CN115029368A - 一种产双降醇的基因工程菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产双降醇的基因工程菌和用途。基因在提高双降醇产量或改造双降醇的产生菌中的用途，所述基因为编码3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的基因，敲除或失活所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的基因提高双降醇的产量。本发明还构建了一种产双降醇的基因工程菌。本发明的基因工程菌能够发酵甾醇，高效、专一生产双降醇，且双降醇的产量与出发菌株相比提高了100倍以上，因此具有很好的产业化前景。

Description

一种产双降醇的基因工程菌及其用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产双降醇的基因工程菌及其用途。
背景技术
甾体药物是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，已成为仅次于抗生素的第二大类药物。由于甾体结构极其复杂，目前工业上通常以具有甾体母核结构的甾体中间体采用半合成的方法改造后制得。随着甾体类药物的需求量不断增加，获得高产量的甾体中间体对于制备甾体类药物至关重要。
随着甾体分子代谢机制的研究及相关代谢基因簇的揭示，关键酶的功能被逐一鉴定，人们已经成功的将基因簇的绝大部分基因与甾类代谢通路准确关联病阐释了多步降解反应的发生机制。甾体分子彻底降解的过程大致共四步：甾醇分子的摄取；甾核的开环反应；开环甾核的降解；侧链基团的氧化。研究认为，胞外存在的胆固醇氧化酶是有利于甾醇转运的积极因素之一。甾类物质的代谢同时开始于甾核的开环与侧链的末端氧化，而甾核的开环反应则开始于胆固醇氧化酶(或脱氢酶)的作用，其次是接连发生的脱氢和羟基化反应。甾核上的第一步反应是将胆甾-5-烯-3-醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮，实质包括胆甾-5-烯-3-醇的生成与自身异构化为胆甾-4-烯-3-酮两个过程。此过程需要胆固醇氧化酶(Cho)和3β-羟基甾体脱氢酶/异构酶(3β-HSD)的参与。经过Cho和3β-HSD的催化后，甾醇氧化为4-烯-3-酮结构的甾酮，由此开始甾环的降解。甾醇的支链降解是个类似脂肪酸β-氧化的过程，共经历十几步酶促反应便可将载体分子侧链断裂并转化成丙酰CoA以及乙酰CoA。一些重要的实验发现，细胞色素P450单加氧酶cyp125基因参与了类固醇C26羧酸的形成，该基因的缺失将导致4-胆甾烯-3-酮的积累，不能继续转化胆固醇的侧链。
20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮(双降醇，20α-Hydroxymethyl-pregna-4-dien-3-one，BA，4-HP)是一种关键的甾体类药物中间体，在甾体药物工业化生产中起着重要作用，具有极高的经济价值。利用20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮为前体物能够合成黄体酮、熊去氧胆酸、氢化可的松、倍他米松、地塞米松、可的松、氟美松和依普利酮等多种高价值甾体原料药。因此，提高20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的生产能力一直是人们研究的热点。3-甾酮-△1-脱氢酶(KstD，EC1.3.99.4)是甾体母核降解过程中的关键酶，可介导甾体母核C1和C2之间双键的形成。在放线菌对植物甾醇的降解过程中，KstD的存在会将BA氧化脱氢产生20α-羟甲基-孕甾-1,4-双烯-3-酮(1,4-BA，HPD)，而1,4-BA在9α羟化酶(3-Ketosteroid-9α-hydroxylase，KshAB)的作用下甾环破裂从而导致产物降解。同时由于KstD的存在，发酵液中也存在HPD副产物，不仅降低了BA的产量，还对后期产物纯化产生影响，增加生产成本。美国专利US3759791中公开了通过分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3805降解胆固醇和豆甾醇侧链从而得到雄烯二酮(4-AD)、BA和1,4-BA的方法，但其发酵产物中BA的含量仅有4％左右。美国专利US 4223091公开了一株可以生产BA的菌株Mycobacterium parafortuitumcomplex MCI 0617，该菌株对植物甾醇的转化总产率达85％，但生产的BA仅占发酵总产物的7％，绝大部分为1,4-BA。
目前微生物转化植物甾醇生产BA存在的问题有菌株转化能力低，产物种类多且存在降解现象严重影响生产效益。由于缺少高效、专一生产BA的微生物，在发酵产物中，BA所占比例小，副产物种类多，导致提取分离困难，生产成本高等问题，因此亟需开发高效专一的生产菌株以满足生产需求。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产双降醇的基因工程菌和用途，以期解决现有技术中存在的问题。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。
本发明的第一方面保护，基因在提高双降醇产量或改造双降醇的产生菌中的用途，所述基因为编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因，敲除或失活所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因提高双降醇的产量。
本发明发现敲除或失活所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因能提高双降醇的产量，促进分枝杆菌将1,4-BA转化为BA。
根据本发明的技术方案，所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；
A1)所述基因为kstD1；所述kstD1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
A2)所述基因为kstD2；所述kstD2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；
A3)所述基因为kstD3；所述kstD3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；
A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸。
根据本发明的技术方案，所述基因还包括编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因，过表达所述编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因提高双降醇的产量。
优选地，所述编码胆固醇氧化酶的基因为如下B1)或B2)；
B1)所述编码胆固醇氧化酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.23所示序列；
B2)与所述SEQ ID NO.23所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述胆固醇氧化酶的核苷酸。
优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述编码细胞色素P450单加氧酶的基因为如下C1)或C2)；
C1)所述编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.24所示序列；
C2)与所述SEQ ID NO.24所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸。
优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌。
根据本发明的技术方案，所述产生菌为分枝杆菌，优选地，为敲除或失活KshAB和Hsd4A基因的分枝杆菌，更优选地，为金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381。
本发明的目的之二在于提供，与如上文所述的用途中的基因相关的生物材料，包括如下中的任一种：
a)多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示序列中的一种或多种；
b)含有a)所述的核苷酸序列的重组表达载体；
c)含有a)所述的核苷酸序列的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌；
d)由a)所述的核苷酸序列编码的蛋白质。
本发明的目的之三在于提供，一种产双降醇的基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主细胞中敲除或失活编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因构建获得。
根据本发明的技术方案，所述宿主细胞选自分枝杆菌，所述分枝杆菌的基因组中敲除或失活KshAB和Hsd4A基因。
优选地，所述宿主细胞为金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381。
根据本发明的技术方案，所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；
A1)所述基因为kstD1；所述kstD1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
A2)所述基因为kstD2；所述kstD2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；
A3)所述基因为kstD3；所述kstD3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；
A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸。
根据本发明的技术方案，所述基因工程菌还包括过表达编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因。
优选地，所述编码胆固醇氧化酶的基因为如下B1)或B2)；
B1)所述胆固醇氧化酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.23所示序列；
B2)与所述SEQ ID NO.23所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述胆固醇氧化酶的核苷酸。
优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述过表达胆固醇氧化酶是通过将编码所述胆固醇氧化酶的基因插入到质粒中，然后导入所述基因工程菌中。
更优选地，所述质粒为pMV40。
优选地，所述编码细胞色素P450单加氧酶的基因为如下C1)或C2)；
C1)所述编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.24所示序列；
C2)与所述SEQ ID NO.24所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸。
优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述过表达细胞色素P450单加氧酶是通过将编码所述细胞色素P450单加氧酶的基因插入到质粒中，然后导入所述基因工程菌中。
更优选地，所述质粒为pMV40。
进一步优选地，所述pMV40的构建方法为：将Psmyc启动子并连接到pMV306质粒的KpnI和EcoRI位点之间，得到所述的pMV40。所述的Psmyc启动子的序列如SEQ ID NO.16所示序列。
本发明的目的之四在于提供，如上文所述的基因工程菌在制备双降醇的用途。
本发明的目的之五在于提供，一种提高双降醇产量的方法，包括如下步骤：如上文所述的基因工程菌发酵甾醇，得到所述的双降醇。
根据本发明的技术方案，所述甾醇选自胆固醇或植物甾醇中的一种或两种。
优选地，所述甾醇为植物甾醇。所述植物甾醇选自β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇一种或多种。较佳地，所述植物甾醇为β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇的混合物。具体地，所述β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇的质量比为45：37：18。
根据本发明的技术方案，所述发酵的温度为30～37℃。更优选地，为32～37℃。在某个优选的实施方式中，为30℃。
根据本发明的技术方案，所述发酵的时间为5～9d。更优选地，为6～8d。在某个优选的实施方式中，为7d。
根据本发明的技术方案，所述发酵的pH优选为7～8。更优选地，为7.4～8。在某个优选的实施方式中，为7.5。
根据本发明的技术方案，先将所述基因工程菌接入种子培养基中培养，得到种子培养液；然后将所述种子培养液接种至含有甾醇的培养基中发酵，得到所述的双降醇。
优选地，所述种子培养基包括15g/L酵母粉，6g/L葡萄糖，2g/L MgSO4·7H2O，1.0g/L K2HPO4，2.0g/L KNO3，2g/L吐温-80；所述种子培养基的pH值为7.5-8.0。
优选地，所述培养的温度为30℃。
优选地，所述培养的时间为48h。
优选地，所述发酵的温度为30℃。
优选地，所述发酵的时间为168h。
优选地，所述含有甾醇的发酵培养基包括5～25g/L碳源、5～20g/L氮源、0～1g/L硫酸镁、0～1g/L硝酸铵、0～5g/L柠檬酸、0～5ml/L乳化剂和5～25g/L甾醇。
更优选地，所述碳源选自葡萄糖、甘油和柠檬酸中的一种或多种。
更优选地，所述氮源选自玉米浆、酵母膏和磷酸氢二铵中的一种或多种。
更优选地，所述乳化剂包括吐温-80和羟丙基β-环糊精。
进一步优选地，所述吐温-80和和甾醇的体积质量比为(1～3)mL：1g。在某个优选的实施方式中为2mL：1g。
进一步优选地，所述羟丙基β-环糊精和甾醇的质量比为(0.5～2)：1。在某个优选的实施方式中为15：1。
更进一步优选地，所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、12g/L磷酸氢二铵、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、硝酸钠0.5g/L、柠檬酸3g/L、吐温-80 2mL/L、1.5g/L羟丙基-β-环糊精和20g/L植物甾醇；所述发酵培养基的pH值为7.5。
本发明发现，敲除野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381中编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因kstD1、kstD2和kstD3后，分枝杆菌能将植物甾醇代谢为双降醇(BA)，BA的摩尔转化率从0.14％提高到90.12％，同时BA的产量从0.14g/L提高到3.61g/L；说明3-甾酮-Δ1-脱氢酶在分枝杆菌转化甾醇为双降醇过程中具有重要的调控作用，特别是BA的关键基因。而同时过表达编码胆固醇氧化酶的基因或编码细胞色素P450单加氧酶的基因能进一步提高BA的摩尔转化率和产量。敲除野生型分枝杆菌Mycobacteriumneoaurium DSM1381中编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因后同时过表达编码胆固醇氧化酶的基因和编码细胞色素P450单加氧酶的基因，BA的摩尔转化率可达到96.17％，产量达到15.33g/L，分别比野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381提高了26.4倍和108.5倍。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明的基因工程菌能够发酵甾醇，通过生物转化将甾醇转化为BA。
2)本发明BA的制备方法，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，摩尔产率不低于95％，远远高于Hu Y.et al(doi:10.1007/s10529-020-02991-1)报道的69.5％，有效的减少底物1,4-BA残留，提高产物BA的含量，减少了分离提取的步骤，具有很好的产业化前景。
附图说明
图1显示为本发明的基因工程菌发酵植物甾醇产双降醇的示意图。
图2显示为本发明中实施例2至5得到的基因工程菌分别发酵植物甾醇过程中，发酵液中植物甾醇含量随时间变化的曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明的目的在于解决现有技术中放线菌对植物甾醇降解过程中，KstD的存在会将BA氧化脱氢产生20α-羟甲基-孕甾-1,4-双烯-3-酮(1,4-BA，HPD)，而1,4-BA在9α-羟化酶(3-Ketosteroid-9α-hydroxylase，KshAB)的作用下甾环破裂从而导致产物降解。同时由于KstD的存在，发酵液中也存在HPD副产物，BA产量低的问题。
为了上述目的，本发明的第一方面保护，基因在提高双降醇产量或改造双降醇的产生菌中的用途，所述基因为编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因，敲除或失活所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因提高双降醇的产量。
本发明发现敲除或失活所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因能提高双降醇的产量，促进分枝杆菌将1,4-BA转化为BA。
作为优选的实施方式，所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；
A1)所述基因为kstD1；所述kstD1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
A2)所述基因为kstD2；所述kstD2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；
A3)所述基因为kstD3；所述kstD3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；
A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸。
SEQ ID NO.1所示序列如下：
GTGTTCTACATGACTGAACAGGACTACAGTGTCTTTGACGTAGTGGTGGTAGGGAGCGGTGCTGCCGGCATGGTCGCCGCCCTCACCGCCGCTCACCAGGGACTCTCGACAGTAGTCGTTGAGAAGGCTCCGCACTATGGCGGTTCCACGGCGCGATCGGGCGGCGGCGTGTGGATTCCGAACAACGAGGTTCTGCAGCGTGACGGGGTCAAAGATACCGCCGCCGAGGCACGGAAATACCTGCACACCATCATCGGCGACGTCGTGCCGGCCGAGAAGATCGACACCTATCTGGACCGCAGTCCGGAGATGTTGTCGTTCGTGCTGAAGAACTCGCCGCTCAAGCTGTGCTGGGTGCCCAACTACTCCGACTACTACCCGGAGACCCCAGGCGGTAAGGCCACCGGCCGCTCGGTCGAGCCCAAGCCGTTCAACGCCAAGAAGCTCGGTCCCGACGAGAAGGGCCTCGAACCGCCGTACGGCAAGGTGCCGCTGAACATGGTGGTGCTGCAGCAGGACTATGTCCGGCTCAACCAGCTCAAGCGTCACCCGCGCGGCGTGCTGCGCAGCATCAAGGTGGGTGTGCGATCGGTGTGGGCCAACGCCACCGGTAAGAACCTGGTCGGCATGGGCCGGGCGCTGATCGCGCCGCTGCGCATCGGTCTGCAGAAGGCCGGGGTGCCGGTGCTGTTGAACACCGCGCTGACCGACCTGTACCTCGAGGACGGGGTGGTGCGCGGCATCTACGTTCGCGAGGCGGGTGCCCCCGAGTCTGCCGAGCCGAAGCTGATCCGGGCCCGCAAGGGCGTCATCCTCGGTTCGGGTGGCTTCGAACACAACCAGGAAATGCGCACCAAGTACCAGCGCCAGCCCATCACCACCGAGTGGACCGTCGGCGCCGTGGCCAACACCGGTGACGGCATCGTGGCGGCCGAAAAGCTGGGTGCGGCACTGGAACTCATGGAGGACGCGTGGTGGGGCCCGACCGTCCCGCTGGTGGGCGCCCCGTGGTTCGCCCTCTCCGAGCGGAACTCCCCCGGGTCGATCATCGTCAACATGAACGGCAAGCGGTTCATGAACGAATCGATGCCCTATGTGGAGGCCTGCCACCACATGTACGGCGGTCAGTACGGCCAGGGTGCCGGGCCTGGCGAGAACGTGCCCGCCTGGATGGTCTTCGACCAGCAGTACCGTGATCGCTACATCTTCGCGGGATTGCAGCCAGGGCAACGTATCCCGAAGAAGTGGATGGAATCGGGCGTCATCGTCAAGGCCGACAGCGTGGCCGAACTCGCCGAGAAGACCGGTCTTGCCCCCGACGCGCTGAAGGCCACCATCGACCGGTTCAACGGTTTCGCACGTTCCGGCGTCGACGAGGACTTCCACCGTGGTGAGAGCGCCTACGACCGCTACTACGGCGATCCGACCAACAAGCCGAACCCGAACCTCGGCGAGATCAAGAACGGTCCGTTCTACGCCGCGAAGATGGTGCCGGGCGACCTTGGCACCAAGGGCGGCATCCGCACCGACGTGCACGGCCGTGCGCTGCGTGATGACAATACGGTGATCGAAGGCCTCTATGCGGCAGGCAATGTCAGCTCGCCGGTGATGGGTCACACCTATCCCGGCCCGGGTGGCACAATCGGGCCCGCCATGACCTTCGGCTACCTCGCCGCGTTGCATCTCGCTGGAAAGGCCTGA
SEQ ID NO.2所示序列如下：
GTGACCGATCAGAACAACATCACCGTCGACCTCGTCGTCGTCGGCTCGGGTACCGGGATGGCGGCAGCATTGGCTGCCCACGAGCTGGGAATGTCGACGCTGATCGTCGAGAAGAGCGCCTATGTCGGTGGTTCGACGGCTCGCTCCGGCGGTGCCTTCTGGCTTCCCGGCAGCTCCATTCTCAAGGACGCCGGTTCGGCGGACACTCCGGCCAAGGCGCGCACCTACCTTGAAGCACTCGTCGGTGACGACGTCTCACCCGAACGCGCACGCACTTTCATCGATCAGATCCCCGCGACCATCGACATGTTGCGTCGCACCACCCCGATGAAGTTCATGTGGGCCAAGGGATATTCGGACTACCACCCGGAGAGGCCAGGAGGCAGTGCGGTGGGCCGGACCTGTGAGTGTCGCCCGTTCGACACTGCGGTCCTCGGTCCAGAGCTGGCGCGGCTACGACCTGGAGTGATGAAGTCATCGTTCCCGATGCCGGTCACCGGCGCCGATTACCGTTGGCTGAACCTGATGGCCCGCACCCCGCGCAAGTCCTGGCCGCGGATCATGCTGCGGGCCATGCAGGGTGTCGGCGGTTTGGCCCTGCGGCGCCGGTACGCCGCAGGCGGCCAGGCCTTGGCGGCCGGGATGTTCGCCGGCGTGCTGCAGGCGGGGATCCCGGTGTGGACCGATTCGACGGTGACCGAGCTCATCACCGATGGTGGGCGGGTGACCGGCGCGCGGGTGCTGCGCGAGGGATCGGCCGTGACCGTCACCGCACGCCGTGGCATCGTGCTGGCCACCGGCGGTTTCGACCACGAGATGAATTGGCGGCGGAAGTTCCAGTCCGAGCTCCTCGGTGAACATCTCAGCCTTGGGGCCGAGAGCAATACCGGCGATGGCATCCGGCTCGCCCAGGACCTGGGCGCAGGCACCGGACTGATGGACCAGGCATGGTGGTTTCCGGCCTTTGCTCCGCTGCCTGGCGGGGATCCCACCGTGATGCTGGCCGAGCGGTCGCTGCCCGGCTGCCTGCTGGTAGACCAGACCGGTGAGCGCTTCATCAACGAGGCCACCGACTACATGTCCTTCGGACAGCAGCTGCTGCGTCGCGAACACGCGGGCAATCCGGTCGAGACGATGTGGATGATCTTCGATCAGCGCTACCGGAACAGCTATCTGCTTGCCGCCGAACTATTTCCACGAATGCCGATCCCACAGAGTTGGTACGACGCCGGGATCGCGCACCGCGGCACGGATGCGGAAGCACTGGGCCGCCAGATCGGTTTCGATCCCGCGACGTTGGTCGCCACGATCGAGCGGTTCAACGGACTCGCCGATGCCGGTGTCGACGCCGACTTCCAGCGCGGCGCGAGCGCCTACGACCGCTACTACGGCGACCCGACGATCACGCCCAACCCGAACCTGCGACCGCTGGATCCCGGCCCGCTGTACGCCGTCAAGGTCGTGCTGAGCGACCTGGGCACCTGTGGTGGGGTCCTGTGCGACGTGAACGGCCGGGTTCTGCGCGAAGACGGAGTGCCCATCGACGGTCTGTACGCGATCGGCAATACCGCGGCCAACGCATTCGGCAAGACCTACCCGGGCGCGGGCGCGACCATCGCGCAGGGGCTGGTGTACGGCCATGTTGCCGCGCAGCATGCCGCCGGACACACCTGA
SEQ ID NO.3所示序列如下：
ATGCCTGAATCAGACATGCCTGATCCAGATCTCGAGTTCGACGTCATCGTCGCAGGGTCCGGCGGGGGACTTGCCGGCGCGTACACCGCTGCCCGCGAGAATCTTTCGGTGCTGCTCGTCGAGGCCACCGATCTGTTCGGCGGCACCACGTCGTTCTCCGGCGGGGGCGGCATGTGGTTTCCCTGCAACCCCGTTCTGCAGCGCGCGGGCACGGATGACACCATCGACAAGGCGTTGACCTACTTTCATGCTGTCGTGGGTGAGCGCACCCCGCGCGCACTTCAAGACGCCTACGTCCGCGGCGGCGCCAAGCTCATCGAGTATCTGGAACAGGATCCGGCCTTCGAGTTCACGGCGCTCCCGTGGCCGGATTATTACGGCACGGCTCCCGAGGCGCGTACCGACGGCTACCGGCACACGATTCCGCTTCCCGTTCCCGATGCGGCCCTTGGCAAGTACGCGGGCCTGGTGCGCGGACCGCTGGACACCGAGCGGCTCGGCGCCGAAGCGCCCGATCTTCTCGTCGGAGGGCGCGCGCTGGTCGGCCGGTTCCTGGCTGCACTGGACAAGCTACCCACCGTCACCTGCTGGTTGAACGCGCCACTGGTGGACCTGATCACCGAGAACGGACGCGTCGTCGGCGCGGTGGTCGAGCGCGACGGCGCTCCGGTGCGGGTCGGGACACGGCGCGGTGTGCTGCTGGCCAGCGGTGGATTCGAGCAGAACGCCGAGATGCGCGCCGAGTACGGCGTACCCGGCCACGCCACGGACTCCATGGGCGGCCCGGGTAGCACCGGCCGCGCGCACCGCGCCGCCATCGCCGTCGGCGCCGATGTCGATCTGATGGACCAGGCCTGGTGGTCACCGGGGATGACCCATCCCGACGGCCGGTCCGCCTTCGCGCTGTGGTTCACCGGCGGCATCTTCGTCAACCAGCAGGGCCGCCGGTTCGTCAACGAATCCGCACCCTACGACCGCATGGGCCGCGACATCATCGGTCAGCTGGAGAACGGTTCCACCACATTGCCGTTCTGGATGATCTACGACGACCGCGACGGCGGCATTCCCCCCGTCAAAGCCACGAACGTGTCCATGGTCGAGCCCGAGAGATACCGCACGGCAGGTCTGTGGCACAGCGCCGATACGCTGGCCGAGCTCGCCGGGGCAATCGGTGTGCCCGCCGCCGAACTGGAAGCCACCGTGCGGAGATACAACGAACTTGCCGCCACGGGCGTCGACGACGACTTCGGCCGCGGCGGTGAGGCGTACGACCGCGCGTTCAGCGGGGGCGAGTCACCGATGGTCCCGCTGGACACCCCGCCCTATCACGCGGCGGTCTTCGGGCTGTCCGATCTGGGCACCAAGGGTGGGCTGCGCACCGATACCCACGCCCGGGTGCTCGACGCCGACGGCGCGGCCATCCCCGGTCTGTACGCCGCGGGCAACACGATGGCGGCAGTGTCGGGCACCACCTACCCCGGTGGTGGCAACCCCATCGGTGCGTCGATGTTGTTCAGCCACCTGGCGGCATTGGACATGGCGACACAGAGCTCAGCGGTATGA
作为优选的实施方式，所述基因还包括编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因，过表达所述编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因提高双降醇的产量。
优选地，所述编码胆固醇氧化酶的基因为如下B1)或B2)；
B1)所述编码胆固醇氧化酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.23所示序列；
B2)与所述SEQ ID NO.23所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述胆固醇氧化酶的核苷酸。
SEQ ID NO.23所示序列如下：
GTGCAAACACGGGACGATAACGAAGGGGGATTTTGCTGTGAGGGTGGACCGGTTTTGCTGACAAGACGGCGGTTCCTGGGTGTCGCGCTCGGTGCGGCGGCCGGTGCCGGCGCCGTGGTGGCGTGCCAGCGGACCGAGTCCGGCGAGCGACCGGCCATCGTGGTCGGCAGCGGGTACGGCGGGGGCGTCAGCGCGTTGCGTTTGGGGGAGGCCGGCGTCGAAACGCTGATCCTGGAGCGCGGTCGGCTCTGGGACACCCCGGACGAGGACGGTAAGCGGTTCAGCAAAATGTTGCCCGCCGACACCCGGGCGGGTTGGTTCCGCGATGTGCCACCGAGCCTGGTGCCCTCATTCGGCGGCATATCGGTCAACGCGGTCGCTGCCCAGAATCCTGGTTCGCAGCCGGTCCAGGCGGGCATCTGCGACAAGATCACCTACGGCGCCCACGAGGTCTTCCGCGGGATAGCGGTCGGTGGTGGCTCGATGGTGAACGCCGCGATCGCCGCGATACCCACGCCGGATCAGGTGCGGGCGGCCTTCCCCGACATCGACCCCAACGAGTTCCTCGGCACCTATGTCGAGCGGGCCAAGACCACGCTGAAGATCAGCTATCGCGATATGGGCTGGTTCGAGCAGACCCCCTACTTCCAATATGCGCGGGTGGGGCGCAGTTATGCCGAGGCGGCAGGCTACGGAGTGGACTACAACGGAAGCGCCTACTCGTTCGATTACATGGTCTCGGAGGCCGCCGGCCAGGCGCCGAAGTCGGCACTGGACTGGGAATGCCAGTACGGCAACAACTACGGACGCTTCGGCAGTGTGGATCAGACCTACATCGCCGCGGCGTTGGCCACCGGCAAGGTGACGTTGCGTCCGCTGACCGAGGTGACCGGCATCCGCCGCGAATCCTCCGGGGAGTACGTGGTGTCCATCCGCGAGATCGATCGGTGGGGCAAAGAGTTGTCGCGCAACGAGATCGGTTGCGAGCAGCTGTATCTGGCGGCCGGCGTGGTCGGGACGGCTGAGCTGCTACTGCGCGCGCGTGAGAACGGCGATCTTGCCGACCTGTCCGACGAGGTCGGTGAGGGTTATGGCAACAACGGGGACATCATGGTGGCCCACAACACCGCCGAGCAGGATCCGGTGGGTACCCTGCAGTCGCTGCTGGGCATGATCAACCTGGACGGTCGCAACGATCCGGACAACCCGGTGTACGCCAGCATGTTCTCGCTACCGCTGCCGCTGGAGACCCATGCGCTGGGCTACTACGCCATGGTCCGCACCGGCGATCGCGCGGTGATCAGCTATGACCGCGCGTCCGACGCCATCTCCATCGATTGGCCGCAGAGCAACACCGACCGCCTGATCGAGCGGGCCAAGCTCGTCTTCGACAAGGTGACGCAGGCCAACGGGGTGGATTACCGCGATGACCTGTTCGAGGGGAAAGCCTTCGCGCCCAACACTGTTCACCCATTGGGTGGGTGTGTGCGGGGTGTTGCCACCGATGCCTTCGGGCGGGTCAACGGTTACGAGAATCTCTATGTCAACGACGCGTCGCTCGTTCCGGGGTATATCGGCTGCAACCCGTACATGTCGATCACCGCGCTGGCCGAACGCAATATCGAGGCGATCCTGCAGGGCCGCAAGTAG
优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述编码细胞色素P450单加氧酶的基因为如下C1)或C2)；
C1)所述编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.24所示序列；
C2)与所述SEQ ID NO.24所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸。
SEQ ID NO.24所示序列如下：
ATGGGCTGCCCCAACATCCCCAAGGATTTCGACTTCCTCGATTCCGAGCTGAACCTCAAGGGCCTGCCGGTCAAGGAACTCGCCGAGCTCCGTAAGGCCGAGCCGGTTCGCTGGGTCGACGTGCCGGGCGGCACCGGTGGCTTCGGCGACAAGGGCTACTGGCTGGTCACCCGCCACGAGGACGTCAAGGACGTCTCACTGCGCAGCGACGTGTTCTCCAGCTCGATGAACGGCGCGATCCCGGTCTGGCCGCAGGAGATGACCCGCGAGGCCGTCGACTTGCAGCGCGCCGTTCTGCTCAACATGGACGCACCGCACCACACCCGCCTGCGCAAGATCATCTCCCGCGGTTTCACCCCGCGCGCCCTGTCGCGGCTCGAGGACGAGTTGAACTCGCGCGCACAGCAGATCGCCAAGAACGCCGCGGCCTCGACCACCGGCGACTTCGTCGAGCAGGTCTCCTGCGAGCTGCCGCTGCAGGCCATCGCCGAACTGCTCGGCGTGCCCCAGGACGATCGCGACAAGCTGTTCCGCTGGTCCAACGAGATGACCGCCGGTGACGATCCCGAGTACGCCGACGTGGACCCGGCCATGTCCTCGTTCGAGCTCATCTCCTACGCCATGAAGATGGCCGAAGAGCGCGGCAAGAACCCGACCGACGACATCGTCACCAAGCTGATCCAGGCCGACATCGACGGCGAGAAGCTCAGCGACGACGAGTTCGGCTTCTTCGTGATCATGCTGGCCGTGGCCGGTAACGAGACCAGCCGTAACTCGATCACCCACGGCATGATCGCGTTCTCGCAGCATCCCGAGCAGTGGGAGCTGTTCAAGAAGGAGCGGCCCAAGACCGCGGTCGACGAGATCATCCGCTGGGCCACCCCCGTGTCGGCCTTCCAGCGCACCGCCAGCGAGGACACCGAGATCTCCGGTGTCAAGATCAAGGCCGGAGAGCGTGTGGTGATGTCCTACCGCTCGGCCAACTTCGACGAGACGGTGTTCGAAGACCCGTTCACGTTCAACATCCTTCGGGATCCCAACCCGCACGTCGGCTTCGGCGGCACGGGGGCGCACTACTGCATCGGCGCCAACCTGGCCCGCCTGACGATCAACCTGATCTTCAACGCCGTGGCCGATCACATGCCCGACCTCAAGCCCGTCGGAGAACCCGAGCGGCTGAAGTCCGGATGGCTCAATGGTATTAAGCATTGGCCGGTCGACTACACCGGTAAGTGCCCGGTCAGCCACTGA
优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌。
根据本发明的技术方案，所述产生菌为分枝杆菌，优选地，为敲除或失活KshAB和Hsd4A基因的分枝杆菌，更优选地，为金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381。
为了上述目的，本发明的另一方面保护，与如上文所述的用途中的基因相关的生物材料，包括如下中的任一种：
a)多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示序列中的一种或多种；
b)含有a)所述的核苷酸序列的重组表达载体；
c)含有a)所述的核苷酸序列的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌；
d)由a)所述的核苷酸序列编码的蛋白质。
为了上述目的，本发明的另一方面保护，一种产双降醇的基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主细胞中敲除或失活编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因构建获得。
根据本发明的技术方案，所述宿主细胞选自分枝杆菌，所述分枝杆菌的基因组中敲除或失活KshAB和Hsd4A基因。
优选地，所述宿主细胞为金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381。
根据本发明的技术方案，所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；
A1)所述基因为kstD1；所述kstD1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
A2)所述基因为kstD2；所述kstD2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；
A3)所述基因为kstD3；所述kstD3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；
A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸。
根据本发明的技术方案，所述基因工程菌还包括过表达编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因。
优选地，所述编码胆固醇氧化酶的基因为如下B1)或B2)；
B1)所述编码胆固醇氧化酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.23所示序列；
B2)与所述SEQ ID NO.23所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述胆固醇氧化酶的核苷酸。
优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述过表达胆固醇氧化酶是通过将编码所述胆固醇氧化酶的基因插入到质粒中，然后导入所述基因工程菌中。
更优选地，所述质粒为pMV40。
优选地，所述编码细胞色素P450单加氧酶的基因为如下C1)或C2)；
C1)所述编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.24所示序列；
C2)与所述SEQ ID NO.24所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸。
优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
更优选地，所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌。
优选地，所述过表达细胞色素P450单加氧酶是通过将编码所述细胞色素P450单加氧酶的基因插入到质粒中，然后导入所述基因工程菌中。
更优选地，所述质粒为pMV40。
进一步优选地，所述pMV40的构建方法为：将Psmyc启动子并连接到pMV306质粒的KpnI和EcoRI位点之间，得到所述的pMV40。所述的Psmyc启动子的序列如SEQ ID NO.16所示序列。
为了上述目的，本发明的另一方面保护，如上文所述的基因工程菌在制备双降醇的用途。
为了上述目的，本发明的另一方面保护，一种提高双降醇产量的方法，包括如下步骤：采用如上文所述的基因工程菌发酵甾醇，得到所述的双降醇。
根据本发明的技术方案，所述甾醇选自胆固醇或植物甾醇中的一种或两种。
根据本发明的技术方案，先将所述基因工程菌接入种子培养基中培养，得到种子培养液；然后将所述种子培养液接种至含有甾醇的培养基中发酵，得到所述的双降醇。
优选地，所述种子培养基包括15g/L酵母粉，6g/L葡萄糖，2g/L MgSO4·7H2O，1.0g/L K2HPO4，2.0g/L KNO3，2g/L吐温-80；所述种子培养基的pH值为7.5-8.0。
优选地，所述培养的温度为30℃。
优选地，所述培养的时间为48h。
优选地，所述发酵的温度为30℃。
优选地，所述发酵的时间为168h。
优选地，所述含有甾醇的发酵培养基包括5～25g/L碳源、5～20g/L氮源、0～1g/L硫酸镁、0～1g/L硝酸铵、0～5g/L柠檬酸、0～5ml/L乳化剂和5～25g/L甾醇。
更优选地，所述碳源选自葡萄糖、甘油和柠檬酸中的一种或多种。
更优选地，所述氮源选自玉米浆、酵母膏和磷酸氢二铵中的一种或多种。
更优选地，所述乳化剂包括吐温-80和羟丙基β-环糊精。
进一步优选地，所述吐温-80和和甾醇的体积质量比为(1～3)mL：1g。在某个优选的实施方式中为2mL：1g。
进一步优选地，所述羟丙基β-环糊精和甾醇的质量比为(0.5～2)：1。在某个优选的实施方式中为15：1。
本发明在研究中意外发现，敲除野生型分枝杆菌Mycobacterium neoauriumDSM1381中编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因kstD1、kstD2和kstD3后，分枝杆菌能将植物甾醇代谢为双降醇(BA)，BA的摩尔转化率从0.14％提高到90.12％，同时BA的纯度从5.20％提高到98.27％；而同时过表达编码胆固醇氧化酶的基因或编码细胞色素P450单加氧酶的基因能进一步提高BA的摩尔转化率和产量。敲除野生型分枝杆菌Mycobacterium neoauriumDSM1381中编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因后同时过表达编码胆固醇氧化酶的基因和编码细胞色素P450单加氧酶的基因，BA的摩尔转化率可达到96.17％，产量达到15.33g/L，分别比野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381提高了26.4倍和108.5倍。
下述实施例中的野生型Mycobacterium neoaurium DSM1381记载于文献“Identification,function,and application of 3-ketosteroid Delta1-dehydrogenase isozymes in Mycobacterium neoaurum DSM 1381for the productionof steroidic synthons.Microb Cell Factory.2018,17:77”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，传代时间短，容易培养且培养基原料低廉。公众可从德国微生物菌种保藏中心DSMZ获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
质粒pMV306、p2NIL、pGOAL19均购买于Addgene。
实施例1基因敲除质粒的构建
本实施例中，以野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381(简记为分枝杆菌DSM1381或DSM1381)为出发菌株，敲除出发菌株中编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因kstD1、kstD2和kstD3，使得3-甾酮-Δ1-脱氢酶失活，得到KstD基因敲除质粒。编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因kstD1、kstD2和kstD3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
1.1 PCR扩增得到kstD1、kstD2和kstD3片段
以分枝杆菌DSM1381的基因组为模板进行PCR扩增，按照表1中的PCR体系和表2中的引物进行PCR扩增，分别得到kstD1、kstD2和kstD3的上下游同源臂片段。PCR程序为：98℃5min；98℃20s变性，65℃20s退火，72℃60s延伸，30个循环；72℃10min。
表1
物质 添加量
模板 0.5μL
2×Phanta Master Mix 25μL
引物-F 1μL
引物-R 1μL
ddH<sub>2</sub>O 至50μL
表2
Figure BDA0003712353780000151
Figure BDA0003712353780000161
1.2连接
将步骤1.1扩增出来的kstD1、kstD2和kstD3的上下游同源臂片段与经EcoRI和HindIII酶切的p2NIL质粒连接得到3个具有敲除基因同源臂的质粒p2NIL-kd1、p2NI L-kd2、p2NIL-kd3。
最后将pGOAL19质粒上的筛选标记基因片段分别连接到所构建的质粒p2NIL-kd1、p2NIL-kd2、p2NIL-kd3中得到相应基因的敲除质粒pDel-kd1、pDel-kd2、pDel-kd 3，敲除基因同源臂片段的选取和与质粒的连接方法参照文献进行“Parish T,Stoker N G.Use ofa flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacteriumtuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement.Microbiology.2000,146:1969-75”。
1.3转化至DH5α感受态细胞中
将步骤1.2得到的连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan、Hyg双抗性LB平板，37℃过夜培养。LB平板的组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，1.5％琼脂(g/L)，50μg/mL Kan，50μg/mL Hyg和200μg/mL X-Gal。
挑蓝色单菌落进行菌落PCR验证出正确条带后，提质粒进行测序保证敲除质粒pDel-kd1、pDel-kd2、pDel-kd3没有突变，得到KstD基因敲除质粒。
实施例2敲除菌株的筛选
将实施例1构建好的KstD基因敲除质粒电转入DSM 1381菌株感受态细胞，37℃震荡培育2h后涂布Kan、Hyg双抗性LB平板，进行第一次筛选。LB平板的组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，1.5％琼脂，50μg/mL Kan，50μg/mL Hyg和400μg/mL X-Gal。
从中挑取蓝色单菌落，利用相对应的敲除基因的引物up-F/down-R(表2中各目的基因的上游同源臂的正向引物和下游同源臂的反向引物)进行菌落PCR验证，将显示一长一短双PCR条带的单克隆转移至5mL LB液体培养基，并于37℃震荡培养24h后，取1μL菌液在含有蔗糖、X-gal的LB固态培养基涂布培养进行第二次筛选。其中，LB液体培养基的组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠；LB固态培养基的组成为在LB液体培养基的基础上加入1.5％(g/L)的琼脂糖。
从固态培养基上挑白色菌落，利用引物up-F/down-R进行菌落PCR验证，将显示单条短PCR条带的单克隆转至液体LB培养基，30℃培养约36小时后取部分菌液保存。
若基因敲除成功，则PCR产物应约为2.5kbp左右较短的单一片段。对单基因敲除的菌株再进行上述转染、菌株筛选步骤，从而得到了KstD1、KstD2和KstD3三基因均敲除的基因工程菌1381Δkd。
实施例3基因工程菌1381Δkd-ChoM的构建
本实施例中，构建过表达胆固醇氧化酶ChoM2基因的质粒，转化至实施例2构建的基因工程菌1381Δkd的感受态细胞中，得到基因工程菌1381Δkd-cyp125A2。包括如下步骤：
3.1整合型质粒pMV40的构建
为了使外源基因在宿主菌体内能够稳定能够表达，选取整合质粒pMV306进行构建外源基因表达系统，由于质粒pMV306没有启动子，因此需要先对pMV306进行改造。经过比较，选取了转录能力较强的Psmyc启动子(doi:10.1002/pro.242.)，并委托金唯智生物科技有限公司将其合成并连接到pMV306质粒的KpnI和EcoRI位点之间得到具有启动子的整合型质粒pMV40，Psmyc启动子的序列如SEQ ID NO.16所示：
AGATCTTTAAATCTAGATTTAAAGATCTATTTAAATGGATCGTCGGCACCGTCACGGCCGTGGGAGGCGGCACGATCCGCGACGTGATGATCGGCCGCATCCCCACGGTGCTGCGCAGTGAGCTCTACGCCATCCCGGCGTTGATCTGTGCGTTAGCACGCACAGGCCCGGTGTGAGAAGGGTCTCTGACGAGCGGGAGAACCCACCCGGGGTGGGCGAGTTTGTCCTGCGTGTGCTCGGTCGAGTAGGCTCTGGGAGTACCCGTGTGTACGACCAGCACGGCATACATCATTTCGACGCCGAGAGATTCGCCGCCCGAAATGAGCACGATCCCGGTACCATCAGGAGGAATCCTGC(SEQ ID NO.16)
3.2过表达胆固醇氧化酶质粒的构建
以Mycobacterium neoaurium ATCC 44074基因组为模板，应用引物choM2-F和choM2-R(引物序列见表4)扩增来自Mycobacterium neoaurium ATCC 44074基因组中的胆固醇氧化酶(ChoM2，Genebank Accession No.:JQ303324，基因核酸序列如SEQ ID NO.23所示)，获得带有与质粒pMV40的EcoRV和ClaI位点两侧的15bp同源臂的基因片段。然后与经EcoRV和ClaI酶切纯化后的整合型质粒pMV40进行infusion重组连接，得到重组表达整合质粒pMV-ChoM2。
表4
Figure BDA0003712353780000181
将重组表达整合质粒pMV-ChoM2转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。LB平板的组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，1.5％琼脂，50μg/mL Kan。
挑单菌落PCR验证后，培养菌落提质粒测序进一步确证是否构建成功，得到构建成功的重组表达质粒pMV-ChoM2。
3.3基因工程菌1381Δkd-ChoM的构建
通过电转化将步骤3.2构建好的重组表达质粒pMV-ChoM2，导入实施例2构建的基因工程菌1381Δkd感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒pMV-ChoM2的重组菌株1381Δkd-ChoM，命名为基因工程菌1381Δkd-ChoM。
实施例4基因工程菌1381Δkd-cyp125A2的构建
本实施例中，构建过表达细胞色素P450 cyp125A2基因的质粒，转化至实施例2构建的基因工程菌1381Δkd的感受态细胞中，得到基因工程菌1381Δkd-cyp125A2。包括如下步骤：
4.1过表达细胞色素P450单加氧酶质粒的构建
细胞色素P450 cyp125A2基因的核酸序列如SEQ ID NO.24所示。
以Mycobacterium fortuitum ATCC35855基因组为模板，应用引物cyp125A2-F和cyp125A2-R(引物序列见表5)扩增，获得带有与质粒pMV40的EcoRV和ClaI位点两侧的15bp同源臂的基因片段。然后与实施例3得到的经EcoRV和ClaI酶切纯化后的整合型质粒pMV40进行infusion重组连接，得到重组表达整合质粒pMV-cyp125A2。
表5
引物名称 引物序列
cyp125A2-F CATCAGGAGGAATCCTGCATGGGCTGCCCCAACATCC(SEQ ID NO.19)
cyp125A2-R TTAACTACGTCGACATCGATTCAGTGGCTGACCGGGCACTTAC(SEQ ID NO.20)
将重组表达整合质粒pMV-cyp125A2转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。LB平板的组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，1.5％琼脂，50μg/mL Kan。
挑单菌落PCR验证后，培养菌落提质粒测序进一步确证是否构建成功，得到构建成功的重组表达质粒pMV-cyp125A2。
4.2基因工程菌1381Δkd-cyp125A2的构建
通过电转化将步骤3.2构建好的重组表达质粒pMV-cyp125A2，导入实施例2构建的基因工程菌1381Δkd感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒pMV-ChoM2的基因工程菌pMV-Cyp125A2，命名为基因工程菌1381Δkd-cyp125A2。
实施例5基因工程菌1381BA的构建
本实施例中，构建过表达胆固醇氧化酶ChoM2基因和细胞色素P450单加氧酶cyp125A2基因的质粒，转化至实施例2构建的基因工程菌1381Δkd的感受态细胞中，得到基因工程菌1381Δkd-cyp125A2。包括如下步骤：
5.1过表达胆固醇氧化酶ChoM2基因和细胞色素P450单加氧酶cyp125A2质粒的构建
以实施例4得到的重组表达整合质粒pMV-cyp125A2基因组为模板，应用引物chocyp-F/chocyp-R(引物序列见表6)扩增，然后与实施例4得到的经SalI酶切纯化后的重组表达整合质粒pMV-ChoM2进行连接，得到重组表达整合质粒pMV--ChoM-Cyp125A2。
表6
引物名称 引物序列
chocyp-F CAGGAGGAATCCTGCGATATCATGGGCTGCCCCAACATCC(SEQ ID NO.21)
chocyp-R CTAGTTAACTACGTCGACTCAGTGGCTGACCGGGCACTTAC(SEQ ID NO.22)
将重组表达整合质粒pMV-ChoM-Cyp125A2转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。LB平板的组成：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，1.5％琼脂，50μg/mL Kan。
挑单菌落PCR验证后，培养菌落提质粒测序进一步确证是否构建成功，得到构建成功的重组表达质粒pMV-ChoM-Cyp125A2。
5.2基因工程菌1381BA的构建
通过电转化将步骤5.1构建好的重组表达质粒pMV-ChoM-Cyp125A2导入实施例2构建的基因工程菌1381Δkd感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒pMV-ChoM-Cyp125A2的重组菌株1381BA，命名为基因工程菌1381BA。
应用例
采用实施例2得到的基因工程菌1381Δkd、实施例3得到的基因工程菌1381Δkd-ChoM、实施例4得到的基因工程菌1381Δkd-cyp125A2和实施例5得到的基因工程菌1381BA发酵植物甾醇制备双降醇。包括如下步骤：
1)基因工程菌活化，得到种子液
30℃下LB平板培养72h以活化菌种，从活化后的平板选取生长状态较好的菌落接种至种子培养基中，于180rpm和30℃培养3d，得到种子液。将种子液在无菌条件下取样进行取样镜检，镜检无染菌方可接种。同时设立对照组，对照组的菌株为野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381。种子培养基：15g/L酵母粉，6g/L葡萄糖，2g/LMgSO4·7H2O，1.0g/L K2HPO4，2.0g/L KNO3，2g/L吐温-80，pH值调为7.5-8.0，高压灭菌115℃，15min。
2)将种子液接种至发酵培养基中发酵
按10％(v/v)的接种量，将本实施例中步骤1)得到的种子培养液接种至250mL挡板瓶不同植物甾醇浓度的发酵培养基中，于200rpm和30℃发酵培养，发酵培养168h，发酵过程每24h取2mL发酵液进行检测，通过液相色谱检测得到发酵液中BA的产量，并计算甾醇的质量转化率和BA的摩尔产率。
Figure BDA0003712353780000201
Figure BDA0003712353780000202
发酵培养基的组成：以种子培养基为基础，添加植物甾醇和羟丙基-β-环糊精获得。其中，种子培养基的组成为：15g/L酵母粉、6g/L葡萄糖、2g/L MgSO4·7H2O、1.0g/LK2HPO4、2.0g/L KNO3和2g/L吐温-80；羟丙基-β-环糊精与植物甾醇的质量比1∶3。
发酵培养基的制备方法：先把植物甾醇和羟丙基β环糊精用少量培养基混合均匀，搅拌20min，超声溶解30min后进行分装灭菌。
3)不同基因工程菌对植物甾醇降解的研究
实施例2和野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381的发酵培养基中，植物甾醇的终浓度为5g/L。
实施例3、实施例4和实施例5得到的基因工程菌的发酵培养基中，植物甾醇的的终浓度为20g/L。
于200rpm和30℃发酵培养，发酵培养168h后通过液相色谱检测BA的含量，并计算甾醇的转化率和BA的摩尔转化率，结果见表7。
表7
Figure BDA0003712353780000203
Figure BDA0003712353780000211
从表7可知，在终浓度为5g/L甾醇的发酵体系中，以野生型分枝杆菌Mycobacterium neoaurium DSM1381和实施例2获得的基因工程菌1381Δkd进行发酵，发现发酵过程中菌株1381Δkd的发酵液中积累了大量的BA，虽然还有少量杂质，但相对于出发菌DSM1381，BA的摩尔转化率由3.51％提高到90.12％，同时BA的产量从0.14g/L提高到3.6g/L，说明敲除三个3-甾酮-△1-脱氢酶以后能够积累BA作为主要降解产物。
同时从表7可知，实施例3、实施例4和实施例5得到基因工程菌能将高浓度的甾醇降解为BA，其BA的摩尔产率高达96.17％，产量高达15.33g/L。
4)不同基因工程菌对高浓度植物甾醇降解的研究
为了验证胆固醇氧化酶(ChoM2)和细胞色素P450单加氧酶cyp125A2基因对植物甾醇降解的促进作用，在20g/L植物甾醇的发酵体系中，通过对实施例2得到的基因工程菌1381Δkd、实施例3得到的基因工程菌1381Δkd-ChoM、实施例4得到的基因工程菌1381Δkd-cyp125A2、实施例5得到的基因工程菌1381BA进行发酵并分析比较，如图2所示。
图2为实施例2得到的基因工程菌1381Δkd、实施例3得到的基因工程菌1381Δkd-ChoM、实施例4得到的基因工程菌1381Δkd-cyp125A2和实施例5得到的基因工程菌1381BA在含有终浓度为20g/L植物甾醇的发酵培养基上发酵，发酵液中植株甾醇的含量随时间变化的曲线图。
从图2可知，单独过表达固醇氧化酶或细胞色素P450单加氧酶都可以加快植物甾醇的降解，当同时过表达编码固醇氧化酶和细胞色素P450单加氧酶基因时，不仅能提高甾醇的降解速率(0.12g/L/h)，而且提高了植物甾醇的降解量(97.47％)，20g/L的植物甾醇几乎全部都被降解。
5)基因工程菌1381BA对不同浓度甾醇的发酵效果研究
以实施例5得到的基因工程菌1381BA为对象，研究了其发酵不同浓度植物甾醇产双降醇的能力，植物甾醇在发酵培养基中的终浓度分别为10、15、20、25g/L。发酵结果如表8所示。
表8
Figure BDA0003712353780000212
从表8可知，基因工程菌1381BA能将20g/L甾醇完全降解，但是当甾醇浓度增加到25g/L时，则会有少量甾醇不再被降解。总体上在20g/L投料浓度下，整个发酵体系较好，BA的产量达到15.33g/L，摩尔产率为96.17％。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：实现了从植物甾醇出发，通过生物转化实现BA的生产，进一步地，本发明能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，BA的摩尔产率高达96.17％％，植物甾醇被降解完全，远远高于现有文献中报道为69.5％，且能有效减少底物1,4-BA残留，提高产物BA的含量，减少了分离提取的步骤，具有很好的产业化前景。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 中国科学院上海高等研究院
<120> 一种产双降醇的基因工程菌及其用途
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgttctaca tgactgaaca ggactacagt gtctttgacg tagtggtggt agggagcggt 60
gctgccggca tggtcgccgc cctcaccgcc gctcaccagg gactctcgac agtagtcgtt 120
gagaaggctc cgcactatgg cggttccacg gcgcgatcgg gcggcggcgt gtggattccg 180
aacaacgagg ttctgcagcg tgacggggtc aaagataccg ccgccgaggc acggaaatac 240
ctgcacacca tcatcggcga cgtcgtgccg gccgagaaga tcgacaccta tctggaccgc 300
agtccggaga tgttgtcgtt cgtgctgaag aactcgccgc tcaagctgtg ctgggtgccc 360
aactactccg actactaccc ggagacccca ggcggtaagg ccaccggccg ctcggtcgag 420
cccaagccgt tcaacgccaa gaagctcggt cccgacgaga agggcctcga accgccgtac 480
ggcaaggtgc cgctgaacat ggtggtgctg cagcaggact atgtccggct caaccagctc 540
aagcgtcacc cgcgcggcgt gctgcgcagc atcaaggtgg gtgtgcgatc ggtgtgggcc 600
aacgccaccg gtaagaacct ggtcggcatg ggccgggcgc tgatcgcgcc gctgcgcatc 660
ggtctgcaga aggccggggt gccggtgctg ttgaacaccg cgctgaccga cctgtacctc 720
gaggacgggg tggtgcgcgg catctacgtt cgcgaggcgg gtgcccccga gtctgccgag 780
ccgaagctga tccgggcccg caagggcgtc atcctcggtt cgggtggctt cgaacacaac 840
caggaaatgc gcaccaagta ccagcgccag cccatcacca ccgagtggac cgtcggcgcc 900
gtggccaaca ccggtgacgg catcgtggcg gccgaaaagc tgggtgcggc actggaactc 960
atggaggacg cgtggtgggg cccgaccgtc ccgctggtgg gcgccccgtg gttcgccctc 1020
tccgagcgga actcccccgg gtcgatcatc gtcaacatga acggcaagcg gttcatgaac 1080
gaatcgatgc cctatgtgga ggcctgccac cacatgtacg gcggtcagta cggccagggt 1140
gccgggcctg gcgagaacgt gcccgcctgg atggtcttcg accagcagta ccgtgatcgc 1200
tacatcttcg cgggattgca gccagggcaa cgtatcccga agaagtggat ggaatcgggc 1260
gtcatcgtca aggccgacag cgtggccgaa ctcgccgaga agaccggtct tgcccccgac 1320
gcgctgaagg ccaccatcga ccggttcaac ggtttcgcac gttccggcgt cgacgaggac 1380
ttccaccgtg gtgagagcgc ctacgaccgc tactacggcg atccgaccaa caagccgaac 1440
ccgaacctcg gcgagatcaa gaacggtccg ttctacgccg cgaagatggt gccgggcgac 1500
cttggcacca agggcggcat ccgcaccgac gtgcacggcc gtgcgctgcg tgatgacaat 1560
acggtgatcg aaggcctcta tgcggcaggc aatgtcagct cgccggtgat gggtcacacc 1620
tatcccggcc cgggtggcac aatcgggccc gccatgacct tcggctacct cgccgcgttg 1680
catctcgctg gaaaggcctg a 1701
<210> 2
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaccgatc agaacaacat caccgtcgac ctcgtcgtcg tcggctcggg taccgggatg 60
gcggcagcat tggctgccca cgagctggga atgtcgacgc tgatcgtcga gaagagcgcc 120
tatgtcggtg gttcgacggc tcgctccggc ggtgccttct ggcttcccgg cagctccatt 180
ctcaaggacg ccggttcggc ggacactccg gccaaggcgc gcacctacct tgaagcactc 240
gtcggtgacg acgtctcacc cgaacgcgca cgcactttca tcgatcagat ccccgcgacc 300
atcgacatgt tgcgtcgcac caccccgatg aagttcatgt gggccaaggg atattcggac 360
taccacccgg agaggccagg aggcagtgcg gtgggccgga cctgtgagtg tcgcccgttc 420
gacactgcgg tcctcggtcc agagctggcg cggctacgac ctggagtgat gaagtcatcg 480
ttcccgatgc cggtcaccgg cgccgattac cgttggctga acctgatggc ccgcaccccg 540
cgcaagtcct ggccgcggat catgctgcgg gccatgcagg gtgtcggcgg tttggccctg 600
cggcgccggt acgccgcagg cggccaggcc ttggcggccg ggatgttcgc cggcgtgctg 660
caggcgggga tcccggtgtg gaccgattcg acggtgaccg agctcatcac cgatggtggg 720
cgggtgaccg gcgcgcgggt gctgcgcgag ggatcggccg tgaccgtcac cgcacgccgt 780
ggcatcgtgc tggccaccgg cggtttcgac cacgagatga attggcggcg gaagttccag 840
tccgagctcc tcggtgaaca tctcagcctt ggggccgaga gcaataccgg cgatggcatc 900
cggctcgccc aggacctggg cgcaggcacc ggactgatgg accaggcatg gtggtttccg 960
gcctttgctc cgctgcctgg cggggatccc accgtgatgc tggccgagcg gtcgctgccc 1020
ggctgcctgc tggtagacca gaccggtgag cgcttcatca acgaggccac cgactacatg 1080
tccttcggac agcagctgct gcgtcgcgaa cacgcgggca atccggtcga gacgatgtgg 1140
atgatcttcg atcagcgcta ccggaacagc tatctgcttg ccgccgaact atttccacga 1200
atgccgatcc cacagagttg gtacgacgcc gggatcgcgc accgcggcac ggatgcggaa 1260
gcactgggcc gccagatcgg tttcgatccc gcgacgttgg tcgccacgat cgagcggttc 1320
aacggactcg ccgatgccgg tgtcgacgcc gacttccagc gcggcgcgag cgcctacgac 1380
cgctactacg gcgacccgac gatcacgccc aacccgaacc tgcgaccgct ggatcccggc 1440
ccgctgtacg ccgtcaaggt cgtgctgagc gacctgggca cctgtggtgg ggtcctgtgc 1500
gacgtgaacg gccgggttct gcgcgaagac ggagtgccca tcgacggtct gtacgcgatc 1560
ggcaataccg cggccaacgc attcggcaag acctacccgg gcgcgggcgc gaccatcgcg 1620
caggggctgg tgtacggcca tgttgccgcg cagcatgccg ccggacacac ctga 1674
<210> 3
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcctgaat cagacatgcc tgatccagat ctcgagttcg acgtcatcgt cgcagggtcc 60
ggcgggggac ttgccggcgc gtacaccgct gcccgcgaga atctttcggt gctgctcgtc 120
gaggccaccg atctgttcgg cggcaccacg tcgttctccg gcgggggcgg catgtggttt 180
ccctgcaacc ccgttctgca gcgcgcgggc acggatgaca ccatcgacaa ggcgttgacc 240
tactttcatg ctgtcgtggg tgagcgcacc ccgcgcgcac ttcaagacgc ctacgtccgc 300
ggcggcgcca agctcatcga gtatctggaa caggatccgg ccttcgagtt cacggcgctc 360
ccgtggccgg attattacgg cacggctccc gaggcgcgta ccgacggcta ccggcacacg 420
attccgcttc ccgttcccga tgcggccctt ggcaagtacg cgggcctggt gcgcggaccg 480
ctggacaccg agcggctcgg cgccgaagcg cccgatcttc tcgtcggagg gcgcgcgctg 540
gtcggccggt tcctggctgc actggacaag ctacccaccg tcacctgctg gttgaacgcg 600
ccactggtgg acctgatcac cgagaacgga cgcgtcgtcg gcgcggtggt cgagcgcgac 660
ggcgctccgg tgcgggtcgg gacacggcgc ggtgtgctgc tggccagcgg tggattcgag 720
cagaacgccg agatgcgcgc cgagtacggc gtacccggcc acgccacgga ctccatgggc 780
ggcccgggta gcaccggccg cgcgcaccgc gccgccatcg ccgtcggcgc cgatgtcgat 840
ctgatggacc aggcctggtg gtcaccgggg atgacccatc ccgacggccg gtccgccttc 900
gcgctgtggt tcaccggcgg catcttcgtc aaccagcagg gccgccggtt cgtcaacgaa 960
tccgcaccct acgaccgcat gggccgcgac atcatcggtc agctggagaa cggttccacc 1020
acattgccgt tctggatgat ctacgacgac cgcgacggcg gcattccccc cgtcaaagcc 1080
acgaacgtgt ccatggtcga gcccgagaga taccgcacgg caggtctgtg gcacagcgcc 1140
gatacgctgg ccgagctcgc cggggcaatc ggtgtgcccg ccgccgaact ggaagccacc 1200
gtgcggagat acaacgaact tgccgccacg ggcgtcgacg acgacttcgg ccgcggcggt 1260
gaggcgtacg accgcgcgtt cagcgggggc gagtcaccga tggtcccgct ggacaccccg 1320
ccctatcacg cggcggtctt cgggctgtcc gatctgggca ccaagggtgg gctgcgcacc 1380
gatacccacg cccgggtgct cgacgccgac ggcgcggcca tccccggtct gtacgccgcg 1440
ggcaacacga tggcggcagt gtcgggcacc acctaccccg gtggtggcaa ccccatcggt 1500
gcgtcgatgt tgttcagcca cctggcggca ttggacatgg cgacacagag ctcagcggta 1560
tga 1563
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggtcgacg gatccgcgcc gcatcacgat gcacatacg 39
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccgcatag aggccgtcac gctgcagaac ctcgttgttc g 41
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttctgcagc gtgacggcct ctatgcggca ggcaatgt 38
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattacaggg gaattccagc tgatgcagca ggccatgcag 40
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtggtcgacg gatccgtcga ccatatccgg tgtgacgtc 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccgatcgcg tacagggcgc tcttctcgac gatcagcgt 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcgagaaga gcgccctgta cgcgatcggc aataccgcg 39
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggattacag gggaattcct gcggcgtgct cgaactcgat at 42
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtggtcgacg gatccagctc gtaccagtac tcacgcacg 39
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgccatcgtg ttgccgtggt gccgccgaac agatcg 36
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcggcggc accacggcaa cacgatggcg gcagtgtcg 39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggattacag gggaattccg gcttcggtca gcgccgcac 39
<210> 16
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agatctttaa atctagattt aaagatctat ttaaatggat cgtcggcacc gtcacggccg 60
tgggaggcgg cacgatccgc gacgtgatga tcggccgcat ccccacggtg ctgcgcagtg 120
agctctacgc catcccggcg ttgatctgtg cgttagcacg cacaggcccg gtgtgagaag 180
ggtctctgac gagcgggaga acccacccgg ggtgggcgag tttgtcctgc gtgtgctcgg 240
tcgagtaggc tctgggagta cccgtgtgta cgaccagcac ggcatacatc atttcgacgc 300
cgagagattc gccgcccgaa atgagcacga tcccggtacc atcaggagga atcctgc 357
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggaatcct gcgatatcgt gcaaacacgg gacgataacg aagg 44
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttaactacg tcgacatcga tctacttgcg gccctgcagg at 42
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
catcaggagg aatcctgcat gggctgcccc aacatcc 37
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttaactacgt cgacatcgat tcagtggctg accgggcact tac 43
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caggaggaat cctgcgatat catgggctgc cccaacatcc 40
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctagttaact acgtcgactc agtggctgac cgggcactta c 41
<210> 23
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgcaaacac gggacgataa cgaaggggga ttttgctgtg agggtggacc ggttttgctg 60
acaagacggc ggttcctggg tgtcgcgctc ggtgcggcgg ccggtgccgg cgccgtggtg 120
gcgtgccagc ggaccgagtc cggcgagcga ccggccatcg tggtcggcag cgggtacggc 180
gggggcgtca gcgcgttgcg tttgggggag gccggcgtcg aaacgctgat cctggagcgc 240
ggtcggctct gggacacccc ggacgaggac ggtaagcggt tcagcaaaat gttgcccgcc 300
gacacccggg cgggttggtt ccgcgatgtg ccaccgagcc tggtgccctc attcggcggc 360
atatcggtca acgcggtcgc tgcccagaat cctggttcgc agccggtcca ggcgggcatc 420
tgcgacaaga tcacctacgg cgcccacgag gtcttccgcg ggatagcggt cggtggtggc 480
tcgatggtga acgccgcgat cgccgcgata cccacgccgg atcaggtgcg ggcggccttc 540
cccgacatcg accccaacga gttcctcggc acctatgtcg agcgggccaa gaccacgctg 600
aagatcagct atcgcgatat gggctggttc gagcagaccc cctacttcca atatgcgcgg 660
gtggggcgca gttatgccga ggcggcaggc tacggagtgg actacaacgg aagcgcctac 720
tcgttcgatt acatggtctc ggaggccgcc ggccaggcgc cgaagtcggc actggactgg 780
gaatgccagt acggcaacaa ctacggacgc ttcggcagtg tggatcagac ctacatcgcc 840
gcggcgttgg ccaccggcaa ggtgacgttg cgtccgctga ccgaggtgac cggcatccgc 900
cgcgaatcct ccggggagta cgtggtgtcc atccgcgaga tcgatcggtg gggcaaagag 960
ttgtcgcgca acgagatcgg ttgcgagcag ctgtatctgg cggccggcgt ggtcgggacg 1020
gctgagctgc tactgcgcgc gcgtgagaac ggcgatcttg ccgacctgtc cgacgaggtc 1080
ggtgagggtt atggcaacaa cggggacatc atggtggccc acaacaccgc cgagcaggat 1140
ccggtgggta ccctgcagtc gctgctgggc atgatcaacc tggacggtcg caacgatccg 1200
gacaacccgg tgtacgccag catgttctcg ctaccgctgc cgctggagac ccatgcgctg 1260
ggctactacg ccatggtccg caccggcgat cgcgcggtga tcagctatga ccgcgcgtcc 1320
gacgccatct ccatcgattg gccgcagagc aacaccgacc gcctgatcga gcgggccaag 1380
ctcgtcttcg acaaggtgac gcaggccaac ggggtggatt accgcgatga cctgttcgag 1440
gggaaagcct tcgcgcccaa cactgttcac ccattgggtg ggtgtgtgcg gggtgttgcc 1500
accgatgcct tcgggcgggt caacggttac gagaatctct atgtcaacga cgcgtcgctc 1560
gttccggggt atatcggctg caacccgtac atgtcgatca ccgcgctggc cgaacgcaat 1620
atcgaggcga tcctgcaggg ccgcaagtag 1650
<210> 24
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgggctgcc ccaacatccc caaggatttc gacttcctcg attccgagct gaacctcaag 60
ggcctgccgg tcaaggaact cgccgagctc cgtaaggccg agccggttcg ctgggtcgac 120
gtgccgggcg gcaccggtgg cttcggcgac aagggctact ggctggtcac ccgccacgag 180
gacgtcaagg acgtctcact gcgcagcgac gtgttctcca gctcgatgaa cggcgcgatc 240
ccggtctggc cgcaggagat gacccgcgag gccgtcgact tgcagcgcgc cgttctgctc 300
aacatggacg caccgcacca cacccgcctg cgcaagatca tctcccgcgg tttcaccccg 360
cgcgccctgt cgcggctcga ggacgagttg aactcgcgcg cacagcagat cgccaagaac 420
gccgcggcct cgaccaccgg cgacttcgtc gagcaggtct cctgcgagct gccgctgcag 480
gccatcgccg aactgctcgg cgtgccccag gacgatcgcg acaagctgtt ccgctggtcc 540
aacgagatga ccgccggtga cgatcccgag tacgccgacg tggacccggc catgtcctcg 600
ttcgagctca tctcctacgc catgaagatg gccgaagagc gcggcaagaa cccgaccgac 660
gacatcgtca ccaagctgat ccaggccgac atcgacggcg agaagctcag cgacgacgag 720
ttcggcttct tcgtgatcat gctggccgtg gccggtaacg agaccagccg taactcgatc 780
acccacggca tgatcgcgtt ctcgcagcat cccgagcagt gggagctgtt caagaaggag 840
cggcccaaga ccgcggtcga cgagatcatc cgctgggcca cccccgtgtc ggccttccag 900
cgcaccgcca gcgaggacac cgagatctcc ggtgtcaaga tcaaggccgg agagcgtgtg 960
gtgatgtcct accgctcggc caacttcgac gagacggtgt tcgaagaccc gttcacgttc 1020
aacatccttc gggatcccaa cccgcacgtc ggcttcggcg gcacgggggc gcactactgc 1080
atcggcgcca acctggcccg cctgacgatc aacctgatct tcaacgccgt ggccgatcac 1140
atgcccgacc tcaagcccgt cggagaaccc gagcggctga agtccggatg gctcaatggt 1200
attaagcatt ggccggtcga ctacaccggt aagtgcccgg tcagccactg a 1251

Claims (10)

1.基因在提高双降醇产量或改造双降醇的产生菌中的用途，其特征在于，所述基因为编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因，敲除或失活所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因提高双降醇的产量。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因还包括编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因，过表达所述编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因提高双降醇的产量。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，包括如下1)-5)中的一项或多项；
1)所述编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；
A1)所述基因为kstD1；所述kstD1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
A2)所述基因为kstD2；所述kstD2的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示序列；
A3)所述基因为kstD3；所述kstD3的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；
A4)与所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸；
2)所述编码胆固醇氧化酶的基因为如下B1)或B2)；
B1)所述编码胆固醇氧化酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.23所示序列；
B2)与所述SEQ ID NO.23所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述胆固醇氧化酶的核苷酸；
3)所述编码细胞色素P450单加氧酶的基因为如下C1)或C2)；
C1)所述编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.24所示序列；
C2)与所述SEQ ID NO.24所示序列限定的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性，且编码如所述细胞色素P450单加氧酶的核苷酸；
4)所述胆固醇氧化酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌；
5)所述细胞色素P450单加氧酶来源于分枝杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。
4.与如权利要求1-3任一项所述的用途中的基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下中的一项或多项：
a)多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示序列中的一种或多种；
b)含有a)所述的核苷酸序列的重组表达载体；
c)含有a)所述的核苷酸序列的工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的工程菌；
d)由a)所述的核苷酸序列编码的蛋白质。
5.一种产双降醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过在宿主细胞中敲除或失活编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因构建获得。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包括过表达编码胆固醇氧化酶的基因和/或编码细胞色素P450单加氧酶的基因。
7.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞选自分枝杆菌，所述分枝杆菌的基因组中敲除或失活KshAB和Hsd4A基因，优选地，为金色分枝杆菌Mycobacteriumneoaurium DSM1381；
和/或，用于构建过表达编码胆固醇氧化酶和/或细胞色素P450单加氧酶的基因采用的穿梭质粒选自pMV40。
8.一种提高双降醇产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用如权利要求5-7任一项所述的基因工程菌发酵甾醇，得到所述的双降醇。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述甾醇选自胆固醇或植物甾醇中的一种或两种。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃～37℃；
和/或，所述发酵的pH值为7～8；
和/或，所述发酵的时间为5～9天。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024131933A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-27 Hangzhou Enhe Biotechnology Co., Ltd. Engineered microbes for production of progesterone and ursodeoxycholic acid by fermentation

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3759791A (en) * 1970-12-10 1973-09-18 Searle & Co Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione
US4223091A (en) * 1977-10-14 1980-09-16 Mitsubishi Chemical Industries Limited Process for producing steroidal alcohols
CN102168098A (zh) * 2011-01-21 2011-08-31 华东理工大学 胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用
CN104263791A (zh) * 2014-09-12 2015-01-07 苏州汉酶生物技术有限公司 一种酶法制备11a,17a-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN108138126A (zh) * 2016-06-16 2018-06-08 华东理工大学 一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备甾体化合物中的应用
CN108456666A (zh) * 2018-03-12 2018-08-28 中国科学院上海高等研究院 一种3-甾酮-△1-脱氢酶及其编码基因和应用
CN109971694A (zh) * 2018-12-16 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种在双降醇生产中基因敲除新金色分枝杆菌的方法
CN109971813A (zh) * 2018-12-18 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种制备双降醇的工艺
CN109971780A (zh) * 2018-12-17 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种在双降醇中分枝杆菌甾酮c1,2位脱氧酶基因敲除的方法
CN111454871A (zh) * 2020-03-03 2020-07-28 天津大学 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
CN111484964A (zh) * 2020-03-14 2020-08-04 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法
CN111662858A (zh) * 2020-07-17 2020-09-15 湖北工业大学 Hgms2菌株突变体在制备4-雄甾烯-3,17-二酮（4-ad）中的应用
CN111808830A (zh) * 2020-06-28 2020-10-23 中国科学院上海高等研究院 一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法
CN112094797A (zh) * 2020-11-05 2020-12-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用
WO2021252411A2 (en) * 2020-06-10 2021-12-16 Sandhill One, Llc Genetically modified organisms for the production of steroid derivatives

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3759791A (en) * 1970-12-10 1973-09-18 Searle & Co Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione
US4223091A (en) * 1977-10-14 1980-09-16 Mitsubishi Chemical Industries Limited Process for producing steroidal alcohols
CN102168098A (zh) * 2011-01-21 2011-08-31 华东理工大学 胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用
CN104263791A (zh) * 2014-09-12 2015-01-07 苏州汉酶生物技术有限公司 一种酶法制备11a,17a-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法
CN108138126A (zh) * 2016-06-16 2018-06-08 华东理工大学 一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备甾体化合物中的应用
CN106282080A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 江南大学 一种新金色分枝杆菌来源的甾酮c27‑单加氧酶及其应用
CN108456666A (zh) * 2018-03-12 2018-08-28 中国科学院上海高等研究院 一种3-甾酮-△1-脱氢酶及其编码基因和应用
CN109971694A (zh) * 2018-12-16 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种在双降醇生产中基因敲除新金色分枝杆菌的方法
CN109971780A (zh) * 2018-12-17 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种在双降醇中分枝杆菌甾酮c1,2位脱氧酶基因敲除的方法
CN109971813A (zh) * 2018-12-18 2019-07-05 浙江神洲药业有限公司 一种制备双降醇的工艺
CN111454871A (zh) * 2020-03-03 2020-07-28 天津大学 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用
CN111484964A (zh) * 2020-03-14 2020-08-04 天津大学青岛海洋技术研究院 一种高产9-ohad的分枝杆菌及其构建的方法
WO2021252411A2 (en) * 2020-06-10 2021-12-16 Sandhill One, Llc Genetically modified organisms for the production of steroid derivatives
CN111808830A (zh) * 2020-06-28 2020-10-23 中国科学院上海高等研究院 一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法
CN111662858A (zh) * 2020-07-17 2020-09-15 湖北工业大学 Hgms2菌株突变体在制备4-雄甾烯-3,17-二酮（4-ad）中的应用
CN112094797A (zh) * 2020-11-05 2020-12-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAGIN,E.Y等: "Mycobacterium sp. VKM Ac-1817D, complete genome", 《NCBI GENBANK DATABASE》, pages 009914 *
HAIDONG PENG等: "A dual role reductase from phytosterols catabolism enables the Efficient Production of Valuable Steroid Precursors", 《ANGEW CHEM INT ED ENGL》, vol. 60, no. 10, pages 5414 - 5420 *
LQ XU 等: "Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism", 《NATURE》, vol. 6, pages 5 *
RUIJIE ZHANG等: "Identification, function, and application of 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenase isozymes in Mycobacterium neoaurum DSM 1381 for the production of steroidic synthons", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》, vol. 17 *
XINGZI LI等: "Synthesis of plant-derived cholesterol from bisnoralcohol", 《STEROIDS》, vol. 178 *
XUEMEI LI等: "New product identification in the sterol metabolism by an industrial strain Mycobacterium neoaurum NRRL B-3805", 《STEROIDS》, vol. 132, pages 40 - 45 *
YU HU等: "A recycled batch biotransformation strategy for 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one production from high concentration of phytosterols by mycobacterial resting cells", 《BIOTECHNOL LETT》, vol. 42, no. 12, pages 2589 - 2594, XP037278335, DOI: 10.1007/s10529-020-02991-1 *
ZHANG B等: ""Mycolicibacterium neoaurum 3-ketosteroid-1-dehydrogenase KstD3 gene, complete cds", 《NCBI GENBANK DATABASE》, pages 251737 *
李辉等: "分枝杆菌转化植物甾醇定向积累甾药中间体的代谢工程研究进展", 《中国油脂》, vol. 47, no. 4 *
柳相鹤;张瑞婕;赵树欣;张保国;史吉平;: "Mycobacterium sp. BFZ304转化植物甾醇产9α-羟基雄烯二酮培养基的响应面优化", 食品工业科技, no. 16 *
王贵娥;陈艺强;范永仙;李剑锋;陈小龙;: "3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中强化表达", 药物生物技术, no. 05 *
贾红晨;李芳;郑鑫铃;崔慧林;骆健美;申雁冰;王敏;田妥;丁安鹏;: "甾体微生物转化反应关键酶3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的研究进展", 微生物学通报, no. 07 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024131933A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-27 Hangzhou Enhe Biotechnology Co., Ltd. Engineered microbes for production of progesterone and ursodeoxycholic acid by fermentation

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