JP2024502062A - フコース転移酵素を発現する組換え微生物およびこれを用いた２’－フコシルラクトース製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、２’－フコース転移酵素が導入された微生物、およびこれを用いた２’－フコシルラクトースの製造方法に関するものであって、本発明の微生物由来フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、従来のヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来酵素に比べて安全で高活性を有する。【選択図】図４
Description
本発明は、フコース転移酵素が発現されるように形質転換された組換え微生物、およびこれを用いた２’－フコシルラクトース製造方法に関するものである。
母乳中含量が最も高いオリゴ糖三つを含む１３７種がフコシル化されており、その比率が約７７％であり、残りのオリゴ糖は大部分シアル化されたもの（３９個）で約２８％に該当する。このうち、特に２’－フコシルラクトースと３’－フコシルラクトースは、プレバイオティク（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌腸内付着抑制効果、そして免疫調節システム調節効果などを有する。Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ効果は、今まで最も多くの研究が行われ、母乳の母乳オリゴ糖は、乳児の腸で初期に優占種として育つＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍの生育を選択的に増進させる反面、有害菌によっては用いられない。また、母乳オリゴ糖は、病原菌の腸内付着を抑制すると知られており、これは腸内レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）と結合する病原菌の細胞壁多糖体構造が時々母乳オリゴ糖の一部構造と類似しているためである。したがって、母乳オリゴ糖が水溶性リガンド類似体を提供して、母乳授乳乳児が病原菌による感染に耐性を有すると見られる。しかし、女性の約２０％は２’－フコシルラクトースを合成するフコース転移酵素の変異によって体内でこれらを十分に合成できないと知られている。これによって、２’－フコシルラクトースの産業的生産が必要であるのが実情である。
母乳オリゴ糖の一部は、大部分哺乳動物（霊長類、牛、豚、ヤギ、羊、象）の乳でも少量発見される。このうち、ヤギの乳が母乳オリゴ糖組成と最も類似しており、これによって、ヤギ乳チーズ生産工程の乳清副産物から大規模膜利用分離技術が提示された。また、最近開発された固相化学合成法（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いると、一日内にＬｅｗｉｓ Ｘ－Ｌｅｗｉｓ Ｙ糖を生産することができ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いると、２’－フコシルラクトースの速い合成が可能になった。しかし、前記分離法や化学的合成法の開発にもかかわらず、母乳オリゴ糖の産業化のための大量生産にはいくつかの障害物が残っており、これは、本技術の低い立体選択性、低い総収率と毒性試薬の使用などが食品または薬品産業に適しないためである。従って、より環境にやさしく収率の高い生産法が必要になり、最近、微生物による高濃度の２’－ＦＬ生産方法が報告される傾向にある。しかし、２’－フコシルラクトース生合成遺伝子は、Ｂｉｏ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ２菌株Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから確保された２’－フコシルラクトースを使用して主に母乳授乳代替用粉乳および乳児用食品に適用時消費者の認識に否定的な要素として作用することがあり、国内生産販売許可に適しない。したがって、食品添加物としてより安定性の高い遺伝子を適用して、Ｂｉｏ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ １菌株の遺伝子導入による２’－フコシルラクトース生産が必要である。
本発明は、食品、化粧品、および医薬品素材であるフコシルラクトースを生産する転移酵素を有している微生物であって、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １菌株、例えばバチルス・メガテリウム（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）に由来した２’－フコース転移酵素を挿入した組換え微生物を提供し、これを用いて効果的な２’－フコシルラクトースを生産する方法を提供するためのものである。
本発明の一例は、α－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換された、組換え微生物に関するものである。前記α－１，２－フコース転移酵素は、配列番号１～５からなる群より選択された１種以上を含むものであってもよい。
本発明は、バイオセーフティーレベル１（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １）菌株に由来したフコース転移酵素が導入されて、安定性側面から消費者の憂慮がない組換え微生物、およびこれを用いた２’－フコシルラクトースの生産方法を提供することができる。
本発明で、２－フコース転移酵素活性を有するポリペプチドは、配列番号１～５のアミノ酸配列に制限されず、配列番号１～５のアミノ酸配列中の一部アミノ酸残基の置換、挿入または欠乏によって形成したアミノ酸配列を含み、このようなアミノ酸が修飾されたタンパク質またはポリペプチドが２－フコース転移酵素活性を有していれば、ラクトースとＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅを基質にしてフコシルラクトースに転換できる。
前記α－１，２－フコース転移酵素をコードする核酸配列は、例えば、配列番号１４～１８からなる群より選択された１種以上の核酸配列を含むものであってもよい。
前記組換え微生物は、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）微生物であり得る。現在まで２’－フコシルラクトース生産に使用される遺伝子は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから確保された２’－フコシルラクトースを使用するので安定性が良くなく、このような問題点を解決するために、本発明による組換え微生物は、Ｂｉｏ Ｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ １微生物であり得る。ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、バイオセーフティーレベル２（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ２）であるため食品素材の生産のための酵素に適しないが、本発明によるフコース転移酵素は、バイオセーフティーレベル１（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １）であるため安定性側面に対する消費者の憂慮が全くない長所を有する。
本発明による組換え微生物は、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｏｒｉ由来のα－１，２－フコース転移酵素を含む対照群に対比して、２’－フコシルラクトース生産性が顕著に上昇して、安定性向上および生産性向上が可能である。
具体的に、本発明の一例による組換え微生物は、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｏｒｉ由来のα－１，２－フコース転移酵素を含む対照群に対比して、２倍以上、２．１倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、または７．５倍以上の２’－フコシルラクトース生産性を有するものであり得る。したがって、前記組換え微生物は、α－１，２－フコース製造に有用に使用することができ、α－１，２－フコース生産収率を向上させることができる。
本発明の一例による組換え微生物は、組換え前に２’－フコシルラクトース生産能を有せず、組換えによって２’－フコシルラクトース生産能を有するものであり得る。
前記組換え微生物を形質切換する方法は、当業界に公知された全ての形質転換方法を特別な制限なく選択して使用することができ、例えば、細菌原形質体の融合、電気穿孔法、遺伝子銃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターを使用した感染などから選択されたものであってもよい。
本発明による組換え微生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）微生物、または酵母（ｙｅａｓｔ）であってもよい。
具体的に、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、またはバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であってもい。
具体的に、前記コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。
具体的に、前記大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよい。
具体的に、前記酵母（ｙｅａｓｔ）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）であってもよい。
本発明の一例による組換え微生物は、フコース合成能を有するか、フコース合成能が改善されたものであり得る。２’－フコシルラクトースを生産するためにどんな微生物でも基本的に外来のα－１，２－フコース転移酵素を導入しなければならないのは同一であるが、各微生物の菌株自体の遺伝的特性が異なるため、大腸菌やバチルス・メガテリウムは、α－１，２－フコース転移酵素のみ挿入しても２’－フコシルラクトース生産が可能であるが、バチルス・サブチリス、コリネバクテリウム、酵母微生物などは、追加的にフコース合成酵素を導入することができる。
具体的に、本発明の一例による組換え微生物は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＷｃａＧ）、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｒａｓｅ）、およびＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上を保有するか、過発現することを特徴とすることができる。よって、本発明の一例による組換え微生物は、α－１，２－フコース転移酵素発現特性と共に、フコース合成能が改善されてα－１，２－フコース生産収率がさらに向上できる。
例えば、前記フコース合成酵素は、配列番号１９～２２からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
例えば、前記ＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２３の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
例えば、前記ホスホマンノムターゼは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２４の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
例えば、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＷｃａＧ）は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２５の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
例えば、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＷｃａＧ）は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２５の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
例えば、前記ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むものであるか、配列番号２６の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
本発明の一例による組換え微生物は、ラクトース膜輸送タンパク質を発現または過発現するものであってもよい。前記ラクトース膜輸送タンパク質は、２’－フコシルラクトースの基質であるラクトースを細胞内に導入して、２’－フコシルラクトース生産能を改善するものであり得る。
具体的に、前記ラクトース膜輸送タンパク質は、Ｌａｃ１２および／またはＬａｃＹであってもよい。
例えば、前記Ｌａｃ１２は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、前記Ｌａｃ１２をコードする核酸は、配列番号２９の核酸配列を含むものであってもよい。一例として、前記Ｌａｃ１２は、配列番号２９の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
例えば、前記ＬａｃＹは、配列番号２８のアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、前記ＬａｃＹをコードする核酸配列は、配列番号３０の核酸配列を含むものであってもよい。一例として、前記ＬａｃＹは、配列番号３０の核酸配列によってコードされるものであってもよい。
本発明のまた他の一例は、本発明による組換え微生物を用いて得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、２’－フコシルラクトース生産用組成物に関するものである。前記組換え微生物、前記α－１，２－フコース転移酵素、前記２’－フコシルラクトースなどは、前述の通りである。
前記培養物は、前記組換え微生物から生産された酵素を含むものであって、前記組換え微生物を含むか、前記組換え微生物を含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。前記破砕物は、前記組換え微生物を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上清液を意味するものであって、前記組換え微生物から生産された酵素を含むものである。本明細書において、別途の言及がない限り、２’－フコシルラクトース製造に使用される組換え微生物は、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物および前記微生物の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。
本発明のまた他の一例は、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）を含む培地で本発明による組換え微生物を培養する工程を含む、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｌｓｙｌａｃｔｏｓｅ）の生産方法に関するものである。
前記製造方法は、培養物から得られたα－１，２－フコース転移酵素、前記微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物、および前記破砕物または培養物の抽出物からなる群より選択された１種以上をラクトース含有原料と反応して２’－フコシルラクトースを生産することであってもよい。
以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
実施例１．生物情報学ツールを用いたａ－１，２－フコース転移酵素スクリーニング
生物情報学ツールを用いてＢｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １由来ａ－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素（以下、２ＦＴ）候補を選別した。具体的に、ｎｃｂｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／）でａ－１，２－フコース転移酵素機能を有すると予想される酵素のうちＢａｃｔｅｒｉａ由来およびＧＲＡＳ ｂａｃｔｅｒｉａ由来を基準にして＞９０％相同性ｓｅｑｕｅｎｃｅを除去し、タンパク質形態可視化プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｌａｂ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／ｐｒｏｔｔｅｒ）を用いて膜タンパク質の有無を把握した。
コンピュータ生物情報学ツールを使用して３２個の候補群を選別した（表１）。また、タンパク質発現において問題になる膜タンパク質の存在有無をプログラムを通じて予測した際に、３２個候補群のうち、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来を除いた残り３１個の酵素で著しい膜タンパク質は予測されなかった。
生物情報学ツールを用いてＢｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １由来ａ－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ酵素（以下、２ＦＴ）候補を選別した。具体的に、ｎｃｂｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／）でａ－１，２－フコース転移酵素機能を有すると予想される酵素のうちＢａｃｔｅｒｉａ由来およびＧＲＡＳ ｂａｃｔｅｒｉａ由来を基準にして＞９０％相同性ｓｅｑｕｅｎｃｅを除去し、タンパク質形態可視化プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｌａｂ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／ｐｒｏｔｔｅｒ）を用いて膜タンパク質の有無を把握した。
コンピュータ生物情報学ツールを使用して３２個の候補群を選別した（表１）。また、タンパク質発現において問題になる膜タンパク質の存在有無をプログラムを通じて予測した際に、３２個候補群のうち、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来を除いた残り３１個の酵素で著しい膜タンパク質は予測されなかった。
候補群のうち、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １ Ｂｍ２ＦＴが、反応性が以後確認されて、Ｂｍ２ＦＴタンパク質配列相同性に基づいて追加候補群をＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来酵素を探索した。Ｂｍ２ＦＴの配列情報に基づいて、ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて酵素を探索した。選別された酵素候補群目録を表２に示した。
比較例１．従来のα－１，２－フコース転移酵素の準備
ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｏｒｉ由来の２ＦＴ（ＦｕｔＣ）は２ＦＴ酵素のうち、活性が最も高くて様々な文献で２ＦＬ生産のために使用しているので、対照群に選定した。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ．２０１９ Ｍａｙ；２２２：３５－４２論文Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ α１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．で、大腸菌を用いてＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ由来の２ＦＴ反応性を確認し、これを対照群に選定した。
ＷＯ２０１５／１７５８０１文献でＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ由来の２ＦＴ反応性を確認できなかったが、生産性を再検討するために対照群に選定した。
選別された対照群酵素目録および情報を表３に示した。
ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｏｒｉ由来の２ＦＴ（ＦｕｔＣ）は２ＦＴ酵素のうち、活性が最も高くて様々な文献で２ＦＬ生産のために使用しているので、対照群に選定した。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ．２０１９ Ｍａｙ；２２２：３５－４２論文Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ α１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．で、大腸菌を用いてＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ由来の２ＦＴ反応性を確認し、これを対照群に選定した。
ＷＯ２０１５／１７５８０１文献でＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ由来の２ＦＴ反応性を確認できなかったが、生産性を再検討するために対照群に選定した。
選別された対照群酵素目録および情報を表３に示した。
実施例２．大腸菌用発現プラスミドクローニング
実施例１で選別された酵素と比較例１の対照群酵素の大腸菌での活性を確認するために、酵素発現プラスミドにクローニングを行った。
具体的に、実施例１で選別された酵素配列のコドンを大腸菌に最適化しようとコドン最適化プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／）に配列入力後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿ｃｏｌｉを選択して、ｇｕｉｄｅｄ ｒａｎｄｏｍコドン最適化検索を行った。確認された酵素配列を合成し、条件に合わせて表５の提示されたプライマーを通じてＰＣＲを行って合成遺伝子を増幅した。ｐＥＴ２４ｍａのプラスミド増幅の場合、合成遺伝子のｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎの配列がＴＡＧあるいはＴＡＡなのかに合わせて、ＴＡＧ＿ＰＥＴ２４ｍａ＿ＦあるいはＴＡＡ＿ＰＥＴ２４ｍａ＿Ｆ ＰＣＲプライマーを場合によって使用した。各酵素によるプライマー配列情報および名称を表４に示した。
実施例１で選別された酵素と比較例１の対照群酵素の大腸菌での活性を確認するために、酵素発現プラスミドにクローニングを行った。
具体的に、実施例１で選別された酵素配列のコドンを大腸菌に最適化しようとコドン最適化プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／）に配列入力後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿ｃｏｌｉを選択して、ｇｕｉｄｅｄ ｒａｎｄｏｍコドン最適化検索を行った。確認された酵素配列を合成し、条件に合わせて表５の提示されたプライマーを通じてＰＣＲを行って合成遺伝子を増幅した。ｐＥＴ２４ｍａのプラスミド増幅の場合、合成遺伝子のｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎの配列がＴＡＧあるいはＴＡＡなのかに合わせて、ＴＡＧ＿ＰＥＴ２４ｍａ＿ＦあるいはＴＡＡ＿ＰＥＴ２４ｍａ＿Ｆ ＰＣＲプライマーを場合によって使用した。各酵素によるプライマー配列情報および名称を表４に示した。
Ｔｅ２ＦＴ、Ｂｔ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ、Ｌｇ２ＦＴ、Ｌｓ２ＦＴ、およびＬｌ２ＦＴ合成遺伝子の場合、遺伝子精製後、それぞれ１μＬ ＮＥＢ制限酵素（Ｎｄｅ１／Ｘｈｏ１）を処理して３７℃で３時間保管した。その後、制限酵素とバッファーを除去するために再び遺伝子精製後、１６℃で同一制限酵素を処理したｐＥＴ２４ｍａと共に４時間ｌｉｇａｔｉｏｎを行った。前記Ｔｅ２ＦＴ、Ｂｔ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ、Ｌｇ２ＦＴ、Ｌｓ２ＦＴ、およびＬｌ２ＦＴ合成遺伝子を除いた残り合成遺伝子は全て、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ方法でｃｌｏｎｉｎｇを行うためにｇｅｌ ｐｒｅｐを行った。
Ｐｒｅｐ後、ｎａｎｏ ｄｒｏｐでそれぞれの遺伝子濃度を確認し、ｖｅｃｔｏｒとｉｎｓｅｒｔの比が１：２になり総反応体積が８μＬになるように、２Ｘ ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れた。その後、５０℃で１時間反応した。ｃｌｏｎｉｎｇ遺伝子をＤＨ１０ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした後、Ｋｍ抗生剤が入っているｐｌａｔｅに塗抹して、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで育てた。
それぞれのｐｌａｔｅに育ったｃｏｌｏｎｙのうち５つずつを選別して、遺伝子に該当する表５のプライマーを用いてｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲを行った。ＤＮＡ ｇｅｌ上に大きさに該当するｂａｎｄを確認したｃｏｌｏｎｙをＫｍ抗生剤が含まれている３ｍｌ ＬＢ培地に接種後、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ育てた。翌日、ｃｅｌｌを集めてＤＮＡを抽出しシークエンシングした。
Ｐｒｅｐ後、ｎａｎｏ ｄｒｏｐでそれぞれの遺伝子濃度を確認し、ｖｅｃｔｏｒとｉｎｓｅｒｔの比が１：２になり総反応体積が８μＬになるように、２Ｘ ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを入れた。その後、５０℃で１時間反応した。ｃｌｏｎｉｎｇ遺伝子をＤＨ１０ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした後、Ｋｍ抗生剤が入っているｐｌａｔｅに塗抹して、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで育てた。
それぞれのｐｌａｔｅに育ったｃｏｌｏｎｙのうち５つずつを選別して、遺伝子に該当する表５のプライマーを用いてｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲを行った。ＤＮＡ ｇｅｌ上に大きさに該当するｂａｎｄを確認したｃｏｌｏｎｙをＫｍ抗生剤が含まれている３ｍｌ ＬＢ培地に接種後、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ育てた。翌日、ｃｅｌｌを集めてＤＮＡを抽出しシークエンシングした。
実施例３．酵素タンパク質発現確認
大腸菌内でｃｌｏｎｉｎｇしたそれぞれの遺伝子がタンパク質発現しているか確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）△ｆｕｃｌ△ｆｕｃＫ：：ＡｐｒＲ ｌａｃＺ△ｍ１５：：ＰｌａｃＵＶ５ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに、実験するそれぞれの２ＦＴベクターとＧＤＰ－ｆｕｃを生産する酵素を有するｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢとＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧを共にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。ＫｍとＡｍｐ抗生剤が入っているｐｌａｔｅに塗抹してｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。
ｃｏｌｏｎｙをＫｍとＡｍｐ抗生剤が含まれている３ｍＬ培地に接種後、ｓｅｅｄをｏｖｅｒｎｉｇｈｔ育てた。４ｍＬ ＬＢに２００μＬ ｓｅｅｄと０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加後、３０℃で１６時間育てた。４ｍＬで育った細胞を遠心分離機で全て回収した後、上清液を捨てた。５００μＬのバッファーを添加後、ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで破砕後、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してｓｏｌｕｂｌｅタンパク質を回収した。ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをおろした。選別酵素のｔｏｔａｌおよびｓｏｌｕｂｌｅタンパク質発現ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（図１の左側）、および予想タンパク質大きさ（図１の右側）を図１に示した。図１で、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、およびＷｃａＧは追加的に入れたｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢ＋ＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧプラスミドで発現されたタンパク質である。
図１に示されているように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて比較したタンパク質のうち８個の酵素Ｂｍ２ＦＴ、Ｔｅ２ＦＴ、Ｈｐ２ＦＴ、Ａｍ２ＦＴ＿２、Ｆｐ２ＦＴ、Ｒｉ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ＿２、およびＢｍ２ＦＴ＿３で過発現を確認した。
大腸菌内でｃｌｏｎｉｎｇしたそれぞれの遺伝子がタンパク質発現しているか確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）△ｆｕｃｌ△ｆｕｃＫ：：ＡｐｒＲ ｌａｃＺ△ｍ１５：：ＰｌａｃＵＶ５ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに、実験するそれぞれの２ＦＴベクターとＧＤＰ－ｆｕｃを生産する酵素を有するｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢとＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧを共にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。ＫｍとＡｍｐ抗生剤が入っているｐｌａｔｅに塗抹してｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。
ｃｏｌｏｎｙをＫｍとＡｍｐ抗生剤が含まれている３ｍＬ培地に接種後、ｓｅｅｄをｏｖｅｒｎｉｇｈｔ育てた。４ｍＬ ＬＢに２００μＬ ｓｅｅｄと０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加後、３０℃で１６時間育てた。４ｍＬで育った細胞を遠心分離機で全て回収した後、上清液を捨てた。５００μＬのバッファーを添加後、ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒで破砕後、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してｓｏｌｕｂｌｅタンパク質を回収した。ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをおろした。選別酵素のｔｏｔａｌおよびｓｏｌｕｂｌｅタンパク質発現ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（図１の左側）、および予想タンパク質大きさ（図１の右側）を図１に示した。図１で、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、およびＷｃａＧは追加的に入れたｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢ＋ＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧプラスミドで発現されたタンパク質である。
図１に示されているように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて比較したタンパク質のうち８個の酵素Ｂｍ２ＦＴ、Ｔｅ２ＦＴ、Ｈｐ２ＦＴ、Ａｍ２ＦＴ＿２、Ｆｐ２ＦＴ、Ｒｉ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ＿２、およびＢｍ２ＦＴ＿３で過発現を確認した。
実施例４．試験管を用いた反応分析最適化
２５０ｍＬフラスコで総５０ｍＬ ｃｕｌｔｕｒｅを通じて２ＦＬ生産性を確認した。酵素候補群が多い場合、確実な比較分析のために３繰り返し以上の実験の再現が必須であるが、既存の５０ｍＬ培養条件の場合、分析時必要量（１ｍＬ）以上の労力がかかる短所がある。多様な候補群の速い反応傾向性把握のために、１０ｍＬ試験管で４ｍＬ培養を通じて酵素反応確認方法を確立しようとする。
Ｈｐ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ、Ｂｔ２ＦＴがクローニングされたｐｌａｓｍｉｄをそれぞれｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢ＋ＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧ ｐｌａｓｍｉｄと共にＥ．ｃｏｌｉ菌株にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。それぞれのｐｌａｔｅで３つのｃｏｌｏｎｙを接種して、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅを行った。
ｓｅｅｄのうち５００μＬは５０ｍＬ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅにｉｎｄｕｃｔｉｏｎした。ＯＤ600が～０．８程度になるとき、０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅを入れた後、２０ｈ後ＨＰＬＣで分析した。
ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ反応の場合、ｓｅｅｄ２００μＬを０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加した。ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ反応は、ｆｌａｓｋのＯＤを確認するｓｔｅｐを省略することができる。
２０ｈ後、ＨＰＬＣで分析してフラスコ反応（図２の上段）および試験管反応（図２の下段）の２ＦＬ生産傾向性を図２に示した。図２に示されているように、定立した試験管反応条件がフラスコ条件よりは２ＦＬの生産性が１／３水準であるが、その反応傾向性は同一で多様な酵素を一度に比較分析することに適するのを確認した。
２５０ｍＬフラスコで総５０ｍＬ ｃｕｌｔｕｒｅを通じて２ＦＬ生産性を確認した。酵素候補群が多い場合、確実な比較分析のために３繰り返し以上の実験の再現が必須であるが、既存の５０ｍＬ培養条件の場合、分析時必要量（１ｍＬ）以上の労力がかかる短所がある。多様な候補群の速い反応傾向性把握のために、１０ｍＬ試験管で４ｍＬ培養を通じて酵素反応確認方法を確立しようとする。
Ｈｐ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ、Ｂｔ２ＦＴがクローニングされたｐｌａｓｍｉｄをそれぞれｐＣＤＦｍ：：ＰＴ７ｍａｎＣ－ｍａｎＢ＋ＰＴ７－ｇｍｄ－ｗｃａＧ ｐｌａｓｍｉｄと共にＥ．ｃｏｌｉ菌株にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。それぞれのｐｌａｔｅで３つのｃｏｌｏｎｙを接種して、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅを行った。
ｓｅｅｄのうち５００μＬは５０ｍＬ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅにｉｎｄｕｃｔｉｏｎした。ＯＤ600が～０．８程度になるとき、０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅを入れた後、２０ｈ後ＨＰＬＣで分析した。
ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ反応の場合、ｓｅｅｄ２００μＬを０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加した。ｔｅｓｔ ｔｕｂｅ反応は、ｆｌａｓｋのＯＤを確認するｓｔｅｐを省略することができる。
２０ｈ後、ＨＰＬＣで分析してフラスコ反応（図２の上段）および試験管反応（図２の下段）の２ＦＬ生産傾向性を図２に示した。図２に示されているように、定立した試験管反応条件がフラスコ条件よりは２ＦＬの生産性が１／３水準であるが、その反応傾向性は同一で多様な酵素を一度に比較分析することに適するのを確認した。
実施例５．ＨＰＬＣ分析を通じた２ＦＬ生産性比較
実施例１で選別された酵素および対照群酵素３種の反応性を比較した。
比較するプラスミドをそれぞれＥ．ｃｏｌｉにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ後、３７℃で育てた。それぞれのｐｌａｔｅで３つのｃｏｌｏｎｙを接種してｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅを行った。ｓｅｅｄ ２００μＬを０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加した。２０ｈ後、ＨＰＬＣで分析した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔを用いた多様な２ＦＴの２ＦＬ生産活性比較結果を図３に示した。
図３に示されているように、ＦｕｔＣに対比して同等または高い活性酵素３つを含んで、２ＦＬ生産酵素合計５つを確保した：Ａｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ＿３、およびＢｓ２ＦＴの場合、ＦｕｔＣに対比してそれぞれ１２２％、２０７％、８４％、１００％、２１％２ＦＬ生産様相をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。２ＦＬ生産酵素５種の配列を表５に示した。
実施例１で選別された酵素および対照群酵素３種の反応性を比較した。
比較するプラスミドをそれぞれＥ．ｃｏｌｉにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ後、３７℃で育てた。それぞれのｐｌａｔｅで３つのｃｏｌｏｎｙを接種してｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅを行った。ｓｅｅｄ ２００μＬを０．１ｍＭ ＩＰＴＧと１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加した。２０ｈ後、ＨＰＬＣで分析した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔを用いた多様な２ＦＴの２ＦＬ生産活性比較結果を図３に示した。
図３に示されているように、ＦｕｔＣに対比して同等または高い活性酵素３つを含んで、２ＦＬ生産酵素合計５つを確保した：Ａｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ、Ｂｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ＿３、およびＢｓ２ＦＴの場合、ＦｕｔＣに対比してそれぞれ１２２％、２０７％、８４％、１００％、２１％２ＦＬ生産様相をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。２ＦＬ生産酵素５種の配列を表５に示した。
実施例６．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株内フコース転移酵素を用いた２’－ＦＬ生産性比較
プラスミド製作および２’－フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ、２’－ＦＬ）の生産のために、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２を用いた。ｐＭＢＣプラスミドを構築するためにコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｍａｎＢ遺伝子を増幅した後、ｐＣＥＳ２０８プラスミドにこれを挿入させた。構築された前記プラスミドに再びコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｍａｎＣ遺伝子を増幅し、プラスミドにこれを後挿入させることによってｐＭＢＣを構築した。また、ｐＥＧＷプラスミドを構築するために大腸菌であるＫ－１２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｇｍｄ－ｗｃａＧ遺伝子クラスターを増幅した後、プラスミドに挿入させることによってｐＥＧＷを構築した。また、配列番号２のフコシル転移酵素を導入した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｈｏｓｔを用いる際、Ｂｍ２ＦＴとＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株を１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加して２ＦＬを生産し、培養６０時間が経過すると約１２０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。ｐＭＢＣとｐＥＧＷ空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産しなかった。
プラスミド製作および２’－フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ、２’－ＦＬ）の生産のために、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２を用いた。ｐＭＢＣプラスミドを構築するためにコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｍａｎＢ遺伝子を増幅した後、ｐＣＥＳ２０８プラスミドにこれを挿入させた。構築された前記プラスミドに再びコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｍａｎＣ遺伝子を増幅し、プラスミドにこれを後挿入させることによってｐＭＢＣを構築した。また、ｐＥＧＷプラスミドを構築するために大腸菌であるＫ－１２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｇｍｄ－ｗｃａＧ遺伝子クラスターを増幅した後、プラスミドに挿入させることによってｐＥＧＷを構築した。また、配列番号２のフコシル転移酵素を導入した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｈｏｓｔを用いる際、Ｂｍ２ＦＴとＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株を１０ｍＭ ｌａｃｔｏｓｅが添加された４ｍＬ培地に添加して２ＦＬを生産し、培養６０時間が経過すると約１２０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。ｐＭＢＣとｐＥＧＷ空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産しなかった。
実施例８．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ菌株内フコシル転移酵素を通じた２’－ＦＬ生産性比較
Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最もさらに多くの活性が増大されたＡｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ酵素をそれぞれＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１（韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）寄託番号４０４４１）ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２ＦＬ生産性を比較した。反応性の正確な確認のために、対照群としては２ＦＴ遺伝子が入っていない空ベクターｐ１５２５が挿入されたｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１を使用した。図４は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１ ｈｏｓｔを用いた多様な２ＦＬ生産性比較結果を示した図である。
図４に示されているように、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｈｏｓｔを用いる際、ｐ１５２５空ベクタ－を入れた菌株の場合、２ＦＬを生産せず、Ｂｍ２ＦＴとＦｕｔＣの場合、反応６４時間が経過するとそれぞれ平均４０．３ｍｇ／Ｌおよび１８．８ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。これによって、Ｂｍ２ＦＴ酵素がＦｕｔＣに対比して２．１倍以上の生産性増大を示すのを確認した。
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ菌株を使用して母乳オリゴ糖を生産した研究が現在まで報告されたことがなく、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１ ｈｏｓｔはｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １菌株であって人体に無害なので、本発明で確立されたＢｍ２ＦＴをＧＲＡＳ菌株に導入して既存酵素（ＦｕｃＴ）に対比して２倍以上の生産性を確立した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最もさらに多くの活性が増大されたＡｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ酵素をそれぞれＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１（韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）寄託番号４０４４１）ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２ＦＬ生産性を比較した。反応性の正確な確認のために、対照群としては２ＦＴ遺伝子が入っていない空ベクターｐ１５２５が挿入されたｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１を使用した。図４は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１ ｈｏｓｔを用いた多様な２ＦＬ生産性比較結果を示した図である。
図４に示されているように、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｈｏｓｔを用いる際、ｐ１５２５空ベクタ－を入れた菌株の場合、２ＦＬを生産せず、Ｂｍ２ＦＴとＦｕｔＣの場合、反応６４時間が経過するとそれぞれ平均４０．３ｍｇ／Ｌおよび１８．８ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。これによって、Ｂｍ２ＦＴ酵素がＦｕｔＣに対比して２．１倍以上の生産性増大を示すのを確認した。
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ菌株を使用して母乳オリゴ糖を生産した研究が現在まで報告されたことがなく、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ１４５８１ ｈｏｓｔはｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １菌株であって人体に無害なので、本発明で確立されたＢｍ２ＦＴをＧＲＡＳ菌株に導入して既存酵素（ＦｕｃＴ）に対比して２倍以上の生産性を確立した。
実施例９．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株内フコシル転移酵素を通じた２’－ＦＬ生産性比較
Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最も多く活性が増大したＢｍ２ＦＴ酵素をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２’－ＦＬ生産性を比較した。反応性の正確な確認のために、対照群として２’－ＦＴ遺伝子がクローニングされていない空ベクターｐＢＥ－Ｓが形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８（寄託番号：（ＡＴＣＣ（登録商標） ２３８５７TM））を使用した。使用したベクターはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ用のｐＢＥ－Ｓであり、常時発現が可能なａｐｒＥ ｐｒｏｍｏｔｅｒが挿入されている。ｃｌｏｎｉｎｇ時にはｓｅｃｒｅｔｉｏｎ機能が必要ないため、２’－ＦＴクローニングを行う時、ａｐｒＥ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅは除去した。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８はＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅを生産する４種の酵素を有していないため、一つのｖｅｃｔｏｒに４種の酵素をｅｎｃｏｄｉｎｇする遺伝子を一度にクローニングした。４種遺伝子（ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｍｄ、ｗｃａＧ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来でＰＣＲを通じて遺伝子増幅して確保した。４種の遺伝子を一度にクローニングするために使用したｖｅｃｔｏｒは、ｐ３ＳＴＯＰ１６２３－２ＲＢＳｈｐであってＥ．ｃｏｌｉ－Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒである。本ｖｅｃｔｏｒは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍだけでなくＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでも使用することができる。本Ｖｅｃｔｏｒの特徴としては、２つのＲＢＳを有していて多重遺伝子のクローニングが非常に容易である。本ｖｅｃｔｏｒのｐｒｏｍｏｔｅｒは、ｘｙｌｏｓｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒのＰｘｙｌＡである。ＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅは図５のような遺伝子順序で製作した。
Ｖｅｃｔｏｒと４種の遺伝子は、前述のＢｍ２ＦＴ ｃｌｏｎｉｎｇ時と同様にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ方法を適用して行った。但し、Ｖｅｃｔｏｒの大きさが約６．６Ｋｂであって、一度にＰＣＲするにはシークエンスエラーが発生することがあるので、Ｖｅｃｔｏｒ中間にｐｒｉｍｅｒを製作して半分に分けてＰＣＲを行った。総６つのＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓを精製するために、ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ全部を電気泳動してｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎした。精製して確保したＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓは、ＤＮＡ濃度を測定し、濃度とサイズに合わせて含量を調節してＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを行った。その後、同様にＥ．ｃｏｌｉに形質転換してｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙを確保した後、コロニーＰＣＲを通じてｐｌａｓｍｉｄの挿入を確認した。ＰＣＲ確認されたコロニーは、ＬＢに培養してｐｌａｓｍｉｄ抽出後、シークエンス分析を通じて４種の遺伝子が十分にｃｌｏｎｉｎｇされたことを確認した。シークエンスまで確認されたｐｌａｓｍｉｄは、生産性確認のためにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して確認した方法と同様にコロニーＰＣＲでｐｌａｓｍｉｄの挿入を確認した後、２’－ＦＬ生産性比較のために培養を行った。
図６に示されているように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｈｏｓｔを用いる時、ｐＢＥ－Ｓとｐ３ＳＴＯＰ１６２３－２ＲＢＳｈｐ空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産しなく、Ｂｍ２ＦＴとＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株の場合、反応６３時間が経過すると約１５０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。これは従来のＦｕｔＣの平均２ＦＬ生産量１８．８ｍｇ／Ｌに対比して約７倍以上に生産性が向上した結果である。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最も多く活性が増大したＢｍ２ＦＴ酵素をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２’－ＦＬ生産性を比較した。反応性の正確な確認のために、対照群として２’－ＦＴ遺伝子がクローニングされていない空ベクターｐＢＥ－Ｓが形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８（寄託番号：（ＡＴＣＣ（登録商標） ２３８５７TM））を使用した。使用したベクターはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ用のｐＢＥ－Ｓであり、常時発現が可能なａｐｒＥ ｐｒｏｍｏｔｅｒが挿入されている。ｃｌｏｎｉｎｇ時にはｓｅｃｒｅｔｉｏｎ機能が必要ないため、２’－ＦＴクローニングを行う時、ａｐｒＥ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅは除去した。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８はＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅを生産する４種の酵素を有していないため、一つのｖｅｃｔｏｒに４種の酵素をｅｎｃｏｄｉｎｇする遺伝子を一度にクローニングした。４種遺伝子（ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｍｄ、ｗｃａＧ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来でＰＣＲを通じて遺伝子増幅して確保した。４種の遺伝子を一度にクローニングするために使用したｖｅｃｔｏｒは、ｐ３ＳＴＯＰ１６２３－２ＲＢＳｈｐであってＥ．ｃｏｌｉ－Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒである。本ｖｅｃｔｏｒは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍだけでなくＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでも使用することができる。本Ｖｅｃｔｏｒの特徴としては、２つのＲＢＳを有していて多重遺伝子のクローニングが非常に容易である。本ｖｅｃｔｏｒのｐｒｏｍｏｔｅｒは、ｘｙｌｏｓｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒのＰｘｙｌＡである。ＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅは図５のような遺伝子順序で製作した。
Ｖｅｃｔｏｒと４種の遺伝子は、前述のＢｍ２ＦＴ ｃｌｏｎｉｎｇ時と同様にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ方法を適用して行った。但し、Ｖｅｃｔｏｒの大きさが約６．６Ｋｂであって、一度にＰＣＲするにはシークエンスエラーが発生することがあるので、Ｖｅｃｔｏｒ中間にｐｒｉｍｅｒを製作して半分に分けてＰＣＲを行った。総６つのＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓを精製するために、ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ全部を電気泳動してｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎした。精製して確保したＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓは、ＤＮＡ濃度を測定し、濃度とサイズに合わせて含量を調節してＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを行った。その後、同様にＥ．ｃｏｌｉに形質転換してｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙを確保した後、コロニーＰＣＲを通じてｐｌａｓｍｉｄの挿入を確認した。ＰＣＲ確認されたコロニーは、ＬＢに培養してｐｌａｓｍｉｄ抽出後、シークエンス分析を通じて４種の遺伝子が十分にｃｌｏｎｉｎｇされたことを確認した。シークエンスまで確認されたｐｌａｓｍｉｄは、生産性確認のためにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して確認した方法と同様にコロニーＰＣＲでｐｌａｓｍｉｄの挿入を確認した後、２’－ＦＬ生産性比較のために培養を行った。
図６に示されているように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｈｏｓｔを用いる時、ｐＢＥ－Ｓとｐ３ＳＴＯＰ１６２３－２ＲＢＳｈｐ空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産しなく、Ｂｍ２ＦＴとＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株の場合、反応６３時間が経過すると約１５０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。これは従来のＦｕｔＣの平均２ＦＬ生産量１８．８ｍｇ／Ｌに対比して約７倍以上に生産性が向上した結果である。
実施例１０．Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株内フコシル転移酵素を通じた２’－ＦＬ生産性比較
プラスミド製作および２’－フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ、２’－ＦＬ）の生産のために、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃを用いた。サッカロミセス・セレビシアエにないＧＤＰ－Ｌ－Ｆｕｃｏｓｅ遺伝子を大腸菌であるＫ－１２からクローニングして使用した。ｐＲＳＫ４２６プラスミドを構築するために、大腸菌であるＫ－１２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｇｍｄ－ｗｃａＧ遺伝子クラスターを増幅した後、プラスミドに挿入させることによってｐＲＳＫ４２６を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最もさらに多くの活性が増大されたＡｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ酵素をそれぞれＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２ＦＬ生産性を比較した。３種の組換えプラスミドは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃ菌株で形質転換後、Ｇ４１８抗生剤が含まれているＹＰＤ固体培地で選別した。選別された菌株は、Ｇ４１８抗生剤が含まれている５０ｍＬ液体生産培地で２日培養した後、２ＦＬ生産性をＨＰＬＣ分析して測定した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃ ｈｏｓｔを用いる際、ｐＲＳＫ４２６空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産せず、Ｂｍ２ＦＴ、Ａｍ２ＦＴ＿２とＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株の場合、培養４８時間が経過するとそれぞれ８０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。
プラスミド製作および２’－フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ、２’－ＦＬ）の生産のために、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃを用いた。サッカロミセス・セレビシアエにないＧＤＰ－Ｌ－Ｆｕｃｏｓｅ遺伝子を大腸菌であるＫ－１２からクローニングして使用した。ｐＲＳＫ４２６プラスミドを構築するために、大腸菌であるＫ－１２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから二つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ反応を通じてｇｍｄ－ｗｃａＧ遺伝子クラスターを増幅した後、プラスミドに挿入させることによってｐＲＳＫ４２６を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｏｓｔ使用時、ＦｕｔＣに対比して最もさらに多くの活性が増大されたＡｍ２ＦＴ＿２、Ｂｍ２ＦＴ酵素をそれぞれＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｈｏｓｔ内に形質転換して、それぞれの２ＦＬ生産性を比較した。３種の組換えプラスミドは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃ菌株で形質転換後、Ｇ４１８抗生剤が含まれているＹＰＤ固体培地で選別した。選別された菌株は、Ｇ４１８抗生剤が含まれている５０ｍＬ液体生産培地で２日培養した後、２ＦＬ生産性をＨＰＬＣ分析して測定した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ２－１ｃ ｈｏｓｔを用いる際、ｐＲＳＫ４２６空ベクターを入れた菌株の場合、２ＦＬを生産せず、Ｂｍ２ＦＴ、Ａｍ２ＦＴ＿２とＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ ｃａｓｓｅｔｔｅを導入した菌株の場合、培養４８時間が経過するとそれぞれ８０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌの２ＦＬが生産された。
Claims (11)
- 配列番号１～５からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換された、組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）微生物である、請求項１に記載の組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）微生物、または酵母（ｙｅａｓｔ）である、請求項１に記載の組換え微生物。
- 前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、またはバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であり、
前記コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり、
前記大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、
前記酵母（ｙｅａｓｔ）は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である、請求項３に記載の組換え微生物。 - 前記微生物は、組換え前に２’－フコシルラクトース生産能を有せず、組換えによって２’－フコシルラクトース生産能を有するものである、請求項１に記載の組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、フコース合成遺伝子を発現するものである、請求項１に記載の組換え微生物。
- 前記フコース合成遺伝子は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）、およびＧＴＰマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群より選択された１種以上を発現するものである、請求項６に記載の組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、ラクトース膜輸送タンパク質を発現するものである、請求項１に記載の組換え微生物。
- 前記ラクトース膜輸送タンパク質は、Ｌａｃ１２およびＬａｃＹからなる群より選択された１種以上である、請求項８に記載の組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｏｒｉ由来のα－１，２－フコース転移酵素を含む対照群に対比して、２倍以上の２’－フコシルラクトース生産性を有するものである、請求項１に記載の組換え微生物。
- ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）を含む培地で請求項１～１０のうちのいずれか一項による組換え微生物を培養する工程を含む、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｌｓｙｌａｃｔｏｓｅ）の生産方法。
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