CN111808830A

CN111808830A - 一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法

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Publication number: CN111808830A
Application number: CN202010698933.8A
Authority: CN
Inventors: 张保国; 刘相岑; 袁辰阳; 曹慧锦; 杜桂林; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2020-10-23

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法，首次从新金分支杆菌DSM 1381中克隆出一个新的3‑甾酮‑△¹‑脱氢酶基因，过基因工程手段，获得了高效表达3‑甾酮‑△¹‑脱氢酶的重组菌，在转化培养基中底物植物甾醇浓度高达5g/L时，可使转化液中产物雄二烯二酮的纯度在95％以上，有效的减少副产物雄烯二酮残留，提高产物雄二烯二酮的纯度。

Description

一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法。

背景技术

甾体药物(steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型的不同，形成了种类繁多的甾体化合物，具有很强抗感染、抗过敏、抗病毒等作用，是临床上一类重要的药物，对机体起着非常重要的调节作用。甾体药物主要分为盐皮质激素、糖皮质激素、性激素和蛋白同化激素等。广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘、乳腺癌、前列腺癌、口服避孕药等各个方面，到目前为止，已获得批准使用的甾体类药物大约有300多种，是产量仅次于抗生素的第二大类药物。

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，简称雄二烯二酮、ADD)是重要的甾类药物中间体，可用于雌性激素、口服避孕药等药物的合成。目前工业上生产ADD的方法是以AD为底物进行Δ¹脱氢，虽然这种方法转化率高，反应时间短，但是AD价格昂贵导致ADD生产成本较高。植物甾醇是一种混合物，包括豆甾醇、Β-谷甾醇和菜油甾醇等，微溶于水，易溶于有机溶剂，具有甾体化学结构的基本特征且原料来源广泛可再生，如今甾药生产大多以植物甾醇为原料经微生物菌株如分枝杆菌等选择性降解修饰后得到。这不仅解决了化学合成甾药的污染问题，而且使自然资源得到了合理利用，并且极大的促进了甾体药业的可持续发展。但是植物甾醇转化生成ADD不仅底物投料量低，转化速度慢，转化率低，而且总会有副产物AD存在于产物当中。不仅降低了ADD的产率而且由于AD和ADD化学结构的高度相似性对下游产物的分离提纯带来了极大的困难，增加了生产成本。

3-甾酮-△¹-脱氢酶(3-ketosteroid-△¹-dehydrogenase，ksdd或kstd)，属于黄素蛋白酶类，是甾体母核降解途径中的的关键酶，可介导甾体母核A环上C_1,2之间氢键的形成，能够成倍增加原有底物的抗炎活性及经济价值。因此对ksdd酶基因的深入研究对整个甾体药物行业的发展具有深远意义。目前生产高附加值ADD的最直接有效的方法是以AD为底物，通过微生物产生3-甾酮-Δ¹-脱氢酶来实现AD到ADD的一步转化。目前从已有的节杆菌(Arthrobacter)，诺卡氏菌(Nocardia sp.)、分支杆菌(Mycobacterium sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)等微生物中克隆并鉴定了多个ksdd酶基因，并且将不同来源的ksdd酶基因进行了外源表达。专利CN106636160A公开了一种在大肠杆菌BL21中过表达新金分支杆菌ksdd的方法可以转化AD为ADD，但是投料浓度仅为0.1％(W/V)，底物转化率仅为76.5％。专利CN102703494A公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化AD生成ADD的方法，构建的基因工程菌株比对照菌株的酶活力显著提高，但是以0.1％的AD为底物时，底物的摩尔转化率也仅仅为65.7％。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种3-甾酮-△¹-脱氢酶，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，包含第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种工程菌，所述工程菌含有第三方面所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供一种制备前述的3-甾酮-△¹-脱氢酶的方法，包括如下步骤：在合适的条件下培养第四方面所述的工程菌，使之表达所述3-甾酮-△¹-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△^1-脱氢酶。

本发明的第六方面，提供第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组表达载体，或，第四方面所述的工程菌用于制备雄二烯二酮的用途。

本发明的第七方面，提供一种生成雄二烯二酮的转化剂，含有第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的工程菌中的任一项。

本发明的第八方面，提供一种生成雄二烯二酮的方法，包括步骤：将第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶作用于雄烯二酮，或，第四方面所述的工程菌作用于植物甾醇和/或雄烯二酮。

如上所述，本发明的一种3-甾酮-△¹-脱氢酶及其编码基因和应用，具有以下有益效果：

1、首次从新金分支杆菌DSM 1381中克隆出一个新的如SEQ ID NO：28所示的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因ksdd1。ksdd1与目前报道的其它3-甾酮-△¹-脱氢酶基因最高相似度96.18％，具有差异性，是一种新的3-甾酮-△^1-脱氢酶基因，利用基因工程技术构建具有高效3-甾酮-△¹-脱氢酶重组菌提供了更多的基因资源。

2、通过基因工程手段，将ksdd1基因整合到分支杆菌株基因组中异源表达，获得了高效表达3-甾酮-△¹-脱氢酶的重组菌，建立该重组菌对植物甾醇的生物转化工艺，在转化培养基中底物植物甾醇浓度高达5g/L时，利用该工艺底物转化完全，转化液中产物ADD的纯度在95％以上，有效的减少副产物AD残留，提高产物ADD的纯度，减少了下游分离提取的步骤，具有很好的产业化前景。

附图说明

图1：质粒验证凝胶电泳图。

图2：不同3-甾酮-△¹-脱氢酶过表达菌株发酵验证。

图3：不同启动子对3-甾酮-△¹-脱氢酶的转录效果验证。

图4：双拷贝-甾酮-△¹-脱氢酶重组菌的发酵验证。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在一实施例中，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述多核苷酸编码第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶，所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明的用于编码所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR法

本发明的所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示，所述多核苷酸可从新金分支杆菌DSM 1381中克隆获得。

本领域技术人员可用现有的技术构建所述重组表达载体，这些技术包括DNA合成技术和同源重组技术等。可将编码所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的多核苷酸连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达3-甾酮-△¹-脱氢酶。

在一实施例中，所述重组表达载体为pMV306。能够将外源基因整合到分支杆菌基因组中，使其稳定表达。

在一实施例中，所述重组表达载体包括启动子，所述启动子选自Hsp60、Psmyc、pJK-F8和Ymn。实施人员可根据需求选择不同种类的启动子，优选的启动子是Psmyc和Ymn，具有很强的转录效果，且转录强度大于Hsp60和pJK-F8。

进一步优选的所述启动子选自Hsp60、Psmyc、pJK-F8和Ymn中任意两个的组合。实施人员可根据需求选择两个不同种类的启动子组合，例如，Hsp60和Psmyc组合、Hsp60和Pjk-F8组合、Hsp60和Ymn组合、Psmyc和pJK-F8组合、Psmyc和Ymn组合、pJK-F8和Ymn组合，优选的是Hsp60和Psmyc组合、Hsp60和Ymn组合。

更优选的是Hsp60和Ymn组合，Hsp60和Psmyc组合，两条启动子可一同转录，提高转录强度产出更多的3-甾酮-△¹-脱氢酶。

本发明的启动子Hsp60的基因序列SEQ ID NO：6所示；

启动子Psmyc可参考文献DOI:10.1002/PRO.242；

启动子pJK-F8可参考文献DOI:10.1128/AEM.03677-15；

启动子Ymn的基因序列SEQ ID NO：17所示。

在一实施例中，所述重组表达载体包括ksdd2、ksdd3、ksddA和ksddP中的任意一个编码基因。实施人员可根据需求选择两个编码基因组合使用，例如可以是ksdd1和ksdd2组合、ksdd1和ksddA组合、ksdd1和ksdd3组合、ksdd1和ksddP组合，两条编码基因一同表达，单位时间内可产出更多的能将雄烯二酮转化为雄二烯二酮的3-甾酮-△¹-脱氢酶，提高生产雄二烯二酮的效率。

本发明第二方面所述的多核苷酸序列SEQ ID NO：28所示，命名为ksdd1。

ksdd2可参考专利CN108456666A；

ksdd3可参考文献：zhang ruijie,liu xiangcen,wang yushi,etal.identification,function,and application of 3-ketosteroid δ1-dehydrogenaseisozymes in mycobacterium neoaurum dsm 1381 for the production of steroidicsynthons[j].microbial cell factories,2018,17(1):77；

ksddA可参考文献：nierman w c,pain a,anderson m j,et al.erratum:genomicsequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus aspergillusfumigatus(nature(2005)438(1151-1156))[j].nature,2006,439(7075):502-502；

ksddP可参考文献:shtratnikova v y,schelkunov m i,pekov y a,etal.complete genome sequence of steroid-transforming nocardioides simplex vkmac-2033d[j].genome announcements,2015,3(1):e01406-14.

优选的重组表达载体包括两个以上本发明第二方面所述的多核苷酸。编码所述ksdd1获得所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶的活性高，且大于ksdd2、ksdd3、ksddA和ksddP编码的3-甾酮-△¹-脱氢酶的活性。

在一实施例中，所述工程菌为分支杆菌，具体的为Mycobacterium sp.ZFZ菌株。将第三方面所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的第二方面所述的多核苷酸通过电转整合到Mycobacterium sp.ZFZ菌株的感受态细胞中，获得能够生产所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的重组工程菌。Mycobacterium sp.ZFZ菌株可以将植物甾醇进行发酵得到雄烯二酮，编码所述多核苷酸生产的所述3-甾酮-△¹-脱氢酶作用于雄烯二酮获得雄二烯二酮，重组后的Mycobacterium sp.ZFZ可直接作用于植物甾醇生产雄二烯二酮，可降低能耗，减少副产物雄烯二酮。

本发明的第五方面，提供一种制备前述的3-甾酮-△¹-脱氢酶的方法，包括如下步骤：在合适的条件下培养第四方面所述的工程菌，使之表达所述3-甾酮-△¹-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△1-脱氢酶。

在合适的条件下培养第四方面所述的工程菌，使之表达所述3-甾酮-△¹-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△¹-脱氢酶。

一种生成雄二烯二酮的转化剂可以但不限于粉末状、液体状等，所述转化剂含有第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的工程菌中的任一项。

在合适的催化条件下将第一方面所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶添加到含有雄烯二酮的溶液内获得雄二烯二酮。

或者

在合适的培养条件下将第四方面所述的工程菌添加到含有雄烯二酮的溶液内获得雄二烯二酮。

或者

在合适的培养条件下将第四方面所述的工程菌添加到含有植物甾醇的溶液内获得雄二烯二酮。

在一实施例中，将种子培养基内的工程菌转移到由葡萄糖、玉米浆干粉、硝酸钠、磷酸氢二铵、吐温-80、大豆油和植物甾醇组成的发酵培养基，将第四方面所述的工程菌与发酵培养基均匀混合，在适宜的温度下培育48至96h就可获得雄二烯二酮。

优选地，发酵时所用的培养基为油水两相培养基。

进一步优选地，所述发酵培养基中的油水比例为1-3:10，所述油相为菜籽油、玉米油、大豆油中的一种或多种组合。

更优选的是大豆油，大豆油对对底物植物甾醇的溶解度达很高，能有效解决底物水溶性差的问题，而且分支杆菌表面脂肪含量较多，在油相中能增大与植物甾醇分子的接触频率，提高过程转化效率，减少转化时间，有利于节约生产成本。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecular cloning：a laboratory manual，second edition，cold spring harborlaboratory press，1989 and third edition，2001；ausubel等，current protocols inmolecular biology，john wiley&sons，new york，1987 and periodic updates；theseries methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatinstructure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods inenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academicpress，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。

实施例1：新金分支杆菌Mycobacterium neoaurium DSM 1381 3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1的获取

利用Illumina Miseq测序技术对新金分支杆菌DSM 1381进行测序分析，根据基因注释信息，得到完整的3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1序列，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：

VFYMTAQDYSVFDVVVVGSGAAGMVAALTAAHQGLSTVVVEKAPHYGGSTARSGGGVWIPNNEVLQRDGVKDTAAEARKYLHTIIGDVVPAEKIDTYLDRSPEMLSFVLKNSPLKLCWVPNYSDYYPETPGGKATGRSVEPKPFNAKKLGPDEKGLEPPYGKVPLNMVVLQQDYVRLNQLKRHPRGVLRSIKVGVRSVWANATGKNLVGMGRALIAPLRIGLQKAGVPVLLNTALTDLYLEDGVVRGIYVREAGAPESAEPKLIRARKGVILGSGGFEHNQEMRTKYQRQPITTEWTVGAVANTGDGIVAAEKLGAALELMEDAWWGPTVPLVGAPWFALSERNSPGSIIVNMNGKRFMNESMPYVEACHHMYGGQYGQGAGPGENVPAWMVFDQQYRDRYIFAGLQPGQRIPKKWMESGVIVKADSVAELAEKTGLAPDALKATIDRFNGFARSGVDEDFHRGESAYDRYYGDPTNKPNPNLGEIKNGPFYAAKMVPGDLGTKGGIRTDVHGRALRDDNTVIEGLYAAGNVSSPVMGHTYPGPGGTIGPAMTFGYLAELHLAGKA(SEQ ID NO：1)

所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1的核酸序列如SEQ ID NO：28所示，具体为：

GTGTTCTACATGACTGCCCAGGACTACAGTGTCTTTGACGTAGTGGTGGTAGGGAGCGGTGCTGCCGGCATGGTCGCCGCCCTCACCGCCGCTCACCAGGGACTCTCGACAGTAGTCGTTGAGAAGGCTCCGCACTATGGCGGTTCCACGGCGCGATCGGGCGGCGGCGTGTGGATTCCGAACAACGAGGTTCTGCAGCGTGACGGGGTCAAAGATACCGCCGCCGAGGCACGGAAATACCTGCACACCATCATCGGCGACGTCGTGCCGGCCGAGAAGATCGACACCTATCTGGACCGCAGTCCGGAGATGTTGTCGTTCGTGCTGAAGAACTCGCCGCTCAAGCTGTGCTGGGTGCCCAACTACTCCGACTACTACCCGGAGACCCCAGGCGGTAAGGCCACCGGCCGCTCGGTCGAGCCCAAGCCGTTCAACGCCAAGAAGCTCGGTCCCGACGAGAAGGGCCTCGAACCGCCGTACGGCAAGGTGCCGCTGAACATGGTGGTGCTGCAGCAGGACTATGTCCGGCTCAACCAGCTCAAGCGTCACCCGCGCGGCGTGCTGCGCAGCATCAAGGTGGGTGTGCGATCGGTGTGGGCCAACGCCACCGGTAAGAACCTGGTCGGCATGGGCCGGGCGCTGATCGCGCCGCTGCGCATCGGTCTGCAGAAGGCCGGGGTGCCGGTGCTGTTGAACACCGCGCTGACCGACCTGTACCTCGAGGACGGGGTGGTGCGCGGCATCTACGTTCGCGAGGCGGGTGCCCCCGAGTCTGCCGAGCCGAAGCTGATCCGGGCCCGCAAGGGCGTCATCCTCGGTTCGGGTGGCTTCGAACACAACCAGGAAATGCGCACCAAGTACCAGCGCCAGCCCATCACCACCGAGTGGACCGTCGGCGCCGTGGCCAACACCGGTGACGGCATCGTGGCGGCCGAAAAGCTGGGTGCGGCACTGGAACTCATGGAGGACGCGTGGTGGGGCCCGACCGTCCCGCTGGTGGGCGCCCCGTGGTTCGCCCTCTCCGAGCGGAACTCCCCCGGGTCGATCATCGTCAACATGAACGGCAAGCGGTTCATGAACGAATCGATGCCCTATGTGGAGGCCTGCCACCACATGTACGGCGGTCAGTACGGCCAGGGTGCCGGGCCTGGCGAGAACGTGCCCGCCTGGATGGTCTTCGACCAGCAGTACCGTGATCGCTACATCTTCGCGGGATTGCAGCCAGGGCAACGTATCCCGAAGAAGTGGATGGAATCGGGCGTCATCGTCAAGGCCGACAGCGTGGCCGAACTCGCCGAGAAGACCGGTCTTGCCCCCGACGCGCTGAAGGCCACCATCGACCGGTTCAACGGTTTCGCACGTTCCGGCGTCGACGAGGACTTCCACCGTGGTGAGAGCGCCTACGACCGCTACTACGGCGATCCGACCAACAAGCCGAACCCGAACCTCGGCGAGATCAAGAACGGTCCGTTCTACGCCGCGAAGATGGTGCCGGGCGACCTTGGCACCAAGGGCGGCATCCGCACCGACGTGCACGGCCGTGCGCTGCGTGATGACAATACGGTGATCGAAGGCCTCTATGCGGCAGGCAATGTCAGCTCGCCGGTGATGGGTCACACCTATCCCGGCCCGGGTGGCACAATCGGGCCCGCCATGACCTTCGGCTACCTCGCCGAGTTGCATCTCGCTGGAAAGGCCTGA(SEQ ID NO：28)

将此序列经BLAST比对，发现与目前报道的Mycobacterium neoaurum NwIBL-01的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因最高相似度为96.18％，具有一定差异性，是一种新的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。利用Primer 5.0设计引物如下：

ksdd1-F:ccggaattcGTGTTCTACATGACTGCCCAGGA(SEQ ID NO：2)；

ksdd1-R:acgcgtcgacTCAGGCCTTTCCAGCGAGA(SEQ ID NO：3)。

其中，在引物ksdd1-F上引入EcoRI酶切位点，在引物ksdd1-R上引入SalI酶切位点。

以新金分支杆菌DSM 1381的总DNA(按照AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒说明书提取)为模板，以引物对ksdd1-F/R为扩增引物，选择高保真PrimeSTAR HS DNAPolymerase with GC Buffer(TaKaRa)进行PCR扩增，具体条件为95℃预变性3min，95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸10min，PCR扩增体系详见PrimeSTAR HS DNA Polymerase试剂说明书。PCR产物清洁以后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示。

实施例2：3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1表达载体的构建和转化

将实施例1得到的片段经EcoRI和SalI双酶切，与同样利用EcoRI和SalI进行双酶切的整合型表达载体pMV306进行连接，连接产物经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)，经菌落PCR筛选验证得到表达重组质粒。提取该重组质粒pMV-ksdd1送到苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析，经测序所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

以质粒pJES103(ADDgene:#135410)为模板，设计引物按照实施例1中基因片段扩增验证方法扩增启动子Hsp60，引物序列如下：

Hsp60-F:gcctctagaAGACGGTGACCACAACGCG(SEQ ID NO：4)

Hsp60-R:ccggaattcCCATTGCGAAGTGATTCCTCC(SEQ ID NO：5)

其中，在引物Hsp60-F上引入XbaI酶切位点，在引物Hsp60-R上引入EcoRI酶切位点。

启动子Hsp60基因序列如下：

AGACGGTGACCACAACGCGCCCGCTTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGTTGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCCGGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTCGAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGGCGAGTGCTAAGAATAACGTTGGCACTCGCGACCGGTGAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAGGCCAGGCCCGTCGTCGCAGCGAGTGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCGGGCACTGCGCCCGGCCAGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACCCGGTGACCCCCGTTTCATCCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCAATGG(SEQ ID NO：6)

将获得的启动子Hsp60基因片段与上述步骤所获得的质粒pMV-ksdd1用XbaI和EcoRI进行双酶切，清洁回收酶切产物连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)，经菌落PCR筛选验证得到整合型表达重组质粒pMV-hsp60-ksdd1。提取该重组质粒进行酶切验证(凝胶电泳结果见图1)并送到苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析，经测序所述启动子Hsp60序列与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列一致。

把构建的整合型表达重组质粒pMV-hsp60-ksdd1按照电转化方法转化到Mycobacterium sp.ZFZ菌株的感受态细胞中，获得生产3-甾酮-△¹-脱氢酶的重组菌ZFZ-11。

实施例4重组菌ZFZ-11对植物甾醇的转化

种子培养基(g/L)：葡萄糖6，玉米浆干粉15，硝酸钠5.4，磷酸氢二铵0.6，115℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖6，玉米浆干粉15，硝酸钠5.4，磷酸氢二铵0.6，吐温-801，大豆油10％(V/V)，植物甾醇5，115℃灭菌20min。

将重组菌ZFZ-11单克隆接种于种子培养液中30℃，160rpm培养两天至指数后期，转接10％体积的菌液到发酵培养基中30℃，160rpm进行发酵，待油相完全乳化后，取适量油层用等量的乙酸乙酯萃取后，待萃取液挥发干，用等提及的甲醇溶解，取适量溶解液进行HLPC检测发酵液中AD/ADD含量。一般的，发酵培养基在加入菌液培养48h后开始乳化，96h植物甾醇开始转化完全，此时得到ADD为1.74±0.10g/L，副产物AD为0.27±0.07g/L(见图2)，产物中ADD含量为86.56％。

实施例5：双拷贝ksdd1重组菌的构建及发酵

由于存在较多的副产物AD，说明菌株的ksdd脱氢酶活性不足，因此我们便从增加kadd的数量方面加强ksdd脱氢酶的活性。据文献报导启动子Psmyc具有很强的转录效果，因此我们便在重组质粒pMV-hsp60-ksdd1的基础上又增加了一条启动子Psmyc引导的ksdd1基因序列，以质粒pMV-Psmyc-ksdd1(见对照实施例2)为模板用引物对Pk1P11-F/R按照实施例1和实施例2中相对应的方法将获得的Psmyc-ksdd1序列片段插入到质粒pMV-hsp60-ksdd1的KpnI位点，得到了双拷贝质粒pMV-Psmyc-ksdd1-hsp60-ksdd1。将其电转到Mycobacterium sp.ZFZ菌株的感受态细胞中得到相应的双拷贝重组菌ZFZ-2111。其中引物序列如下：

Pk1P11-F:cggggtaccGGATCGTCGGCACCGTCA(SEQ ID NO：7)

Pk1P11-R:cggggtaccATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTT(SEQ ID NO：8)

其中，在引物Pk1P11-F/R分别引入KpnI酶切位点。

将得到的双拷贝重组菌ZFZ-2111按照实施例4的方法进行植物甾醇发酵实验，经检测，发酵96h时，发酵液中的ADD含量为2.11±0.09g/L，副产物AD为0.08±0.04g/L(见图4)。发酵液中ADD的含量能够达到96.34％。由于菌株代谢途径的复杂性导致部分ADD被降解致使ADD的产量没有达到预期，但是极大地减少了发酵产物中副产物的积累，使ADD达到较高的纯度。

实施例6：不同3-甾酮-△1-脱氢酶重组菌株的构建及发酵

取来源于不同菌株或同一菌株不同的3-甾酮-△¹-脱氢酶进行构建重组质粒。经调研文献我们了解到来自于Pimelobacter simple和Aspergillus fumigatus的3-甾酮-△¹-脱氢酶活性(CP009896.1、XM_746255.1)较高，另外CN108456666A报道了同样来自新金分支杆菌DSM 1381的ksdd2(MG251736.1)也具有较高的脱氢活性，另外新金分支杆菌DSM1381还有一条3-甾酮-△¹-脱氢酶ksdd3(MG251737.1),为比较这四种脱氢酶活性与新金分支杆菌DSM 1381ksdd1的区别，我们根据各个脱氢酶序列分别设计引物(见表2)按照实施例1中方法从其菌株基因组模板中扩增获得各个3-甾酮-△¹-脱氢酶基因片段。然后对各个基因片段和质粒pMV-hsp60-ksdd1进行EcoRI和SalI双酶切。所得到的基因片段按照实施例2中方法连接、化转分别得到相应的重组质粒pMV-Hsp60-ksdd2、pMV-Hsp60-ksdd3、pMV-Hsp60-ksddA、pMV-Hsp60-ksddP，将各个质粒分别电转到分支杆菌感受态中，经测序验证后得到相应的重组菌株ZFZ-12、ZFZ-13、ZFZ-1A、ZFZ-1P。

表1：3-甾酮-△¹-脱氢酶引物序列

其中，在以上表2中各引物对中上有引物均引入EcoRI酶切位点，在下游引物均引入SalI酶切位点。

我们对得到的重组菌株ZFZ-12、ZFZ-13、ZFZ-1A、ZFZ-1P按照实施例4中描述的方法进行发酵转化，经HPLC检测，各重组菌发酵液中的AD/ADD的含量见图2，其中重组菌ZFZ-13、ZFZ-1A、ZFZ-1P的发酵液中ADD含量较低，说明ksdd1、ksddA、ksddP的脱氢活力不够；ZFZ-12的发酵液中ADD含量为1.72±0.06g/L，与ZFZ-11相差不大，说明在此发酵条件下，ksdd2的微低于ksdd1。

实施例6：检测不同启动子对3-甾酮-△1-脱氢酶的转录效果

酶基因的表达强弱取决于转录水平，而启动子与转录酶的结合能力的强弱影响下游基因的转录水平，因此我们以ksdd1基因为准，检测了几种不同的启动子对ksdd1基因的转录效果，通过都相应的重组菌株进行发酵，验证各启动子效果。我们检测了启动子Psmyc(doi:10.1002/pro.242.)、pJK-F8(DOI:10.1128/AEM.03677-15)以及新金分支杆菌DSM1381 3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因ksdd1的基因组启动子Ymn(启动子Ymn序列见SEQ IDNO:17)；

启动子Ymn序列如下：

GTGCGAACGCCGCCGTGGCGGCCAACACATCATCCTCGGTGCACCCCGCACCGGGCAGATCATCGGCCAGGATGAACCCCACCTCGACCTCCACCCGCGGATACAGAAACCGGCCCGCCGCAACCGGTTTGTCCTCGAACACCTCCATATCGGCGAGCAGATGACCGTAATCGGGTTCATCGACCCCCATCATCTTCTGCATCGCCTCCGAGGACAGACCCACCTTGTGGCCGATCACCCGCGCACCCTGCGCCACCCGCTGCCGGATATTGATCAGCTGGATCTCGTAGGCATCCACCACATCGATATCGGGATACCGATCCGTCAACGGAGTGGTCGGCACCCGACTGCGCTCCGCCTCGGCCAAGTCGGCAGCAAGCTCGTCGCGGACCTCGACACTGAGC(SEQ ID NO:17)。

对以上三种启动子序列设计引物(各引物对见表3)，按照实施例1和实施例2中基因片段扩增重组方法，将各个启动子分别与经过XbaI和EcoRI双酶切的pMV-Hsp60-ksdd1片段连接，分别获得质粒pMV-Psmyc-ksdd1、pMV-pJKF8-ksdd1、pMV-Ymn-ksdd1。将各个质粒分别电转到分支杆菌感受态中，经测序验证后得到相应的重组菌株ZFZ-21、ZFZ-31、ZFZ-01。

我们对得到的重组菌株ZFZ-21、ZFZ-31、ZFZ-01按照实施例4中描述的方法进行发酵转化，经HPLC检测，各重组菌发酵液中的AD/ADD的含量见图3，其中重组菌ZFZ-21、ZFZ-31、ZFZ-01的发酵液中ADD含量分别为：2.16±0.05，1.62±0.06，209±0.18g/L；各重组菌发酵液中ADD含量分别为89.98％、70.01％、89.64％。与ZFZ-11发酵情况相比，我们可以看出启动子的转录强度依次为Psmyc>Ymn>Hsp60>pJK-F8。另外我们从图3中还可以看出各个重组菌发酵液中都有部分的AD存在，说明此发酵条件下，菌株的3-甾酮-△¹-脱氢酶不足以将AD全部转化ADD。

表2不同启动子序列扩增引物

其中，表2所有引物对中，均在上引物引入xbai酶切位点，在下游引物引入ecori酶切位点。

实施例7：不同组合双拷贝ksdd1重组菌的构建及发酵

为进一步降低发酵液中副产物AD的含量，因此我们便从增加kadd的数量方面加强ksdd脱氢酶的活性。分别以pMV-Ymn-ksdd1、pMV-Hsp60-ksdd2为模板，按照实施例5中相应方法设计引物(引物序列见表3)。

其中，在表4所列所有引物中都分别引入KpnI酶切位点。

将获得的Ymn-ksdd1、Hsp60-ksdd2序列片段插入到质pMV-hsp60-ksdd1的KpnI位点，分别得到了双拷贝质粒pMV-Ymn-ksdd1-hsp60-ksdd1、pMV-Hsp60-ksdd2-hsp60-ksdd1。将其按照实施例5中所述方法电转到Mycobacterium sp.ZFZ菌株的感受态细胞中得到相应的双拷贝重组菌ZFZ-0111、ZFZ-1211。将得到的双拷贝重组菌ZFZ-0111、ZFZ-1211按照实施例4的方法进行植物甾醇发酵实验，经检测，发酵96h时，ZFZ-0111和ZFZ-1211发酵液中的ADD含量分别为2.04±0.12、1.83±0.07g/L，副产物AD分别为0.23±0.01、0.38±0.13g/L(见图4)，与ZFZ-2111相比，副产物AD的含量都比较高，而且与单拷贝脱氢酶重组菌相比，ADD(AD)的积累量也有所降低，这说明提高3-甾酮-△¹-脱氢酶拷贝数在一定程度上会增加脱氢效果，减少副产物的积累，但是由于菌株自身道谢途径的复杂性，会导致ADD在一定程度上被降解掉。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法

<150> 2020106008214

<151> 2020-06-28

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Phe Tyr Met Thr Ala Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val

1 5 10 15

Val Gly Ser Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His

20 25 30

Gln Gly Leu Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val

50 55 60

Leu Gln Arg Asp Gly Val Lys Asp Thr Ala Ala Glu Ala Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Leu His Thr Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr

85 90 95

Tyr Leu Asp Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser

100 105 110

Pro Leu Lys Leu Cys Trp Val Pro Asn Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu

115 120 125

Thr Pro Gly Gly Lys Ala Thr Gly Arg Ser Val Glu Pro Lys Pro Phe

130 135 140

Asn Ala Lys Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr

145 150 155 160

Gly Lys Val Pro Leu Asn Met Val Val Leu Gln Gln Asp Tyr Val Arg

165 170 175

Leu Asn Gln Leu Lys Arg His Pro Arg Gly Val Leu Arg Ser Ile Lys

180 185 190

Val Gly Val Arg Ser Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val

195 200 205

Gly Met Gly Arg Ala Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys

210 215 220

Ala Gly Val Pro Val Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Glu Asp Gly Val Val Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Glu Ser Ala Glu Pro Lys Leu Ile Arg Ala Arg Lys Gly Val Ile Leu

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Phe Glu His Asn Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr Gln

275 280 285

Arg Gln Pro Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val Gly Ala Val Ala Asn Thr

290 295 300

Gly Asp Gly Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Glu Leu

305 310 315 320

Met Glu Asp Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val Pro Leu Val Gly Ala Pro

325 330 335

Trp Phe Ala Leu Ser Glu Arg Asn Ser Pro Gly Ser Ile Ile Val Asn

340 345 350

Met Asn Gly Lys Arg Phe Met Asn Glu Ser Met Pro Tyr Val Glu Ala

355 360 365

Cys His His Met Tyr Gly Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Pro Gly

370 375 380

Glu Asn Val Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg

385 390 395 400

Tyr Ile Phe Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp

405 410 415

Met Glu Ser Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala

420 425 430

Glu Lys Thr Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Lys Ala Thr Ile Asp Arg

435 440 445

Phe Asn Gly Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly

450 455 460

Glu Ser Ala Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn

465 470 475 480

Pro Asn Leu Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met

485 490 495

Val Pro Gly Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His

500 505 510

Gly Arg Ala Leu Arg Asp Asp Asn Thr Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala

515 520 525

Ala Gly Asn Val Ser Ser Pro Val Met Gly His Thr Tyr Pro Gly Pro

530 535 540

Gly Gly Thr Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Glu Leu

545 550 555 560

His Leu Ala Gly Lys Ala

565

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaattcg tgttctacat gactgcccag ga 32

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcgtcgac tcaggccttt ccagcgaga 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcctctagaa gacggtgacc acaacgcg 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattcc cattgcgaag tgattcctcc 30

<210> 6

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agacggtgac cacaacgcgc ccgctttgat cggggacgtc tgcggccgac catttacggg 60

tcttgttgtc gttggcggtc atgggccgaa catactcacc cggatcggag ggccgaggac 120

aaggtcgaac gaggggcatg acccggtgcg gggcttcttg cactcggcat aggcgagtgc 180

taagaataac gttggcactc gcgaccggtg agtgctaggt cgggacggtg aggccaggcc 240

cgtcgtcgca gcgagtggca gcgaggacaa cttgagccgt ccgtcgcggg cactgcgccc 300

ggccagcgta agtagcgggg ttgccgtcac ccggtgaccc ccgtttcatc cccgatccgg 360

aggaatcact tcgcaatgg 379

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggggtaccg gatcgtcggc accgtca 27

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggggtacca taaaacgaaa ggcccagtct tt 32

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccggaattcg tgaccgatca gaacaacatc acc 33

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac tcaggtgtgt ccggcggc 28

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccggaattca tgcctgaatc agacatgcct g 31

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgcgtcgac tcataccgct gagctctgtg tc 32

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccggaattca tggccgcaag acagctcc 28

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgcgtcgac ctatacatgc tcagaagcaa tatggtc 37

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccggaattca tggactgggc agaggagtac g 31

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgcgtcgac tcatcgcgcg tcctcggt 28

<210> 17

<211> 404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgcgaacgc cgccgtggcg gccaacacat catcctcggt gcaccccgca ccgggcagat 60

catcggccag gatgaacccc acctcgacct ccacccgcgg atacagaaac cggcccgccg 120

caaccggttt gtcctcgaac acctccatat cggcgagcag atgaccgtaa tcgggttcat 180

cgacccccat catcttctgc atcgcctccg aggacagacc caccttgtgg ccgatcaccc 240

gcgcaccctg cgccacccgc tgccggatat tgatcagctg gatctcgtag gcatccacca 300

catcgatatc gggataccga tccgtcaacg gagtggtcgg cacccgactg cgctccgcct 360

cggccaagtc ggcagcaagc tcgtcgcgga cctcgacact gagc 404

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcctctagat ctagatttaa agatctattt aaatggatcg 40

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccggaattcg gatcgtgctc atttcggg 28

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcctctagag gaaacagcta tgaccatgat tacg 34

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccggaattcc atatgcgatc tccctttccc 30

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcctctagag acggcattga tggcttttat at 32

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccggaattcg ttatagaatt gcagtgcctt tcg 33

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggggtacca gcttgatctt ccagtcggtg a 31

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggggtacca taaaacgaaa ggcccagtct tt 32

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cggggtacca gacggtgacc acaacgcg 28

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cggggtacca taaaacgaaa ggcccagtct tt 32

<210> 28

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtgttctaca tgactgccca ggactacagt gtctttgacg tagtggtggt agggagcggt 60

gctgccggca tggtcgccgc cctcaccgcc gctcaccagg gactctcgac agtagtcgtt 120

gagaaggctc cgcactatgg cggttccacg gcgcgatcgg gcggcggcgt gtggattccg 180

aacaacgagg ttctgcagcg tgacggggtc aaagataccg ccgccgaggc acggaaatac 240

ctgcacacca tcatcggcga cgtcgtgccg gccgagaaga tcgacaccta tctggaccgc 300

agtccggaga tgttgtcgtt cgtgctgaag aactcgccgc tcaagctgtg ctgggtgccc 360

aactactccg actactaccc ggagacccca ggcggtaagg ccaccggccg ctcggtcgag 420

cccaagccgt tcaacgccaa gaagctcggt cccgacgaga agggcctcga accgccgtac 480

ggcaaggtgc cgctgaacat ggtggtgctg cagcaggact atgtccggct caaccagctc 540

aagcgtcacc cgcgcggcgt gctgcgcagc atcaaggtgg gtgtgcgatc ggtgtgggcc 600

aacgccaccg gtaagaacct ggtcggcatg ggccgggcgc tgatcgcgcc gctgcgcatc 660

ggtctgcaga aggccggggt gccggtgctg ttgaacaccg cgctgaccga cctgtacctc 720

gaggacgggg tggtgcgcgg catctacgtt cgcgaggcgg gtgcccccga gtctgccgag 780

ccgaagctga tccgggcccg caagggcgtc atcctcggtt cgggtggctt cgaacacaac 840

caggaaatgc gcaccaagta ccagcgccag cccatcacca ccgagtggac cgtcggcgcc 900

gtggccaaca ccggtgacgg catcgtggcg gccgaaaagc tgggtgcggc actggaactc 960

atggaggacg cgtggtgggg cccgaccgtc ccgctggtgg gcgccccgtg gttcgccctc 1020

tccgagcgga actcccccgg gtcgatcatc gtcaacatga acggcaagcg gttcatgaac 1080

gaatcgatgc cctatgtgga ggcctgccac cacatgtacg gcggtcagta cggccagggt 1140

gccgggcctg gcgagaacgt gcccgcctgg atggtcttcg accagcagta ccgtgatcgc 1200

tacatcttcg cgggattgca gccagggcaa cgtatcccga agaagtggat ggaatcgggc 1260

gtcatcgtca aggccgacag cgtggccgaa ctcgccgaga agaccggtct tgcccccgac 1320

gcgctgaagg ccaccatcga ccggttcaac ggtttcgcac gttccggcgt cgacgaggac 1380

ttccaccgtg gtgagagcgc ctacgaccgc tactacggcg atccgaccaa caagccgaac 1440

ccgaacctcg gcgagatcaa gaacggtccg ttctacgccg cgaagatggt gccgggcgac 1500

cttggcacca agggcggcat ccgcaccgac gtgcacggcc gtgcgctgcg tgatgacaat 1560

acggtgatcg aaggcctcta tgcggcaggc aatgtcagct cgccggtgat gggtcacacc 1620

tatcccggcc cgggtggcac aatcgggccc gccatgacct tcggctacct cgccgagttg 1680

catctcgctg gaaaggcctg a 1701

Claims

1.一种3-甾酮-△¹-脱氢酶，其特征在于，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶。

3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：

1)所述重组表达载体为pMV306；

2)所述重组表达载体包括启动子，所述启动子选自Hsp60、Psmyc、pJK-F8和Ymn。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述启动子选自Hsp60、Psmyc、pJK-F8和Ymn中任意两个的组合。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：

1)所述重组表达载体包括ksdd2、ksdd3、ksddA和ksddP中的任意一个编码基因；

2)所述重组表达载体包括两个以上权利要求2或3所述的多核苷酸。

8.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌含有如权利要求4～7中任一项所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求2或3任一项所述的多核苷酸。

9.根据权利要求8所述的一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为分支杆菌。

10.一种制备如权利要求1所述的3-甾酮-△1-脱氢酶的方法，包括如下步骤：在合适的条件下培养如权利要求8或9中任一项所述的工程菌，使之表达所述3-甾酮-△^1-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△¹-脱氢酶。

11.如权利要求1所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、如权利要求2或3中任一项所述多核苷酸、如权利要求4～7中任一项所述重组表达载体，或，如权利要求8或9中任一项所述工程菌用于制备雄二烯二酮的用途。

12.一种生成雄二烯二酮的转化剂，其特征在于，含有如权利要求1所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、如权利要求2或3中任一项所述多核苷酸、如权利要求4～7中任一项所述重组表达载体或如权利要求8或9中任一项所述工程菌中的任一项。

13.一种生成雄二烯二酮的方法，其特征在于，包括步骤：将如权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶作用于雄烯二酮，或，如权利要求8或9中任一项所述工程菌作用于植物甾醇和/或雄烯二酮。