CN114854659B - 一种麦角硫因生产工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种麦角硫因生产工艺及其应用，属于发酵工程领域。本发明对大肠杆菌出发菌株进行基因编辑制备得到底盘细胞，在底盘细胞中游离表达麦角硫因合成基因簇，经摇瓶发酵48h合成110mg/L的麦角硫因。本发明进一步成功构建麦角硫因生产菌株的高密度发酵的方法，通过将补料培养基的流速调节菌株生长的速度，溶氧控制实现了麦角硫因的高效合成，菌株菌株OD₆₀₀最终达到110，培养77h麦角硫因合成量达到了最高为7g/L。

Description

一种麦角硫因生产工艺及其应用

技术领域

本发明涉及一种麦角硫因生产工艺及其应用，属于发酵工程领域。

背景技术

麦角硫因是一种含硫的氨基酸衍生物，具有极强的抗氧化、抗辐射和抗衰老能力。麦角硫因目前主要应用于高端化妆品中，其生产方式主要为植物提取。根据目前报道，自然界中麦角硫因自身合成水平最高生物的如蘑菇、蕈菌等的含量约为100mg/g，因此植物提取麦角硫因的产生极为有限，也导致麦角硫因的价格居高不下，达到200-1000W/Kg，这些大大限制了麦角硫因的使用规模。

合成生物学旨在利用基因编辑技术赋予其他生物高效合成特定生物质的能力。通过对大肠杆菌自身改造及异源基因导入，我司已经获得了一株可以合成麦角硫因的菌株BWEGT-12。麦角硫因合成菌株的生产工艺及放大优化也是难点问题之一，在本研究中对菌株摇瓶全细胞催化合成麦角硫因的条件进行了优化，为发酵罐生产麦角硫因提供基础。继续在2L发酵罐上可对菌株的补料条件进行了优化，获得的最佳条件可以更高效的合成麦角硫因。

发明内容

本研究对菌株摇瓶全细胞催化合成麦角硫因的条件进行优化，探索不同碳源、转化温度、底物添加浓度对麦角硫因合成水平的影响，为菌株发酵罐大规模培养提供参考。并提供一种麦角硫因的纯化工艺。

本发明第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌游离表达麦角硫因合成基因组合RrEgtB和RrEgtC。

在本发明的一种实施方式中，所述RrEgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RrEgtC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌BW25113为出发菌株，增强基因组上HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达，抑制或降低基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述增强为将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为强启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述强启动子包括J23100启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS。

在本发明的一种实施方式中，所述HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的核苷酸序列的GeneBank号依次为：946521，946516，948126，947161，946883，948522，948542，947168，945389，948432。

在本发明的一种实施方式中，所述YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的核苷酸序列的GeneBank号依次为：916164，948221，947521，94843，949036，948656，946157。

本发明的第二个目的是提供一种高密度发酵生产麦角硫因的方法，所述方法具体步骤如下：

(1)菌体培养阶段：将重组菌的种子液接种于R培养基，通气量0.8～1.2L/min，培养温度为35～38℃，转速为400r/min，溶氧为100％。

(2)发酵过程控制：将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在20％以上，当葡萄糖耗尽，溶氧反弹，流加补料培养基，并通过补料速度调节菌体生长速度，当菌体OD₆₀₀小于10时保持每小时OD₆₀₀增加小于1，当OD₆₀₀为10至添加诱导剂之前均保持每小时OD₆₀₀增加量为2-3。

(3)合成麦角硫因：当OD₆₀₀达到30-40时，加入8～12mL 28～22％(m/v)诱导剂，诱导温度为28～32℃，补料速度减半，通气量维持在0.8～1.2L/min，转速降低至550～650r/min，同时加入底物。

在本发明的一种实施方式中，整个发酵过程中，控制pH值为6.8～7.2。

在本发明的一种实施方式中，通过流加2M氨水和2M HCl调节pH，使罐内的pH始终维持在6.8～7.2。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，将所述重组菌接种于100mL LB培养基，35～38℃，180～220rpm条件下过夜培养获得种子液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，向装液量50％的发酵罐中，以体积比5％的接种量接入种子液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，R培养基按g/L计：葡萄糖10，KH₂PO₄13.3，(NH₄)₂HPO₄4.0，MgSO₄·7H₂O 1.2，柠檬酸1.7，微量元素5mL。

在本发明的一种实施方式中，微量元素按mg/L计：EDTA 8.4，CoCl₂·6H₂O 2.5，MnCl₂·4H₂O 15.0，CuCl₂·2H₂O 1.5，H₃BO₃3.0，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5，Zn(CH₃COO)₂·2H₂O13.0，柠檬酸铁(Ⅲ)100，盐酸硫铵4.5。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，转速在400-800r/min范围内的自动调节，使溶解氧的浓度维持在20％以上。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，补料培养基按g/L计：甘油500，MgSO₄·7H₂O20。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，所述底物为15～25g甲硫氨酸、15～25g半胱氨酸和15～25g组氨酸。

本发明的第三个目的是提供一种摇瓶发酵生产麦角硫因的方法，所述方法为将上述麦角硫因生产菌株的种子液接种于培养基中进行初级培养后，调整培养条件进行麦角硫因的转化合成。

本发明的一种实施方式中，转化合成10～12h后补充碳源。

本发明的一种实施方式中，所述碳源为0.1～0.6mL 50％葡萄糖溶液。

本发明的一种实施方式中，初级培养的发酵条件为35～38℃，180～220rpm，培养10～15h。

本发明的一种实施方式中，转化合成的发酵条件为30～37℃，180～220rpm，培养10～12h。

本发明的一种实施方式中，所述培养基的组成为90～110ml氮源，1.5～2.5ml盐溶液，1.5～2.5ml碳源，150～250μL 1M MgSO₄，150～250μL微量元素。

本发明的一种实施方式中，所述氮源为终浓度0.8～1.2％胰蛋白胨和/或终浓度0.45～0.55％酵母提取物。

本发明的一种实施方式中，所述培养基底液盐溶液为1.25M Na₂HPO₄，1.25MKH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄。

本发明的一种实施方式中，所述碳源为25％甘油，2.5％葡萄糖。

本发明的一种实施方式中，所述微量元素为50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂MO₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

本发明还提供了所述高密度发酵生产麦角硫因的方法和摇瓶发酵生产麦角硫因的方法在食品、化妆品和医药领域中的应用。

本发明还提供了所述高密度发酵生产麦角硫因的方法和摇瓶发酵生产麦角硫因的方法在制备含有麦角硫因的产品中的应用。

附图说明

图1.WT菌株和BWEGT-12菌株摇瓶麦角硫因合成结果。

图2.添加不同浓度甘油和葡萄糖的摇瓶麦角硫因合成结果，A：以葡萄糖为碳源，B：以甘油为碳源。

图3.不同温度下菌株麦角硫因的合成结果。

图4.菌株2L发酵罐上麦角硫因的合成结果。

图5.麦角硫因纯化工艺流程图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：构建麦角硫因生产菌株

(1)选取黑根霉菌(Rhizopus stolonifer)来源的麦角硫因合成基因RsEGT1(genebank：RCH97401.1)和RsEGT2(genebank：RCI05990.1)，进行针对大肠杆菌密码子优化后，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的基因片段，进行DNA合成获得候选基因。

设计相关引物(表1)，以步骤(1)中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RsEGT1基因片段为模板，利用引物F1和R1，PCR扩增获得片段RsEGT1；以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的RsEGT2基因片段为模板，利用引物F2和R2，PCR扩增获得片段RsEGT2。以pBAD/HisA载体(北京江晨生物)为模板，利用引物pBAD-F和pBAD-R进行PCR扩增出线性pBAD载体。使用无缝拼接试剂盒(南京诺维赞)将RsEGT1和RsEGT2连接到线性pBAD载体上，并转化大肠杆菌Trans-T1，涂布于LB平板37℃过夜培养，挑取质粒进行测序，获得正确的质粒命名为：pBAD-RsEGT1-RsEGT2。

(2)选取耐辐射红色杆菌(Rubrobacter radiotolerans)来源的基因RrEgtB(NCBIReference Sequence为：WP_038682659.1)和基因RrEgtC(NCBI Reference Sequence：WP_003419806.1)两个麦角硫因合成酶做针对大肠杆菌密码子优化后，获得核苷酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的基因片段，进行DNA合成获得候选基因。

以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的RrEgtB基因片段为模板，利用引物F4和R4，PCR扩增获得片段RrEgtB；以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RrEgtC基因片段为模板，利用引物F5和R5，PCR扩增获得片段RrEgtC。以R3和pBAD-F为引物，以pBAD-RsEGT1-RsEGT2质粒为模板，进行PCR获得载体片段。片段RrEgtB、片段RrEgtC和载体片段使用无缝拼接试剂盒组装质粒，转化大肠杆菌Trans-T1，涂布于LB平板37℃过夜培养，挑取质粒进行测序，获得正确的质粒命名为：pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC。

表1相关引物

(3)利用CRISPR/CAS9基因编辑技术对大肠杆菌BW25113进行染色体编辑增强三项前体氨基酸和腺苷甲硫氨酸(SAM)的供给，本发明采用的基因编辑方法参照文献“Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System”进行。

(一)CRISPR/CAS9基因编辑技术：

1)DNA片段的制备：利用CRISPR/CAS9基因编辑技术进行基因敲除，设计引物对分别扩增目的基因的上下游同源臂各100-500bp，通过融合PCR将上下游片段融合获得DNA片段，经DNA胶回收或PCR产物纯化试剂盒回收。利用CRISPR/CAS9基因编辑技术进行基因插入则在扩增插入位点上下游同源臂的同时，扩增出目的基因，并用融合PCR的方片段融合获得DNA片段。

2)sgRNA的设计：利用CRISPR-ERA网站(crispr-era.stanford.edu)设计目标位点的sgRNA的靶向序列(20bp)，并设计引物利用无缝拼接将其整合到sgRNA表达质粒pTarget上。

表2 sgRNA

3)CRISPR电转化感受态的制备

a.从-80℃中取出目标菌种的热激感受态细胞，转化pCas质粒并涂布Kan抗性LB固体平板培养基，在30℃恒温培养箱中静置培养16-24h。

b.挑取单菌落，接种5ml LB液体培养基(Kan)，30℃，220rpm培养过夜。

c.挑取1ml培养液接种100ml LB液体培养基(Kan)，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀：0.3，加入1ml 20％阿拉伯糖诱导，继续培养至OD₆₀₀为1。

d.将菌液置于冰上30min，冰浴过后的菌液4000rpm，4℃，离心5min。

e.弃掉上清，每管细胞用50mL冰冷的10％甘油溶液轻柔重悬，4000rpm，4℃，离心5min.重复步骤5两次。

f.倒掉上清，加入0.4ml冰冷的10％甘油溶液轻柔重悬，分装入1mL ep管中，0.1mL/管，由于Cas9蛋白质特性，感受态要求即做即用。

4)CRISPR电击转化

a.在100μl电转化感受态中加入1000ng总量的DNA片段和200-400ng的pTarget质粒，用移液枪轻轻吹打混匀。

b.2mm电转杯冰上放置30min，混合物加入电转杯中，轻柔震击将其混匀，利用伯乐预设的大肠杆菌电转条件(2mm电转杯)直接电转。

c.在电击杯中加入0.5mL预热30℃LB液体无抗培养基，用移液枪轻轻吹打混匀，并转移到1.5mL灭菌的ep管中，30℃，200rpm培育2h。离心后收集全部菌体，培养液涂布于Kan与Spec双抗LB固体平板培养基。

d.正置30min待培养基干燥后，在30℃恒温培养中倒置培养16-24h。

5)CRISPR转化子验证与质粒丢失

a.挑取若干平板单菌落于5mL LB试管中(kan单抗)，30℃，220rpm培养5-12h。

b.使用PCR验证引物验证打靶结果.

c.转接菌体到新的LB液体无抗培养基，30℃，220rpm培养3小时至OD₆₀₀为0.3时加入IPTG诱导培养8h，pTarget质粒会在pCas质粒产生的sgRNA介导下消失。

d.转接菌体到新的LB液体无抗培养基，37℃，220rpm培养16-24h，pCas质粒属于温度敏感型质粒，在37℃下菌体会丢失该质粒。

e.取培养液稀释涂布无抗LB培养基上，在30℃恒温培养箱中静置培养16-24小时后，挑取平板上的单菌落分别点板Kan、Spec、无抗LB固体平板培养基各一块，在30℃恒温培养箱中静置培养24小时。在Spec和Kan抗性的平板上无法生长，只在无抗平板正常生长的菌落即是基因插入或敲除成功，并丢失了pCas和pTarget质粒的阳性克隆。

(二)目的基因的成功编辑

A,组氨酸代谢途径：针对组氨酸代谢途径，通过染色体定点交换，将组氨酸合成基因簇HisA，HisF的启动子替换为J23100启动子，序列为ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc(SEQ ID NO.5)；

B,半胱氨酸代谢途径：将半胱氨酸合成关键酶cysE和NrdH的启动子替换为J23100启动子，将cysP转运蛋白的启动子替换为J23100启动子来提高大肠杆菌对硫元素的摄入能力，同时敲除半胱氨酸的胞内降解基因YhaM，tnaA及敲除外泌蛋白TolC；

C,甲硫氨酸代谢途径：首先对甲硫氨酸合成途径中的反馈抑制因子metJ做敲除，解除其反馈抑制，敲除大肠杆菌胞内主要的甲硫氨酸消耗蛋白：mgl，外泌蛋白YjeH和YeaS，将metH蛋白的启动子替换为J23100启动子增强表达；

D，蛋氨酸循环和叶酸循环全途径：甲硫氨酸再胞内被转化为SAM从而为麦角硫因合成提供其必须的甲基供体，在上述增强甲硫氨酸自身供给基础上，将SAM循环涉及的mtn，lux，metK，叶酸循环中的metF的启动子替换为J23100启动子。

继续底盘改造完成后，获得底盘细胞并制备成感受态细胞，将步骤(2)中构建的pBAD-RsEGT1-RsEGT2-RrBC质粒化转法转入底盘细胞中，获得菌株命名为BWEGT-12。

实施例2：摇瓶发酵生产麦角硫因

首先在摇瓶中模拟发酵罐上生产方式，将麦角硫因生产菌株(BW25113菌株和BWEGT-12菌株)分别接种至5ml LB培养基试管中，37℃，200rpm条件下培养24h，获得种子液，将种子液按照1％(v/v)接种量接种至100ml自诱导培养基中(并含1g/L组氨酸、1g/L甲硫氨酸、1g/L半胱氨酸，5mL 20％(质量比)浓度阿拉伯糖)，在37℃，200rpm条件下培养12h后，将培养条件调整为转化温度30℃，转化转速为200rpm进行麦角硫因合成。30℃培养操作开始后，每间隔12h取样进行HPLC检测，同时补加0.4mL 50％葡萄糖溶液，直至麦角硫因合成水平平稳。检测结果如图1所示，麦角硫因合成水平在发酵进行至48h达到最高，产量为75mg/L。

自诱导培养基ZYM：100mLA+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度):

A.自诱导培养基底液：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂MO₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

实施例3：培养基碳源的优化

在摇瓶中，探索添加不同浓度葡萄糖、甘油时菌株麦角硫因合成水平的变化，为罐上补料提供信息。具体实施方法同实施例1，仅调整12h添加碳源的种类和添加量。将添加的碳源分为50％葡萄糖和50％甘油两种，添加量分别为0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL。结果如图2所示，添加甘油会获得比添加葡萄糖更好的效果，甘油的添加量达到0.4mL即达到最有效果，48h麦角硫因合成量达到了110mg/L。

实施例4：转化温度的优化

在确定麦角硫因转化时碳源的添加量和种类后，对转化过程中温度的影响进行了探索，具体实施方法同实施例1，补料时添加碳源为0.4ml 50％甘油，仅调整转化温度分别为25℃，30℃，35℃，37℃。

结果显示如图3所示，30℃时麦角硫因的合成水平高于25℃，但与35℃和37℃转化水平并无差异，因此转化时最佳温度确定为30℃。

实施例5：发酵罐发酵条件

经过前述摇瓶实验，确定麦角硫因的转化温度为30℃，转化时补加的碳源最佳为甘油，以此为依据进行菌株的2L发酵罐上的发酵操作。

发酵使用培养基为无机盐培养基配方如下：

A.R培养基(g/L)：葡萄糖10，KH₂PO₄13.3，(NH₄)₂HPO₄4.0，MgSO₄·7H₂O 1.2，柠檬酸1.7，微量元素5mL；

B.微量元素(mg/L)：EDTA 8.4，CoCl₂·6H₂O 2.5，MnCl₂·4H₂O 15.0，CuCl₂·2H₂O1.5，H₃BO₃3.0，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5，Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 13.0，柠檬酸铁(Ⅲ)100，盐酸硫铵4.5；

补料培养基(g/L)：甘油500，MgSO₄·7H₂O 20

具体操作流程如下：

将麦角硫因生产菌株(BWEGT-12菌株)接种至100ml LB培养基中，37℃，200rpm条件下过夜培养，获得种子液(OD₆₀₀约为3)。

使用2L四联发酵罐(上海宝兴生物设备工程有限公司)，加入R培养基1L，116℃灭菌30分钟，将种子液按照5％(v/v)接种量接种至R培养基，通气量1L/min，菌体培养阶段温度设为37℃，通过流加2M氨水和2M HCl控制培养基的pH值为7.0，接种前转速为400r/min，接种种子液前发酵罐溶氧设置为100％。接种后至诱导前将发酵罐转速与溶氧设为联动，通过转速在400-800r/min范围内的自动调节，使溶解氧的浓度维持在20％以上。当培养基中的葡萄糖消耗完，溶氧突然开始飙升时，开始流加补料培养基，通过补料速度的调节菌体生长速度：当菌体OD₆₀₀小于10时保持每小时OD₆₀₀增加小于1，当OD₆₀₀为10至添加诱导剂之前均保持每小时OD₆₀₀增加量为2-3。当菌体密度OD₆₀₀达到30-40时加入10mL20％(m/v)诱导剂阿拉伯糖同时将温度调为30℃，将补料速度减半，通气量维持在1L/min，转速降低至600r/min继续诱导，同时加入底物20g甲硫氨酸、20g半胱氨酸、20g组氨酸开始转化。最终结果如图4所示，培养77h麦角硫因合成量达到了最高为7g/L，菌株OD₆₀₀最终达到110。

实施例6：麦角硫因的分离纯化结晶

将发酵罐中的发酵液取出，进行麦角硫因的分离纯化(图5)，具体步骤如下：

(1)发酵液放料：发酵液加热至75℃，保温30min，随后降温至40℃，放料至料液桶内，将发酵液调整为pH 3，确保体系中杂蛋白和杂氨基酸最大限度的去除。

(2)陶瓷膜过滤：调完pH的发酵液进入陶瓷膜的物料循环系统，得到陶瓷膜清液，清液继续收集过超滤膜，浓液集中排放处理。

(3)超滤膜过滤：将陶瓷膜清夜加入超滤膜的物料循环系统，得到超滤膜清液，超滤膜清液进入脱盐系统，浓液集中排放处理。这里需要优化超滤膜的截留分子量，再保证膜通量的前提下尽可能的截留更多的杂质。

(4)脱盐系统：脱盐的工艺有很多，采用醇沉法、离交法和凝胶层析法，将超滤膜清液的电导率降至1000us/cm以下。

(5)脱色除杂：树脂离交层析法对料液进行脱色处理。

(6)结晶浓缩：采用旋蒸仪，80℃对麦角硫因料液进行旋蒸，观察至有白色晶体析出立刻停止。

(7)粗品离心：将降温好的物料，抽滤，漂洗，离心得粗品。

(8)重结晶精制：将粗品折干后，需按照一定浓度进行重新溶解，重新设定和优化结晶条件，通过精制拿到更加纯净的产品。

(9)成品离心：将冷却好的物料进行抽滤，离心，漂洗得到精制产品。

(10)干燥：进行真空干燥获得最终粉末。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司

<120> 一种麦角硫因生产工艺及其应用

<130> BAA220711A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcttcc gtgcaccttc cccgccgtcg actggttact ctatcgtgga tattcgtact 60

gcatccagcc tgtctactaa agaagacaac ggtattgata tcaaccgtcc gccaagccct 120

ccgcgttctt ccgacatctc cgaagacgca ttcaacgcgt ccgacctggc agacactatc 180

ctggactcgc tggataaacc gatcaaccag aaatctatcc caacgtacat cctgtacgac 240

aaacgcggtc tgcagctctt cgaccaaatc acgtatctcg acaatgaata ctatctgact 300

aacgcggaac tggatattct ggaacgtaag tctgatgagt ttgcggaccg tctgcaggac 360

ggcagcgtta tcttcgagct gggtgcgggt gcgctgcgca aaactcaggt aattctgcac 420

gcaatcgaaa aaaaaggcat tcacgtcacg tactatgcgc tggacctgga ccagcacgag 480

ctggaacgta gcctggctag cctgggtgaa ttccagtatg tacagctcta cggcctgctg 540

ggcacgtatg atcagggcat tccatggatc tctcaggaat tcacgtccaa aggcatccag 600

aaaaacttcc tgtggctggg ctcttctatc ggcaacgaca cgcgctgtca gagcgctgtc 660

ttcctggcgc gtctgcagcg tatgtgcgtt gagccaggcg atctgtgtgt tattggtttc 720

gataaacgta acgacccggc gaaaattgaa cgcgcatacg acgatagccg tggtgttact 780

cgtgaattca tcatgaacgg cctggatcat gtcaacctga tcatgggtca gaaagatttc 840

atcaaccgta accagtttgt gtacgactct acgtaccagg aaaagcaagg ccgtcacgta 900

gcacactatc gttctctggt agatactaaa attaatcatc aaagccgtga gatcaaaatt 960

cagaaagatg aactgatcca tgtagaatat tctcacaaat attctctggt tgagattgat 1020

agcatcctgt ctgccgccgg cctggacatg gtagactgct ggactgatac taaagaccag 1080

taccgcctcg tgctggccga aagccgtccg ttcaagttcg aacgtaacgt tgcgcgtgtt 1140

ctggaaactc tgtttgcgtc caaagaaacg attgactctg aaccgattaa ctgcagccat 1200

tgttctacaa acgaggacgt cgtgtcctcg gaactggaag ttgaagcact gaacctgatg 1260

ctgtcggaaa cgaaaatctg gccgacagaa tctctgccta ctgcaaaaga atggaaagaa 1320

ctgtgggcta gctgggatct ggttacgcag cacatgctga accacccgga tatgctcttc 1380

gaacgcccga ttgcactgcg tcacccgttt attttctacc tgggccacat cccgggtttc 1440

ctggacatcc agctgagccg tcaccaggta gataaggaac tgggtgaatc tagcctgacg 1500

aaaccagaag aattcgccga aatcttcgaa cgtggcatcg atccggatat ggatgacccg 1560

agccaatgtc accagcactc cgaagttccg actaacgata acgattggcc gagcgtcgaa 1620

tctatcatga cttaccagac taaaatccgt ggtcgtctgc tgcgtctgct gaaccactgg 1680

gaatcggaga gcctggccgc gcagaacatt tcttggatct ctctcaaacc ggaacgcaaa 1740

cgtcacgcac gtattatctg gatgtgcttt gaacacgaag cgatgcacct ggaaacgctg 1800

ctgtacatgc tgatgcagtc tccaaacaca ctgccgccta aaggcgtttc cattccgtcg 1860

tggaaactgt ctgtaaacca ggaaaacaac gtcgcaccac tgtccgacgc accgacgctg 1920

aagatcccgg cggccggcac tgcgatcctg ggtcgtaacg acagcgaagc gactgatctg 1980

gacccatctt ccaaggaagt tcaggttttc ggctgggata acgaatcccc tcaacgcatc 2040

atcgacaacg tttctagctt cgatatccag actcgcccag taactaacgg cgaatatctg 2100

gcgtacattc agcgtgcgaa cctgctgact attccggcgt cctggctgaa aaaagataac 2160

cagctgtatg tgcgcacggt tttcggtcct tgcccattcc aggtggcgca gaactggccg 2220

gtgcaggttt cgtacaacga agcatctggc tacgctaaag aaaaacatgc tcgcctgccg 2280

acggaagtag aactcgttcg cttccgtgaa tttgcgtctg tttccgacct gccaaaaaaa 2340

ctgctgaacg taggtttcaa ggactggact ccaactgcgg tgaataacga agagattcag 2400

tatctgggtg acaattggga atggactgac acgatgtggg acaaatacga aggcttccag 2460

acttccactg tctatccggg ctattcgact gatttctttg acggtaaaca tcgtgtagtt 2520

ctcggcggtt cgtgggcaac tcacccgcgt attgcagaac gtacgacttt ccgtaactgg 2580

tatcagtctg gttatcctta tgttttctct ggttttcgtc tgtgtttcta a 2631

<210> 2

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgactccga agccattcgg taagcagtac cgtgctgatt tcccgctgga agaaggttac 60

atccctatga actccggtgc tttcggttcg tttccgaaga aatttgttcc gctcattgag 120

aattacaacg aacagactga aaaacaaccg gatcgttggc tgcgcttcca agcgccggag 180

aaactgctga agtcgctgga aagcgcagct ccaattctcg gttgcgactc ctccgacatc 240

gttttcgcga acaactccac tacgggtgtc aataacattc tgcgctcttt tccgttccag 300

gaaggcgaca aaattctgtg ctatcagact gtttattcta attgcggcaa aactctggaa 360

ttcctggaga cttacaaaaa agtcaaactg gtgcgtgttc acctgaatta cccgatcgaa 420

gatgatgacg tggttcgtct gactcgtgaa gctattgaac gcgaacaggc aaaagatggt 480

actcacaaaa tcaaactgtg tctgctggat gcgatctcct ctctcccggg cgtttgtaag 540

ccgtatcagc gcctggtcaa gctgctgaaa gagtatgaca tcaaatccct ggtggacggt 600

gctcacgcta tcggtcagat tgagctgaac ctgcgtgaat gtgatccgga tttctttgtt 660

actaattgtc acaaatggct gttcacgccg cgcggctgcg ccattatgta cgtagcaaag 720

cgtaaccagg gcattgtgca cccgacttct attaattacg ctttccagta ccatgaagat 780

gcagctgatg gttcctcgtt ccgtgaagag cactacccgg gcgttatgta catgaacagc 840

tttctgatcc tggatgaatc catcaagtat cgtgaaagcc tgggcggtga aaaggcgatc 900

cgcgaatata ctcataagct ggcagtggaa ggcggtgagc tggtagcaaa aatgctcggc 960

acgcaggtta tggaaaattc tactaaaact ctgactgcgt ctatggtcaa cgtcgaactg 1020

ccgattccgt ccccggtctc cctgccggat tcccagattc cgaacttctt tatgaaaaag 1080

gctgtgtttg aacacaacac tgctctgact gtctacaaaa ataacgacaa atggtgggtc 1140

cgcctctgcg cacagatcta cctggacctg gacgatttca aggctactgg cgaagttctg 1200

ctgaaactga tcaaagaact ggaataa 1227

<210> 3

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatacta aacgccgtga aactgagcac ctgaaacgtg aaatcgtagc ccagctgaaa 60

gagggtcgtg aacgcactcg cctcctgctg gaaaacgtta gcgacgccga cctggcggcg 120

cagcacgacg agatcatgtc tcctctgatc tgggactacg gtcacatcgg caactacgaa 180

gagctgtggc tgctgaacga agcgtttggt aaaactctct ctgaccgtgc actgttcgac 240

gtctacgatg cgagcctgca cccgcgctct gaacgtccga gcctgaatac actggaccgc 300

ccagatgccg atcgttacct ggacgcagtt cgtgaggcag ctatctgtag cctggaagca 360

gccgatctgg acagcggcga actgctgcgt gacggtttcg tctataacat ggtactgctg 420

cacgaagccc aacataacga aacgatgctg cagactctgc agctgatgcc gtctggctac 480

cgccctgaag cgcgtgttga actgccggaa ggcaacccgc caggcggcgg tgaagagatg 540

aagcgtatcc cggccggcac gttcatcatg ggtactgacg acactgtctg ggcgctggac 600

aacgaacgtt ctgcacacga ggtttacgtc gaggaatttg aaattgacac tgtgccggtc 660

acgaaccgtg ctttcatgga atttgtggaa gacggcggtt atgaaaaacg cgaactgtgg 720

gacccagacg gctgggaatg gaaagtagat gagcatatcc acggtccgaa acactggtat 780

cagccagaac gccacacttg gtggacacag cgtttcggct tcgatgagcc ggttgacccg 840

gacgctccgg ttatgcatgt gtctttctac gaggctgagg catatgccca gtgggccggc 900

aaacgtctgc cgacggaagc agagtgggaa aaagctgcat cttgggaccc ggtgactgag 960

actaaacgtc tgttcccgtg gggcgatgaa gcgtggaatg gcacgcaagc aaatctggac 1020

caactggcat tccgtcctgc tcgcgtcggt gcttatccgg aaggcgcatc tgcatacggc 1080

gtcctgggca tgctgggtga cgtttgggaa tggacggata ctgacttcta cgcgtatcca 1140

ggtttccgtg cttttccgta tcgtgaatac tctgaggtat tcttcgatga cggttatgtt 1200

gtcctgcgtg gtggctcctt cgcgactcgc ccgcgcgcgg tgacgaacac gttccgcaac 1260

tgggattttc caatccgtcg ccagctgttc gtgggcttcc gttgcgcgcg ctaa 1314

<210> 4

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtgccgtc tgctggccta tctgggtact gcgccagccg cactgtctcg ttacgttttt 60

gaaccggacc atagcctgga agttcaggct tttgcaccgc gtgaaatgct gtctggcgtt 120

gttaatgctg atggtttcgg cgtaggttgg tatgccgaag acgatccgga accggcgctg 180

taccgctcgc tgtttccact gtggtctgat gcgacattcc gttctatcgc gccgcgtatt 240

aagtcccgcg cctacttcgc tgcactgcgt aacgcgactc ctccgctgcc gtctgaactg 300

agcgcggttc cgccgttcgc ttctggccgc tacctgttta tgcacaacgg cgcaatcgat 360

cgctttcgcg agactgcgat gcgcccgctg cgcgactctc tgtcggaggc tggttaccgt 420

gaagttactg gcgcatctga ctccgaaacg atctgtgcgt gtgtgatgga tcgtctgcgc 480

tccggtatgc cgccgaaggt cgctctgctg gacgcaactg ccttcgtcgc ggaagtgtgt 540

cagggccgtg gcgtccgcgc agccctcaat ctgggcctga gcgacggtga acgcctggtg 600

ttttctcgtt attccactga aggcccggct aacagcctgt attacctggc tgaagaaggc 660

gcagttatcg tatccagcga acgcctggat gcagatgagc gttggcgtga agtgccggaa 720

ggctccgtgc tgacagttga acgtgatctg actgtcatgg ttgaaggtat gccgctgtaa 780

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

Claims (3)

1.一种高密度发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：

（1）菌体培养阶段：将麦角硫因生产菌株的种子液接种于R培养基，通气量0.8~1.2 L/min，培养温度为35~38 ℃，转速为400 r/min，溶氧为100%；

（2）发酵过程控制：将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在20%以上，当葡萄糖耗尽，溶氧反弹，流加补料培养基，并通过补料速度调节菌体生长速度，当菌体OD₆₀₀小于10时保持每小时OD₆₀₀增加小于1，当OD₆₀₀为10至添加诱导剂之前均保持每小时OD₆₀₀增加量为2-3；

（3）合成麦角硫因：当OD₆₀₀达到30-40时，加入8~12 mL 28~22%(m/v)诱导剂，诱导温度为28~32℃，补料速度减半，通气量维持在0.8~1.2 L/min，转速降低至550~650 r/min，同时加入底物15~25 g甲硫氨酸、15~25 g半胱氨酸和15~25 g组氨酸；

所述麦角硫因生产菌株游离表达麦角硫因合成基因组合RrEgtB和RrEgtC，述RrEgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RrEgtC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述麦角硫因生产菌株以大肠杆菌BW25113为出发菌株，将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的J23100启动子，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS；

所述HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的核苷酸序列的GeneBank号依次为：946521，946516，948126，947161，946883，948522，948542，947168，945389，948432；

所述YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的核苷酸序列的GeneBank号依次为：916164，948221，947521，94843，949036，948656，946157；

所述发酵过程中，控制pH值为6.8~7.2；

所述步骤（1），向装液量50%的发酵罐中，以体积比5%的接种量接入种子液；

所述步骤（1），R培养基按g/L计：葡萄糖 10，KH₂PO₄ 13.3，(NH₄)₂HPO₄ 4.0，MgSO₄٠7H₂O1.2，柠檬酸 1.7，微量元素5 mL；微量元素按mg/L计：EDTA 8.4，CoCl₂·6H₂O 2.5，MnCl₂·4H₂O 15.0，CuCl₂·2H₂O 1.5，H₃BO₃ 3.0，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5，Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 13.0，柠檬酸铁（Ⅲ）100，盐酸硫铵 4.5；

所述步骤（2），补料培养基按g/L计：甘油 500，MgSO₄·7H₂O 20。

2.权利要求1所述高密度发酵生产麦角硫因的方法在食品、化妆品和医药领域中的应用。

3.权利要求1所述高密度发酵生产麦角硫因的方法在制备含有麦角硫因的产品中的应用。