CN116286923B - 核糖体结合序列的筛选及其在肌醇重组菌构建中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过构建RBS筛选库和高通量筛选方法，得到协调肌醇代谢通路关键基因的RBS序列，并用其构建了发酵生产肌醇的重组菌株。使得肌醇发酵菌株的产量获得极大提升，对肌醇生产具有重要的经济价值和科学研究价值。

Description

核糖体结合序列的筛选及其在肌醇重组菌构建中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种肌醇代谢途径的基因调控元件和肌醇生产菌种构建。
背景技术
肌醇是合成鲨肌醇、糖醛酸的前体，广泛分布在动物和植物体内，是动物和微生物的生长因子。肌醇有多个顺反异构体，天然存在的异构体为顺-1,2,3,5-反-4,6-环己六醇。有几种不同途径生产肌醇。一、在酸/碱性条件下水解肌醇六磷酸生产肌醇，缺点是酸/碱容易造成环境污染。二、以米糠、饼粕为原料生产肌醇，从米糠或麸皮中提取植酸钙，经过加压水解生产肌醇，缺点是生产效率低，生产设备要求高，易造成环境污染。三、体外四种酶级联反应生产肌醇，缺点是制备酶的成本高。首先，淀粉经过α-葡聚糖(或麦芽糖糊精)磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶催化得到葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，再经过肌醇-3-磷酸合酶(IPS)、肌醇单磷酸酶(IMP)级联催化得到肌醇，缺点是酶不稳定，酶的生产成本高。四、体外三酶催化生产肌醇，三酶分别是多聚磷酸葡萄糖激酶(PPGK)，肌醇-3-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶，缺点是产物分离提纯复杂，酶的生产成本高，酶不稳定。五、发酵法生成肌醇，葡萄糖作为起始原料，被磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，经过肌醇-3-磷酸合酶的环化和异构化作用生成肌醇-3-磷酸，再经过肌醇单磷酸化酶催化生成肌醇，主要挑战是在菌体生长和产物生成之间平衡葡萄糖-6-磷酸的代谢流。
根据文献和专利报道，发酵法生产肌醇主要是过表达ips(编码肌醇-1-磷酸合酶)、imp(编码肌醇单磷酸酶)和glpK(编码甘油激酶)，敲除竞争性代谢途径得到重组菌株。但是重组菌株中代谢通路经过改造后，改变了天然的代谢通路，需要对过表达的基因进行代谢调控，以适应新的代谢通路体系，从而提高肌醇生产效率，否则会导致转化率或产量偏低。例如在重组菌株发酵生产肌醇过程中，IPS表达量的不足会限制产物的合成，常用的基因表达量检测方法无法满足高通量筛选，因此提供高效的高通量筛选方法以便于协调重组菌改造过程中基因表达的调节，同时得到适于肌醇代谢调控的基因元件，构建协调性强的菌体代谢通路，得到转化效率提高的菌株，是肌醇发酵生产亟待解决的问题。
发明内容
本发明从调控基因表达的核糖体结合序列(RBS)入手，构建了核糖体结合序列的筛选库，得到了能够调控ips和imp基因表达的核糖体结合序列，构建了ips和imp基因的表达盒，应用于构建肌醇重组菌株，用于肌醇的发酵生产。
本发明的一个方面：构建了RBS筛选库，首先构建用于蓝白斑筛选的质粒，目标基因ips与lacZα通过设计的核苷酸碱基连接，翻译后的融合蛋白(IPS-LacZα)与基因组上LacZω片段结合可用于显色筛选。该质粒表达ips(编码肌醇-1-磷酸合酶)、imp(编码肌醇单磷酸酶)和glpK(编码甘油激酶)，将上述基因置于RBS调控之下。RBS库的建立是通过含有八个简并碱基的引物，以上述表达质粒为模板，通过PCR扩增进行建库，以敲除lacZα片段的宿主菌作为蓝白斑筛选的底盘菌株，将构建得到的RBS区域库转化到底盘菌株中，涂布至含有IPTG和X-Gal的平板上进行筛选。
本发明的另一个方面：构建了肌醇发酵的底盘菌株，该菌株的构建过程中进行了以下基因操作：
1)敲除了编码葡萄糖磷酸异构酶的pgi；
2)敲除了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf；
3)敲除了编码丙酮酸激酶的pykF或pykA；
4)转入了ips、imp、glpK基因。
本领域技术人员能够理解，可以用现有技术已知的方式进行基因敲除，使得所述酶的活性被降低或失活。所述的敲除操作针对的是出发微生物内源性的酶基因，使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。
本领域技术人员能够理解，丙酮酸激酶的国际酶学编号为EC2.7.1.40，又称磷酸丙酮酸激酶和丙酮酸磷酸转移酶。细菌中通常有两种丙酮酸激酶，即I型pykF丙酮酸激酶(PykF)和II型丙酮酸激酶(PykA)。而且该酶在同一有机体中存在多种同工酶，本领域技术人员能够明了，对其任一同工酶的基因敲除都会影响丙酮酸的进一步代谢。
本领域技术人员能够理解敲除pgi，zwf和pykF基因可以增加肌醇的积累，其同工酶基因的敲除将会具有相同或相似的效果。
本发明的另一个方面：将筛选到的RBS用于ips和imp的调控，并构建在肌醇发酵的生产菌株中，获得肌醇高产菌株。
基因可以单独表达也可以串联表达，在本申请的一个实施例中串联表达了ips基因、imp基因和glpK基因。ips基因与imp基因之间采用序列3所示的核苷酸序列进行连接。IPS与LacZα之间采用连接肽连接进行融合表达，连接肽的核苷酸序列如序列5所示，对应的氨基酸序列如序列4所示。
本发明过表达的基因可以以质粒的形式存在也可以整合到基因组中。可以对基因组上副产物相关一个或多个基因进行替换。
本发明在目标蛋白后通过短肽连接LacZα，因此可以通过蓝白斑筛选策略对靶基因表达量进行较准确的筛选。同时又将底盘菌株构建为△lacZα基因型，直接在底盘菌株中进行建库筛选，避免了基因元件筛选过程中与工业菌株构建后基因元件表现一致性差的问题。
本申请的实施例中公开了一种筛选基因核糖体结合序列的方法：包括构建缺失lacZα基因的菌株，建立核糖体结合序列库，将核糖体序列筛选库转入缺失lacZα基因的菌株，转化子接种到含有X-gal的培养基中，根据颜色变化进行核糖体结合序列的筛序，其特征在于核糖体结合序列库是将核糖体结合序列与目的基因进行重组构建目的基因表达盒，并将目的基因与lacZ基因融合，优选的核糖体结合序列的融合采用PCR方法，更优选的目的基因为肌醇生产关键基因肌醇-1-磷酸合酶基因(ips)和/或肌醇单磷酸酶基因(imp)。
依赖蓝白斑筛选策略优化RBS序列：蓝白斑筛选的原理是lacZα和lacZω两个无催化活性的片段，靠近结合成有β-半乳糖苷酶活性的酶，能够催化显色剂X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)分解得到蓝色物质(如图5所示)。IPS可溶性表达优化，在此将lacZα与目标蛋白融合表达，根据显色结果判断IPS蛋白的表达量。
在一个实施例中，本申请使用RBS区域的几种正向突变，在经过验证后获得了一株肌醇高产菌株OH-MI4。于2022年11月14日提交专利保藏，保藏号为CCTCC NO:M20221796，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW25113，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。经过发酵验证，使用含该序列的质粒明显提高了肌醇的产量，菌株OH-MI4经过96h补料发酵后产量达到53g/L。
附图说明
图1为：核糖体结合序列(RBS)蓝白斑筛选原理
图2为：p-IPS-lacZα-IMP-glpK图谱
图3为：核糖体结合序列(RBS)位置示意图
图4为：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7转化子发酵
图5为：OH-MI4、OH-MI5和OH-MI6发酵
图6a为：标样的液相图谱
图6b为：发酵液的液相图谱
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中DH5α是masterbio(https://www.masterbio.shop/)的产品，产品编号为TSC-C14。
下述实施例中内切酶DpnⅠ是NEB(http://www.neb-china.com/)的产品，货号为R0176V。
下述实施例中pTrc99a-Kan、pMal-c4X和pKD46质粒是miaolingbio(http://www.miaolingbio.com/)的产品，产品编号分别为P8575、P1362和P0098。
下述实施例中一步克隆和PCR所用的试剂盒为诺唯赞(Vazyme)的产品，产品编号分别为C112-01和P505-d1。
下述实施例中产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒为爱思进(Axygen)的产品，产品编号分别为AP-PCR-250和AP-GX-250G。
下述实施例中细菌基因组提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品编号为DP302。
下述实施例中抗生素和常规试剂均是生工生物工程(上海)股份有限公司(https://www.sangon.com/)的产品。
下述实施例中的外源基因密码子优化和合成，引物合成，测序工作由北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.)完成。
下述实施例中使用的质粒pOH5899由实验室构建保存。
本发明使用的引物如下表所示：
以大肠杆菌BW25113为出发菌株，采用两步同源重组的方法实施基因编辑，具体操作方法参考以下文献：Kaemwich,Jantama,Xueli,et al.Eliminating side products andincreasing succinate yields in engineered strains ofEscherichia coliC[J].Biotechnology&Bioengineering,2008(101)5：881-893。敲除葡萄糖异构酶基因pgi，敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，以减少肌醇前体物质葡萄糖-6-磷酸的消耗。敲除丙酮酸激酶基因pykF，以减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，提高葡萄糖磷酸转移系统(PTS)的效率。
实施例一、△pgi敲除盒与BW25113△pgi菌株的构建
1.1、△pgi敲除盒pgi-1和pgi-2的构建
1)以质粒pOH5899为模板，使用引物对Sp-pgi-cat-up/Sp-pgi-SacB-down进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，获得单一目的条带pgi-cat-SacB；
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水20μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
2)将上述单一目的条带pgi-cat-SacB纯化回收后，加入限制性内切酶DpnⅠ消化带甲基化的质粒模板，37℃，反应30分钟。
3)将消化模板后的片段pgi-cat-SacB纯化，测序验证，获得△pgi基因型的第一次重组片段pgi-1。
4)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物pgi-up-F和pgi-up-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pgi-up片段。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸0.5分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
5)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物pgi-down-F和pgi-down-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pgi-down片段。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸0.5分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
6)以pgi-up和pgi-down为模板，使用引物pgi-up-F和pgi-down-R进行重叠PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pgi-2片段。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
1.2、BW25113△pgi菌株构建
1)将底盘菌株BW25113制备成化学转化感受态，使用常规的制备方法，参照以下书籍：J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南[M].科学出版社,2002.。
2)将质粒pKD46转化到底盘菌株中，30℃，培养10-12h，挑取转化子接种至LB培养基，添加氨苄霉素和阿拉伯糖(终浓度分别为50mg/L，2g/L)。
3)将接种的菌株制备成电击转化感受态备用，在感受态培养过程中添加氨苄霉素和阿拉伯糖(终浓度分别为50mg/L，2g/L)。
4)将第一次重组片段pgi-1电击转化到感受态中，涂布至氯霉素和氨苄霉素的双抗性平板上，30℃，过夜培养。挑取转化子接种到LB培养基中，添加氨苄霉素、氯霉素和阿拉伯糖(终浓度分别为50mg/L，25mg/L，2g/L)用于制备电转感受态。
5)将转化子制备成电击转化感受态备用，在感受态培养过程中添加氨苄霉素、氯霉素和阿拉伯糖(终浓度分别为50mg/L，25mg/L，2g/L)。
6)将第二次重组片段pgi-2电击转化到感受态中，将孵育后的500uL菌液接种到30mL含有蔗糖培养基的三角瓶中，37℃，250rpm，培养18-24h。
7)经过培养后，三角瓶中有概率出现絮状沉淀，从摇瓶中取20uL划线到含蔗糖的平板上，37℃，过夜培养。次日挑取平板上的单克隆影印到LB平板、氯霉素抗性平板、氨苄霉素抗性平板。选择在LB平板上生长，在氯霉素抗性平板和氨苄抗性平板上不能生长的单克隆，使用引物pgi-VF和pgi-VR进行菌落PCR，扩增长度为1000bp的为阳性菌株。将PCR产物测序验证，获得BW25113△pgi菌株。
菌落PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
实施例二、△zwf敲除盒与BW25113△pgi△zwf菌株的构建
2.1△zwf敲除盒zwf-1和zwf-2的构建
1)以质粒pOH5899为模板，使用引物Sp-zwf-cat-up和Sp-zwf-SacB-down进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，获得单一目的条带zwf-cat-SacB。
2)将上述单一目的条带zwf-cat-SacB纯化回收后，使用DpnⅠ消化模板，37℃，反应30分钟。
3)将消化模板后的片段zwf-cat-SacB纯化，测序验证，获得△zwf基因型的第一次重组片段zwf-1。
4)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物zwf-up-F和zwf-up-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得zwf-up片段。
5)使用引物zwf-down-F和zwf-down-R，以大肠杆菌BW25113基因组为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得zwf-down片段。
6)使用引物zwf-up-F和zwf-down-R，以zwf-up和zwf-down为模板进行重叠PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得△zwf基因型的第二次重组片段zwf-2片段。
构建方法参考实施例一的1.1部分。
2.2BW25113△pgi△zwf菌株构建
将BW25113△pgi菌株制成感受态，电击转入第一次重组片段zwf-1，进行氯霉素抗性筛选，验证正确的转化子制成感受态，转入第二次重组片段zwf-2，验证正确的转化子命名为BW25113△pgi△zwf菌株。
转化筛选方法参考实施例一的1.2部分。
实施例三、△pykF敲除盒与BW25113△pgi△zwf△pykF菌株的构建
3.1△pykF敲除盒pykF-1和pykF-2的构建
1)以质粒pOH5899为模板，使用引物Sp-pykF-cat-up和Sp-pykF-SacB-down进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，获得单一目的条带pykF-cat-SacB；
2)将上述单一目的条带pykF-cat-SacB纯化回收，加入DpnⅠ消化模板质粒，37℃，反应30分钟。
3)将消化模板后的片段pykF-cat-SacB纯化，测序验证，获得
△pykF基因型的第一次重组片段pykF-1。
4)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物pykF-up-F和pykF-up-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pykF-up片段。
5)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物pykF-down-F和pykF-down-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pykF-down片段。
6)使用引物pykF-up-F和pykF-down-R，以pykF-up和pykF-down为模板进行重叠PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板，纯化回收，获得pykF-2片段。
构建方法参考实施例一的1.1部分。
3.2BW25113△pgi△zwf△pykF菌株的构建
将BW25113△pgi△zwf菌株制成感受态，电击转入第一次重组片段pykF-1，进行氯霉素抗性筛选，验证正确的转化子制成感受态，电击转入第二次重组片段pykF-2，筛选转化子，测序验证，获得BW25113△pgi△zwf△pykF菌株。
转化筛选方法参考实施例一的1.2部分。
实施例四、△lacZα表达盒的构建与RBS筛选菌株的构建
4.1lacZα敲除盒lacZ-1和lacZ-2的构建
1)以质粒pOH5899为模板，使用引物Sp-lacZ-cat-up和Sp-lacZ-SacB-down进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，获得单一目的条带lacZ-cat-SacB；
2)将上述单一目的条带lacZ-cat-SacB纯化回收，加入DpnⅠ消化模板，37℃，反应30分钟。
3)将消化模板后的片段lacZ-cat-SacB纯化测序验证，获得△lacZα基因型的第一次重组片段lacZ-1。
4)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物lacZ-up-F和lacZ-up-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，加入DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得片段lacZ-up。
5)以大肠杆菌BW25113基因组为模板，使用引物lacZ-down-F和lacZ-down-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，加入DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得片段lacZ-down。
6)使用引物lacZ-up-F和lacZ-down-R，以lacZ-up和lacZ-down为模板进行重叠PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，加入DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得第二次重组片段lacZ-2。
构建方法参考实施例一的1.1部分。
4.2RBS筛选菌株的构建
将实施例三获得的BW25113△pgi△zwf△pykF菌株制成感受态，电击转入第一次重组片段lacZ-1，进行氯霉素抗性筛选，验证正确的转化子制成感受态，电击转入第二次重组片段lacZ-2，筛选转化子，测序验证，获得RBS筛选菌株BW25113△pgi△zwf△pykF△lacZα。
转化筛选方法参考实施例一的1.2部分。
实施例五、p-IPS-IMP过表达质粒的合成
1)在NCBI网站上获得来自Trypanosoma brucei brucei TREU927的IPS基因序列(Gene ID:3662676)，来自Escherichia coli str.K-12substr.MG1655的IMP基因序列(Gene ID:915157)。
2)将序列提交给擎科生物公司进行大肠杆菌密码子偏好性优化，IPS基因优化后的序列如序列1所示，IMP基因优化后的序列如序列2所示。
3)密码子优化后的IPS、IMP基因进行人工合成，并连接到质粒pTrc-99a(Kan)上。两个基因之间使用RBS(如序列3所示)进行连接，获得质粒p-IPS-IMP。
实施例六、p-IPS-IMP-glpK质粒的构建
1)使用引物piig-pd-F和piig-pd-R，以大肠杆菌BW25113基因组为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得glpK片段。
2)使用引物piig-zt-F和piig-zt-R，以质粒pTrc-IPS-IMP为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得线性化的载体pTrc-IPS-IMP。
3)将线性化的载体pTrc-IPS-IMP和glpK片段通过一步克隆连接，所得重组质粒转化至大肠杆菌DH5α，所得转化菌液涂布在含卡那霉素抗性(终浓度50mg/L)的LB平板，37℃，过夜培养，挑取转化子用引物piig-yz-F和piig-yz-R验证，正确PCR产物条带大小为1000bp，PCR产物纯化测序，测序结果正确的转化子接种至含卡那霉素抗性(终浓度50mg/L)的LB液体培养基中培养，保菌，提取质粒，获得p-IPS-IMP-glpK质粒。
实施例七、p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒的构建
1)使用引物21027b-zt-F和21027b-zt-R，以p-IPS-IMP-glpK为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得线性化p-IPS-IMP-glpK载体。扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
2)使用引物176-pd-F和176-pd-R，以质粒pMal-c4X为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得lacZα片段。
3)线性化p-IPS-IMP-glpK载体与lacZα片段通过一步克隆连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布在含卡那霉素抗性(终浓度50mg/L)的LB平板，37℃，过夜培养，挑取转化子用引物21027b-yz-F和21027b-yz-R验证，正确PCR产物条带大小为1000bp，PCR产物测序，测序结果正确的转化子接种至含卡那霉素抗性(终浓度50mg/L)的LB培养基中培养，保菌，提取质粒，获得p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒。
实施例八、以p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒为模板构建RBS筛选库
1)在引物合成时可以增加提供的碱基种类来获得序列随机的引物库，如D(A、G、T)、B(G、C、T)、N(A、G、C、T)。使用该引物库对p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒进行扩增，对PCR产物进行纯化获得一个RBS区域突变的库p-IPS-lacZα-IMP-glpK*。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸8分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
2)p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒上基因的表达通过一个trc启动子、一个乳糖结合位点、一个RBS实现。基因元件的连接顺序为trc启动子，乳糖结合位点和RBS-IPS-lacZα-IMP-glpK。建库时保持trc启动子和乳糖结合位点不变，在组成RBS的20个碱基中，从第9位到13位是RBS中的保守区域，在此选择保守区域前8个碱基进行突变建库，如图3所示。
3)设计一对引物jk-F/ji-R建突变体库，正向引物jk-F的前半部分序列与trc启动子-乳糖结合位点的序列一致，中间序列是8个连续N的简并碱基(A、G、C、T)，后半部分序列是RBS保守区域，正向引物jk-F全序列是：GAATTGTGAGCGGATAACAANNNNNNNNAGGAAACAGACC。反向引物jk-R序列配对trc启动子-乳糖结合位区域的碱基。
4)使用引物jk-F和jk-R，以p-IPS-lacZα-IMP-glpK质粒为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnⅠ消化模板后纯化回收，获得p-IPS-lacZα-IMP-glpK的突变体库。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸8分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
实施例九、RBS的蓝白斑显色筛选
9.1、转化
1)将实施例四得到的BW25113△lacZα△pgi△zwf△pykF菌株制备成化学转化感受态。
2)将突变库p-IPS-lacZα-IMP-glpK*转化到BW25113△lacZα△pgi△zwf△pykF菌株中，涂布在含IPTG、X-Gal和卡那霉素(终浓度分别为0.5mM、40ug/ml、50mg/L)的LB平板上，37℃，过夜培养。
3)次日，平板上出现分布均匀的单菌落。
4)将平板倒置放入4℃冰箱，静置24h，观察显蓝色情况。
5)同时将质粒p-IPS-lacZα-IMP-glpK转化到BW25113△lacZα△pgi△zwf△pykF菌株中作为对照。
9.2、比色筛选
1)通过比色卡的方式对平板上的单菌落显色程度进行比较，最终筛选获得5个颜色较深的菌落
2)将5个颜色较深的菌落编号为M1、M2、M3、M4、M5，将原质粒p-IPS-lacZα-IMP-glpK的菌落作为对照编号为M6，将颜色较浅的菌落编号为M7。
3)将M1-M7菌株接种到试管后提取质粒，将质粒送测，使用引物RBS-seqF正向测序一个反应，M1-M7的RBS序列如下：
菌株 RBS名称 对应的RBS序列
M1 M1-RBS TCGTCGAG
M2 M2-RBS GCTTAAGG
M3 M3-RBS GCGTATCC
M4 M4-RBS CAGGACAC
M5 M5-RBS GCAGATGC
M6 M6-RBS TTTCACAC
M7 M7-RBS TCATTCGA
4)将以上菌株进行了β-Gal活力测定。测定方法参考(Wigley,W.,Stidham,R.,Smith,N.et al.Protein solubility and folding monitored in vivo by structuralcomplementation of a genetic marker protein.Nat Biotechnol 19,131-136(2001).https://doi.org/10.1038/84389)。
菌株 β-Gal活力(U/OD600)
1 M6(WT) 10.2
2 M1 42.2
3 M2 46.7
4 M3 52.3
5 M4 66.1
6 M5 60.2
8 M7 8.7
实施例十、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7转化子的发酵
1)将M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7菌株分别接种到含有卡那霉素(50mg/L)的10mL LB培养基的试管中，37℃培养8-10h。
2)将试管中的菌液转接到含有卡那霉素(50mg/L)的100mL LB摇瓶中，接种量为2％，37℃，培养8-10h。
3)将摇瓶中的菌液作为种子液接种到发酵罐中，接种量5％。37℃培养，当培养至10h时添加诱导剂IPTG，96h时结束发酵。
4)发酵罐中的初始培养基成分如下所示：
葡萄糖5-10g/L；甘油10-20g/L；磷酸二氢钾7g/L；七水硫酸镁2g/L；硫酸铵2-10g/L；酵母粉1-5g/L；柠檬酸2-8g/L；消泡剂PPE 0.5mL/L；微量元素母液1mL/L；加水定容至2L；
其中微量元素母液组成：称取FeCl3 5g，CoCl·6H2O 2.5g，MnCl2·4H2O0.15g，CuCl2·2H2O 1.5g，H3BO3 3g，NaMnO4·2H2O 2.5g，Zn(CH3COO)2·2H2O 13g，加水定容至1L。
补料培养基为葡萄糖与甘油混合液，比例为5:1。发酵过程中pH保持6.8，通气量1vvm，搅拌速率设定为500转/分钟，溶氧与补料关联，DO大于35％开始补料。
实施例十一、RBS优化肌醇高产菌株的构建
1、根据M4-RBS和M5-RBS序列设计了突变引物RBS4-F和RBS4-R、RBS5-F和RBS5-R。
2、以质粒p-IPS-IMP-glpK作为模板，使用引物RBS4-F和RBS4-R，RBS5-F和RBS5-R分别进行PCR扩增。将PCR产物使用DpnⅠ处理，纯化后获得质粒p4-iig和p5-iig。将质粒p4-iig、p5-iig和p-IPS-IMP-glpK化学转化到底盘菌株中，涂布至卡那霉素抗性(终浓度为50mg/L)的LB平板上，37℃，培养8-10h。
扩增体系为：2×Phanta Max Buffer缓冲液(Vazyme)25μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水19μl，总体积为50μl。
扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸8分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
3、将平板上获得的克隆使用引物piig-yz-F和piig-yz-R进行菌落PCR，正确PCR产物条带大小为1000bp。挑取正确的转化子接种到试管培养，提取质粒并测序，为了验证RBS区域是否已按预期完成突变，使用正向引物RBS-seqF测序一个反应，得到M4-RBS、M5-RBS和M6-RBS的重组菌株，对应的菌株命名为OH-MI4、OH-MI5和OH-MI6。
菌落PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、56℃退火15秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
将菌株OH-MI4、OH-MI5和OH-MI6按照实施例十中的发酵方法进行发酵验证。发酵结果如图4所示，菌株OH-MI4显示出良好的肌醇生产能力。菌株OH-MI4已于2022年11月14日提交专利保藏，保藏号为CCTCC NO:M20221796，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BW25113，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种核糖体结合序列，其具体为：
GAATTGTGAGCGGATAACAACAGGACACAGGAAACAGACC；或
GAATTGTGAGCGGATAACAAGCAGATGCAGGAAACAGACC。
2.权利要求1所述核糖体结合序列在构建肌醇生产重组大肠埃希氏菌中的应用。
3.一种构建肌醇生产重组大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，敲除选自以下基因组中的一个或多个，所述基因组包括葡萄糖磷酸异构酶基因，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因和丙酮酸激酶基因；插入肌醇-1-磷酸合酶基因ips、肌醇单磷酸酶基因imp和甘油激酶基因glpK，上述插入基因依次串联表达，其中，ips基因前含有权利要求1所述核糖体结合序列。
4.根据权利要求3所述方法得到的肌醇生产重组大肠埃希氏菌。
5.一种可以用于肌醇生产的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M20221796。
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