⅰ

22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮，英文名为22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one，结构式如式Ⅰ所示，可以作为合成许多甾体激素药物的中间体，如肾上腺皮质激素，孕激素，蛋白同化激素等。

二十世纪70年代，研究学者在考察利用分枝杆菌转化甾醇为C19甾体化合物—雄甾-4-烯-3,17-二酮（4-AD），雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）时，22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮做为一种副产物被发现并且鉴定出来，产量仅为40 μg/ml，与主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮的比例不到1/10（Marsheck W J, Karychy S, Muir R D. Microbialdegradation of sterols. Applied Microbiology, 1972, 23: 72-77；US Pat. No.3759791）。

美国专利US4223091报道了用紫外诱变的方法得到一株分枝杆菌Mycobacterium parafortuitumcomplex MCI 0617，转化胆固醇得到的主产物为22-羟基-23, 24-二降胆-1,4-二烯-3-酮，副产物为20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮，产量仅为0.44 g/l，占发酵总产物的7%。

Xu等报道了用基因改造的手段得到的分枝杆菌，利用大量静息细胞转化植物甾醇，底物投料浓度为40 g/l，转化144 h，底物转化率仅60%，得到的主产物为22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，摩尔产率为47%，反应中还包含其它副产物，不适合大规模工业生产（CN201480078679.4；Xu L Q, Liu Y J, Yao K, et al. Unraveling and engineeringtheproduction of 23,24-bisnorcholenicsteroids in sterol metabolism,Scientific Repots,2016, 6: 21928）。

通过基因工程技术改造，控制不同酶的活力，可大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，从而有助于甾体药物价格的下降。

发明内容

为了进一步提高22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量，提升产品纯度，本发明提供了一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮中的应用。

具体而言，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种分枝杆菌基因工程菌，其是将出发菌中的3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因和17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶（Ltp2）的基因敲除，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）和DNA结合蛋白（CxgB）的基因构建获得。其中，出发菌种转化植物甾醇生产的主要产物为4-AD，副产物为ADD和22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮。上述分子改造中，单独敲除3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因只会减少副产物ADD的产生，目标产物22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量不变；同时将3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因和17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶（Ltp2）的基因敲除，会减少4-AD和ADD的产生，目标产物22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量不变；而同时将3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因和17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶（Ltp2）的基因敲除，过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）和DNA结合蛋白（CxgB）的基因，会大幅度提高目标产物22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量。

由于分枝杆菌具有一致的甾醇代谢途径，因此本发明的出发菌可以是任意的分枝杆菌。但在一个极具体的实施例中可采用Mycobacterium neoaurumNRRL B-3805为出发菌，以进行本发明所述的基因改造。

在一个实施方式中，所述3-甾酮-∆¹-脱氢酶的编码基因具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。所述17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶的编码基因具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。其中将分枝杆菌中的这两个基因的表达量降低、失活或敲除，可以通过已知的方法实现，例如基因编辑方法等。

具体地，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性的氨基酸序列。优选地，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡式菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因来源于分枝杆菌。

在一个实施方式中，所述DNA结合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性的氨基酸序列。所述DNA结合蛋白基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡式菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述DNA结合蛋白基因来源于分枝杆菌。

本发明的第二方面提供了上述基因工程菌在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。所述应用是利用上述的基因工程菌，以甾醇为发酵原料进行发酵生产22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮。所述应用优选在25-45℃下进行，更优选在25-37℃下进行。发酵时的pH优选为7-8。发酵优选进行3-12天，例如进行3-10天，更优选4-10天。根据具体的应用和条件，可以随意调整所述22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮生产菌的发酵接种量，例如可以为：生产菌种子液的OD_600nm(600nm下的OD值)为1-20(例如10)、体积为发酵用培养液的1%-20%。例如，当OD值低时，可以接种较大体积的种子液；当OD值高时，可以接种较小体积的种子液。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明所提供的基因工程菌株大大降低了其它产物如4-AD，ADD的生成，选择性地产生22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，提高了生产效率和产品品质，使产物易于分离纯化，降低了生产成本，因而同时减少了对环境的污染。

附图说明

图1为甾醇在微生物中代谢途径；

图2所示为kstd基因敲除PCR验证结果，其中泳道1-2为验证菌株，泳道1为基因敲除未成功菌株，泳道2为基因敲除成功菌株，M为分子量标记；

图3所示为ltp2基因敲除PCR验证结果，其中泳道1-3为验证菌株，泳道1为基因敲除未成功菌株，泳道2,3为基因敲除成功菌株，M为分子量标记；

图4所示实施例4的发酵液萃取样品的液相色谱图，其中a为出发菌株发酵液萃取样品，b为敲除KstD和Ltp2菌株发酵液萃取样品，c为敲除KstD和Ltp2、乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白编码基因过表达菌株发酵液萃取样品，d为22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮标准品。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，未进行具体说明的操作步骤均为常规的操作。

实施例1：基因敲除质粒的构建

3-甾酮-∆¹-脱氢酶编码基因（kstd）如SEQ ID NO：1所示，17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶编码基因（ltp2）如SEQ ID NO：2，按照以下的方法分别构建敲除kstd和敲除ltp2的质粒。

以出发菌株Mycobacterium neoaurum（菌种号：Mycobacterium neoaurum NRRLB-3805）的基因组为模板进行PCR扩增。

PCR体系：

5×Phusion GC Buffer 10 μl

2mM dNTPs 5 μl

Primer F 1 μl

Primer R 1 μl

Template DNA 50-100 ng

DMSO 1.5 μl

Phusion 0.5 μl

ddH₂O 至 50 μl

PCR程序：98℃ 3 min；98℃ 10 s变性，58℃ 20 s退火，72℃ 30 s延伸，30个循环；72℃ 10 min。其中所用引物序列为：

对于kstd：

上游片段引物：

kstD _del-Up-F：

5'acgttgttgccattgctgcagTTCGAAAGAAAGACGAACCGAACC3'

kstD _del-Up-R：

5'ACCCTTGGTGCCCAGagtactCTTGACCCCGTCACGCTGCAG

下游片段引物：

kstD _del-Down-F：

5'CGTGACGGGGTCAAGagtactCTGGGCACCAAGGGTGGCATC3'

kstD _del-Down-R：

5'CTTAATTAAGCGGCCGCGGTACCAGCGTTCCGATGAACTTGCCG3'

对于ltp2：

上游片段引物：

ltp2-Up-F：5' acgttgttgccattgctgcagGACCGACGGTCTGCATGAGCTG3'

ltp2-Up-R：

5' CGATGGATTCCAACCTGGAGagtactATCGAGATCGGCGGGAAGCTAC3'

下游片段引物：

ltp2-down-F：

5' AGCTTCCCGCCGATCTCGATagtactCTCCAGGTTGGAATCCATCGTG 3'

ltp2-down-R：

5' GTACCGCGGCCGCTTAATTAACAAGTTCTTCTGGGATGGCGTC 3'

将扩增出的上、下游片段与pGOAL19中的片段（该片段的选取和与该片段的连接参照文献“Parish T,StokerNG.Use of a flexible cassette method to generate adouble unmarkedMycobacteriumtuberculosistlyAplcABCmutant by genereplacement.Microbiology, 2000,146:1969-75”所述的方法进行）以及p2NIL载体相连接。将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan、Hyg双抗LB(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，Kan：50μg/ml，Hyg：50μg/ml，琼脂：1.5％)平板，同时加IPTG与X-Gal，37℃过夜培养。挑蓝色单菌落培养后提质粒进行PacI单酶切验证后，再测序进一步确证是否构建成功。

实施例2：敲除菌株的筛选

将构建好的基因敲除质粒电转入出发菌株Mycobacterium neoaurum（菌种号：Mycobacterium neoaurum NRRL B-3805）感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，Kan：50μg/ml，琼脂：1.5％)并加IPTG和X-gal，进行第一次筛选。从中挑取蓝色单菌落至蔗糖板(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，蔗糖：10g/L，琼脂：1.5％) (加IPTG和X-gal)，进行第二次筛选。在蔗糖板上挑白色菌落至液体LB培养基，30℃培养约36小时后，提基因组，以目的基因的Up-F、Down-R为引物进行PCR验证。若基因敲除成功，则PCR产物应约为1900 bp的单一片段。图2显示成功获得了kstd基因敲除的分枝杆菌菌株。对kstd基因敲除的菌株再进行上述转染、菌株筛选步骤，从而得到kstd和ltp2双基因敲除的菌株，图3显示成功获得了ltp2基因敲除的分枝杆菌菌株。

实施例3：基因表达菌株的构建

3.1 表达质粒构建

应用引物cxgAB-F和cxgAB-R扩增来自Mycobacterium sp. NRRL B-3805基因组中的乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因（cxgA）和DNA结合蛋白基因（cxgB），获得带有与质粒pMV261的15bp同源臂的cxgAB片段后，与表达质粒pMV261经EcoRI和HindIII酶切纯化获得单片段连接，获得重组表达质粒261-cxgAB。

PCR体系：

5×Phusion GC Buffer 10 μl

2mM dNTPs 5 μl

Primer F 1 μl

Primer R 1 μl

Template DNA 50-100 ng

DMSO 1.5 μl

Phusion 0.5 μl

ddH₂O 至 50 μl

cxgAB-F: 5'GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGGGTTTGCGTGGTGACG 3'

cxgAB-R: 5'TACGTCGACATCGATAAGCTTCTATTCGGCGGCGGTGTAGTG 3'

将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板（胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，Kan：50μg/ml，琼脂：1.5％），37℃过夜培养。挑单菌落培养后提质粒进行酶切验证后，再测序进一步确证是否构建成功。

3.2 分枝杆菌表达菌的构建

通过电转化将构建好的重组表达质粒261-cxgAB导入上述实施例2构建的双基因敲除成功的分枝杆菌感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒261-cxgAB的重组菌株。

实施例4：发酵生产22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮

种子培养基：葡萄糖6 g/L，酵母粉15 g/L，NaNO₃5.4 g/L，甘油2 g/L，NH₄H₂PO₄0.6g/L，卡纳霉素0.1mg/L，pH 7.5，115°C灭菌30分钟。

发酵培养基：脱脂豆粉 10 g/L，玉米浆 5 g/l,磷酸氢二氨3 g/L,大豆油150 g/L，卡纳霉素0.1 mg/L，pH 7.5，121°C灭菌30分钟。

发酵培养步骤：

1、30℃下LB平板（胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，琼脂：15 g/L）培养72小时以活化菌种；

2、从活化平盘接种至种子培养基中，180 rpm，30°C培养3天；将种子液在无菌条件下取样进行取样镜检，镜检无染菌方可接种；

3、按10%的接种量接种至3 L发酵培养基中；

500 rpm，30°C发酵培养，通气比为0.5 vvm，培养24小时后提高温度至42°C并保持30分钟，再降低发酵温度至30°C继续发酵，整个发酵过程pH在7-8之间，不需要控制；发酵前期因为是有油体系，所以底物植物甾醇会有结块现象，因此前期最好不要取样，在体系变均匀后可以定时取样进行检测。具体而言，每8小时取样50ml，加入乙酸乙酯萃取得到粗提物，TLC分析植物甾醇的残留量。当植物甾醇转化为22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的反应转化率达到95%时，终止发酵。发酵后的整个体系用乙酸乙酯萃取直至萃取完全，记录整个萃取相体积，通过制作标准曲线进行定量，得到整个发酵收率，液相色谱结果如图4所示。

发酵罐验证结果如下表所示：

本发明所提供的敲除KstD和Ltp2，过表达CxgA, CxgB基因工程菌株大大降低了其它产物如4-AD，ADD的生成，选择性地产生22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，提高了生产效率（摩尔收率可达53%，而出发菌株仅为5.0%，仅敲除KstD和Ltp2时也仅为5.2%）和产品品质，使产物易于分离纯化。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用

<130> 202001015

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 1

atgactgaac aggactacag tgtctttgac gtagtggtgg tagggagcgg tgctgccggc 60

atggtcgccg ccctcaccgc cgctcaccag ggactctcga cagtagtcgt tgagaaggct 120

ccgcactatg gcggttccac ggcgcgatcc ggcggcggcg tgtggattcc gaacaacgag 180

gttctgcagc gtgacggggt caaggacacc cccgccgagg cacgcaaata cctgcacgcc 240

atcatcggcg atgtggtgcc ggccgagaag atcgacacct acctggaccg cagtccggag 300

atgttgtcgt tcgtgctgaa gaactcgccg ctgaagctgt gctgggttcc cggctactcc 360

gactactacc cggagacgcc gggcggtaag gccaccggcc gcttggtcga gcccaagccg 420

ttcaatgcca agaagctcgg tcccgacgag aagggcctcg aaccgccgta cggcaaggtg 480

ccgctgaaca tggtggtgct gcaacaggac tatgtccggc tcaaccagct caagcgtcac 540

ccgcgcggcg tgctgcgcag catcaaggtg ggtgtgcggt cggtgtgggc caacgccacc 600

ggcaagaacc tggtcggtat gggccgggcg ctgatcgcgc cgctgcgcat cggcctgcag 660

aaggccgggg tgccggtgct gttgaacacc gcgctgaccg acctgtacct cgaggacggg 720

gtggtgcgcg gaatctacgt tcgcgaggcc ggcgcccccg agtctgccga gccgaagctg 780

atccgagccc gcaagggcgt gatcctcggt tccggtggct tcgagcacaa ccaggagatg 840

cgcaccaagt atcagcgcca gcccatcacc accgagtgga ccgtcggcgc agtggccaac 900

accggtgacg gcatcgtggc ggccgaaaag ctcggtgcgg cattggagct catggaggac 960

gcgtggtggg gaccgaccgt cccgctggtg ggcgccccgt ggttcgccct ctccgagcgg 1020

aactcccccg ggtcgatcat cgtcaacatg aacggcaagc ggttcatgaa cgaatcgatg 1080

ccctatgtgg aggcctgcca ccacatgtac ggcggtcagt acggccaagg tgccgggcct 1140

ggcgagaacg tcccggcatg gatggtcttc gaccagcagt accgtgatcg ctatatcttc 1200

gcgggattgc agcccggaca acgcatcccg aagaaatgga tggaatcggg cgtcatcgtc 1260

aaggccgaca gcgtggccga gctcgccgag aagaccggtc ttgcccccga cgcgctgacg 1320

gccaccatcg aacggttcaa cggtttcgca cgttccggcg tggacgagga cttccaccgt 1380

ggcgagagcg cctacgaccg ctactacggt gatccgacca acaagccgaa cccgaacctc 1440

ggcgagatca agaacggtcc gttctacgcc gcgaagatgg tacccggcga cctgggcacc 1500

aagggtggca tccgcaccga cgtgcacggc cgtgcgttgc gcgacgacaa ctcggtgatc 1560

gaaggcctct atgcggcagg caatgtcagc tcaccggtga tggggcacac ctatcccggc 1620

ccgggtggca caatcggccc cgccatgacg ttcggctacc tcgccgcgtt gcatctcgct 1680

ggaaaggcct ga 1692

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 2

tcagccgagg atcagacccg atgtcggcac cccggtaccc gccgtgacca gcacatgttc 60

gacattgtcg acctggttga ccgacgttcc ccgcagttga cgcacacctt cggcgatgcc 120

gttcatcccg tggatatacg cctcgccgag ctggccgccg tgggtgttga tcggtagctt 180

cccgccgatc tcgatggcgc cgccggcgat gaaatccttg gcctcgccct taccgcagaa 240

gccgagctcc tcgagctgga tcagtgtgta cggggtgaag tggtcgtaga ggatcgcagt 300

ctggatatcc gtgggcgtca gaccgctctg ctcccacagc tgacggccga ccaggcccat 360

ctcgggcagc ccgagctcct cgcggtagta ggagtacatg gtgaactgat cggtccccgc 420

accctgcgcg gccgcctcga tgatcgtcgg gcggtgcttg aggtccttgg cccgctcggg 480

ggtggtgacc acgatcgcga cgccaccatc ggtctcctgg cagcagtcca gcagccggag 540

cggttcggcg atccagcggg agttctggtg atcctcgatc gtgatcggct tgccgtagaa 600

gtgcgccttg gggttggttg cggcgtgttt gcgatcggcg accgacaccg caccgaaatc 660

ggcactggtg gcgccgtatt cgtgcatata gcgctgcgcg atcatggcca ccgacgcggc 720

gggtgtactc agaccgtgcg ggtaggacca gctgtactcg acgccacggg aatcggcatt 780

gacggtcaag cccgtcatca cctgaccgaa ccggaactcg gaacgctcgt tgaaggcccg 840

gtaggccacc acgacctcgg ccaccccggt cgcgacggcc agcgcggcct gctgcacggt 900

cgccgccgcc gcaccgccgc cataaccgat ctggctgaag aacttcagat caccgatgcc 960

ggtggaccgc gcgacggcgg tctccaggtt ggaatccatc gtgaaggtga ccagaccgtc 1020

cacatcggac ggcgcgagcc cggcgtcatc gagcgcgtcg agcaccgcct cggcggccag 1080

tcgcagctcg ctgcgcccgg aattcttgga gaaatcggtg gcaccgatac cggcgatcgc 1140

cgctttgccg gacat 1155

<210> 3

<211> 401

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 3

MGLRGDAAIV GFHELPATRK PTGTAEFTIE QWARLAAAAV ADAGLSVQQV DGLVTCGVME 60

SQLFVPSTVA EYLGLAVNFA EIVDLGGASG AAMVWRAAAA IELGLCQAVL CAIPANYLTP 120

MSAERPYDPG DALYYGASSF RYGSPQAEFE IPYGYLGQNG PYAQVAQMYS AAYGYDETAM 180

AKIVVDQRVN ANHTPGAVFR DKPVTIADVL DSPIIASPLH MLEIVMPCMG GSAVLVTNAE 240

LARAGRHRPV WIKGFGERVP YKSPVYAADP LQTPMVKVAE SAFGMAGLTP ADMDMVSIYD 300

CYTITALLTL EDAGFCAKGT GMRFVTDHDL TFRGDFPMNT AGGQLGYGQP GNAGGMHHVC 360

DATRQLMGRA GATQVADCHR AFVSGNGGVL SEQEALVLEG D 401

<210> 4

<211> 138

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 4

MTESSARPVP LPTPTSAPFW DGLRRHEVWV QFSPSSDAYV FYPRILAPGT LADDLSWRQI 60

SGDATLVSFA VAQRPVAPQF ADAVPHLLGV VQWTEGPRLA TEIVGVDPAR LRIGMAMTPV 120

FTEPDGADIT LLHYTAAE 138

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttgttgc cattgctgca gttcgaaaga aagacgaacc gaacc 45

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acccttggtg cccagagtac tcttgacccc gtcacgctgc ag 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtgacgggg tcaagagtac tctgggcacc aagggtggca tc 42

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttaattaag cggccgcggt accagcgttc cgatgaactt gccg 44

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgttgttgc cattgctgca ggaccgacgg tctgcatgag ctg 43

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgatggattc caacctggag agtactatcg agatcggcgg gaagctac 48

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcttcccgc cgatctcgat agtactctcc aggttggaat ccatcgtg 48

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtaccgcggc cgcttaatta acaagttctt ctgggatggc gtc 43

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcggatccag ctgcagaatt catgggtttg cgtggtgacg 40

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tacgtcgaca tcgataagct tctattcggc ggcggtgtag tg 42

Claims

1.一种分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将出发菌中的3-甾酮-∆¹-脱氢酶基因和17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶基因的表达量降低、失活或敲除，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白的基因构建获得；其中所述出发菌是能转化植物甾醇为雄烯二酮的分枝杆菌；

其中，所述3-甾酮-∆¹-脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧基-CoA醛缩酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，其出发菌是Mycobacterium neoaurum NRRL B-3805。

3.如权利要求1至2任一项所述的分枝杆菌基因工程菌在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述的基因工程菌，以甾醇为发酵原料进行发酵以生产22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵是在25-45℃下进行。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵是在25-37℃下进行发酵。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵时的pH为7-8。