CN112094797A

CN112094797A - 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用

Info

Publication number: CN112094797A
Application number: CN202011223266.4A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 李雪梅; 吴洽庆; 冯进辉; 朱敦明; 张瑞; 王玉; 徐自祥; 卜丹丹
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN112094797B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及分枝杆菌基因工程菌及其在制备9α，22‑二羟基‑23，24‑双降胆甾‑4‑烯‑3‑酮中的应用。所述基因工程菌是将分枝杆菌中的3个3‑甾酮‑∆¹‑脱氢酶的基因kstd 1、kstd 2和kstd 3失活，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白的基因构建获得，其能够选择性地产生9α，22‑二羟基‑23，24‑双降胆甾‑4‑烯‑3‑酮，减少了副产物9‑OH‑AD的生成，大大提高了生产效率和产品品质，使产物易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少了对环境的污染。

Description

基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯- 3-酮的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

背景技术

甾体是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，通常在C-10和C-13位有甲基基团，在C-17位有烷基侧链。甾体作为一种细胞膜的组分，在生物体中具有重要的作用。一些甾体还具有激素和信号分子的作用。自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体激素药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。

根据《甾体化学进展》（周维善、庄治平主编，科学出版社2002年出版，ISBN 7-03-009607-X）报道，很多微生物包括诺卡氏菌（Nocardia）、分枝杆菌（Mycobacterium）、节杆菌（Arthrobocter）、和假单胞杆菌（Pseudomonas）等都可将甾体母核环戊烷多氢菲及侧链全部氧化成二氧化碳和水。代谢途径经Sih及其合作工作者（参考文献“Sih CJ, Wang KC,Tai HH. Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms. XIII. C22 acidintermediates in the degradation of the cholesterol side chain. Biochemistry,1968, 7: 796-807”）的研究阐述如图1所示。该过程表明，在微生物降解过程中可通过控制不同酶的活力，获得如4-AD（化合物15）、9-OH-AD，22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮和9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮等重要的中间体。美国专利US 20110191875A1报道了通过在分枝杆菌中阻断DNA结合蛋白（CxgB）的活力，抑制了植物甾醇转化生产4-雄烯二酮（4-AD）过程中副产物22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的产生，推测乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）也参与到了植物甾醇转化生产22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮和22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的代谢途径中。

Ⅰ

9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮，英文名为9α,22-dihydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one，结构式如式Ⅰ所示，可以作为合成许多甾体激素药物的中间体，如肾上腺皮质激素，孕激素，蛋白同化激素等。目前利用生物方法制备9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮的报道较少，王风清等的研究表明（专利：CN201910510202.3，参考文献“Xu L Q, Liu Y J, Yao K, et al. Unraveling and engineering the productionof 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism, Scientific Repots,2016, 6: 21928”），在分枝杆菌中敲除分枝杆菌中的酯酰辅酶A硫解酶基因，可用于生产9ɑ,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-二烯-3-酮，利用大量静息细胞转化植物甾醇，底物投料浓度为40 g/l，转化144 h，底物转化率仅50%，得到的主产物为9ɑ,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-二烯-3-酮，摩尔产率为30%，反应中还包含其它副产物，导致分离纯化困难、生产成本高。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种基因工程菌及其在制备9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

具体而言，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种分枝杆菌基因工程菌，所述基因工程菌是将分枝杆菌中的3个3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因的表达量降低、失活或敲除，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）和DNA结合蛋白（CxgB）的基因构建获得。本发明研究发现，同时将3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因失活，并过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）和DNA结合蛋白（CxgB）的基因，会大幅度提高目标产物9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮的产量。单独失活3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因，产生的产物为9-OH-AD，检测不到目标产物9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮，需要进一步配合过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶（CxgA）和DNA结合蛋白（CxgB）的基因，才能最终得到目标产物9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮。

其中，所述的基因工程菌的出发菌是分枝杆菌，其均有一致的甾醇代谢途径，都可以适用。在一个具体实施方式中，出发菌是美国模式培养物保存库(ATCC)的菌种号为ATCC700084的Mycobacteriu. smegmatis mc²155。

优选地，所述三个3-甾酮-∆¹-脱氢酶的编码基因具有SEQ ID NO：1（kstd 1），SEQID NO：2（kstd 2），SEQ ID NO：3（kstd 3）所示核苷酸序列。其中将分枝杆菌中的这3个3-甾酮-∆¹-脱氢酶（KstD）的基因的表达量降低、失活或敲除，可以通过已知的方法实现，例如基因编辑方法等。

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡式菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因来源于分枝杆菌。所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性的氨基酸序列。

所述DNA结合蛋白基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡式菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述DNA结合蛋白基因来源于分枝杆菌。所述DNA结合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性的氨基酸序列。

本发明的第二方面提供了上述基因工程菌在制备9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

所述应用是利用上述的基因工程菌，以甾醇为发酵原料进行发酵以生产9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮。所述应用优选在25-45℃下进行，更优选在25-37℃下进行发酵。发酵时的pH优选为7-8。发酵优选进行3-12天，例如进行3-10天，更优选4-10天。根据具体的应用和条件，可以根据情况进行调整所述9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮生产菌的发酵接种量，例如可以为：生产菌种子液的OD_600nm(600nm下的OD值)为1-20(例如10)、体积为发酵用培养液的1%-20%。例如，当OD值低时，可以接种较大体积的种子液；当OD值高时，可以接种较小体积的种子液。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本发明所提供的基因工程菌株选择性地产生9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮，减少了副产物9-OH-AD的生成，大大提高了生产效率和产品品质，使产物易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少了对环境的污染。

附图说明

图1为甾醇在微生物中代谢途径；

图2所示实施例3的发酵液萃取样品的液相色谱图。其中，a为出发菌株发酵液萃取样品，b为3个KstD失活菌株发酵液萃取样品，c为KstD失活、乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白编码基因过表达菌株发酵液萃取样品，d为9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮标准品；

图3所示是实施例3制得的9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮的¹H-NMR图。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，未进行具体说明的操作步骤均为常规的操作。

实施例1：基因失活菌株的构建

3-甾酮-∆¹-脱氢酶编码基因（kstd1，kstd2，kstd3）如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3所示，以出发菌株Mycobacteriu. smegmatis mc²155（菌种号：ATCC 700084 ）的基因组为模板进行PCR扩增，按照以下的方法分别构建失活kstd1，kstd2和kstd3的菌株。

本研究采用CRISPR-Cas12a辅助重组工程（参考文献：Yan MY, Yan HQ, Ren GX,Zhao JP, Guo XP, Sun YC. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria[J]. Appl EnvironMicrobiol, 2017, 83(17): e00947-17）构建敲除菌株。首先在kstd1基因上选取靶向滞后链的31个碱基序列作为基因特异性crRNA，以pCR-Hyg质粒为模板，用KstD1-F/R和pCR-Hyg-F/R两对引物扩增，得到的两个质粒片段连接并转化后送测序，测序正确的抽提得到重组质粒pCR-Hyg- kstd1。与此同时，合成60 bp用于重组的ssDNA kstd1（包含31 bp crRNA），并引入两个连续终止密码子（TAATAA）用于终止目标基因的表达，然后将约100ng crRNA重组质粒pCR-Hyg-kstd1和500 ng ssDNA-kstd1转化到已表达Cas12a和重组酶的Mycobacteriu. smegmatis mc²155（菌种号：ATCC 700084 ）中，引物KstD1-PCR-F/R进行PCR验证后测序可得到重组菌株。最后，在添加了10%蔗糖的LB培养基中培养菌株获得了无抗性质粒的kstd1失活菌株Msm1。

参照kstd1失活菌株的构建过程，构建同时失活kstd1，kstd2及同时失活kstd1， kstd2，kstd3菌株。以pCR-Hyg质粒为模板，KstD2-F/KstD-R和pCR-Hyg-F/R两对引物同时扩增，得到包含31 bp基因特异性crRNA的重组质粒pCR-Hygkstd2，之后将pCR-Hyg-kstd2和寡核苷酸ssDNA-kstd2共转化已表达Cas12a和重组酶的Msm1感受态细胞，用引物KstD2-PCR-F/R进行菌液PCR验证，在kstd2基因中成功引入TAATAA突变的即为同时失活kstD1和kstD2的Msm12菌株，用同样的方法继续将pCR-Hyg-kstd3和寡核苷酸ssDNA-kstd3共转化已表达Cas12a和重组酶的Msm12感受态细胞，用引物KstD3-PCR-F/R进行PCR验证及测序，最终可得到同时失活kstd1、kstd2和kstd3的菌株Msm123。

对于kstd1：

crRNA- kstd1：5' GTCCTCAAGCACTCGCCGCTGAAGCTGTGCT 3'

KstD1-F：5' TGTTGTAGATGTCCTCAAGCACTCGCCGCTGAAGCTGTGCTGTCTAAG

AACTTTAAATAA 3'

KstD1-R：5' TTCTTAGACAGCACAGCTTCAGCGGCGAGTGCTTGAGGACATCTACAA

CAGTAGAAATTA 3'

pCR-Hyg-F：5' AGACTCCCGCTACAGCCTGGTGCAAC 3'

pCR-Hyg-R：5' GTTGCACCAGGCTGTAGCGGGAGTCT 3'

KstD1-PCR-F: 5' ATGACTGGACAGGAGTACGACG 3'

KstD1-PCR-R: 5' CCATACCGACGAGGTTCTTGC 3'

ssDNA-kstd1：5' TGGACCGCGGGCCGGAAATGCTGTCGtaataaCTCAAGCACTCGCCGCTGAAGCTGTGCT3'

对于kstd2：

crRNA- kstd2：5' CCGATGCCGGTGACCGGCGCCGACTACCGCT 3'

KstD2-F: 5' CTGATTTAGGCAAAAACGGGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTG

TAGATCCGATGCCGGTGACCGGCGCCGACTACCGCTGTCTAAGAACTTTA 3'

KstD2-R: 5' CCGTTTTTGCCTAAATCAGCCTC 3'

KstD2-PCR-F：5' ATTCCAGTGGGCCAAGGGGTATT 3'

KstD2-PCR-R：5' GTCGCTCAGCACCACCTTCACC 3'

ssDNA-kstd2: 5' TGCGGCCGGGGGTGATGAAATCCTCGtaataaATGCCGGTGACCGGCGC

CGACTACCGCT 3'

对于kstd3：

crRNA- kstd3: 5' AAGTACTTCCACGCCGTCGTCGGCGACCGGA 3'

KstD3-F: 5' CTGATTTAGGCAAAAACGGGTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTG

TAGATAAGTACTTCCACGCCGTCGTCGGCGACCGGAGTCTAAGAACTTTA 3'

KstD3-PCR-F: 5' GGTCT TTCGGTGCTGCTGGTGG 3'

KstD3-PCR-R: 5' AGTGGTTTCGGGACGATGTGGC 3'

ssDNA-kstd3: 5' GAACCGACGACACCCTCGACGAGGCGtaataaTACTTCCACGCCGTCGTC

GGCGACCGGA 3'。

实施例2：基因表达菌株的构建

1、表达质粒构建

应用引物cxgAB-F和cxgAB-R扩增来自Mycobacterium sp. NRRL B-3805基因组中的乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶基因（cxgA）和DNA结合蛋白基因（cxgB），获得带有与质粒pMV261的15bp同源臂的cxgAB片段后，与表达质粒pMV261经EcoRI和HindIII酶切纯化获得单片段连接，获得重组表达质粒261-cxgAB。

PCR体系：

5×Phusion GC Buffer 10 μl

2mM dNTPs 5 μl

Primer F 1 μl

Primer R 1 μl

Template DNA 50-100 ng

DMSO 1.5 μl

Phusion 0.5 μl

ddH₂O 至50 μl

PCR程序：98℃ 3 min；98℃ 10 s变性，58℃ 20 s退火，72℃ 30 s延伸，30个循环；72℃ 10 min。其中所用引物序列为：

cxgAB-F: 5' GCGGATCCAGCTGCAGAATTCATGGGTTTGCGTGGTGACG 3'

cxgAB-R: 5' TACGTCGACATCGATAAGCTTCTATTCGGCGGCGGTGTAGTG 3'

将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板（胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，Kan：50μg/ml，琼脂：1.5%），37℃过夜培养。挑单菌落培养后提质粒进行酶切验证后，再测序进一步确证是否构建成功。

2、分枝杆菌表达菌的构建

通过电转化将构建好的重组表达质粒261-cxgAB导入上述三失活菌株Msm123感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒261-cxgAB的重组菌株。

实施例3：发酵生产9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮

种子培养基：葡萄糖6 g/L，酵母粉15 g/L，NaNO₃ 5.4 g/L，甘油2 g/L，NH₄H₂PO₄ 0.6g/L，卡纳霉素0.1 mg/L，pH 7.5，115°C灭菌30分钟。

发酵培养基：脱脂豆粉 10 g/L，玉米浆 5 g/l,磷酸氢二氨3 g/L,大豆油150 g/L，卡纳霉素0.1 mg/L，pH 7.5，121°C灭菌30分钟。

发酵培养步骤：

1、37℃下LB平板（胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，琼脂：15 g/L）培养72小时以活化菌种；

2、从活化平盘接种至种子培养基中，180 rpm，37°C培养3天；将种子液在无菌条件下取样进行取样镜检，镜检无染菌方可接种；

3、按10%的接种量接种至3 L发酵培养基中；

500 rpm，37°C发酵培养，通气比为0.5 vvm，培养24小时后提高温度至42°C并保持30分钟，再降低发酵温度至37°C继续发酵，整个发酵过程pH在7-8之间，不需要控制；发酵前期因为是有油体系，所以底物植物甾醇会有结块现象，因此前期最好不要取样，在体系变均匀后可以定时取样进行检测。具体而言，每8小时取样50ml，加入乙酸乙酯萃取得到粗提物，TLC分析植物甾醇的残留量。当植物甾醇转化为9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮的反应转化率达到95%时，终止发酵。发酵后的整个体系用乙酸乙酯萃取直至萃取完全，记录整个萃取相体积，通过制作标准曲线进行定量，得到整个发酵收率，液相色谱结果如图2所示。

制得的样品9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮的核磁数据，核磁谱图如图3所示：：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ5.85 (s, 1H), 3.63 (dd, J = 3.2, 6.8 Hz,1H), 3.36 (dd, J = 31.9, 8.9 Hz, 1H), 2.52-2.36 (m, 4H), 2.34-2.24 (m, 1H),1.96-1.80 (m, 3H), 1.79-1.67 (m, 1H),1.65-1.23 (m, 15H), 1.21-1.08 (m, 1H),1.05 (d, J = 3.2 Hz, 3H), 0.75 (s, 3H).

其中，发酵罐验证结果如下表所示：

本发明所提供的基因工程菌株选择性地产生9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮，减少了副产物9-OH-AD的生成（摩尔收率达30%）。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用

<130> 202001015

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> Mycobacterium. smegmatis

<400> 1

gtgttctaca tgactggaca ggagtacgac gttgtggtgg tcgggagcgg tgctgccggc 60

atggtcgccg ccctcaccgc agcccaccag ggcctctcga cagtagtcgt agaaaaggct 120

ccgcactacg gtggttccac tgcgcggtca ggtggtggtg tgtggatccc gaacaacgag 180

atcctcaagc gcgacggcgt caaggacact cctgacgagg cgcggaaata cctgcacgcg 240

atcatcggtg acgtcgtccc ggccgagaag atcgacacgt atctggaccg cgggccggaa 300

atgctgtcgt tcgtcctcaa gcactcgccg ctgaagctgt gctgggtgcc cggatactcc 360

gactactacc ccgagacccc gggtggcaag cccacggggc ggtcggtcga gccgaagccg 420

ttcgacgcca acaagctggg ccccgacctc aaaggtctcg aaccgccgta cggcaaggtc 480

cccatgaaca tggtggtcat gcagcaggac tacgtgcggc tcaaccagct caaacgtcat 540

ccgcgcggcg tactgcgcag cctcaaggtc ggcatccgcg cgacgtgggg caaggtcagc 600

ggcaagaacc tcgtcggtat gggccgcgcg ctcatcgcgc cgctgcgtat cggcctgcgc 660

gaggccgggg ttccggtgct gctgaacacc gcgctgaccg atctgtacgt cgaggacggc 720

cgcgtgctgg gcatctacgt ccgcgacacg acggccggcg acgacgccga gccccggctg 780

atccgcgcac gccacggcgt gatcctcgga tccggcgggt tcgagcacaa cgagcagatg 840

cgcgtgaagt accagcgcgc gcccatcacc acggagtgga ccgtcggcgc ggtcgccaac 900

accggcgacg gtatcgtcgc cgccgaaaag ctcggggcgg cactcgaact catggaagac 960

gcgtggtggg gccccacggt tccgctggtc ggcgccccgt ggttcgcctt gagcgagcgc 1020

aactcccccg gatcgatcat cgtcaacatg tccggcaagc gcttcatgaa cgaatccatg 1080

ccctacgtcg aggcatgcca ccacatgtac ggcggccagt acggccaggg ccccggtccc 1140

ggcgagaaca tcccggcgtg gctcatcttc gaccagcaat accgcgaccg ctacatcttc 1200

gccggtttgc aaccagggca gcggatcccg tcgaagtggc tggaatccgg tgtgatcgtc 1260

aaggccgaca cgctggtcga actggccgag aagaccggcc tgcccgccga tcagttcacc 1320

tcgaccatcg agcgcttcaa cgggttcgca cgctcgggtg tcgacgagga cttccaccgc 1380

ggcgagagtg cctacgaccg ttactacggc gatcccacca acaaacccaa cccgaacctg 1440

ggcgagatca agcacggccc cttctacgcc gccaagatgg tgcccggtga cctcggcacc 1500

aagggcggca tccgcaccga cgtgcgcgga cgcgctctgc gcgacgacga ttcggtgatc 1560

gagggtctgt atgctgccgg caatgtcagc tcaccggtga tgggccacac ctatccggga 1620

cccggcggca ccatcggtcc cgccatgaca ttcggttacc tggccgcact cgacatcgcc 1680

gctaccgcgg cggcctcccg gaagggctga 1710

<210> 2

<211> 1677

<212> DNA

<213> Mycobacterium. smegmatis

<400> 2

gtgactgatc cccagaacct caccgtcgat ctgctggttg tcggctccgg caccggaatg 60

gccgccgccc tggccgcgca cgaactcggc ctgtcggcaa tgatcgtgga gaagaccgcc 120

ctggtcggcg ggtcgaccgc acgctcaggt ggcgcgttct ggatgcctgc caatccgatc 180

ctgtccgaag aaggttccga cgacaccctc gatgccgggc gcacctatct ggagaccctc 240

gtcgccgatg ccgcaccggc cgaccgggcc ggggcgttcc tggatcacgg cagcgcgaca 300

gtcgagatgc tgcggcgcac cacgccgatg aaattccagt gggccaaggg gtattcggat 360

tatcacccgg agcgtcccgg tggcagtgcc gtcggccgca cgtgtgaatg ccgcccgttc 420

gacaccgccg tcctcgggcg ggaactgtca cggctgcggc cgggggtgat gaaatcctcg 480

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cgcatcgccc aggacctcgg cgccgacacc ggactcatgg accaggcgtg gtggttcccg 960

gcgttcgctc ccctacccgg tggtgagccc accgtgatgc tcgccgagcg gtcactgccc 1020

ggatgtctgc tggtcgatca gaccggcaac cggttcatca acgaagccac cgactacatg 1080

tcgttcgggc agcgcgtgct ggaccgtgag cgcgtgggca acccggtcga cgtgatgtgg 1140

atgatcttcg accagcggta ccgcaacagc tatctgcttg ccaccgaact gtttccgcgg 1200

atgccgatcc cgcagacctg gtatgacgcc ggcatcgcgc accgcagtga cgatctcggc 1260

ggactcgcgc ggtcgatcgg cgtcgacgtg tcggtcctga ccgccacact gagccgcttc 1320

aacgcgctcg cacgcaccgg cgtcgactcc gacttcggcc gcggcgacag cgcctacgat 1380

cgctactacg gcgaccccac cgtgacaccg aaccccaatc tgcgcccgct ggacgacggc 1440

ccgctctacg cggtgaaggt ggtgctgagc gacctcggta cctgcggtgg cgtgcgggcc 1500

gatgcccgcg gccgggcgtt gcgtgaggac ggctcggtga tcgagggtct ctacgccatc 1560

ggcaacaccg ccgccaacac cttcggcgcc agctacccgg gcgcgggcgc caccatcggg 1620

cagggcctgg tgttcggcta catcgcggcc cggcacgccg caggccggct cgactga 1677

<210> 3

<211> 1569

<212> DNA

<213> Mycobacterium. smegmatis

<400> 3

atgcccgacc aaagatctga gtccggccgg ttcgacgtcg aggtcgatgt gttggtggct 60

ggttccggtg gcggtgtggc cggtgcgtat accgctgccc gggagggtct ttcggtgctg 120

ctggtggagg ccaccgacaa gttcggcggc accacggcgt tctccggtgg tggcggcatg 180

tggtttccct gcaacccggt gctcgaacgg gccggaaccg acgacaccct cgacgaggcg 240

ttgaagtact tccacgccgt cgtcggcgac cggactcccc aagaactgca ggacgcctac 300

gtcaccggcg gggccggctt catcgcctac ctcgagcagg accacggctt cgagttcgcc 360

gtgctgccct ggccggacta ctacggttcg gtaccgggcg cccgcaacga cgggtaccgc 420

cacatcgtcc cgaaaccact gcccgacagc gctttgggct cataccaggg tctggtgcgc 480

ggtccgctcg acaccgaacg cctcggcgcg cccgcacccg acacgctgat cggcggccgc 540

gcactggtcg gacggttcct ggccgccctg gacaagctgc cgaacgccga ctgctggtgt 600

gaggccccgc tgaccgaact gatcaccgaa agtggccgag tggtgggcgc catcgtggaa 660

cgcggcggtg agcgtctacg ggtgtgcgcc cggcgcgggg tgctgctggc gtcgggcggg 720

ttcgagcaga acgccgacat gcgtggcaga tacggggtgc cgggcagcgc gacggacacc 780

atgggcggcc cgggcagcac aggtgcggcc caccgcgcgg cgatggcggt gggtgcggat 840

gtcgacctga tggatcaggc gtggtggtcg ccgggcctga cacacccgga cggccgttcc 900

gcgttcgcgc tgtggttcac cgggggcatc ttcgtcgacc aggacggcaa gcggttcgtc 960

aacgagtccg caccgtacga ccggttgggc cgcgcggtga tcgagcgact cgaatccggg 1020

cgcctgacgc tgccgtactg gatggtgtac gacagccggg ccggtgatgt gccgccggtc 1080

ggcgccacca acgtctcgat ggtcgatccg gccgagtacc gcgcggcggg actgtggcgt 1140

tcagcagaga cgatctcggg cctcgcagag gagatcggcg ttcccgccga cgctctcgaa 1200

gccaccatcc agcgcttcaa cgagatggcc accgcaggcc acgacgacga cttcggccgc 1260

ggcgacgagg catacgaccg ggtgttcacc ggcggggcct cgccgctggt tccgatcgac 1320

acaccgccct accatgcggc cgcgttcgga ctgtccgatc tcgggacgaa aggcggtctg 1380

cgcactgaca cccgcgcccg tgtccgcgga cgtgacggcg agccgattcc gggcctgtac 1440

gccgcgggca acaccatggc tgccgtgagc ggtacgacct accccggcgg cggcaatccg 1500

atcggggcgt cgatgctgtt cagtcacttc gcggcgctcg acatggcggc cgaaggcacc 1560

acggcgtga 1569

<210> 4

<211> 401

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 4

MGLRGDAAIV GFHELPATRK PTGTAEFTIE QWARLAAAAV ADAGLSVQQV DGLVTCGVME 60

SQLFVPSTVA EYLGLAVNFA EIVDLGGASG AAMVWRAAAA IELGLCQAVL CAIPANYLTP 120

MSAERPYDPG DALYYGASSF RYGSPQAEFE IPYGYLGQNG PYAQVAQMYS AAYGYDETAM 180

AKIVVDQRVN ANHTPGAVFR DKPVTIADVL DSPIIASPLH MLEIVMPCMG GSAVLVTNAE 240

LARAGRHRPV WIKGFGERVP YKSPVYAADP LQTPMVKVAE SAFGMAGLTP ADMDMVSIYD 300

CYTITALLTL EDAGFCAKGT GMRFVTDHDL TFRGDFPMNT AGGQLGYGQP GNAGGMHHVC 360

DATRQLMGRA GATQVADCHR AFVSGNGGVL SEQEALVLEG D 401

<210> 5

<211> 138

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 5

MTESSARPVP LPTPTSAPFW DGLRRHEVWV QFSPSSDAYV FYPRILAPGT LADDLSWRQI 60

SGDATLVSFA VAQRPVAPQF ADAVPHLLGV VQWTEGPRLA TEIVGVDPAR LRIGMAMTPV 120

FTEPDGADIT LLHYTAAE 138

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcctcaagc actcgccgct gaagctgtgc t 31

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttgtagat gtcctcaagc actcgccgct gaagctgtgc tgtctaagaa ctttaaataa 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcttagaca gcacagcttc agcggcgagt gcttgaggac atctacaaca gtagaaatta 60

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agactcccgc tacagcctgg tgcaac 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttgcaccag gctgtagcgg gagtct 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgactggac aggagtacga cg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccataccgac gaggttcttg c 21

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggaccgcgg gccggaaatg ctgtcgtaat aactcaagca ctcgccgctg aagctgtgct 60

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgatgccgg tgaccggcgc cgactaccgc t 31

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctgatttagg caaaaacggg tctaagaact ttaaataatt tctactgttg 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tagatccgat gccggtgacc ggcgccgact accgctgtct aagaacttta 50

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgtttttgc ctaaatcagc ctc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

attccagtgg gccaaggggt att 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtcgctcagc accaccttca cc 22

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgcggccggg ggtgatgaaa tcctcgtaat aaatgccggt gaccggcgcc gactaccgct 60

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aagtacttcc acgccgtcgt cggcgaccgg a 31

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctgatttagg caaaaacggg tctaagaact ttaaataatt tctactgttg tagataagta 60

cttccacgcc gtcgtcggcg accggagtct aagaacttta 100

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggtctttcgg tgctgctggt gg 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agtggtttcg ggacgatgtg gc 22

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaaccgacga caccctcgac gaggcgtaat aatacttcca cgccgtcgtc ggcgaccgga 60

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcggatccag ctgcagaatt catgggtttg cgtggtgacg 40

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tacgtcgaca tcgataagct tctattcggc ggcggtgtag tg 42

Claims

1.一种分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将分枝杆菌中的3个3-甾酮-∆¹-脱氢酶的基因kstd 1、kstd 2和kstd 3的表达量降低、失活或敲除，同时过表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶和DNA结合蛋白的基因构建获得。

2.如权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，其出发菌是菌种号为ATCC700084的Mycobacteriu. smegmatis mc²155。

3.如权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的3个3-甾酮-∆¹-脱氢酶的编码基因kstd 1、kstd 2和kstd 3分别是如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶/硫解酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的分枝杆菌基因工程菌，其特征在于，所述DNA结合蛋白具有SEQID NO:5所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1至5任一项所述的分枝杆菌基因工程菌在制备9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述的基因工程菌，以甾醇为发酵原料进行发酵以生产9α，22-二羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵是在25-45℃下进行。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵是在25-37℃下进行发酵。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵时的pH为7-8。