CN116917485A

CN116917485A - 表达岩藻糖基转移酶的重组微生物和使用其生产2’-岩藻糖基乳糖的方法

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Publication number: CN116917485A
Application number: CN202180093567.6A
Authority: CN
Inventors: 洪银伶; 朴芙洙; 李尚熙; 崔垠修
Original assignee: Samyang Corp
Current assignee: Samyang Corp
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-10-20
Also published as: KR20220096752A; WO2022145945A1; JP2024502062A; WO2022145945A8; EP4273250A1

Abstract

本发明涉及：引入了2’‑岩藻糖基转移酶的微生物；以及使用该微生物生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，源自本发明的微生物的岩藻糖基转移酶比源自幽门螺杆菌的现有酶更安全且具有更高的活性。

Description

表达岩藻糖基转移酶的重组微生物和使用其生产2’-岩藻糖基乳糖的方法

技术领域

本发明涉及经转化以表达岩藻糖基转移酶的重组微生物，以及使用该微生物生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

人乳中包括含量最高的3种低聚糖在内的137种低聚糖被岩藻糖基化，其比例为约77％，其余低聚糖大部分是被唾液酸化的(39种)，相当于约28％。其中，特别是2’-岩藻糖基乳糖和3’-岩藻糖基乳糖具有益生元(prebiotic)作用、抑制病原体肠道附着的作用和调节免疫调节系统的作用等。关于益生元作用，迄今为止已经进行了最多的研究，人乳中的人乳低聚糖选择性地促进最初在婴儿的肠道中作为优势物种生长的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的生长和发育，而有害细菌则无法利用这些人乳低聚糖。此外，已知人乳低聚糖抑制病原体的肠道附着，这是因为与肠凝集素结合的病原体的细胞壁多糖的结构通常与人乳低聚糖的某些结构相似。因此，由于人乳低聚糖提供了水溶性配体类似物，母乳喂养的婴儿似乎对病原体的感染具有抵抗力。然而，已知由于合成2’-岩藻糖基乳糖的岩藻糖基转移酶的突变，约20％的女性不能在体内正常合成2’-岩藻糖基乳糖。因此，需要工业化生产2’-岩藻糖基乳糖。

大多数哺乳动物(灵长类动物、牛、猪、山羊、绵羊、大象)的乳汁中也含有少量人乳低聚糖。其中，山羊奶与人乳低聚糖的组成最相似，因此，已经提出了使用膜从山羊奶奶酪生产过程的乳清副产物中进行大规模分离的技术。此外，当使用最近开发的固相合成时，可以在一天内生产Lewis X-Lewis Y糖，并且当使用结晶中间体技术时，快速合成2’-岩藻糖基乳糖成为可能。然而，尽管开发了上述分离方法或化学合成方法，但现有技术由于立体选择性低、总产率低和使用有毒试剂等原因，不适合于食品或制药工业的大规模生产，人乳低聚糖的工业化大规模生产仍然存在一些障碍。因此，需要更加环保和高产率的生产方法，最近，已经报道了由微生物生产高浓度2’-FL(2’-岩藻糖基乳糖)的方法。然而，2’-岩藻糖基乳糖合成基因使用从一种生物安全2级(Bio Safety Level2)菌株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)获得的2’-岩藻糖基乳糖，因此，当主要应用于代替母乳喂养的奶粉和婴儿食品时，它可能成为消费者认知中的负面因素，并且不适于在国内生产和获得销售许可。因此，需要通过应用具有更高稳定性的基因开发生物安全1级菌株来生产作为食品添加剂的2’-岩藻糖基乳糖。

发明内容

技术问题

本发明提供了一种重组微生物，其中插入了源自生物安全1级菌株的2’-岩藻糖基转移酶，例如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)，作为具有产生岩藻糖基乳糖的转移酶的微生物，所述岩藻糖基乳糖是食品、化妆品和药物的原料，并且本发明还提供了一种使用该微生物生产2’-岩藻糖基乳糖的有效方法。

技术方案

本发明的一个实施方案涉及被转化以表达α-1,2-岩藻糖基转移酶的重组微生物。所述α-1,2-岩藻糖基转移酶可以包含选自SEQ ID NO:1-5中的至少一种。

在本发明中，具有2-岩藻糖转移酶活性的多肽不限于SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列，并且包括通过在SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列中进行取代、插入或缺失一些氨基酸残基而形成的氨基酸序列，并且当用这些氨基酸修饰的蛋白或多肽具有2-岩藻糖转移酶活性时，它可以将乳糖和GDP-岩藻糖作为底物转化为岩藻糖基乳糖。

例如，编码所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的核酸序列可以包含至少一种选自SEQ IDNO:14-18的核酸序列。

所述重组微生物可以是GRAS(Generally Recognized As Safe，通常认为是安全的)微生物。用于生产2’-岩藻糖基乳糖的基因的稳定性不好，因为迄今为止一直使用从幽门螺杆菌获得的基因，为了解决这一问题，根据本发明的重组微生物可以是生物安全1级微生物。由于源自幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶是生物安全2级，所以它不适合作为生产食品原料的酶，然而，根据本发明的岩藻糖基转移酶是生物安全1级，因此它的优点是不会引起消费者的安全担忧。

与包含源自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶的对照组相比，根据本发明的重组微生物可以提高稳定性和生产率，因为2’-岩藻糖基乳糖生产力显著增加。

具体地，与包含源自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶的对照组相比，根据本发明一个实施方案的重组微生物可具有2倍以上、2.1倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、5.5倍以上、6倍以上、6.5倍以上、7倍以上或7.5倍以上的2’-岩藻糖基乳糖生产力。因此，该重组微生物可用于制备α-1,2-岩藻糖，并可提高α-1,2-岩藻糖的产量。

根据本发明一个实施方案的重组微生物在重组前可能不具有2’-岩藻糖基乳糖生产能力，并且可通过重组获得2’-岩藻糖基乳糖生产能力。

对于转化所述重组微生物的方法，可以无限制地选择和使用本领域已知的所有转化方法，例如，可以选自细菌原生质体融合、电穿孔、弹射轰击(projectile bombardment)和使用病毒载体感染等。

根据本发明的重组微生物可以是芽孢杆菌属微生物、棒状杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或酵母。

具体地说，所述芽孢杆菌属微生物可以是巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。

具体地说，所述棒杆菌属微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。

具体地说，所述埃希氏菌属微生物可以是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

具体地说，所述酵母可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candida utilis)。

根据本发明一个实施方案的重组微生物可具有岩藻糖合成能力，或提高岩藻糖合成能力。为了生产2’-岩藻糖基乳糖，任何微生物基本上都需要引入外源α-1,2-岩藻糖基转移酶，但是每种微生物菌株本身的遗传特性是不同的，因此大肠埃希氏菌或巨大芽孢杆菌可以通过仅插入α-1,2-岩藻糖基转移酶来生产2’-岩藻糖基乳糖，但是枯草芽孢杆菌、棒杆菌、酵母微生物等可能另外需要引入岩藻糖合酶。

具体地说，根据本发明一个实施方案的重组微生物的特征在于保持表达或过量表达选自GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)、GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase，WcaG)、磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)和GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)中的至少一种。因此，除了表达α-1,2-岩藻糖基转移酶的特征之外，根据本发明一个实施方案的重组微生物还可以通过提高岩藻糖合成能力来进一步提高α-1,2-岩藻糖产率。

例如，所述岩藻糖合酶可以包含至少一种选自SEQ ID NO:19-22中的氨基酸序列。

例如，所述GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶可以包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:23的核酸序列编码。

例如，所述磷酸甘露糖变位酶可包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或由SEQ IDNO:24的核酸序列编码。

例如，所述GDP-L-岩藻糖合酶(WcaG)可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:25的核酸序列编码。

例如，所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶可以包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:26的核酸序列编码。

根据本发明一个实施方案的重组微生物可以表达或过表达乳糖膜转运蛋白。所述乳糖膜转运蛋白可通过将作为2’-岩藻糖基乳糖的底物的乳糖引入到细胞中来提高2’-岩藻糖基乳糖的生产力。

具体地说，所述乳糖膜转运蛋白可以是Lac12和/或LacY。

例如，所述Lac12可以具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。例如，编码所述Lac12的核酸可以包含SEQ ID NO:29的核酸序列。例如，所述Lac12可以由SEQ ID NO:29的核酸序列编码。

例如，所述LacY可以具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列。例如，编码所述LacY的核酸序列可以包含SEQ ID NO:30的核酸序列。例如，所述LacY可以由SEQ ID NO:30的核酸序列编码。

本发明的另一个实施方案涉及用于生产2’-岩藻糖基乳糖的组合物，其包含选自根据本发明使用重组微生物获得的α-1,2-岩藻糖基转移酶、所述微生物的微生物细胞、所述微生物的培养物、所述微生物的裂解物以及所述裂解物或培养物的提取物中的至少一种。所述重组微生物、所述α-1,2-岩藻糖基转移酶、所述2’-岩藻糖基乳糖等如上所述。

所述培养物包含由所述重组微生物产生的酶，并且它可以包含所述重组微生物，或者可以是不包含所述重组微生物的无细胞形式。所述裂解物是指通过裂解所述重组微生物获得的裂解物或通过离心所述裂解物而获得的上清液，并且包含由所述重组微生物产生的酶。在本说明书中，除非另有说明，否则用于制备2’-岩藻糖基乳糖的重组微生物是指选自所述微生物的微生物细胞、所述微生物的培养物和所述微生物的裂解物中的至少一种。

本发明的另一个实施方案涉及生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括在包含乳糖的培养基中培养根据本发明的重组微生物的步骤。

所述制备方法可以是通过使选自从培养物获得的α-1,2-岩藻糖基转移酶、所述微生物的微生物细胞、所述微生物的培养物、所述微生物的裂解物以及所述裂解物或培养物的提取物中的至少一种与含乳糖的原料反应来生产2’-岩藻糖基乳糖。

有益效果

本发明可以提供了一种重组微生物及使用该微生物生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，由于引入了来源于生物安全1级菌株的岩藻糖基转移酶，所以消费者不必担心其稳定性。

附图说明

图1为示出根据本发明实施例的所选酶的蛋白表达SDS-PAGE结果和预期蛋白大小的图。

图2为示出根据本发明实施例的烧瓶反应(上部图)和试管反应(下部图)的2FL生产趋势的图。

图3为示出根据本发明的一个实施方案，使用α-1,2-岩藻糖基转移酶的大肠埃希氏菌宿主比较2FL生产活性的结果的图。

图4为示出使用巨大芽孢杆菌14581宿主比较不同2FL生产力的结果的图。

图5为示出根据本发明实施例的GDP-岩藻糖盒(GDP-fucose cassette)的图。

图6为证实使用引入了根据本发明实施例的GDP-岩藻糖盒(GDP-fucosecassette)的菌株的2FL生产力的图。

具体实施方式

在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实

施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1.利用生物信息学工具筛选α-1,2-岩藻糖基转移酶

通过使用生物信息学工具，选择来源于生物安全1级的α-1,2-岩藻糖基转移酶(下文称为2FT)的候选酶。具体地，从美国国家生物技术信息中心(NCBI)(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)预期具有α-1,2-岩藻糖基转移酶功能的酶中剔除了基于细菌来源和GRAS细菌来源具有>90％同源性序列的酶，并且使用蛋白质形态学可视化程序(http://wlab.ethz.ch/protter)分析膜蛋白的存在与否。

通过使用计算机生物信息学工具，选择了32个候选组(表1)。此外，当预测是否存在会对蛋白质表达造成问题的膜蛋白时，32个候选组中除乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)来源之外的其余31种酶均未预测到明显的膜蛋白。

[表1]

在候选组中，生物安全1级Bm2FT随后被证实具有反应性，因此，基于Bm2FT蛋白质序列同源性，搜索了其他候选组的源自巨大芽孢杆菌的酶。基于Bm2FT的序列信息，使用BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索酶。表2列出了入选的候选酶列表。

[表2]

比较例1.常规α-1,2-岩藻糖基转移酶的制备

源自幽门螺杆菌的2FT(FutC)因为在2FT酶中活性最高而在各种文献中用于2FL的生产，所以将其选作对照组。

在微生物研究杂志2019年5月；222:35-42，标题为“在重组大肠埃希氏菌中搜索用于2’-岩藻糖基乳糖的全细胞生物合成的细菌α1,2-岩藻糖基转移酶(Search forbacterialα1,2-fucosyltransferases for whole-cell biosynthesis of 2’-fucosyllactose in recombinant Escherichia coli)”中，利用大肠埃希氏菌检测了源自细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongates)的2FT的反应性，并将其选作对照组。

在WO 2015/175801的文献中，源自嗜黏蛋白阿克曼氏菌的2FT的反应性未被证实，但被选作对照组以重新检查生产力。

对照组中所选酶的列表和信息如表3中所示。

[表3]

实施例2.大肠埃希氏菌表达质粒的克隆

为了测试实施例1中选择的酶和比较例1的对照酶在大肠埃希氏菌中的活性，在酶表达质粒中进行克隆。

具体地，为了针对大肠埃希氏菌优化在实施例1中选择的酶序列的密码子，将该序列输入密码子优化程序(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，然后选择大肠埃希氏菌进行引导随机密码子优化搜索。合成得到的酶序列，根据条件用表5所示的引物进行PCR扩增合成基因。对于pET24ma的质粒扩增，根据合成基因中终止密码子序列是TAG还是TAA，使用TAG_PET24ma_F或TAA_PET24ma_FPCR引物。每种酶的引物序列的信息和名称如表4中所示。

[表4]

合成基因Te2FT、Bt2FT、Bm2FT、Lg2FT、Ls2FT和Ll2FT在基因纯化后分别用1uL NEB限制性内切酶(Nde1/Xho1)处理，并在37℃下保存3小时。然后，为了去除限制性内切酶和缓冲液，再次进行基因纯化，并使用经相同限制性内切酶处理的pET24ma在16℃下进行4小时的连接(ligation)。除了上述合成基因Te2FT、Bt2FT、Bm2FT、Lg2FT、Ls2FT和Ll2FT之外，所有剩余的合成基因都经过凝胶制备(gel prep)以根据Gibson组装(assembly)方法进行克隆(cloning)。

制备(Prep)后，通过nano drop确认每种基因的浓度，并加入2X HiFi DNA Assembly Master Mix，使得载体(vector)和插入片段(insert)的比例为1:2，总反应体积为8uL。之后，使其在50℃下反应1小时。将克隆的基因转化(transformation)入DH10b大肠埃希氏菌感受态细胞(E.coli competent cell)后，将其涂在含有Km抗生素的平板(plate)上并生长过夜(overnight)。

选择在每个平板中生长的五个菌落(colony)，并使用表5中与基因对应的引物进行菌落PCR。将具有对应于DNA凝胶(gel)上大小的条带(band)的菌落接种到含有Km抗生素的3ml LB培养基中，然后使其生长过夜。第二天，收集细胞(cell)，提取DNA并进行测序。

实施例3.酶蛋白表达的确认

确认克隆的每个基因是否在大肠埃希氏菌中表达蛋白。将各个2FT载体和含有产生GDP-fuc的酶的pCDFm::PT7manC-manB和PT7-gmd-wcaG一起转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)△fucl△fucK::AprR lacZ△m15::PlacUV5感受态细胞中进行实验。通过将其涂抹在含有Km和Amp抗生素的平板上进行选择(selection)。

将菌落接种在包含Km和Amp抗生素的3mL培养基中，然后进行过夜种子(seed)培养。在4mL LB中加入200uL种子和0.1mM IPTG后，在30℃下培养16小时。用离心机收集4mL培养液中生长的所有细胞后，弃去上清液。加入500uL缓冲液，然后用珠搅拌器(bead beater)粉碎，然后以13000rpm下离心20分钟，收集可溶性(soluble)蛋白质。将它们与分子大小标志物(size marker)一起进行SDS-PAGE凝胶电泳。所选酶的全(total)蛋白表达和可溶性蛋白表达的SDS-PAGE结果(图1左侧)和预测的蛋白大小(图1右侧)显示在图1中。在图1中，ManB、ManC、Gmd和WcaG是由另外添加的pCDFm::PT7manC-manB+PT7-gmd-wcaG质粒表达的蛋白。

如图1中所示，通过SDS-PAGE，确认了八种酶Bm2FT、Te2FT、Hp2FT、Am2FT_2、Fp2FT、Ri2FT、Bm2FT_2和Bm2FT_3在所比较的酶蛋白中的过表达。

实施例4.利用试管优化反应分析

对250mL烧瓶中的总共50mL培养物(culture)分析2FL生产力。在大量候选酶的情况下，为了明确的比较分析，需要重复实验3次以上，但是常规的50mL培养条件的缺点在于，它需要比所需量(1mL)更多的劳动。为了快速鉴定各种候选组的反应趋势，需要建立一种在10mL试管中用4mL培养物确认酶反应的方法。

将克隆有Hp2FT、Bm2FT和Bt2FT的质粒分别与pCDFm::PT7manC-manB+PT7-gmd-wcaG质粒一起转化到大肠埃希氏菌菌株中。在每个平板中接种三个菌落，并过夜进行种子培养。

在50mL烧瓶培养液中加入500uL种子。当OD₆₀₀达到约0.8时，加入0.1mM IPTG和10mM乳糖，然后在20小时后通过HPLC进行分析。

在试管(test tube)反应的情况下，将200uL种子加入到添加有0.1mM IPTG和10mM乳糖(lactose)的4mL培养基中。试管反应可以省略测量烧瓶(flask)OD的步骤。

20小时后，用HPLC分析烧瓶反应(图2的上部)和试管反应(图2的下部)的2FL产生趋势，并示出在图2中。如图2中所示，与烧瓶条件相比，在建立的试管反应条件下，2FL生产力处于1/3的水平，但是反应趋势相同，因此，证实了试管反应适合于同时对不同酶进行比较分析。

实施例5.通过HPLC分析比较2FL的生产力

比较实施例1中选择的酶和3种对照酶的反应性。

将待比较的质粒分别在大肠埃希氏菌中进行转化，然后在37℃下生长。在每个平板中接种三个菌落，并进行过夜种子培养。将200uL种子加入到添加了0.1mM IPTG和10mM乳糖的4mL培养基中。20小时后，通过HPLC对其进行分析。对于使用大肠埃希氏菌宿主(E.colihost)的不同2FL比较2FL的产生活性的结果示于图3中。

如图3中所示，获得了总共五种产生2FL的酶，其中包括三种酶活性等于或高于FutC的酶：五种酶分别为Am2FT_2、Bm2FT、Bm2FT_2、Bm2FT_3和Bs2FT，通过HPLC分析，确认了它们分别具有与FutC相比122％、207％、84％、100％或21％的2FL生产模式。产生2FL的五种酶的序列如表5中所示。

[表5]

实施例6.棒杆菌属菌株利用岩藻糖基转移酶的2’-FL生产力的比较

对于质粒构建和2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)生产，使用谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032。为了构建pMBC质粒，使用来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA的两个DNA引物，通过PCR反应扩增manB基因，然后将其插入pCES208质粒中。在构建的质粒中，再次使用来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA的两个DNA引物通过PCR反应扩增manC基因，并将其插入到质粒中，从而构建pMBC。此外，为了构建pEGW质粒，使用来自大肠埃希氏菌K-12的基因组DNA的两个DNA引物，通过PCR反应扩增gmd-wcaG基因簇，然后将其插入到质粒中以构建pEGW。此外，它由SEQ ID NO:2的岩藻糖基转移酶导入。

在使用谷氨酸棒杆菌宿主的情况下，将引入Bm2FT和GDP-岩藻糖盒的菌株加入到添加了10mM乳糖的4mL培养基中，并培养以产生2FL，培养60小时后，产生约120mg/L的2FL。由pMBC和pEGW空载体引入的菌株不产生2FL。

实施例8.巨大芽孢杆菌中岩藻糖基转移酶2’-FL生产力的比较

当使用大肠埃希氏菌宿主时，与FutC相比活性增加最多的Am2FT_2、Bm2FT酶分别转化到巨大芽孢杆菌(b.megaterium)14581(韩国微生物培养中心(KCCM)登记号40441)宿主中，以比较它们的2FL生产力。为了准确分析反应性，使用了由不含2FT基因的空载体p1525导入的巨大芽孢杆菌14581用作对照组。图4是示出使用巨大芽孢杆菌14581宿主比较不同2FL生产力的结果的图。

如图4中所示，当使用巨大芽孢杆菌宿主时，加入p1525空载体的菌株不产生2FL，但是加入Bm2FT和FutC质粒的菌株在反应64小时后分别平均产生了40.3mg/L和18.8mg/L的2FL。这样的结果证实了Bm2FT酶与FutC相比表现出2.1倍以上的生产力增加。

到目前为止还没有报道使用巨大芽孢杆菌菌株生产人乳低聚糖的研究，并且巨大芽孢杆菌14581宿主由于是生物安全1级菌株而对人体无害，因此，通过将本发明中建立的Bm2FT导入GRAS菌株，获得了比常规酶(FucT)高2倍以上的生产力。

实施例9.比较枯草芽孢杆菌中通过岩藻糖基转移酶的2’-FL生产力

将在大肠埃希氏菌宿主中与FutC相比活性增加最多的Bm2FT酶转化到枯草芽孢杆菌宿主中，以比较2’-FL的生产力。为了准确分析反应性，将用未克隆2’-FL基因的空载体pBE-S转化的枯草芽孢杆菌168(登记号：23857TM)用作对照组。所使用的载体是用于枯草芽孢杆菌分泌的pBE-S，并且含有能够组成型表达的aprE启动子。由于克隆过程中不需要分泌功能，因此在进行2’-FL克隆时，去除了aprE信号肽(signal peptide)。

由于枯草芽孢杆菌168不具有产生GDP-岩藻糖的4种酶，因此编码这4种酶的基因被一次克隆到一个载体中。这4种基因(manB、manC、gmd、wcaG)源自大肠埃希氏菌，通过PCR基因扩增获得。用于一次克隆4种基因的载体是p3STOP1623-2RBShp，它是大肠埃希氏菌-芽孢杆菌穿梭载体(E.coli-Bacillus shuttle vector)。该载体不仅可以在巨大芽孢杆菌中使用，也可以在枯草芽孢杆菌中使用。该载体的特点是具有两个RBS，因此非常容易用于克隆多个基因。该载体的启动子是PxylA，它是木糖诱导型启动子(xylose induciblepromoter)。GDP-岩藻糖盒按如图5中所示的基因顺序构建。

载体和4种基因的克隆方法与上述Bm2FT克隆方法相同，均采用Gibson组装方法。然而，由于载体大小为约6.6Kb，在一起进行PCR时可能会产生序列错误，因此通过构建载体中间区域的引物对被分割的一半区域进行PCR。为了纯化所有六个PCR片段(fragments)，将所有PCR混合物(mixture)进行电泳并进行凝胶提取(gel extraction)。分析通过纯化获得的PCR片段以测量DNA浓度，并根据浓度和大小调整含量来进行Gibson组装。此后，通过以同样的方式将其转化到大肠埃希氏菌中来获得单菌落(single colony)，然后，通过进行菌落PCR来检测质粒的插入。将经PCR确认的菌落在LB中培养，并提取质粒，然后通过序列分析证实4种基因被正确克隆。将序列得到确认的质粒转化到枯草芽孢杆菌168中用于生产力分析。在通过与大肠埃希氏菌转化的确认方法相同的菌落PCR确认质粒的插入后，进行培养以比较2’-FL生产力。

如图6中所示，使用枯草芽孢杆菌宿主时，其中插入了pBE-S和p3STOP1623-2RBShp空载体的菌株不产生2FL，并且其中引入了Bm2FT和GDP-岩藻糖盒的菌株在反应63小时后产生约150mg/L的2FL。这是与常规FutC的18.8mg/L的平均2FL产量相比，生产力提高了约7倍以上的结果。

实施例10.通过酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)中岩藻糖基转移酶的2’-FL生产力的比较

使用酿酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK2-1c进行构建质粒和生产2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。从大肠埃希氏菌K-12中克隆并使用酿酒酵母中不存在的GDP-L-岩藻糖基因。为了构建pRSK426质粒，通过PCR反应扩增gmd-wcaG基因簇后，将其插入质粒中以构建pRSK426。将使用大肠埃希氏菌宿主时，与FutC相比活性增加最多的Am2FT_2、Bm2FT酶分别转化到酿酒酵母宿主中，以比较每种2FL的生产力。将3种重组质粒转化到酿酒酵母CEN.PK2-1c菌株中，然后在包含G418抗生素的YPD固体培养基中选择。将选择的菌株在包含G418抗生素的50mL液体生产培养基中培养2天，然后通过HPLC分析测量2FL生产力。使用酿酒酵母CEN.PK2-1c宿主，其中插入了pRSK426空载体的菌株不产生2FL，而插入了Bm2FT、Am2FT_2和GDP-岩藻糖盒的菌株在培养48小时后分别产生80mg/L、40mg/L的2FL。

<110> 株式会社三养社(SAMYANG CORPORATION)

<120> 表达岩藻糖基转移酶的重组微生物和使用其生产2'-岩藻糖基乳糖的方法

<130> KHP232111114.6

<150> KR 10-2020-0189490

<151> 2020-12-31

<160> 63

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Am2FT_2的氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser

1 5 10 15

Pro Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu

20 25 30

Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val

35 40 45

Pro Trp Ala Tyr Asn Asp Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Arg Leu Gly

50 55 60

Gly Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser

65 70 75 80

Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Cys Pro Val Pro Ser Arg Ile Arg

85 90 95

Thr Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Phe Gln Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly

100 105 110

Gln Glu Ala Phe Ile Arg Ala Leu Phe Ala Pro Leu Thr Ala Glu Lys

115 120 125

Glu Pro Gly Ala Val Gly Ile His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Arg Arg

130 135 140

Leu Arg Asp Lys His Arg Ile Leu Asp Pro Gly Phe Leu Arg Arg Ala

145 150 155 160

Ala Gly His Leu Ser Ser Gly Lys Asn Arg Leu Val Leu Phe Ser Asp

165 170 175

Glu Pro Asp Glu Ala Ala Glu Met Leu Ala Arg Val Pro Ala Phe Gly

180 185 190

Arg Phe Ala Leu Glu Ile Asp Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ser Leu Arg

195 200 205

Arg Met Thr Ala Met Glu Glu Leu Val Met Ser Cys Ser Ser Phe Ser

210 215 220

Trp Trp Gly Ala Trp Leu Gly Asn Thr Arg Lys Val Ile Val Pro Arg

225 230 235 240

Asp Trp Phe Val Gly Gly Val Glu Asp Tyr Arg Asp Ile Tyr Leu Pro

245 250 255

His Trp Val Thr Leu

260

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bm2FT的氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Ile Val Gln Ile Ser Ser Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Leu Tyr Lys Arg Leu Ser Met Asn Asn Asn Asp Val Phe Leu

20 25 30

Asp Val Glu Thr Ser Tyr Gln Leu Asn Lys Asn Gln His Asn Gly Tyr

35 40 45

Glu Ile Glu Arg Ile Phe Ser Ile Gln Pro Ser His Ala Thr Lys Gly

50 55 60

Met Ile Asp Glu Leu Ala Asp Val Asp Asn Arg Leu Ile Asn Arg Leu

65 70 75 80

Arg Arg Lys Leu Phe Gly Pro Lys Asn Ser Met Tyr Thr Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Phe Ser Tyr Asp Cys Glu Val Phe Thr Lys Asp Gly Ile Tyr Ile

100 105 110

Lys Gly Tyr Trp Gln Asn Tyr Asn Tyr Phe Lys Glu Ile Glu Asp Asp

115 120 125

Leu Lys Asn Glu Leu Val Phe Lys Lys Ala Leu Asp Leu Lys Asn Ser

130 135 140

His Leu Ile Asn Gln Met Asn Lys Glu Ile Ser Val Ser Ile His Val

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Gly

165 170 175

Asn Ile Ala Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Ala Ile Asn Phe Ile Lys

180 185 190

Lys Glu Val Asp Asp Pro Lys Phe Tyr Val Phe Ser Asp Asp Ile Lys

195 200 205

Trp Ala Lys Glu Asn Leu Asn Leu Thr Asp Asn Val Thr Tyr Val Glu

210 215 220

His Asn Lys Gly Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Met Arg Leu Met Thr Cys

225 230 235 240

Cys Lys His Asn Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Gly Ala

245 250 255

Phe Leu Asn Glu Asn Lys Asn Lys Ile Val Ile Ala Pro Gly Lys Trp

260 265 270

Ile Asn Val Glu Gly Val Gly Gly Ile Asn Leu Phe Pro Glu Gly Trp

275 280 285

Ile Val Tyr

290

<210> 3

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bm2FT_2的氨基酸序列

<400> 3

Met Gly Cys Ile Lys Arg Leu Phe Leu Tyr Glu Tyr Gly Gly Arg Cys

1 5 10 15

Phe Leu Val Ile Val Lys Ile Lys Gly Gly Phe Gly Asn Gln Leu Phe

20 25 30

Thr Tyr Ala Ser Ala Tyr Ala Ile Ser Gln Glu Leu Gln Gln Asn Leu

35 40 45

Ile Met Asp Lys Val Ile Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Arg Lys Phe Glu

50 55 60

Leu Pro Ser Leu Ser Leu Lys Tyr Asp Gln Met Leu Ile Ser Lys Phe

65 70 75 80

Val Pro Asn Thr Lys Val Lys Thr Leu Ile Tyr Lys Val Leu Arg Arg

85 90 95

Leu Lys Leu Lys Gly Phe Thr Glu Val His Glu Lys Lys Glu Phe Ser

100 105 110

Phe Asp Glu Asn Ile Tyr Asn Leu Ser Gly Asp Ile Tyr Leu Asp Gly

115 120 125

Tyr Trp Gln Asn Tyr Arg Tyr Phe His Lys Tyr Tyr Lys Asp Leu Ser

130 135 140

Glu Met Phe Val Pro Arg Glu Thr Pro Arg Lys Glu Val Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Ile Thr Ser Leu Arg Gly Val Asn Ser Val Ala Met His Val Arg Arg

165 170 175

Gly Asp Tyr Lys Thr Phe Asn Gly Gly Lys Cys Leu Ser Leu Asp Tyr

180 185 190

Tyr Ile Lys Ala Met Glu Tyr Phe Asn Ser Asn Asp Val Gln Phe Tyr

195 200 205

Val Phe Thr Asp Asp Ile Asp Phe Cys Glu Lys Asn Leu Pro Asn Ser

210 215 220

Glu Asn Ile Asn Tyr Val Ser Arg Ser Glu Lys Leu Thr Asp Ile Glu

225 230 235 240

Glu Phe Phe Ile Met Lys Glu Cys Lys Asn Phe Ile Ile Ala Asn Ser

245 250 255

Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ser Glu Gln Lys Ala Asp Ser

260 265 270

Leu Ile Val Ala Pro Val Val Asp Met Trp Lys Arg Asp Phe Tyr Pro

275 280 285

Asp Glu Trp Val Ala Leu Asn Thr His Leu Glu

290 295

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bm2FT_3的氨基酸序列

<400> 4

Met Ile Ile Val Gln Ile Lys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Ser Ala Tyr Gly Ile Ala Arg Glu Asn Glu Thr Glu Leu Ile

20 25 30

Ile Asp Arg Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Tyr Ser Leu Arg Lys Tyr Met

35 40 45

Leu Asp Phe Phe Pro Glu Ile Asp Glu Ala Leu Leu Leu Lys Tyr Ile

50 55 60

Pro Lys Lys Asn Lys Ile Ser Gln Ile Met Tyr Lys Leu Ile Arg Lys

65 70 75 80

Ser Lys Leu Lys Tyr Lys Tyr Lys Ala Gln Leu Phe Leu Glu Glu Glu

85 90 95

Glu Phe Lys Phe Thr Arg Ile Ser Thr Gln Asn Glu Asn Leu Tyr Leu

100 105 110

Asn Gly Tyr Trp Gln Ser Tyr Val Tyr Phe Asp Lys Tyr Arg Asn Asp

115 120 125

Ile Ile Lys Lys Phe Thr Pro Leu Val Ser Phe Asn Gln Asp Gly Asn

130 135 140

Gln Leu Leu Asn Glu Ile Lys Ser Tyr Asn Ser Val Ala Ile His Val

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Asn Phe Lys Gly Gly Lys Cys Leu Asp Ser

165 170 175

Ser Tyr Tyr Ile Lys Ala Met Lys His Leu Tyr Asn Leu Lys Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Phe Phe Tyr Ile Phe Thr Asp Asp Val Glu Tyr Cys Lys Arg

195 200 205

Ile Phe Lys Asn Val Ala Asn Val Lys Phe Ile Gly Glu Glu Ala Lys

210 215 220

Leu Ser Asp Phe Glu Glu Phe Thr Leu Met Thr His Cys Lys Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ile Gly Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ala Ser

245 250 255

Cys Lys Asp Lys Ala Val Ile Ala Pro Val Val Asp Met Trp Thr Glu

260 265 270

Asp Phe Tyr Leu Pro Glu Trp Ile Lys Ile Lys Ala Asp Leu Gln

275 280 285

<210> 5

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bs2FT的氨基酸序列

<400> 5

Met Lys Ile Val His Ile Ser Ser Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Leu Ile Gln Asp Asn Val Phe Leu

20 25 30

Asp Thr Ile Thr Ser Tyr Gln Leu Tyr Pro Asn Gln His Asn Gly Tyr

35 40 45

Glu Leu Glu Lys Val Phe Thr Ile Lys Pro Arg His Ala Ser Lys Glu

50 55 60

Leu Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Leu Asp Asn Ser Val Thr Ser Arg Ile

65 70 75 80

Arg Arg Lys Leu Ile Gly Ser Lys Lys Ser Met Tyr Ile Glu His Lys

85 90 95

Glu Phe Glu Tyr Asp Pro Asn Leu Phe Tyr Gln Glu Asn Ile Tyr Ile

100 105 110

Lys Gly Tyr Trp Gln Asn Tyr Asp Tyr Phe Lys Asp Ile Glu Asn Glu

115 120 125

Leu Lys Asn Asp Phe Thr Phe Gln Arg Ala Leu Asp Glu Lys Asn Asn

130 135 140

Asn Leu Ala Ile Lys Ile Asn Asn Glu Asn Ser Ile Ser Ile His Val

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Leu Asn Arg Lys Asn Gln Glu Lys Phe Gly

165 170 175

Asp Ile Ala Asn Leu Glu Tyr Tyr Ser Lys Ala Ile Ser Tyr Ile Lys

180 185 190

Glu Arg Ile Asp Asn Pro Lys Phe Tyr Ile Phe Ser Asp Asn Val Glu

195 200 205

Trp Val Lys Gln Asn Leu Asn Ser Leu Glu Glu Ala Val Tyr Ile Asp

210 215 220

Tyr Asn Val Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Asp Met Gln Leu Met Ser Leu

225 230 235 240

Cys Lys His Asn Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala

245 250 255

Phe Leu Asn Lys Asn Met Glu Lys Ile Val Ile Ala Pro Gly Lys Trp

260 265 270

Ile Asn Met Lys Gly Val Lys Lys Val Asn Leu Phe Pro Lys Asp Trp

275 280 285

Ile Ile Tyr

290

<210> 6

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bm2FT_4的氨基酸序列

<400> 6

Met Ile Ile Val Arg Val Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Leu Tyr Lys Ser Leu Glu Asn Glu Gly Lys Glu Val Lys Leu

20 25 30

Asp Leu Thr Gly Phe Gly Asp Tyr Asp Leu His Asn Gly Tyr Glu Leu

35 40 45

Asn Lys Ile Phe Asn Ile Asn Glu Asn Val Ala Thr Lys Asp Glu Ile

50 55 60

Asn Lys Leu Ile Lys Leu Pro Asp Asn Lys Val Leu Ser Met Ile Lys

65 70 75 80

Arg Lys Phe Phe Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Tyr Ser Gln Asp Gln Phe

85 90 95

Lys Tyr Leu Ser Glu Ile Phe Gln Leu Asp Asn Val Tyr Leu Asp Gly

100 105 110

Tyr Trp Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Lys Glu Val Ile Arg

115 120 125

Lys Glu Phe Lys Phe Lys Gly Glu Pro Asn Pro Lys Asn Ile Glu Met

130 135 140

Val Lys Leu Met Arg Gly Ser Asn Ser Val Ser Ile His Phe Arg Arg

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Ile Ser Asn Pro Asp Ala Tyr Lys Val His Gly Gly Ile

165 170 175

Thr Thr Ile His Tyr Tyr Glu Asn Ala Val Lys Glu Ile Lys Ser Lys

180 185 190

Val Lys Glu Pro Lys Phe Phe Ile Phe Ser Asp Asp Ile Lys Trp Val

195 200 205

Lys Glu Asn Phe Lys Leu Glu Asp Ala Phe Phe Ile Asp Trp Asn Thr

210 215 220

Gly Ser Glu Ser Tyr Arg Asp Ile Glu Leu Met Ser Asn Cys Lys His

225 230 235 240

Asn Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn

245 250 255

Lys Asn Lys Asn Lys Ile Val Ile Ala Pro Asn Gln Trp Phe Asn Thr

260 265 270

Ile Asp Thr Glu Asp Val Ile Pro Asp Thr Trp Gln Cys Ile Asn Thr

275 280 285

Phe

<210> 7

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bt2FT的氨基酸序列

<400> 7

Met Asn Glu Ile His Val Leu Leu Thr Gly Arg Leu Gly Asn Gln Leu

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Arg Ser Leu Gln Lys Gln Tyr Gly Gly Arg

20 25 30

Ile Val Cys Asn Thr Phe Asp Leu Asp His Arg Ser Glu Lys Ser Lys

35 40 45

Val Ala Asp Gln Lys Phe Ser Tyr Ala Met Gly Asp Phe Lys Leu Asp

50 55 60

Glu Asn Val Ala Leu Glu Asp Ala Ala Leu Pro Trp Tyr Ala Asp Phe

65 70 75 80

Ser Ser Pro Leu Ile Lys Pro Val Lys Lys Leu Phe Pro Arg Arg Tyr

85 90 95

Phe Asp Phe Met Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Met Trp Gln Arg Thr Asp

100 105 110

Tyr Met Pro Ile Pro Lys Leu Glu Cys Glu Asp Val Phe Ala Trp Gly

115 120 125

Trp Trp Gln Asp Ile Arg Tyr Phe Gln Asp Val Gln Thr Glu Leu Ser

130 135 140

Asp Glu Val Val Pro Val Thr Asp Pro Leu Pro Glu Asn Gln Tyr Ile

145 150 155 160

Tyr Asn Ala Ala Ser Gly Glu Glu Ser Val Cys Ile Ser Ile Arg Cys

165 170 175

Gly Asn Tyr Phe Asn Pro Thr Val Lys Lys Leu Leu Tyr Val Cys Thr

180 185 190

Pro Glu Tyr Phe Arg Asn Ala Val Glu Ser Ile Thr Lys Arg Leu Thr

195 200 205

His Pro Lys Phe Ile Val Phe Thr Asp Asp Val Asp Trp Val Lys Glu

210 215 220

Asn Ile Arg Phe Glu Ser Ala Tyr Pro Gln Tyr Glu Phe Leu Tyr Glu

225 230 235 240

Arg Gly Ser Asp Thr Val Glu Glu Lys Ile Arg Met Met Thr Leu Cys

245 250 255

Lys His Phe Ile Ile Ser Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Ala Gln Phe

260 265 270

Leu Ser Lys Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Ala Pro Asp Arg Trp Phe

275 280 285

Val Asp Gly Arg Arg Ile Gly Leu Tyr Met His Gly Trp Thr Leu Ile

290 295 300

Pro Ala Gly Gln

305

<210> 8

<211> 317

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Fp2FT的氨基酸序列

<400> 8

Met Ile Tyr Val Glu Met His Gly Arg Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Ala Arg Ala Leu Gln Glu Lys Asn Asn Gln Pro Ile Met

20 25 30

Leu Ser Phe Arg Lys Val Ile Gly Ala Asn Thr Glu Gly Thr Ala Gly

35 40 45

Trp Glu Asn Ser Leu Lys Tyr Phe Asn Val Lys Pro Cys Glu Tyr Tyr

50 55 60

Met Gly Lys Lys Ser Leu Val Thr Glu Tyr Pro Val Glu Tyr Arg Leu

65 70 75 80

Leu Cys Tyr Ala Tyr Ala Leu Ser Tyr Lys Pro Leu Met Asn Asn Met

85 90 95

Asn Arg Trp Tyr Glu Tyr Gln Val Lys Cys Cys Arg Phe Leu Asp Arg

100 105 110

Phe Gly Ile Arg Trp Ile Ala Asn Gly Tyr Tyr Asp Phe His Tyr Asn

115 120 125

Gly Leu Lys Asn Tyr Leu Leu Asn Gly Ser Phe Glu Ser Pro Lys Tyr

130 135 140

Phe Asp Ser Ile Arg Asp Lys Leu Leu Glu Glu Phe Thr Pro Arg Glu

145 150 155 160

Glu Glu Arg Lys Glu Asn Lys Arg Leu Tyr Glu Gln Ile Arg Lys Arg

165 170 175

Asn Ser Val Cys Leu Ser Val Arg His Phe Gln Leu Thr Gly Lys Gln

180 185 190

Ala Asp Met Tyr Asp Val Cys Ser Leu Glu Tyr Tyr Gln Thr Ala Ile

195 200 205

Arg Lys Met Cys Glu Leu Ile Glu Asn Pro Leu Phe Val Val Phe Ser

210 215 220

Asp Asp Ile Glu Trp Val Lys Asn Thr Ile Asp Leu Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Val Val Tyr Glu Thr Pro Gly Asn Pro Val Trp Glu Lys Leu Arg Leu

245 250 255

Met Tyr Ser Cys Lys Asn Phe Ile Ile Pro Asn Ser Thr Phe Ala Trp

260 265 270

Trp Ala Gln Tyr Leu Ser Arg Asn Pro Asp Lys Tyr Val Leu Cys Pro

275 280 285

Ala Lys Trp Phe Asn Asn Asn Phe Glu Ser Pro Leu Ile Ala Ser Gln

290 295 300

Trp Val Arg Ile Asp Arg Glu Gly Asn Ile Val Asn Glu

305 310 315

<210> 9

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Gs2FT的氨基酸序列

<400> 9

Met Lys Ile Val Lys Val Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Phe Tyr Arg Asn Leu Lys Ala Lys Phe Gln Glu Val Lys Leu

20 25 30

Asp Ile Thr Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Leu His Asn Gly Tyr Glu Leu

35 40 45

Glu Arg Val Phe Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Ala Thr Lys Lys Glu Ile

50 55 60

Tyr Pro Leu Thr Thr Asn Arg Asn Ser Lys Ile Ser Lys Ile Lys Arg

65 70 75 80

Arg Ile Phe Gly Gly Lys Glu Thr Glu Tyr Ile Glu Lys Asp Leu Lys

85 90 95

Phe Asp Pro Glu Val Phe Lys Val Thr Gly Asp Val Tyr Phe Glu Gly

100 105 110

Tyr Trp Gln Thr Glu Lys Tyr Phe Lys Glu Ile Glu Asp Leu Ile Arg

115 120 125

Lys Asp Phe Gln Phe Lys Asn Pro Leu Thr Asn Lys Asn Leu Glu Leu

130 135 140

Ser Asn Lys Ile Lys Asn Glu Asn Ser Val Ser Ile His Val Arg Arg

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Tyr Thr Ser Lys Lys Ala Glu Arg Lys His Gly Asn Ile

165 170 175

Ala Thr Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Val Arg Lys Ile Thr Glu Phe

180 185 190

Val Asp Asn Pro Val Phe Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Ile Pro Trp Val

195 200 205

Lys Glu Asn Leu Lys Leu Glu Asn Glu Val Ile Tyr Val Asp Trp Asn

210 215 220

Lys Gly Leu Asp Ser Tyr Ile Asp Met Gln Leu Met Ser Ile Cys Lys

225 230 235 240

His Asn Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu

245 250 255

Asn Gln Asn Lys Asn Lys Ile Val Ile Ala Pro Ser Arg Trp Ile Asn

260 265 270

Asn Lys Arg Leu Asp Thr Ser Asp Val Ile Pro Lys Glu Trp Ile Lys

275 280 285

Ile

<210> 10

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Lg2FT的氨基酸序列

<400> 10

Met Leu Tyr Val Glu Met Asp Gly Arg Cys Gly Asn Gln Leu Phe His

1 5 10 15

Tyr Ala Val Ala Arg Tyr Ile Gln Leu Ala Ile Gly Asn Lys Glu Lys

20 25 30

Leu Cys Leu Asn Phe Asn Lys Ile Phe Glu Lys Lys Asp Glu Asn Asn

35 40 45

Gly Trp Val Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Thr Val Pro Tyr Ser Tyr

50 55 60

Tyr Ser Lys Ser Gly Thr Ile Leu Lys Asn Glu Ser Asn Phe Ile Gln

65 70 75 80

Lys Ile Ala Ile Gly Leu Lys Ala Ile Gln Ile Lys Ser Leu Thr Lys

85 90 95

Lys Ser Arg Gln Glu Gln Ala Asp Lys Ala Glu Val Gly Gln Arg Thr

100 105 110

Leu Asn Lys Leu Gly Val Tyr Trp Val Arg Glu Gly Val Asn Gln Ile

115 120 125

Tyr Pro Tyr Lys Asn Asn Lys Ile Leu Val Ser Gly Ile Cys Glu Ser

130 135 140

Asn Phe Ile Tyr Glu Ile Gln Glu Gln Leu Gln Lys Glu Leu Ile Pro

145 150 155 160

Val Thr Pro Val Ser Ser Leu Asn Lys Ser Leu Leu Glu Lys Ile Asp

165 170 175

Asn Cys Asn Ser Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Gly Asp Phe Phe Asn

180 185 190

Asn Lys Asn Ala Lys Lys Tyr Gly Val Cys Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile

195 200 205

Arg Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Thr Val Tyr

210 215 220

Phe Cys Phe Ser Asp Asp Ile Glu Trp Cys Lys Glu Asn Leu Lys Phe

225 230 235 240

Thr Asp Lys Asn Val Ile Phe Val Ser Gln Glu Met Pro Val Tyr Glu

245 250 255

Thr Leu Arg Leu Met Ser His Cys Lys His Phe Ile Leu Ser Asn Ser

260 265 270

Thr Phe Ser Trp Trp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Tyr Lys Asp Lys Ile

275 280 285

Val Val Ser Pro Ala Arg Trp Asn Asn Asp Gly Tyr Asp Thr Asn Leu

290 295 300

Ile Asp Lys Asn Trp Ile Leu Ile Asp Ala

305 310

<210> 11

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ll2FT的氨基酸序列

<400> 11

Met Ile Tyr Val Glu Ile Arg Gly Asn Leu Gly Asn Gln Leu Phe Ile

1 5 10 15

Tyr Ala Thr Ala Lys Lys Ile Gln Lys Leu Thr Gly Gln Lys Ile Gln

20 25 30

Leu Asn Thr Thr Thr Leu Asn Lys Tyr Phe Pro Asn Tyr Lys Phe Gly

35 40 45

Leu Ser Glu Phe Ile Met Glu Asp Pro Asp Cys Phe Ile Glu Ser Tyr

50 55 60

Lys Lys Leu Pro Trp Phe Thr Asn Glu Tyr Leu Leu Pro Ile Lys Ile

65 70 75 80

Phe Lys Lys Ile Leu Asn Lys Thr Pro Lys Ile Asn Lys Ile Leu Ser

85 90 95

Asp Phe Phe Phe Lys Ala Phe Glu Lys Lys Gly Tyr Phe Ile Trp Arg

100 105 110

Gly Glu Thr Phe Lys Lys Phe Ser Leu Gly Asn His Lys Asn Tyr Tyr

115 120 125

Leu Ser Gly Phe Trp Gln Ser Glu Asp Tyr Phe Tyr Asp Ile Arg Asp

130 135 140

Glu Leu Leu Glu Ile Ile Thr Pro Ile Asn Ser Ile Arg Glu Cys Asn

145 150 155 160

Phe Glu Leu Leu Asn Leu Ile Arg Asn Ser Glu Ser Ile Cys Val Ser

165 170 175

Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Asp Asn Pro Lys Ile Ser Ala Ile Tyr

180 185 190

Asn Val Cys Asp Ile Asn Tyr Phe Ile Glu Ser Val Asn Glu Ile Lys

195 200 205

Lys Asn Val Val Asn Val Lys Val Ile Cys Phe Ser Asp Asp Val Glu

210 215 220

Trp Val Lys Lys Asn Ile Lys Phe Asp Cys Glu Thr His Tyr Glu Thr

225 230 235 240

Tyr Gly Asn Ser Leu Ser Glu Lys Val Gln Leu Met Ser Ser Cys Lys

245 250 255

His Phe Val Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Thr Glu Phe Leu

260 265 270

Ser Ile Arg Gly Gly Ile Thr Ile Ala Pro Lys Asn Trp Tyr Ala Asp

275 280 285

Glu Arg Glu Ala Asp Ile Tyr Arg Lys Asn Trp Ile Tyr Leu Glu Asp

290 295 300

Lys Thr Glu Glu Glu

305

<210> 12

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ls2FT的氨基酸序列

<400> 12

Met Glu Glu Ile His Thr Leu Leu Thr Gly Arg Leu Gly Asn Gln Leu

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Arg Asn Leu Gln Lys Gln Tyr Gly Gly Gln

20 25 30

Ile Tyr Cys Asp Val Tyr Glu Leu Glu His Arg Met Ser Lys Val Ala

35 40 45

Asp Glu Lys Phe Ser Tyr Ala Met Ser Gly Phe Lys Leu Asp Ala Gly

50 55 60

Val Ile Arg Glu Asp Gln Ala Phe Pro Trp Tyr Ala Asp Phe Ser Asn

65 70 75 80

Pro Val Ile Lys Pro Ile Lys Lys Ala Met Pro Arg Lys Tyr Phe Glu

85 90 95

Leu Met Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Met Trp Gln Arg Ser Asp Tyr Met

100 105 110

Pro Ile Pro Val Leu Asp Thr Gln Arg Val Phe Ala Ser Gly Trp Trp

115 120 125

Gln Asp Ile Arg Tyr Leu Gln Asn Val Gln Glu Glu Leu Ser Asp Glu

130 135 140

Ile Val Pro Ile Thr Asn Pro Leu Gln Glu Asn Arg Tyr Ile Tyr Asp

145 150 155 160

Ala Ala His Asp Arg Asp Ser Val Cys Ile Ser Ile Arg Cys Gly Asn

165 170 175

Tyr Phe Asn Pro Thr Val Lys Lys Leu Leu Tyr Val Cys Asn Pro Gln

180 185 190

Tyr Phe His Asp Ser Val Lys Arg Ile Ser Gln Met Leu Ala His Pro

195 200 205

Lys Phe Ile Val Phe Thr Asp Asp Val Ser Trp Val Lys Glu His Leu

210 215 220

Lys Phe Glu Asp Thr Tyr Pro Gln Phe Glu Phe Leu Tyr Glu Arg Gly

225 230 235 240

Cys Asp Thr Ala Glu Glu Lys Ile Arg Met Met Ala Met Cys Asn Asn

245 250 255

Phe Ile Ile Ser Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Ala Gln Phe Leu Ser

260 265 270

Lys Asn Lys Glu Lys Ile Val Ile Ala Pro Asp Lys Trp Phe Val Asp

275 280 285

Gly Arg Lys Ile Gly Leu Tyr Met Asp Gly Trp Thr Leu Val Pro Ala

290 295 300

Gly Arg

305

<210> 13

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Ri2FT的氨基酸序列

<400> 13

Met Ile Ala Val Lys Ile Gly Asp Gly Met Gly Asn Gln Leu Phe Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Cys Gly Tyr Ala Gln Ala Arg Arg Asp Gly Asp Ser Leu Val

20 25 30

Leu Asp Ile Ser Glu Cys Asp Asn Ser Thr Leu Arg Asp Phe Glu Leu

35 40 45

Asp Lys Phe His Leu Lys Tyr Asp Lys Lys Glu Ser Phe Pro Asn Arg

50 55 60

Asn Leu Gly Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Leu Arg Arg Ala Leu Lys Tyr

65 70 75 80

His Val Ile Lys Glu Arg Glu Val Tyr His Asn Arg Asp His Arg Tyr

85 90 95

Asp Val Asn Asp Ile Asp Pro Arg Val Tyr Lys Lys Lys Gly Leu Arg

100 105 110

Asn Lys Tyr Leu Tyr Gly Tyr Trp Gln His Leu Ala Tyr Phe Glu Asp

115 120 125

Tyr Leu Asn Glu Ile Thr Ala Met Met Thr Pro Ala Tyr Glu Gln Ser

130 135 140

Glu Thr Val Lys Lys Leu Gln Glu Glu Phe Lys Lys Thr Pro Thr Cys

145 150 155 160

Ala Val His Val Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Pro Ala Gly Ala Tyr

165 170 175

Phe Lys His Ala Met Glu Arg Met Glu Gln Glu Lys Pro Gly Val Arg

180 185 190

Tyr Ile Val Phe Thr Asn Asp Met Glu Arg Ala Glu Glu Ala Leu Ala

195 200 205

Pro Val Leu Glu Ser Gln Lys Lys Asp Ala Val Gly Gln Ala Glu Asn

210 215 220

Arg Leu Glu Phe Val Ser Glu Met Gly Glu Phe Ser Asp Val Asp Glu

225 230 235 240

Phe Phe Leu Met Ala Ala Cys Gln Asn Gln Ile Leu Ser Asn Ser Thr

245 250 255

Phe Ser Thr Trp Ala Ala Tyr Leu Asn Gln Asn Pro Asp Lys Thr Val

260 265 270

Ile Met Pro Asp Asp Leu Leu Ser Glu Arg Met Arg Gln Lys Asn Trp

275 280 285

Ile Ile Leu Lys

290

<210> 14

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码Am2FT_2的核苷酸序列

<400> 14

atgaacatgg aacggaaaac cggccttatg aataaaaaat atgtttcccc gtgtttcctg 60

cccggcatgc ggctgggcaa catcatgttc acgctggcgg ccgcctgtgc ccacgcccgt 120

accgtagggg tggagtgccg ggtgccctgg gcttacaatg acgcttccct gatgctgcgc 180

tcccggctcg gcggctgggt gctcccttct acgccgtgcg gcaccaatga acctccatcc 240

tggcaggaac cttcctttgc ctattgtccg gttccctccc gcatccggac gggcgggctt 300

cgcggctact tccagagcgc acggtatttt gaagggcagg aagcgttcat ccgggcgctt 360

ttcgcgcctc tcaccgcgga gaaggagccc ggcgccgttg gcattcacat ccggcttggg 420

gactacaggc gcctccgtga caagcaccgc attctggacc ctggtttcct gcggagggcc 480

gcagggcatt tatcatccgg gaagaaccgt ctggtgctgt tcagcgatga gccggacgag 540

gcggcggaga tgcttgcgcg cgtgccggca ttcggacgct ttgcgctgga aatcgaccgc 600

ggcgctccgt gcgaatccct ccgccgcatg acggcgatgg aggaactcgt catgtcgtgt 660

tcttcctttt cctggtgggg cgcgtggctg ggaaataccc ggaaggtcat cgttccgcgc 720

gactggtttg tcggcggtgt ggaagactac cgggatattt acctgcccca ttgggtaaca 780

ctgtaa 786

<210> 15

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码Bm2FT的核苷酸序列

<400> 15

atgaaaattg ttcagatttc ttctggtctg ggtaaccagc tgttccagta cgccctgtac 60

aaacgtctgt ctatgaacaa caacgatgtg ttcctggatg tggagacgtc ttatcaactg 120

aacaaaaatc agcacaatgg ttacgaaatt gaacgtattt tttccatcca gccatcccat 180

gctaccaagg gtatgatcga tgaactggcc gatgtagaca accgtctgat caaccgctta 240

cgtcgtaaac tgtttggtcc gaaaaactct atgtataccg aaaccaaaga gttcagctac 300

gattgtgaag ttttcaccaa agatggtatc tatatcaagg gctactggca gaactataac 360

tattttaaag agattgaaga cgatctgaaa aatgaactgg tctttaaaaa agctctggat 420

ctgaaaaatt cgcacctgat caatcagatg aataaagaaa ttagcgtaag catccacgta 480

cgccgcggcg attattacct gaacaaggag tacgaaaaca aatttggcaa cattgcggat 540

cttgattatt atctgaaagc gattaacttc atcaaaaaag aagtagacga tcccaaattt 600

tacgttttct ccgacgatat taaatgggct aaagaaaatc tgaacctgac ggataacgta 660

acttatgttg aacacaacaa agggagcgac tcttacaaag acatgcgtct gatgacctgc 720

tgtaaacata acatcatcgc caactctaca ttctcttggt ggggcgcgtt tcttaacgag 780

aacaagaaca aaatcgtaat cgcgccgggc aaatggatca acgttgaagg cgtcggtggc 840

atcaacctgt tccctgaagg ttggatcgtt tactga 876

<210> 16

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码Bm2FT_2的核苷酸序列

<400> 16

atgggttgca taaaaagact attcttatat gaatacggag gacgatgttt tttggtaatt 60

gttaaaataa aaggtggatt tggtaaccaa ttgtttacat acgctagtgc ttatgcaata 120

tctcaagaac tgcaacaaaa cttaattatg gataaggtaa tatatgatct agattacttt 180

agaaaatttg aattaccttc attatcgttg aagtatgatc aaatgttaat tagtaagttt 240

gtacctaata ctaaggttaa aactttaatt tataaagttt taaggaggtt aaaattaaaa 300

ggatttacag aggtacatga aaaaaaggaa ttttcttttg atgaaaatat ttacaatttg 360

tcaggtgata tttatttaga tggttattgg cagaattata gatatttcca taaatattat 420

aaagatctgt cggaaatgtt tgtaccaaga gaaactccta gaaaagaagt aactgattat 480

atcacgtctt tacggggagt taattctgtt gctatgcatg ttaggagagg agattataaa 540

acttttaacg gaggaaaatg tttgtcttta gattattata ttaaggctat ggaatatttc 600

aattcaaatg atgtacaatt ttatgtattt acagatgata ttgatttttg tgagaaaaac 660

ctcccgaata gtgaaaatat taattatgtg tcaagaagcg agaaacttac agatattgaa 720

gaattcttta ttatgaaaga atgtaaaaat tttataattg ctaatagtag tttttcgtgg 780

tgggctgctt atttaagtga acagaaagca gatagtttaa ttgtagcccc tgttgttgac 840

atgtggaaaa gagattttta tccagatgag tgggtggcat tgaatacaca tttagaatag 900

900

<210> 17

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码Bm2FT_3的核苷酸序列

<400> 17

atgataattg ttcaaatcaa gggcggatta ggtaatcaac ttttttcgta tgcttctgct 60

tatggaattg caagagagaa tgaaacagaa ttaattattg atcgatatat atatgataca 120

agctactctt taagaaaata tatgttggat tttttccctg agatcgatga agcactactt 180

ctaaagtata tacctaaaaa aaataaaatt tcacaaatta tgtataaatt gattagaaaa 240

tctaagttga aatataagta caaagctcaa ttatttttag aagaagagga atttaagttt 300

actagaatta gtacccagaa tgaaaatttg tatttaaatg gttattggca aagttatgtg 360

tactttgata aatatcgtaa tgacattatt aaaaaattca cccctttagt aagctttaat 420

caagatggaa atcaacttct taacgaaatt aaaagttata attcagtggc tatccatgtc 480

aggagagggg attatattaa ttttaaaggt ggaaagtgtt tagatagttc ttattatata 540

aaggcaatga agcatttata caatttaaaa ggaaaaaatt tgttttttta tatttttaca 600

gatgatgtgg aatattgtaa aagaattttt aaaaacgtag ctaatgttaa atttataggt 660

gaggaagcaa aattgagtga ttttgaagag tttactttga tgactcattg taaaaacctc 720

ataataggta acagctcatt ttcttggtgg gcagcttact tagcctcttg taaagataaa 780

gctgtaatag ctccagtggt agatatgtgg actgaagatt tctatctacc tgaatggata 840

aaaattaaag cggatttaca atag 864

<210> 18

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码Bs2FT的核苷酸序列

<400> 18

atgaaaatag tacacataag tagcggttta ggaaatcaaa tgtttcaata tgctctatat 60

aaaaaactgt ccttaattca agataatgtt tttttggata caattaccag ttatcagttg 120

tatcctaatc aacataatgg atatgagtta gagaaggtat ttacaattaa accaaggcat 180

gcaagtaaag aattaacata caatttatca gacttagata attcagtaac atctcgcatt 240

cgtaggaaat taattggaag taaaaagagc atgtatatag aacataaaga atttgaatac 300

gatcctaatt tattttatca agaaaatata tatataaaag gttactggca gaattatgat 360

tattttaaag atatagaaaa tgaattaaag aatgatttta cttttcaaag agctttagat 420

gagaaaaata ataatttagc tattaaaatt aacaatgaga attcaatatc aattcatgta 480

agacgtggtg attattactt aaacagaaag aatcaagaga agtttggaga tatcgctaat 540

ttggaatact attcaaaggc aattagctat attaaagaaa gaatagacaa tccaaagttt 600

tatatctttt cagataatgt tgagtgggta aagcaaaatc ttaattcgtt agaggaagct 660

gtatatatag attataacgt gggaaatgat agttacaagg atatgcaact aatgagtctt 720

tgtaaacata atattattgc taatagttct tttagttggt ggggagcatt tttgaataag 780

aatatggaga aaatagttat tgcacctggg aagtggatta atatgaaagg tgtaaaaaaa 840

gtcaatcttt tcccaaagga ttggataatt tattaa 876

<210> 19

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶的氨基酸序列

<400> 19

Met Lys Leu Val Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Lys Arg Leu Trp Pro

1 5 10 15

Leu Ser Asn Asp Thr Arg Ser Lys Gln Phe Leu Lys Val Leu Glu Gly

20 25 30

Arg Asp Gly Gln Lys Glu Ser Met Val Gln Arg Val Trp Ser Gln Ile

35 40 45

Glu Ala Val Gly Leu Asn Glu Ser Thr Val Ile Ala Thr Ser Lys Leu

50 55 60

Gln Arg Asp Met Ile Thr Gly Gln Val Gly Thr Asp Ile Pro Leu Ile

65 70 75 80

Ile Glu Pro Glu Arg Arg Asp Thr Phe Pro Ala Ile Ala Leu Ala Ala

85 90 95

Ser Tyr Leu His Ser Glu Glu Gln Ala Ser Glu Asp Glu Ile Val Val

100 105 110

Val Leu Pro Val Asp Pro Tyr Val Glu Asp Gly Phe Phe Glu Arg Val

115 120 125

Lys Asp Leu Glu Ser Val Leu Arg Asp Ser Lys Ala Asp Leu Ala Leu

130 135 140

Met Gly Val Thr Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Lys Tyr Gly Tyr Ile Val

145 150 155 160

Pro Glu Gly Lys Val Gln Gly Asp Ser Tyr Phe Thr Val Asp Cys Phe

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Ser Glu Glu Ala Ala Val Gly Leu Ile Asn Gln Arg

180 185 190

Ala Leu Trp Asn Cys Gly Val Phe Ala Phe Arg Leu Gly Tyr Leu Leu

195 200 205

Gln Ile Leu Gln Glu Lys Lys Leu Pro Leu Gln Phe Glu Thr Leu His

210 215 220

Lys Glu Tyr Ala Thr Leu Pro Lys Ile Ser Phe Asp Tyr Glu Val Val

225 230 235 240

Glu Lys Ala Ser His Ile Val Ala Leu Pro Tyr Asp Gly Tyr Trp Lys

245 250 255

Asp Leu Gly Thr Trp Asn Thr Leu Thr Glu Glu Met Ala Thr Ser Gln

260 265 270

Ile Gly Lys Gly Val Leu Thr Asp Asp Ser Ala Asn Thr His Leu Val

275 280 285

Asn Glu Leu Asp Ile Pro Val Thr Val Leu Gly Val Lys Asp Val Val

290 295 300

Val Ala Ala Ser Pro Asp Gly Ile Leu Val Ala Asp Lys Ala Ser Ser

305 310 315 320

Pro Lys Ile Lys Glu Ile Ile Gly Asp Trp Asn Tyr Pro Pro Met Tyr

325 330 335

Glu Glu Arg Leu Trp Gly Trp Ser Arg Val Leu Asp Tyr Ala Lys Tyr

340 345 350

Asp Glu Glu Thr Glu Met Val Thr Lys Arg Ile His Ile Ser Lys Gly

355 360 365

Lys Asn Ser Thr Tyr His Tyr His Asn Leu Arg Asp Glu Val Trp Thr

370 375 380

Ile Val Arg Gly Glu Gly Glu Leu Ala Leu Asp Asp Tyr Ile Arg Arg

385 390 395 400

Val Lys Ala Gly Asp Ile Ile His Leu Pro Ala Gly Lys Lys His Gly

405 410 415

Ile His Ala Leu Thr Asp Leu Glu Phe Ile Glu Val Gln Thr Gly Lys

420 425 430

Val Ile Ser Asn Glu Asp Ser Ile Arg Leu Ile Tyr Asp Trp Asn Asp

435 440 445

Val Ile Lys Gln Phe Gln Ser Ser Arg Pro Gln Val Ile Leu

450 455 460

<210> 20

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸甘露糖变位酶的氨基酸序列

<400> 20

Leu Lys Thr Ile Ala Tyr Tyr Ile Ser Asp Tyr Gly Tyr Gly His Ala

1 5 10 15

Thr Arg Ser Thr Ala Ile Ile Arg Gln Leu Leu Lys Gln Asn Glu Glu

20 25 30

Ile Glu Ile Ile Ile Cys His Ser Phe Ala Ile Glu Phe Leu Arg Gln

35 40 45

Ser Phe Arg Tyr Glu Arg Arg Val Arg Phe Arg Glu Ile Leu Thr Asp

50 55 60

Val Gly Tyr Val Leu Lys Glu Asn Ser Leu Glu Pro Asp Ala Asp Leu

65 70 75 80

Leu Asn Arg Gln Val Ala Ser Tyr Val Ser Ser Phe His Thr Lys Leu

85 90 95

Met Tyr Glu Lys His Phe Met Lys Val Ala Asn Val Ser Phe Val Ile

100 105 110

Ser Asp Ile Ser Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ala Tyr Leu Leu Lys Leu

115 120 125

Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Phe Thr Trp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly

130 135 140

Leu Ile Gly Glu Leu Ser Leu Glu Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Lys Gln

145 150 155 160

Met Thr Tyr Gln Phe Ser Leu Ala Cys Ser Asp Glu Pro His Trp Gly

165 170 175

Ile Lys Glu Asn Gln Ser Phe Gly Phe Tyr Ser Arg Glu Ile Asn Asp

180 185 190

Ser Glu Val Gln Arg Ile Arg Lys Glu Ile Asp Pro Glu Gly Glu Ser

195 200 205

Tyr Ile Ile Tyr Phe Gly Leu Gly Met Lys Val Asp Ile Gly Thr Leu

210 215 220

Ser Asp Leu Pro Ile Trp Gln Ser Pro Asn Cys Lys Phe Ile Val Ser

225 230 235 240

Ser Asn Val Asp Val Thr His Pro Asn Val Tyr Lys Ile Pro Gln Asp

245 250 255

Glu Thr Glu Thr Gln His Tyr Val Ala Ala Ala Asp Leu Gly Leu Thr

260 265 270

Lys Ala Gly Trp Gly Thr Ile Ser Glu Ala Val Cys Ala Gly Val Pro

275 280 285

Leu Leu Ile Thr Asn Arg Ser Ser Met Lys Glu Asp Arg His Thr Ile

290 295 300

Asp Tyr Leu Val Arg His Gln Leu Cys Asp Leu Ile Glu Trp Lys Glu

305 310 315 320

Leu Glu Gly Leu Val Val Thr Pro Ser Leu Ile Glu Thr Cys Arg Arg

325 330 335

Gln Gln Ile Asn Arg Tyr Lys Asn Glu Ala Met His Ile Ala Glu Glu

340 345 350

Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ser

355

<210> 21

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GDP-L-岩藻糖合酶的氨基酸序列

<400> 21

Met Asn Lys Asn Ser Lys Ile Tyr Val Ala Gly His Arg Gly Leu Val

1 5 10 15

Gly Ser Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asn Leu

20 25 30

Val Tyr Arg Thr Ser Ala Glu Leu Asp Leu Arg Asp Lys Pro Thr Val

35 40 45

Asp Ala Phe Phe Ala Glu Glu Lys Pro Glu Phe Val Phe Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Glu Tyr Pro Ala Glu Phe

65 70 75 80

Ile His Asp Asn Leu Leu Ile Gln Ser Asn Ile Ile Asp Ala Ala Tyr

85 90 95

Arg Asn Asp Val Glu Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Thr Cys Ile Tyr

100 105 110

Pro Lys Leu Ala Pro Gln Pro Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Leu Thr Gly

115 120 125

Glu Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly

130 135 140

Ile Lys Met Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Thr Lys Tyr Ile

145 150 155 160

Ser Ala Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe Asp Leu

165 170 175

His Thr Ser His Val Leu Pro Ala Leu Leu Arg Lys Phe His Glu Ala

180 185 190

Lys Glu Ser Asn Ala Pro Phe Val Glu Met Trp Gly Thr Gly Thr Pro

195 200 205

Lys Arg Glu Phe Leu Tyr Ser Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val Phe

210 215 220

Leu Met Asn Thr Tyr Glu Gly Asn Glu Ile Val Asn Ile Gly Val Gly

225 230 235 240

Glu Asp Ile Thr Ile Lys Glu Leu Gly Glu Lys Val Lys Ala Val Val

245 250 255

Gly Tyr Glu Gly Asn Ile Gln Phe Asp Thr Ser Lys Pro Asp Gly Thr

260 265 270

Pro Arg Lys Leu Val Asp Val Thr Lys Leu Asn Ser Leu Gly Trp Lys

275 280 285

Ala Glu Thr Ala Leu Glu Asp Gly Leu Gln Lys Ala Tyr Gln Trp Phe

290 295 300

Leu Asp Asn Glu Leu Ala Ala Ala Lys

305 310

<210> 22

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶的氨基酸序列

<400> 22

Met Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Leu Ile

20 25 30

Arg Arg Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Glu Arg Leu Glu Asp Leu Leu Thr

35 40 45

Glu Glu Ala Ala Ser Ala Leu Leu Asn Asn Ser Asn Phe His Leu His

50 55 60

Tyr Gly Asp Val Thr Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Ile Ile Gly Asp

65 70 75 80

Ile Gln Pro Asp Glu Ile Tyr Asn Leu Ala Ala Gln Ser His Val Arg

85 90 95

Val Ser Phe Asp Met Pro Gly Tyr Thr Leu Asp Val Asp Ala Lys Gly

100 105 110

Thr Leu Asn Ile Leu Glu Ala Val Arg Ile Leu Gly Leu Thr Asp Lys

115 120 125

Thr Arg Val Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln

130 135 140

Glu Val Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr

145 150 155 160

Gly Val Ala Lys Ile Tyr Gly Phe Trp Ile Thr Lys Asn Tyr Arg Glu

165 170 175

Ser Tyr Ser Met Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser

180 185 190

Glu Arg Arg Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Leu Ala Ala

195 200 205

Ser Arg Ile Ala Gln Gly Lys Gln Gln Lys Leu Thr Leu Gly Asn Leu

210 215 220

Asp Ser Leu Arg Asp Trp Gly Tyr Ala Lys Asp Tyr Val Glu Cys Met

225 230 235 240

Trp Leu Ile Leu Gln His Asp Lys Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr

245 250 255

Gly Glu Met His Ser Val Arg Glu Phe Val Gln Leu Ala Phe Lys His

260 265 270

Thr Gly Ile Glu Ile Glu Trp Ser Gly Glu Gly Leu Glu Glu Lys Gly

275 280 285

Thr Asn Lys Ala Thr Gly Glu Val Ile Val Glu Ile Asp Pro Lys Phe

290 295 300

Phe Arg Pro Ala Glu Val Asp Gln Leu Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala

305 310 315 320

Lys Thr Leu Leu Lys Trp Asn Pro Thr Lys Thr Ser Phe Glu Glu Leu

325 330 335

Val Arg Ile Met Val Glu Ala Asp Met Lys Lys Val Glu Ser Glu Glu

340 345 350

Lys Ile Lys Val Met Phe Asp

355

<210> 23

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶的核苷酸序列

<400> 23

atgaaacttg tattgttatc gggtggatct ggtaagcgtc tatggccgtt atcaaatgat 60

acgcgttcga agcagttttt aaaggtatta gaaggacgag atggacagaa agagtcaatg 120

gttcagcgcg tctggagtca aattgaagcg gttgggttaa atgagtcaac ggttattgcg 180

acgtctaagc ttcagcgtga tatgattaca ggtcaggttg gcaccgatat tccgttgatt 240

attgaacctg agcgccgcga tacgtttcca gcgattgctt tagctgcttc atatcttcat 300

tccgaagagc aagcatctga agatgaaatc gttgtggtgt tgccagttga cccttatgtg 360

gaagacggat tttttgaacg ggtaaaagat ttagaaagtg tgcttcgtga ttcaaaagcg 420

gatttagcgt taatgggtgt tacacctacg tatccttcat ctaagtacgg gtacatcgtg 480

ccggaaggaa aggtacaagg ggacagttat tttacagtgg attgttttac agaaaagccg 540

agtgaagaag cagctgttgg attaattaat cagcgtgcgc tttggaactg cggcgttttt 600

gcgtttcgtt taggttattt gcttcaaatt ttacaagaga aaaaacttcc acttcaattt 660

gaaacgctac ataaagaata tgcaacattg cctaaaatta gttttgacta tgaagtggtg 720

gaaaaggcaa gtcatattgt cgcgcttccg tatgatgggt actggaaaga tcttggtaca 780

tggaatacgt taacggaaga aatggcgaca tctcaaattg gaaaaggtgt attaacggac 840

gactcagcta atacgcattt agtgaatgaa ttagatattc cggttacggt attaggcgta 900

aaagatgtag ttgttgccgc tagtccagat gggatcttag ttgcggataa agcatctagt 960

cctaagatta aagaaattat tggcgactgg aactaccctc caatgtatga agaacgtctt 1020

tggggctggt cacgcgtgtt agattatgca aagtatgatg aagaaactga aatggtgaca 1080

aaacgtattc atatttcaaa aggaaagaac tcgacgtatc actatcataa tttacgtgat 1140

gaagtatgga cgattgtacg tggagaagga gagcttgcgc ttgatgacta cattcgccgc 1200

gtaaaagcag gggatattat tcacttgccg gctggcaaaa agcacggaat tcatgcgtta 1260

accgaccttg aatttattga agtacaaacg ggaaaagtga tttcaaatga agatagtatt 1320

cgccttattt atgactggaa tgatgtgatc aagcaattcc aatcatcaag accgcaggtg 1380

attttataa 1389

<210> 24

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码磷酸甘露糖变位酶的核苷酸序列

<400> 24

ttgaaaacaa ttgcctatta catttcagac tacggatatg gccacgcgac tagaagcacg 60

gccattattc gtcaattatt aaagcaaaat gaagaaatag aaattattat ttgtcattca 120

tttgcgattg agtttctcag acaatctttt agatatgaac gtcgtgtgag gtttcgagag 180

attttaacgg atgtcggcta cgtgctaaaa gaaaattcac tagaaccaga cgctgatttg 240

ttgaatcgtc aagttgcttc ttatgtatca agctttcata cgaagcttat gtatgagaag 300

cactttatga aagtagccaa cgtttcattc gtgatttcgg atatttctcc gttagggatc 360

gcaggtgcct atctattaaa attgccttct ttaggaatat caaatttcac ttggtttaca 420

gcatacgaag ggttaattgg agagctatcg ctggaatttt tagaaaaacg ttataagcag 480

atgacgtatc agttttcgct agcatgtagt gatgagccac attggggtat caaagaaaat 540

caaagctttg gtttttattc aagagaaata aacgattctg aagtacagcg tattcgtaaa 600

gagattgatc ctgaaggtga gagttacatc atctacttcg gtctgggtat gaaagtagat 660

attggaacgt tgtcggactt gcctatttgg caaagtccaa actgcaagtt tatcgtttca 720

tcgaatgttg atgttactca tcccaatgtt tataaaattc ctcaagatga aacagaaacg 780

cagcactatg tagcagcagc tgatcttggt ttaacaaaag caggctgggg cacgattagt 840

gaagcggttt gcgctggtgt gccgctgttg attacaaatc gcagcagcat gaaagaagat 900

cgtcatacga ttgattattt agttcgtcat cagctatgcg acttaataga gtggaaagag 960

ttagaaggtt tagtagtaac tccttcgctt attgagacat gcaggcggca gcaaatcaat 1020

cgctataaaa atgaagcgat gcatatcgcc gaagaaatca ataaaaaaat aaacagttag 1080

1080

<210> 25

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码GDP-L-岩藻糖合酶的核苷酸序列

<400> 25

atgaacaaaa attcgaaaat ttacgtagct ggtcatagag gtctcgtcgg ttcagctatc 60

gtacgaaaac tacaagaaaa aggctatagc aatctagtgt atcgcacaag cgctgagcta 120

gatttaagag acaagccgac agtagacgca ttctttgctg aagaaaagcc agaatttgtt 180

ttcttagcag ccgctaaagt aggtggtatt gtggcaaaca atgaatatcc agcggaattt 240

attcacgata acttattgat tcaatcaaat attattgatg cagcatatcg caatgatgta 300

gagaaactat tattcctagg aagtacatgt atttatccaa aattagcgcc tcagccatta 360

aaagaagaat acttactaac aggtgagctg gagccaacaa acgaaccgta tgcaattgct 420

aaaattgctg gaatcaaaat gtgtgaatcc tataaccgtc agtacggaac aaaatatatc 480

tcggcaatgc ctactaacct ttacggtcca aacgacaatt ttgaccttca tacatcacac 540

gttcttcctg cactgcttcg taagttccat gaagcgaaag aaagcaatgc gccgtttgtt 600

gaaatgtggg gaacaggcac accaaaacgt gaatttctat attcagatga cctagcagat 660

gcgtgcgtat tcttaatgaa tacatatgaa ggcaatgaaa tcgttaatat cggtgtggga 720

gaagatatta cgattaaaga acttggcgaa aaagtaaaag cagttgttgg ttatgaagga 780

aatattcagt ttgatacgtc aaaaccagac ggaacgcctc gtaaactagt agacgtaaca 840

aaattgaaca gtcttggctg gaaagcagaa acagctttag aagacggtct tcaaaaagcg 900

tatcagtggt ttttagataa cgaactagct gcagcaaaat aa 942

<210> 26

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶的核苷酸序列

<400> 26

atgaaaacag cattaattac aggtgtaaca ggacaagatg gatcatactt agcagaactt 60

ttactagaaa aaggctatga agtgcacgga ctaattcgcc gcagctcttc ttataaccaa 120

gagcgtctag aagatctttt aacagaagaa gcagcgagcg cattattaaa caactcaaac 180

ttccaccttc actatggtga cgtaacagat gcattaaatg ttactcgtat tattggtgac 240

attcagccag atgaaattta caatctagct gcacagtcac atgtacgtgt gtcttttgat 300

atgcctggat atacattaga tgttgatgca aaaggtacgt taaacattct tgaagctgta 360

cgtattttag ggttaacaga taaaacacgt gtgtaccaag cttctacatc tgaactgtac 420

ggaaaagttc aagaagtacc acaaaaggaa acaacacctt tctaccctcg ttctccatat 480

ggcgtagcga aaatttacgg cttttggatt acaaagaact accgtgaatc ttatagcatg 540

tttgcagtaa acggtatttt atttaaccat gaatcagagc gccgcggcga aacgttcgta 600

acacgtaaaa ttacgcttgc tgcttcacgt atcgcgcaag gcaagcagca aaaattaacg 660

cttggaaact tagactcttt acgtgactgg ggttacgcaa aagactatgt agaatgcatg 720

tggttaattc ttcaacacga taaacctgaa gattttgtta ttgcgactgg tgaaatgcac 780

tcagtacgtg aatttgtaca gcttgcattc aaacatacag gcattgaaat tgagtggagc 840

ggtgaaggtc tagaagaaaa aggaacaaat aaagcaacgg gtgaagtgat cgtagaaatc 900

gatcctaagt tcttccgtcc tgcagaagtg gatcaattgt taggtgatcc aactaaagcc 960

aagactttat taaagtggaa ccccactaag acttcgtttg aagaattagt tcgcattatg 1020

gtggaagcgg acatgaagaa ggttgaaagc gaagagaaga ttaaggtgat gtttgattaa 1080

1080

<210> 27

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 乳糖通透酶Lac12的氨基酸序列

<400> 27

Met Ala Asp His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Lys Lys Pro Ile

1 5 10 15

Asn Thr Ile Glu His Lys Asp Thr Leu Gly Asn Asp Arg Asp His Lys

20 25 30

Glu Ala Leu Asn Ser Asp Asn Asp Asn Thr Ser Gly Leu Lys Ile Asn

35 40 45

Gly Val Pro Ile Glu Asp Ala Arg Glu Glu Val Leu Leu Pro Gly Tyr

50 55 60

Leu Ser Lys Gln Tyr Tyr Lys Leu Tyr Gly Leu Cys Phe Ile Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Cys Ala Thr Met Gln Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Met Gly Ser Ile

85 90 95

Tyr Thr Glu Asp Ala Tyr Leu Lys Tyr Tyr His Leu Asp Ile Asn Ser

100 105 110

Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Phe Ser Ile Phe Asn Val Gly Gln Ile

115 120 125

Cys Gly Ala Phe Phe Val Pro Leu Met Asp Trp Lys Gly Arg Lys Pro

130 135 140

Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Gly Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Ser

145 150 155 160

Ser Leu Thr Thr Thr Lys Ser Ala Leu Ile Gly Gly Arg Trp Phe Val

165 170 175

Ala Phe Phe Ala Thr Ile Ala Asn Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Cys Ala

180 185 190

Glu Val Ala Pro Ala His Leu Arg Gly Lys Val Ala Gly Leu Tyr Asn

195 200 205

Thr Leu Trp Ser Val Gly Ser Ile Val Ala Ala Phe Ser Thr Tyr Gly

210 215 220

Thr Asn Lys Asn Phe Pro Asn Ser Ser Lys Ala Phe Lys Ile Pro Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Met Phe Pro Gly Leu Val Cys Ile Phe Gly Trp Leu

245 250 255

Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Gly Val Gly Arg Glu Glu Glu

260 265 270

Ala Arg Glu Phe Ile Ile Lys Tyr His Leu Asn Gly Asp Arg Thr His

275 280 285

Pro Leu Leu Asp Met Glu Met Ala Glu Ile Ile Glu Ser Phe His Gly

290 295 300

Thr Asp Leu Ser Asn Pro Leu Glu Met Leu Asp Val Arg Ser Leu Phe

305 310 315 320

Arg Thr Arg Ser Asp Arg Tyr Arg Ala Met Leu Val Ile Leu Met Ala

325 330 335

Trp Phe Gly Gln Phe Ser Gly Asn Asn Val Cys Ser Tyr Tyr Leu Pro

340 345 350

Thr Met Leu Arg Asn Val Gly Met Lys Ser Val Ser Leu Asn Val Leu

355 360 365

Met Asn Gly Val Tyr Ser Ile Val Thr Trp Ile Ser Ser Ile Cys Gly

370 375 380

Ala Phe Phe Ile Asp Lys Ile Gly Arg Arg Glu Gly Phe Leu Gly Ser

385 390 395 400

Ile Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Thr Gly Leu Ser Ile Cys Thr Ala

405 410 415

Arg Tyr Glu Lys Thr Lys Lys Lys Ser Ala Ser Asn Gly Ala Leu Val

420 425 430

Phe Ile Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Phe Ser Phe Ala Phe Thr Pro Met

435 440 445

Gln Ser Met Tyr Ser Thr Glu Val Ser Thr Asn Leu Thr Arg Ser Lys

450 455 460

Ala Gln Leu Leu Asn Phe Val Val Ser Gly Val Ala Gln Phe Val Asn

465 470 475 480

Gln Phe Ala Thr Pro Lys Ala Met Lys Asn Ile Lys Tyr Trp Phe Tyr

485 490 495

Val Phe Tyr Val Phe Phe Asp Ile Phe Glu Phe Ile Val Ile Tyr Phe

500 505 510

Phe Phe Val Glu Thr Lys Gly Arg Ser Leu Glu Glu Leu Glu Val Val

515 520 525

Phe Glu Ala Pro Asn Pro Arg Lys Ala Ser Val Asp Gln Ala Phe Leu

530 535 540

Ala Gln Val Arg Ala Thr Leu Val Gln Arg Asn Asp Val Arg Val Ala

545 550 555 560

Asn Ala Gln Asn Leu Lys Glu Gln Glu Pro Leu Lys Ser Asp Ala Asp

565 570 575

His Val Glu Lys Leu Ser Glu Ala Glu Ser Val

580 585

<210> 28

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 乳糖通透酶LacY的氨基酸序列

<400> 28

Met Lys Ser Ser Lys Ser Leu Tyr Trp Lys Leu Ser Ala Tyr Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Phe Phe Thr Trp Ser Ser Ser Tyr Ser Leu Phe Ser Ile Trp

20 25 30

Leu Gly Gln Glu Ile Lys Leu Asn Gly Ser Ala Thr Gly Leu Ile Phe

35 40 45

Ser Val Asn Ala Ile Phe Ala Leu Cys Met Gln Pro Leu Tyr Gly Tyr

50 55 60

Ile Ser Asp Arg Ile Gly Leu Lys Lys His Val Leu Phe Phe Ile Ser

65 70 75 80

Cys Leu Leu Val Phe Val Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Val Tyr Gly Pro

85 90 95

Leu Leu Gln Tyr Asn Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Leu Tyr

100 105 110

Leu Gly Val Ala Phe Leu Ala Gly Ile Gly Ala Ile Glu Thr Tyr Ile

115 120 125

Glu Lys Val Ser Arg Lys Tyr Lys Phe Glu Tyr Gly Lys Ser Arg Met

130 135 140

Trp Gly Ser Leu Gly Trp Ala Ala Ala Thr Phe Phe Ala Gly Gln Leu

145 150 155 160

Phe Asn Ile Asn Pro His Ile Asn Phe Trp Val Ala Ser Val Ser Ala

165 170 175

Val Ile Leu Val Ala Ile Ile Phe Ser Val Lys Val Glu Met Ser Ser

180 185 190

Tyr Glu Met Glu Lys Ala Glu Ser Val Thr Leu Arg Asp Val Gly Ser

195 200 205

Leu Phe Leu Leu Lys Glu Phe Trp Phe Phe Met Ile Tyr Val Val Gly

210 215 220

Val Thr Cys Val Tyr Gly Val Tyr Asp Gln Gln Phe Pro Ile Tyr Tyr

225 230 235 240

Ala Ser Leu Phe Pro Thr Glu Ser Ile Gly Asn Gln Val Phe Gly Tyr

245 250 255

Leu Asn Ser Phe Gln Val Phe Leu Glu Ala Gly Met Met Phe Ala Ala

260 265 270

Pro Phe Ile Val Asn Lys Ile Gly Ala Lys Asn Ser Leu Ile Leu Ala

275 280 285

Gly Phe Leu Met Gly Phe Arg Ile Ile Gly Ser Gly Leu Val Val Gly

290 295 300

Pro Ile Gly Ile Ser Ser Met Lys Leu Ile His Ala Leu Glu Leu Pro

305 310 315 320

Ile Met Leu Ile Ala Ile Phe Lys Tyr Leu Ala Ala Asn Phe Asp Thr

325 330 335

Arg Leu Ser Ser Ile Leu Tyr Leu Val Gly Phe Gln Phe Ala Ser Gln

340 345 350

Ile Gly Ala Ser Val Leu Ser Pro Ile Val Gly Gly Leu Tyr Asp Ser

355 360 365

Val Gly Phe Ser Arg Thr Tyr Leu Ile Met Gly Gly Met Val Leu Val

370 375 380

Phe Asn Val Ile Ser Met Phe Thr Leu Leu Asn Ser Lys Lys His Arg

385 390 395 400

Phe Ile Arg Lys Asp Val Gln Glu Asn Thr Gln Ile Ile

405 410

<210> 29

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码乳糖通透酶Lac12的核苷酸序列

<400> 29

atggctgatc actcttcttc ttcttcttct ttacaaaaaa aaccaattaa cacaattgaa 60

cacaaagata cattaggtaa cgatcgtgat cacaaagaag ctttaaactc tgataacgat 120

aacacatctg gtttaaaaat taacggtgta ccaattgaag atgctcgtga agaagtatta 180

ttaccaggtt acttatctaa acaatactac aaattatacg gtttatgttt cattacatac 240

ttatgtgcta caatgcaagg ttacgatggt gctttaatgg gttctattta cacagaagat 300

gcttacttaa aatactacca cttagatatt aactcttctt ctggtacagg tttagtattc 360

tctattttca acgtaggtca aatttgtggt gctttcttcg taccattaat ggattggaaa 420

ggtcgtaaac cagctatttt aattggttgt ttaggtgtag taattggtgc tattatttct 480

tctttaacaa caacaaaatc tgctttaatt ggtggtcgtt ggttcgtagc tttcttcgct 540

acaattgcta acgctgctgc tccaacatac tgtgctgaag tagctccagc tcacttacgt 600

ggtaaagtag ctggtttata caacacatta tggtctgtag gttctattgt agctgctttc 660

tctacatacg gtacaaacaa aaacttccca aactcttcta aagctttcaa aattccatta 720

tacttacaaa tgatgttccc aggtttagta tgtattttcg gttggttaat tccagaatct 780

ccacgttggt tagtaggtgt aggtcgtgaa gaagaagctc gtgaattcat tattaaatac 840

cacttaaacg gtgatcgtac acacccatta ttagatatgg aaatggctga aattattgaa 900

tctttccacg gtacagattt atctaaccca ttagaaatgt tagatgtacg ttctttattc 960

cgtacacgtt ctgatcgtta ccgtgctatg ttagtaattt taatggcttg gttcggtcaa 1020

ttctctggta acaacgtatg ttcttactac ttaccaacaa tgttacgtaa cgtaggtatg 1080

aaatctgtat ctttaaacgt attaatgaac ggtgtatact ctattgtaac atggatttct 1140

tctatttgtg gtgctttctt cattgataaa attggtcgtc gtgaaggttt cttaggttct 1200

atttctggtg ctgctttagc tttaacaggt ttatctattt gtacagctcg ttacgaaaaa 1260

acaaaaaaaa aatctgcttc taacggtgct ttagtattca tttacttatt cggtggtatt 1320

ttctctttcg ctttcacacc aatgcaatct atgtactcta cagaagtatc tacaaactta 1380

acacgttcta aagctcaatt attaaacttc gtagtatctg gtgtagctca attcgtaaac 1440

caattcgcta caccaaaagc tatgaaaaac attaaatact ggttctacgt attctacgta 1500

ttcttcgata ttttcgaatt cattgtaatt tacttcttct tcgtagaaac aaaaggtcgt 1560

tctttagaag aattagaagt agtattcgaa gctccaaacc cacgtaaagc ttctgtagat 1620

caagctttct tagctcaagt acgtgctaca ttagtacaac gtaacgatgt acgtgtagct 1680

aacgctcaaa acttaaaaga acaagaacca ttaaaatctg atgctgatca cgtagaaaaa 1740

ttatctgaag ctgaatctgt ataa 1764

<210> 30

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码乳糖通透酶LacY的核苷酸序列

<400> 30

atgaaaagtt caaaaagttt atattggaag ctgagtgcat attttttctt cttctttttt 60

acgtggtcgt ccagctactc tttattttct atctggttag ggcaagagat taagttgaac 120

ggatcagcaa caggcttaat cttttctgtg aacgctatct ttgctttgtg tatgcagcct 180

ttgtacggat atatatctga caggataggt ttaaagaaac acgttttatt ttttattagc 240

tgtcttttag tgtttgtagg accattttat atttttgttt atggaccttt gcttcaatac 300

aatgtggtga taggggctat tattggaggc ttatatttag gagtagcgtt tttggcgggc 360

atcggagcga ttgaaacata catagagaaa gtcagccgaa aatataaatt tgagtatgga 420

aaatctagaa tgtgggggtc attaggctgg gctgcagcta cgttttttgc aggacaatta 480

tttaatatta atcctcacat taatttttgg gtggcatctg tttcagcggt tatcctagtc 540

gctattattt tttctgtaaa agtagaaatg agcagttatg aaatggaaaa agctgaatcc 600

gtcacgctaa gagatgtagg tagtttattt ttattgaagg aattttggtt ttttatgatt 660

tatgttgttg gtgttacatg cgtatatggg gtatacgatc agcaatttcc tatctattat 720

gcatctttgt ttcctactga atcgataggt aaccaagtat ttggctactt aaattcgttt 780

caagtatttt tagaagctgg aatgatgttc gcagcaccgt ttattgtaaa taagatcggt 840

gcaaaaaata gtttaatttt agcaggattt ctaatgggat ttcgtattat tgggtcaggg 900

cttgttgttg gtccaatcgg aatatcttca atgaaactca ttcatgcatt agaacttcct 960

attatgctca ttgccatctt taaatatttg gcagctaact ttgacacgcg cctatcttcc 1020

atcctttatt tggttggatt ccaatttgct tcgcaaatag gtgcttcagt tctttcaccc 1080

atagtgggag gattatatga tagcgtaggt ttttcccgta cctatttaat tatgggaggt 1140

atggttttgg tatttaacgt tatttcgatg tttacactac taaactctaa aaaacataga 1200

tttataagaa aagatgtaca agaaaacacg cagattatat ag 1242

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Te2FT_F

<400> 31

catatgatta tcgttcatct gtg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Te2FT_R

<400> 32

ctcgagtcac agaacaatcc acc 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bt2FT_F

<400> 33

catatgaacg aaatccacgt gct 23

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bt2FT_1_R

<400> 34

ctcgagtcac tggccagccg gaatc 25

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_F

<400> 35

catatgaaaa ttgttcagat ttct 24

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_R

<400> 36

ctcgagtcag taaacgatcc aacct 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Lg2FT_F

<400> 37

catatgctgt acgttgaaat ggacg 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Lg2FT_R

<400> 38

ctcgagttac gcgtcgatca ggatc 25

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ls2FT_F

<400> 39

catatggaag agattcacac cctg 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ls2FT_R

<400> 40

ctcgagctaa cggccggcag gtac 24

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ll2FT_F

<400> 41

catatgtcta aaaacattta tgtac 25

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ll2FT_R

<400> 42

ctcgagttag attttgatcc agttgt 26

<210> 43

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Am2FT_1_F

<400> 43

aagaaggaga tatacatatg atggctggac attcttgcg 39

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Am2FT_1_R

<400> 44

tggtggtggt ggtgctcgag ttaaatgcgc agccatgagc 40

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Am2FT_2_F

<400> 45

aagaaggaga tatacatatg atgaacatgg aacgtaaga 39

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Am2FT_2_R

<400> 46

tggtggtggt ggtgctcgag ttacagggtc acccagtgcg 40

<210> 47

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Fp2FT_F

<400> 47

aagaaggaga tatacatatg atgatttacg tggaaatg 38

<210> 48

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Fp2FT_R

<400> 48

tggtggtggt ggtgctcgag ttattcgtta acgatgtta 39

<210> 49

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ri2FT_F

<400> 49

aagaaggaga tatacatatg atgatcgcag ttaagatc 38

<210> 50

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Ri2FT_R

<400> 50

tggtggtggt ggtgctcgag ttatttcagg ataatccagt 40

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_2_F

<400> 51

aagaaggaga tatacatatg ggttgcatta aacgcctgt 39

<210> 52

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_2_R

<400> 52

tggtggtggt ggtgctcgag ctattccagg tgagtgttca 40

<210> 53

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_3_F

<400> 53

aagaaggaga tatacatatg atcattgtcc agattaaa 38

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_3_R

<400> 54

tggtggtggt ggtgctcgag ctattgaaga tccgctttga t 41

<210> 55

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_4_F

<400> 55

aagaaggaga tatacatatg atcattgtgc gtgttatc 38

<210> 56

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bm2FT_4_R

<400> 56

tggtggtggt ggtgctcgag ttagaacgta ttaatacact 40

<210> 57

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bs2FT_F

<400> 57

aagaaggaga tatacatatg aaaattgtaa aagttatc 38

<210> 58

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Bs2FT_R

<400> 58

tggtggtggt ggtgctcgag ttagtagatg atccagtctt 40

<210> 59

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Gs2FT_F

<400> 59

aagaaggaga tatacatatg aaaattgtaa aagtta 36

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物Gs2FT_R

<400> 60

tggtggtggt ggtgctcgag ttagatttta atccattct 39

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物TAG_PET24ma_F

<400> 61

tagctcgagc accaccacca ccacc 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物TAA_PET24ma_F

<400> 62

taactcgagc accaccacca ccacc 25

<210> 63

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物PET24ma_R

<400> 63

catatgtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt 40

Claims

1.一种重组微生物，其被转化以表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述重组微生物包含至少一种选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物为GRAS(通常被认为是安全的)微生物。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物为芽孢杆菌属微生物、棒杆菌属微生物、埃希氏菌属微生物或酵母。

4.根据权利要求3所述的重组微生物，其中所述芽孢杆菌属微生物为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，

所述棒杆菌属微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，

所述埃希氏菌属微生物为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，并且

所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candidautilis)。

5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物在重组前不具有2’-岩藻糖基乳糖生产能力，并且通过重组获得了2’-岩藻糖基乳糖生产能力。

6.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物表达岩藻糖合成基因。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述岩藻糖合成基因表达选自下列项中的至少一种：GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、磷酸甘露糖变位酶和GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶。

8.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物表达乳糖膜转运蛋白。

9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述乳糖膜转运蛋白为选自Lac12和LacY中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物具有与包含源自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的α-1,2-岩藻糖基转移酶的对照组相比2倍以上的2’-岩藻糖基乳糖生产力。

11.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括在包含乳糖的培养基中培养根据权利要求1至权利要求10中任一项所述的重组微生物的步骤。