CN116814519B - 一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法和应用 - Google Patents

一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法和应用。本发明通过在大肠杆菌中过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因，建立肌醇合成途径；敲除葡萄糖‑6‑磷酸异构酶基因和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因，阻断竞争途径，增加肌醇合成途径碳通量供给；过表达葡萄糖转运和代谢的关键酶基因，提高葡萄糖利用能力，提高肌醇转化率；过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因，在大肠杆菌中建立蔗糖代谢途径，平衡细胞生长和肌醇合成间碳流量的分配，实现蔗糖到肌醇的高效生产。在优化的高密度发酵条件下，利用以蔗糖为碳源的发酵培养基生产肌醇，肌醇的最高产量达到166.4 g/L。

Description

一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法和应用。
背景技术
肌醇（myo-inositol）是环己烷的多元羟基衍生物，被称为环己六醇，是维生素B家族重要成员，广泛应用于食品、医药和饲料等领域。肌醇因其重要的理化性质及功能，市场的需求不断扩大，已在各个领域得到广泛应用。现阶段，肌醇的生产方法主要有植酸盐水解法、体外酶催化合成法以及微生物发酵法等。其中植酸盐水解法能耗高，污染大且产率低，而体外酶催化合成法需要分别制备多种催化酶，产品分离过程复杂、反应系统不稳定。微生物发酵法具有绿色可持续生产、生产投入成本低、微生物生产平台多样化等优点，因此被认为是一种可行且经济有效的肌醇生产方法，并得到了广泛的应用。利用微生物发酵法合成肌醇的主要难点是如何平衡细胞生长和肌醇合成之间碳流量分配。因此，建立碳源协同利用策略并优化代谢通路，平衡碳流量分配，进而提高肌醇产量的生产策略无疑极具吸引力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株。
本发明的再一目的是提供构建上述大肠杆菌工程菌株的方法。
本发明的再一目的是提供一种利用蔗糖发酵生产肌醇的方法。
根据本发明的利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株，所述工程菌株为突变型大肠杆菌菌株，其中，所述突变型大肠杆菌菌株包括过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因，并敲除了葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，过表达葡萄糖转运和代谢的关键酶基因，过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因，
其中，所述内源和外源肌醇合成关键酶基因分别为酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，
所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
所述葡萄糖转运和代谢的关键酶基因分别为运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因glf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，
所述蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因分别为大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因cscB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，大肠杆菌来源的蔗糖-6-磷酸水解酶基因cscA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，大肠杆菌来源的果糖激酶基因cscK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本发明的构建利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株的方法，包括以下步骤：
在大肠杆菌中过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因；
敲除大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf；
在大肠杆菌中过表达葡萄糖转运和代谢的关键酶基因；
在大肠杆菌中过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因；
其中，所述内源和外源肌醇合成关键酶基因分别为酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，
所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
所述葡萄糖转运和代谢的关键酶基因分别为运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因glf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，
所述过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因分别为大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因cscB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，大肠杆菌来源的蔗糖-6-磷酸水解酶基因cscA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，大肠杆菌来源的果糖激酶基因cscK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本申请的发酵生产肌醇的方法，包括如下步骤：使用上述的利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株，获得肌醇。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，所述蔗糖为碳源的培养基的配方为：蔗糖 10 g/L，木糖 10 g/L，KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L， EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，待初始培养基中的碳源完全消耗后，通过调控蠕动泵开始进行补料，严格控制发酵液中总糖浓度低于20 g/L，其中，所述补料的配方为：蔗糖 500 g/L，木糖15 g/L。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，发酵温度为37 ℃，pH控制在7.0，发酵132小时。
本申请的技术方案的优点：
1. 本发明通过利用游离质粒在底盘细胞内表达了肌醇合成途径的关键酶，在大肠杆菌中建立了肌醇合成途径；通过截断糖酵解途径和磷酸戊糖途径减少了肌醇合成前体葡萄糖-6-磷酸的分流，提高了突变型大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应；利用游离质粒在大肠杆菌中过表达了葡萄糖转运及代谢的关键酶，提高了工程菌株的葡萄糖利用能力；利用游离质粒在大肠杆菌中表达了蔗糖代谢的关键酶，赋予了底盘细胞高效代谢蔗糖的能力；在蔗糖为碳源的培养基中进行高密度发酵，肌醇的产量达到166.4 g/L。
2. 根据本申请的技术方案，在研究过程中旨在过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因（ScIPS）和大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因（EcIMP），建立肌醇合成途径，然而试验数据却表明，肌醇关键基因过表达的大肠杆菌工程菌株在发酵时仅检测到少量肌醇的积累。为了解决上述问题，根据本申请的技术方案，在上述突变型大肠杆菌中敲除了葡萄糖-6-磷酸异构酶基因（pgi）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（zwf），阻断糖酵解和磷酸戊糖途径，增加肌醇合成前体物葡萄糖-6-磷酸的供应，试验数据表明获得的工程菌株在发酵时检测到肌醇的产量显著提高。
3. 根据本申请的技术方案，为了进一步提高肌醇的合成效率，在上述突变型大肠杆菌中对葡萄糖利用系统进行优化，过表达大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因（glk）和运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因（glf），提高该工程菌株的葡萄糖利用能力，实现肌醇的高效生产。试验数据表明，过表达葡萄糖激酶基因（glk）和葡萄糖转运蛋白基因（glf）的工程菌株肌醇的产量进一步提高。
4. 目前大肠杆菌生产肌醇存在的主要问题为细胞生长和肌醇合成之间碳流量分配不平衡。根据本申请的技术方案，为了解决上述问题，在上述突变型大肠杆菌中过表达大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因（cscB）、蔗糖-6-磷酸水解酶基因（cscA）和果糖激酶基因（cscK），建立蔗糖代谢途径，蔗糖分解产生的葡萄糖和果糖分别用于供给肌醇合成和细胞生长，使生长代谢流和生产代谢流相分离，平衡二者间碳流量的分配，实现蔗糖到肌醇的高效生产。
阻断糖酵解和磷酸戊糖途径的工程菌株在以蔗糖为碳源的培养基中生长时会有较长的延滞期，影响肌醇的生产。根据本申请的技术方案，在发酵培养基及补料中添加适量的木糖可以显著提升菌株生长速率和肌醇合成量。所述发酵培养基成分调整为：蔗糖 10g/L，木糖 10 g/L，KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L， EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。补料的配方调整为：蔗糖 500 g/L，木糖15 g/L。其他发酵条件一致的情况下，工程菌株在发酵12 小时OD600便已达到31.3，最高OD600达到78。发酵108小时肌醇产量为132.8，发酵132小时肌醇产量为166.4 g/L
附图说明
图1显示本发明的构建利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株的方法；
图2为本发明实施例1提供的大肠杆菌工程菌株BW01的摇瓶发酵结果图；
图3为本发明实施例2提供的大肠杆菌工程菌株BW03的摇瓶发酵结果图；
图4为本发明实施例3提供的大肠杆菌工程菌株BW04的摇瓶发酵结果图；
图5为本发明实施例4提供的大肠杆菌工程菌株BW05的摇瓶发酵结果图；
图6为本发明实施例5提供的大肠杆菌工程菌株BW05的高密度发酵结果图；
图7为本发明实施例6提供的大肠杆菌工程菌株BW05在添加木糖后的高密度发酵结果图。
实施方式
实施例1 构建过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因的大肠杆菌工程菌株
如图1所示，葡萄糖被转运进入细胞后生成葡萄糖-6-磷酸，之后葡萄糖-6-磷酸经过肌醇-3-磷酸合酶和肌醇单磷酸酶的催化生成肌醇。因此，通过过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因在大肠杆菌中建立肌醇合成途径，实现肌醇的生产。具体步骤如下：
一、 构建肌醇合成质粒p01
利用启动子P J23100 调控酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS和大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP表达。将各基因的表达盒组装到质粒pRSFduet-1上，获得质粒pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP，命名为p01；具体构建方法如下：
PCR扩增酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS片段，通过琼脂糖凝胶电泳、回收纯化；再以纯化后的ScIPS片段为模板，扩增J23100-ScIPS片段，再次通过琼脂糖凝胶电泳、回收纯化。同样的方法PCR扩增大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP片段，获得J23100-EcIMP片段。将获得的片段与经酶切的pRSFduet-1载体进行连接，经热激转化至大肠杆菌Trans1中，37 ℃复苏30 min后涂布LB平板（含卡那霉素50 µg/mL），过夜培养，待生长出菌落后，筛选阳性克隆子，获得质粒pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP，命名为p01。
二、 构建工程菌株BW01
将质粒p01电穿孔转化导入大肠杆菌BW25113底盘细胞中并涂布LB培养基（卡那霉素50 µg/mL）固体平板，于37 ℃下培养16 h。筛选阳性克隆子，获得产肌醇的大肠杆菌工程菌株BW25113-pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP，命名为大肠杆菌BW01。具体构建方法如下：
1. 大肠杆菌BW25113电转化感受态制备
接种200 μL E. coli BW25113于40 mL LB培养基中，37 ℃过夜培养，转接200 μL菌液于200 mL LB培养基中，在温度为37 ℃，转速为200 rpm的摇床中培养至OD 600 达到0.8-1.0。将培养好的菌液在4 ℃，5,000 rpm的条件下离心菌液5 min，弃上清，保留菌体。用100mL预冷的无菌水重悬细胞，再次在4 ℃，5,000 rpm的条件下离心菌液5 min，弃上清，用50mL预冷的无菌水重悬细胞。如上离心，先后用100 mL、50 mL预冷的10%甘油重悬细胞。最后，4 ℃，5,000 rpm的条件下离心菌液5 min，弃上清，加入适量（一般为0.5-1 mL）预冷的10%甘油悬浮细胞，呈白色乳胶状，分装100 μL每支，-80 ℃冷冻保存。
2. 电穿孔转化及突变株筛选
吸取1 μL质粒p01加入感受态细胞中，轻弹混匀后，转入1 mm电转杯，使用电转仪电穿孔转化感受态细胞E.coli BW25113，随后加入200 μL无抗LB，37 ℃孵育1 h，涂布于LB平板（含卡那霉素50 µg/mL），倒置于37 ℃恒温培养箱，过夜培养。待生长出菌落后，使用无菌牙签挑取LB平板（含卡那霉素50 µg/mL）上的单克隆，先后置于装有500 μL LB（含卡那霉素50 µg/mL）的1.5 mL离心管和PCR预混液中，进行菌落PCR验证。接种阳性克隆子于40 mLLB（含卡那霉素50 µg/mL）培养基中，获得大肠杆菌工程菌株BW25113-pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP，命名为BW01。
三、 工程菌株BW01的发酵实验
将上述工程菌株BW01接种到40 mL LB（含有相应抗生素）培养基中，37 ℃、200rpm过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD 600 ，根据相应比例转接种于添加碳源的200 mL 发酵培养基中（1 L锥形瓶），使初始OD 600 约为0.2，在37 ℃、200 rpm条件下进行摇瓶发酵。其中所述发酵培养基成分为：KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L，葡萄糖 10 g/L，EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。每隔12 h取样，发酵共进行96 h，并用高效液相色谱的示差检测器测定肌醇的浓度。如图2所示，工程菌株BW01的发酵液中肌醇最高产量可达0.6 g/L。结果表明，通过过表达肌醇合成的关键基因ScIPS和EcIMP，成功在大肠杆菌中建立了肌醇合成途径，实现了肌醇的生产。
实施例2 通过阻断分支途径增加肌醇碳通量供给
肌醇合成的前体是葡萄糖-6-磷酸，同时葡萄糖-6-磷酸也可进入糖酵解和磷酸戊糖途径进行代谢，因此，阻断糖酵解和磷酸戊糖途径有助于提高肌醇合成途径葡萄糖-6-磷酸的供给。葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf是糖酵解和磷酸戊糖途径的关键基因，敲除以上两个基因可有效阻断糖酵解和磷酸戊糖途径，提高肌醇的合成效率。具体步骤如下：
一、 构建工程菌株BW02
利用实施例1中所示的电转化感受态制备方法，将CRISPR-associatedtransposases基因编辑工具质粒pTetQCas-BsaI、pRE57-Ter-PciI和pUC-gRNA-pgi+zwf采用电穿孔转化法转入E. coli BW25113菌株，加入200 μL无抗LB于37 ℃孵育1 h，涂布于含有三重抗生素氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）和链霉素（50 μg/mL）的LB平板，37 ℃过夜培养。待生长出菌落后，从平板上挑取数十个单菌落，接种于含有三种抗生素和100 ng/mL诱导剂（脱水四环素）的LB液体培养基中，诱导相关转座蛋白表达，37 ℃过夜诱导。使用无菌牙签蘸取诱导菌液，置于PCR预混液中，利用菌落PCR，验证基因pgi和zwf是否敲除。按10-4-10-6稀释比例稀释阳性克隆菌液，涂布于含有三种抗生素和诱导剂的LB平板，37 ℃倒置培养16 h，待其长出单克隆再次进行PCR验证，采用上述筛选和检测方法，通过琼脂糖凝胶电泳验证以及测序验证pgi和zwf是否被敲除，接种阳性克隆子于40 mL LB（含有三重抗生素）培养基中。
为了后续转入质粒，需先丢除已转入的基因编辑工具质粒，通过筛选、纯化后才能进行后续实验。接种阳性克隆子（含有基因编辑工具质粒）于40 mL无抗LB培养基中，并加入200 μL 10% SDS溶液，放置于45 ℃ 200 rpm摇床中传代培养。将多次传代的菌液按10-4-10-6稀释比例稀释，涂布于无抗LB平板，37 ℃过夜培养。待生长出菌落后，随机挑取无抗平板上的单菌落，分别点于无抗以及含有氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素的LB平板，每个平板上的单克隆一一对应，37 ℃过夜培养。对只在无抗LB平板生长的单菌落再次进行PCR验证，验证基因pgi和zwf是否敲除。接种阳性克隆子于40 mL无抗LB培养基中，获得大肠杆菌工程菌株BW25113-ΔpgiΔzwf，命名为BW02。
二、 构建工程菌株BW03
利用实施例1中所述的电转化感受态制备及突变株筛选方法，将工程菌株BW02制备为电转化感受态细胞，将构建好的质粒p01转化至感受态细胞BW02中，获得大肠杆菌工程菌株BW25113-ΔpgiΔzwf-pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP，命名为BW03。
三、 工程菌株BW03的发酵实验
利用实施例1中所述的发酵方法摇瓶发酵工程菌株BW03，其中所述发酵培养基成分为：KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L，果糖 5 g/L，葡萄糖 5 g/L，EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。每隔 12 h取样，发酵共进行96 h，并用高效液相色谱的示差检测器测定肌醇的浓度。如图3所示，工程菌株BW03的发酵液中肌醇最高产量可达1.44 g/L。结果表明，通过敲除糖酵解和磷酸戊糖途径的关键基因pgi和zwf，可有效阻断竞争途径，增加前体物的供应，提高肌醇的产量。
实施例3 通过优化葡萄糖利用系统进一步提高肌醇产量
通过实施例2证明阻断糖酵解和磷酸戊糖途径有助于提高肌醇合成途径葡萄糖-6-磷酸的供给，进而提高肌醇产量。因此，为了进一步提高葡萄糖-6-磷酸的供给，通过过表达葡萄糖转运及利用的关键基因，提高工程菌株对葡萄糖的利用能力，从而提高肌醇的合成效率，实现肌醇的高效生产。具体步骤如下：
一、 构建促进葡萄糖利用质粒p02
利用实施例1中所述的质粒构建方法，利用启动子P J23100 调控大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因glk和运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因glf表达。将各基因的表达盒组装到质粒pCDFduet-1上，获得质粒pCDFduet-1-glk-glf，命名为p02。
二、 构建工程菌株BW04
利用实施例1中所述的电转化感受态制备及突变株筛选方法，将工程菌株BW03制备为电转化感受态细胞，将构建好的质粒p02转化至感受态细胞BW03中，获得大肠杆菌工程菌株BW25113-ΔpgiΔzwf-pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP-pCDFduet-1-glk-glf，命名为BW04。
三、 工程菌株BW04的发酵实验
利用实施例2中所述的发酵培养基及方法摇瓶发酵工程菌株BW04，每隔 12 h取样，发酵共进行96 h，并用高效液相色谱的示差检测器测定肌醇的浓度。如图4所示，工程菌株BW04的发酵液中肌醇最高产量可达3.1 g/L。结果表明，通过过表达促进葡萄糖利用的关键基因glk和glf，显著提高了葡萄糖的利用率，进而提高了肌醇的转化率。
实施例4 构建蔗糖代谢途径平衡碳流量分配
大肠杆菌生产肌醇存在的主要问题为细胞生长和肌醇合成之间碳流量分配不平衡。为了解决上述问题，过表达蔗糖转运、分解及代谢的关键酶基因，在上述大肠杆菌工程菌株中建立蔗糖代谢途径，蔗糖分解产生的葡萄糖和果糖分别用于供给肌醇合成和细胞生长，使生长代谢流和生产代谢流相分离，平衡二者间碳流量的分配，提高肌醇的合成效率，实现蔗糖到肌醇的高效生产。具体步骤如下：
一、 构建蔗糖代谢质粒p03
利用实施例1中所述的质粒构建方法，利用启动子P J23100 调控大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因cscB、蔗糖-6-磷酸水解酶基因cscA和果糖激酶基因cscK表达。为了避免转入质粒过多对工程菌株代谢造成负担，将各基因的表达盒组装到质粒p02上，获得质粒pCDFduet-1-glk-glf+cscB-cscA-cscK，命名为p03。
二、 构建工程菌株BW05
利用实施例1中所述的电转化感受态制备及突变株筛选方法，将构建好的质粒p03转化至感受态细胞BW03中，获得大肠杆菌工程菌株BW25113-ΔpgiΔzwf-pRSFduet-1-ScIPS-EcIMP-pCDFduet-1-glk-glf+cscB-cscA-cscK，命名为BW05。
三、 工程菌株BW05的发酵实验
利用实施例2中所述的发酵方法摇瓶发酵工程菌株BW05，其中所述发酵培养基成分为：KH2PO4 13.3 g/L，（NH4）2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L，蔗糖 10 g/L，EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。每隔 12 h取样，发酵共进行96 h，并用高效液相色谱的示差检测器测定肌醇的浓度。如图5所示，工程菌株BW05的发酵液中肌醇最高产量可达4.8 g/L。结果表明，通过过表达蔗糖的关键基因cscB、cscA和cscK，在上述大肠杆菌工程菌株中建立了蔗糖代谢途径，平衡了细胞生长和肌醇合成间碳流量的分配，提高了肌醇的合成效率，实现蔗糖到肌醇的高效生产。
实施例5 高密度发酵提高肌醇产量
通过摇瓶发酵实验验证，构建得到了以蔗糖为底物高效生产肌醇的大肠杆菌工程菌株BW05，为了进一步探索在高密度发酵条件下工程菌株BW05生产肌醇的能力，对工程菌株BW05在10 L发酵罐中进行高密度发酵实验。
首先，将BW05菌株接种于40 mL LB（含有相应抗生素）培养基中，37 ℃，200 rpm过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD 600 ，根据相应比例转接种于200 mL LB培养基中（1 L锥形瓶），使初始OD 600 约为0.2，在37 ℃、200 rpm条件下过夜培养，作为二级种子液。将二级种子液全部接种到含有7 L发酵培养基的10 L发酵罐中，在pH设定为7.0，温度设定为37 ℃的条件下进行发酵。发酵培养基成分为：蔗糖 20 g/L，KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO44 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L， EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。待初始培养基中的碳源完全消耗后，通过调控蠕动泵开始进行补料，严格控制发酵液中总糖浓度低于20 g/L，补料的配方为蔗糖 500 g/L。发酵共进行108 h，期间定时取样，测定OD600以及发酵液中糖浓度并适量补充，维持糖不被完全消耗。最终，工程菌株BW05在高密度发酵条件下的生长、碳源消耗和肌醇生产如图6所示，工程菌株在前36小时生长较为缓慢，OD600仅为11，从36小时开始迅速生长，72小时达到最大OD600为55.6，发酵108 小时肌醇产量为104.7 g/L。结果表明，在高密度发酵条件下，菌株BW05的肌醇产量进一步提升，但也出现菌株前期生长缓慢的情况，影响了肌醇的生产效率。
实施例6 优化高密度发酵条件提高肌醇产量
由实施例5的高密度发酵实验得知，阻断糖酵解和磷酸戊糖途径的工程菌株在以蔗糖为碳源的培养基中生长时会有较长的延滞期，影响肌醇的生产。为了解决上述问题，在发酵培养基及补料中添加适量的木糖，以补充磷酸戊糖途径中对菌株生长有较大影响的中间产物，从而提高了工程菌株在蔗糖为碳源的培养基中的生长速度，实现了肌醇的高效合成。
利用实施例5中所述的高密度发酵方法发酵工程菌株BW05，其中所述发酵培养基包括：蔗糖 10 g/L，木糖 10 g/L，KH2PO4 13.3 g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L， EDTA·2Na 1.68 mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。补料的配方调整为：蔗糖 500 g/L，木糖15 g/L。最终，工程菌株BW05在优化的高密度发酵条件下的生长、碳源消耗和肌醇生产如图7所示，菌株BW05在发酵12 小时OD600便已达到31.3，最高OD600达到78。发酵108小时肌醇产量为132.8，发酵132小时肌醇产量为166.4 g/L。结果表明，添加木糖可以显著提升工程菌株BW05在高密度发酵条件下的生长和肌醇的生产。
表1本发明各实施例中采用的宿主列表
本发明实施例提供的上述生产肌醇的大肠杆菌通过以下方法提高肌醇的产量：
第一，过表达内源和外源的肌醇合成关键酶基因，在大肠杆菌中建立了肌醇合成途径，实现了肌醇的生产；第二，通过敲除葡萄糖-6-磷酸异构酶基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，阻断了糖酵解和磷酸戊糖途径，增加了肌醇合成前体物葡萄糖-6-磷酸供给；第三，过表达葡萄糖转运及利用的关键酶基因，提高工程菌株对葡萄糖的利用能力，从而提高肌醇的合成效率；第四，过表达蔗糖转运、分解及代谢的关键酶基因，在大肠杆菌中建立蔗糖代谢途径，蔗糖分解产生的葡萄糖和果糖分别用于供给肌醇合成和细胞生长，平衡二者间碳流量的分配，提高肌醇的合成效率，实现蔗糖到肌醇的高效生产。第五，在高密度发酵条件下，通过添加木糖提高了菌株的生长速率，提升了工程菌株的肌醇生产能力。
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为具有以下特征的突变型大肠杆菌工程菌株，
（1）过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因，其中，所述过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因分别为大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
（2）敲除葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，其中，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
（3）过表达葡萄糖转运和代谢的关键酶基因，其中，所述葡萄糖转运和代谢的关键酶基因分别为运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因glf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；以及
（4）过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因，其中，所述蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因为大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因cscB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，大肠杆菌来源的蔗糖水解酶基因cscA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，大肠杆菌来源的果糖激酶基因cscK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
2.一种构建利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在大肠杆菌中过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因，其中，所述过表达内源和外源肌醇合成关键酶基因分别为大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因EcIMP，其核苷酸序列如SEQID NO：2所示，酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因ScIPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
敲除大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，其中，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
在大肠杆菌中过表达葡萄糖转运和代谢的关键酶基因，其中，所述葡萄糖转运和代谢的关键酶基因分别为运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因glf，其核苷酸序列如SEQID NO：6所示，大肠杆菌来源的葡萄糖激酶基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；以及
在大肠杆菌中过表达蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因，其中，所述蔗糖转运、分解和代谢的关键酶基因为大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白基因cscB，其核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示，大肠杆菌来源的蔗糖水解酶基因cscA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，大肠杆菌来源的果糖激酶基因cscK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
3.一种发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株发酵生产肌醇的步骤。
4. 根据权利要求3所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，利用蔗糖为碳源的初始培养基进行发酵，其中，所述初始培养基的配方为：蔗糖 10 g/L，木糖 10 g/L，KH2PO4 13.3g/L，(NH4)2HPO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，一水合柠檬酸 1.7 g/L， EDTA·2Na 1.68mg/L，CoCl2·6H2O 0.5 mg/L，MnCl2·4H2O 3 mg/L，CuCl2·2H2O 0.3 mg/L，H3BO3 0.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 2.6 mg/L，柠檬酸铁 20 mg/L。
5. 根据权利要求3所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，待初始培养基中的碳源完全消耗后进行补料，控制发酵液中总糖浓度低于20 g/L，其中，所述补料的配方为：蔗糖500 g/L，木糖15 g/L。
6. 根据权利要求3所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，发酵温度为37 ℃，pH控制在7.0，发酵132小时。
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