CN116769866A - 一种制备表雄酮的方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请提供了一种制备表雄酮的方法，包括如下步骤：用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α‑还原酶过表达载体，转化至分枝杆菌中进行表达，并收集带有5α‑还原酶的细胞或细胞碎片；往带有5α‑还原酶的细胞或细胞碎片中加入4‑雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80、羟丙基‑β‑环糊精，反应30‑60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，利用薄层色谱法检测反应进程，当转化率达90‑99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中带有5α‑还原酶的细胞或细胞碎片和4‑雄烯二酮的质量比为2～0.5：1。本发明的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体地，涉及制备表雄酮的方法。
背景技术
表雄酮(Epiandrosterone)结构式如下所示，是人体分泌的甾体化合物，同时，也是合成甾体激素药物的前体。
目前已经公开的制备表雄酮的方法中，均为化学法。例如，有报道，4-雄烯二酮经醚化保护反应、钯炭催化加氢还原反应、酸催化水解脱保护反应三步反应合成表雄酮，这种方法存在反应路线长，收率低且环境问题严重等问题。此外，并未有生物法制备表雄酮的报道。
在4-AD生成5α-AD中间体的生物转化的发酵法(如下反应式所示)的报道中，存在产率低，产物不纯，存在分离提取等问题，同样存在实用性问题。因此，期待进一步的改进。
发明内容
本申请提供了一种简单易行的合成表雄酮的生物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且能够大幅度降低生产的成本，适合大规模工业化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α-还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或膜碎片。
往步骤1)中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，TLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
优选地，所述的5α-还原酶的基因序列经分枝杆菌密码子优化的序列。
优选地，所述的5α-还原酶的基因序列与序列11-21中的任一序列具有至少80％以上的同源性。
优选地，所述的5α-还原酶的N端接入信号肽。
优选地，所述的信号肽基因为微生物自身所特有的。
进一步优选地，所述的带有信号肽的5α-还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
更进一步优选地，所述的非致病微生物为分枝杆菌。
优选地，步骤1)中所述的固定化为5α-还原酶需处于脂膜环境。
优选地，步骤1)中所述的脂膜选择细胞膜。
优选地，分枝杆菌包括分枝杆菌3805、分枝杆菌3863、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌等。
更优选地，所述分枝杆菌为新金分支杆菌。
更优选地，所述分枝杆菌具体为新金分枝杆菌B-3805，本发明将其命名为ABI10菌种。
进一步优选地，所述新金分枝杆菌B-3805，可从Leibniz Institute DSMZ-GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH购买，货号为：DSM 2967，B-3805为快速生长、非致病性微生物。
优选地，步骤2)中所述的水相缓冲液为pH为7.5的0.01M磷酸盐缓冲液，该缓冲液由8g/L NaCl，0.27g/L KH2PO4，0.2g/L KCl，1.14g/L Na2HPO4组成。
优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.01-1％。
更优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.05％。
优选地，步骤2)中所述的羟丙基-β-环糊精与4-AD的质量比为0.1：1。
优选地，所述的4-雄烯二酮底物浓度为50-100g/L。
更优选地，固定化5α-还原酶与4-AD投料质量比为2-0.5：1。
优选地，具体实施过程如下：
步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α-还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或膜碎片。
往步骤1)中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，TLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
在一个实施方式中，所述信号肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者与序列SEQ ID NO.3-10中的任一序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列。
优选地，所述脂蛋白LPQH的信号肽基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述脂蛋白LPQH的信号肽基因来源于分枝杆菌。
本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的一种制备表雄酮的方法，与现有路线相比，通过一步生物法，采用更温和的反应条件，使得本发明的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的，同时解决了辅酶再生的技术难题，具有较高的实用价值。
附图说明
图1为基因工程菌ABI10p261-lpqh-5α-Re重组菌PCR验证图，M：DL2000DNA Marker；1-10：不同菌落PCR扩增条带，其中3和8号显示正确条带。
图2为纯化产物的异核单量子相干谱(HSQC)图。
图3为纯化产物的二维NOE谱(NOESY)图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一、1.1带有信号肽的5α-还原酶基因过表达载体的构建
首先，结合NCBI序列查找及比对分析，发现分枝杆菌中细胞膜表面有许多带信号肽的脂蛋白，这里选择分支杆菌脂蛋白LPQH的信号肽基因(即SEQ ID NO.1)作为5α-还原酶N端连接的信号肽。
将来自Treponema.sp的5α-还原酶氨基酸序列进行人工合成PCR组装，合成分枝杆菌密码子偏好性的5α-还原酶基因，所述的5α-还原酶基因对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，与SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:20中的任一序列具有至少90％以上的同源性。
应用引物LPQH-F和LPQH-R扩增来自Mycobacterium sp.ABI10基因组中的LPQH基因，分别用MunⅠ和EcoR1,EcoR1和HindⅢ对LPQH基因和5α-还原酶基因进行双酶切，此外，用NdeⅠ和HindⅢ对质粒pMV261进行双酶切，酶切纯化获得单片段进行连接，获得重组表达质粒p261-lpqh-m5α-re。
PCR体系：
PCR程序：95℃5min；95℃30s变性，56℃30s退火，72℃15s延伸，35个循环；72℃10min。其中所用引物序列为：
LPQH-F:CATGCAATTGGTGAAGCGTGGGTTCGTA
LPQH-R:CCGGAATTCACCGGATTCGGCTGCCGC
将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。挑单菌落培养后提质粒进行酶切验证后，再测序进一步确证是否构建成功。
1.2分枝杆菌基因工程菌的构建
通过电转化将构建好的重组表达质粒p261-lpqh-m5α-re导入分枝杆菌感受态细胞中，经Kan抗性筛选得到带有质粒p261-lpqh-m5α-re的重组菌株。具体步骤如下：
吸取体积不超过5μL，总量在1μg左右的质粒加入分枝杆菌感受态细胞并混匀，放置在冰上10min；将混合好的感受态细胞转入电击杯，电压2.5kv，电阻1000Ω，电容25μf，电击时间为23ms左右，电击一次；取800μLLB-T液体培养基加入电击杯，吹吸均匀将所有菌液转入无菌1.5mL离心管，30℃，200rpm培养3-5h；取100-150μL全部涂布到卡那霉素抗性LB固体培养基中，30℃培养3-5d。挑取单菌落进行菌落PCR筛选(图1)，图1显示成功获得了带有质粒p261-lpqh-m5α-re的重组菌株，其中3号和8号为验证正确的重组菌株，将验证正确的阳性转化子即为基因工程菌ABI10p261-lpqh-m5α-re。
实施例2、基因工程菌ABI10p261-lpqh-m5α-re转化4-AD合成表雄酮
种子培养基：葡萄糖8g/L，酵母粉15g/L，NaNO35.4g/L，甘油2g/L，NH4H2PO40.6g/L，pH7.5，115℃灭菌30分钟。
发酵培养基：15g/L酵母粉、6g/L葡萄糖、2g/LMgSO4·7H2O、1.0g/LK2HPO4、2.0g/LKNO3和2g/L吐温-80，pH7.5，121℃灭菌30分钟。
发酵培养步骤：
1、30℃下LB平板(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：10g/L，琼脂：15g/L)培养72小时以活化菌种；
2、从活化平盘接种至种子培养基中，180rpm，30℃培养3天；将种子液在无菌条件下取样进行取样镜检，镜检无染菌方可接种；
3、按10％的接种量接种至3L发酵培养基中，500rpm，30℃发酵培养，通气比为0.5vvm，发酵温度维持30℃，整个发酵过程pH在7-8之间，培养3-5天；
4、发酵液通过离心获取分枝杆菌细胞，并用磷酸盐缓冲液重悬；
5、往步骤4)中加入40g/L的4-雄烯二酮、0.5g/L的吐温80、4g/L的羟丙基-β-环糊精，在温度30℃下反应30-60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，薄层色谱法(TLC)检测反应进程，当TLC检测底物点直至消失时，反应结束，将产物纯化后，经HSQC(图2)和NOESY(图3)核磁检测鉴定其结构为表雄酮。
本发明所提供的过表达LPQH-5α-还原酶基因工程菌株一方面避免了产物被开环降解，另一方面选择性地产生表雄酮，提高了生产效率(摩尔收率可达95％)和产品品质，使产物易于分离纯化，具有极高的实用价值。
本发明公开的制备表雄酮的方法，以4-雄烯二酮为初始底物，通过生物转化法一步制备表雄酮，在生物法制备表雄酮的过程中，采用了5α-还原酶作为催化剂，并通过细胞膜固定化，并利用宿主细胞自身的3-酮基还原酶，组成双酶级联反应系统，使得所制备的产物的收率和纯度更高。同时，整个反应过程中无需额外添加辅酶等原料，可实现从4-雄烯二酮到表雄酮的一步生物转化，从而实现表雄酮的绿色高效生产，具有较高的使用价值。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
Claims (9)
1.一种制备表雄酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：
用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α-还原酶过表达载体，转化至分枝杆菌中进行表达，并收集带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片；
往带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片中加入4-雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80、羟丙基-β-环糊精，反应30-60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，利用薄层色谱法检测反应进程，当转化率达90-99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中带有5α-还原酶的细胞或细胞碎片和4-雄烯二酮的质量比为2～0.5：1。
2.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为KstD基因和Ksh基因已失活的基因工程菌。
3.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述水相缓冲液为pH为7.5～9.0的磷酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述吐温80的浓度为0.01-0.05％。
5.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述羟丙基-β-环糊精与所述4-雄烯二酮的质量比为0.05～0.2：1。
6.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述信号肽序列与SEQ IDNO:3至SEQ ID NO:10中的任一序列具有至少80％的同源性。
7.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述4-雄烯二酮的投料浓度为50-100g/L。
8.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为分枝杆菌3805、分枝杆菌3863、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌或新金分枝杆菌。
9.根据权利要求8所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为新金分枝杆菌B-3805。
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