CN112592875A - 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112592875A
CN112592875A CN202011461387.2A CN202011461387A CN112592875A CN 112592875 A CN112592875 A CN 112592875A CN 202011461387 A CN202011461387 A CN 202011461387A CN 112592875 A CN112592875 A CN 112592875A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
homoserine
strain
escherichia coli
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011461387.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112592875B (zh
Inventor
张娟
冯志彬
张洪霞
徐明志
杨进
耿子归
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Original Assignee
Ludong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludong University filed Critical Ludong University
Priority to CN202011461387.2A priority Critical patent/CN112592875B/zh
Publication of CN112592875A publication Critical patent/CN112592875A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112592875B publication Critical patent/CN112592875B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用，本发明通过阻断代谢途径中中间产物的分支途径，有效控制了代谢途径的流向；同时引入外源基因，在生产菌中引入新的途径，增加前体物草酰乙酸和天冬氨酸的含量；而且通过启动子替换使一些关键基因的表达水平提高，获得了高产L‑高丝氨酸的基因工程菌，丰富了L‑高丝氨酸的基因工程菌的来源，并且通过实验发现天冬氨酸的产量高52.3g/L，糖酸转化率达44.6％，和现有技术相比，产量和糖酸转化率得到明显的提高，具有一定的优势，更具有大规模生产的应用潜力。

Description

一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用。
背景技术
L-高丝氨酸又称2-氨基-4羟基丁酸，具有丰富的生物活性和保湿能力，是一种重要的化工中间体，广泛应用于各种活性物质的合成。目前国内外主要采用化学法、生物酶催化法和微生物发酵法生产L-高丝氨酸。化学法的主流方法采用L-蛋氨酸和碘甲烷为反应起始物，其反应过程复杂繁琐，而且碘甲烷毒性大，用量多，价格昂贵。生物酶催化法需要以丙酮酸和甲醛为底物，反应也存在成本高，毒性大，对环境不友好的缺点。微生物发酵法具有成本低，条件温和，环境友好的优势，是未来L-高丝氨酸工业化生产的趋势。
L-高丝氨酸是L-天冬氨酸家族氨基酸合成途径的一个重要中间产物，由于大肠杆菌染色体改造的分子生物学技术已经成熟，利用该方法有望获得高产L-高丝氨酸的、无需添加抗生素的稳定生产菌。公开号为CN 108504613 A的中国发明专利公开了一种高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用，该方法通过找到了一些不利于高丝氨酸合成的基因将其敲除，找到了一些有利于其合成的基因增强其表达，并且突变与代谢途径相关的几个基因，发明人在进一步的研究中发现，不利于或利于高丝氨酸合成的基因，不限于上述专利中所指出的基因，发明人还发现了其它基因，通过敲除、增强或代谢其基因得到新的高丝氨酸生产菌株。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株高丝氨酸生产菌ZFgs012(Escherichia coli)。
本发明提供的高丝氨酸生产菌ZFgs012，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期为2020年11月11日，保藏编号为CGMCC NO.21153，保藏地址为中国北京。
本发明的目的之二在于提供上述高丝氨酸生产菌的构建方法，具体包括：
A.敲除大肠杆菌W3110中不利于高丝氨酸合成的基因，获得基因敲除菌株；所述基因选自ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA、thrB中的一个或多个；
B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中有利于高丝氨酸合成的基因的表达，获得基因增强菌株；所述基因选自PEPC、AspA、metL的中的一个或多个；
C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入有利于高丝氨酸合成的外源基因，获得高丝氨酸生产菌ZFgs012，所述外源基因选自PC和/或AspDH。
优选地，步骤B中获得基因增强菌株采取启动子替换，替换的启动子来源于pGEX-4T1的Tac启动子，并突变lacI操纵子序列。
优选地，上述高丝氨酸生产菌的构建方法，具体包括如下步骤：
A.敲除大肠杆菌W3110中的基因ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA和thrB，获得基因敲除菌株；
B.增强在步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC、AspA和metL，使这些基因表达量增加，获得基因增强菌株；
C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入外源基因PC和AspDH，获得的高丝氨酸的生产菌。
本发明的目的之三在于提供上述高丝氨酸生产菌在高效生产高丝氨酸中的应用。
在上述应用中，利用上述基因工程生产菌直接发酵生产高丝氨酸，无需在培养基或发酵液中添加高丝氨酸的合成前体。在优选的实施方式中，培养基或发酵液中以葡萄糖为底物，不添加其他碳源。
具体的发酵培养方法为：
将高丝氨酸生产菌ZFgs012接入装有50ml种子培养基的500mL三角瓶中，置于摇床培养，转速为200r/min，温度37℃，培养12h；按5％的接种量接入5L装有发酵液的自控发酵罐中，初始转速200r/min，通气量0.4L/L·min，温度37℃，流加氨水控制pH值在7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低至1％(m/v)时，流加50％(m/v)葡萄糖并控制残糖浓度在1％(m/v)，发酵周期为48h。
优选地，所述种子培养基为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
优选地，所述发酵液组成如下：葡萄糖6％、NaCl 0.08％、硫酸铵1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.5％、KH2PO4 0.3％、MgSO4 0.1％、豆粕水解液1％、玉米浆2％、生物素100μg/L、烟酰胺5mg/L、腺苷1mg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-异亮氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L和L-赖氨酸0.1g/L，pH为7.0。
本发明具有如下优点：
本发明通过阻断代谢途径中中间产物的分支途径，有效控制了代谢途径的流向；同时引入外源基因，在生产菌中引入新的途径，增加前体物草酰乙酸和天冬氨酸的含量；而且通过启动子替换使一些关键基因的表达水平提高，获得了高产L-高丝氨酸的基因工程菌，和公开号为CN 108504613 A的中国发明专利相比，丰富了L-高丝氨酸的基因工程菌的来源，通过研究与之相关的其它基因，发现了新的基因，通过敲除或者增强表达的方式来得到一种新的高丝氨酸生产菌，并且通过实验发现天冬氨酸的产量高达52.3g/L，糖酸转化率达44.6％，与CN 108504613 A的中国发明专利相比，产量也得到明显的提高，具有一定的优势，更具有大规模生产的应用潜力。
具体实施方式
下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特殊说明，本发明所采用的各种材料和试剂均能通过商业方式获得。同样，所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
ldhA：乳酸脱氢酶
pflB：丙酮酸-甲酸裂解酶
adhE：乙醇脱氢酶
pta：磷酸转乙酰酶
gdh：谷氨酸脱氢酶
dapA：二氢吡啶二羧酸合酶(赖氨酸合成的关键酶)
metA：高丝氨酸琥珀酰转移酶
thrB：高丝氨酸激酶
PEPC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
AspA：天冬氨酸酶
metL：高丝氨酸脱氢酶
PC：丙酮酸羧化酶
CgPC：来自于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的丙酮酸羧化酶
AspDH：天冬氨酸脱氢酶
RpAspDH：来自于沼泽红假单孢杆菌(Rhodopseudomonas palustris)天冬氨酸脱氢酶
以上基因均能通过克隆和合成的方式获得。
大肠杆菌高丝氨酸的生产工程菌ZFgs012的构建方法，参考PoteeteAR和FentonAC报道的文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediated genereplacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)进行大肠杆菌基因组中基因的敲除、启动子代换、外源基因插入。
本发明在设计基因工程菌的构建方案中，根据大肠杆菌中高丝氨酸的代谢途径，在大肠杆菌W3110构建了一系列突变体，如基因ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA、thrB等的敲除，内源基因PEPC、AspA和metL的过表达，外源基因如PC和AspDH的插入。其中ldhA的敲除阻断了丙酮酸生产D-乳酸途径，pflB的敲除阻断了丙酮酸生产甲酸途径，这两个基因的敲除阻断了丙酮酸的流失；adhE的敲除阻断了乙酰辅酶A生成乙醇的途径，pta的敲除阻断了乙酰辅酶A生产磷酸乙酰进而合成乙酸的途径，这两个基因的敲除阻断了乙酰辅酶A的流失；gdh的敲除阻断了α-酮戊二酸生成谷氨酸的途径，阻断了三羧酸循环C的流失；dapA的敲除阻断了天冬氨酰半醛生成二氢吡啶-2，6-二羧酸，切断了赖氨酸的合成；metA的敲除阻断了高丝氨酸生成O-琥珀先高丝氨酸，切断了L-蛋氨酸的合成；thrB的敲除了阻断了高丝氨酸生成高丝氨酸磷酸，切断了L-苏氨酸的合成；大肠杆菌内源基因PEPC、AspA、metL通过启动子代换的方式增强表达，PEPC的增强表达增加了反应前体物草酰乙酸的产生，AspA的增强表达增加了反应前体物天冬氨酸的产生，metL的增强表达直接增加了高丝氨酸的生成；外源高活性基因引入到工程菌的染色体中，PC的引入增加了反应前体物草酰乙酸生产的产生，AspDH的引入增加了反应前体物天冬氨酸的产生。最后获得高丝氨酸生产的基因工程菌ZFgs012。
以下实施例中，所述卡那霉素的使用终浓度为50ng/μL。所述氨苄青霉素的使用终浓度为100ng/μL。所述氯霉素的使用终浓度为35ng/μL。
实施例1：pET28am质粒的构建
(1)突变Tac启动子的合成：根据来源于载体pGEX-4T1的Tac启动子，并突变lacI大肠杆菌脂蛋白基因启动子的序列信息，在序列两端加入来源于pET28a的同源臂序列，命名为Tacm(SEQ ID No.1：)，合成该序列，并序列两端加入Bgl II和Nco I的酶切位点。
(2)连接反应：利用Bgl II和Nco I同时对pET28a和Tacm片段进行酶切，然后利用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。
(3)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定获得启动子改变的载体质粒pET28am。
实施例2：敲除ldhA基因的菌株ZFgs001(ΔldhA)的制备。
(1)PCR扩增：以ldhA-kana-F(SEQ ID No.2)/ldhA-kana-R(SEQ ID No.3)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得ldhA-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入大肠杆菌W3110菌株制备的感受态细胞中(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例1(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将ldhA-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例1(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用ldhAUP(SEQ ID No.4)/ldhADown(SEQ ID No.5)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp；
(5)挑取实施例1(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用ldhAUP(SEQ ID No.4)/ldhADown(SEQ ID No.5)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例1(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明ldhA基因突变成功，得到ZFgs001(ΔldhA)菌株。
实施例3：敲除pflB基因的菌株ZFgs002(ΔldhAΔpflB)的制备。
(1)PCR扩增：以pflB-kana-F(SEQ ID No.6)/pflB-kana-R(SEQ ID No.7)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得pflB-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例1获得的ZFgs001菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例2(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将pflB-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例2(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25uF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用pflBUp(SEQ No.8)/pflBDown(SEQ No.9)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例2(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用pflBUp(SEQ ID No.8)/pflBDown(SEQ ID No.9)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例2(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明pflB基因突变成功，得到ZFgs002(ΔldhAΔpflB)菌株。
实施例4：敲除pta基因的菌株ZFgs003(ΔldhAΔpflBΔpta)的制备。
(1)PCR扩增：以pta-kana-F(SEQ ID No.10)/pta-kana-R(SEQ ID No.11)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得pta-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例2获得的ZFgs002菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例3(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将pta-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例3(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用ptaUp(SEQ ID No.12)/ptaDown(SEQ ID No.13)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例3(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用ptaUp(SEQ ID No.12)/ptaDown(SEQ ID No.13)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例3(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明pta基因突变成功，得到ZFgs003(ΔldhAΔpflBΔpta)菌株。
实施例5：敲除adhE基因的菌株ZFgs004(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhE)的制备。
(1)PCR扩增：以adhE-kana-F(SEQ ID No.14)/adhE-kana-R(SEQ ID No.15)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得adhE-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例3获得的ZFgs003菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例4(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将adhE-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例4(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用adhEUp(SEQ ID No.16)/adhEDown(SEQ ID No.17)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例4(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热激感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用adhEUp(SEQ ID No.16)/adhEDown(SEQ ID No.17)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例4(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明adhE基因突变成功，得到ZFgs004(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhE)菌株。
实施例6：敲除metA基因的菌株ZFgs005(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetA)的制备。
(1)PCR扩增：以metA-kana-F(SEQ ID No.18)/metA-kana-R(SEQ ID No.19)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得metA-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例4获得的ZFgs004菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例5(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将metA-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例5(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用metAUp(SEQ ID No.20)/metADown(SEQ ID No.21)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例5(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热激感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用metAUp(SEQ ID No.20)/metADown(SEQ ID No.21)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例5(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明metA基因突变成功，得到ZFgs005(△ldhA△pflB△pta△adhE△metA)菌株。
实施例7：敲除dapA基因的菌株ZFgs006(△ldhA△pflB△pta△adhE△metA△dapA)的制备。
(1)PCR扩增：以dapA-kana-F(SEQ ID No.22)/dapA-kana-R(SEQ ID No.23)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得dapA-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例5获得的ZFgs005菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例6(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8):2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将dapA-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例6(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用dapAUp(SEQ ID No.24)/dapADown(SEQ ID No.25)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例6(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热激感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用dapAUp(SEQ ID No.24)/dapADown(SEQ ID No.25)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例6(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明dapA基因突变成功，得到ZFgs006(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapA)菌株。
实施例8：敲除thrB基因的菌株ZFgs007(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrB)的制备。
(1)PCR扩增：以thrB-kana-F(SEQ ID No.26)/thrB-kana-R(SEQ ID No.27)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得thrB-Kana片段，约1600bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例6获得的ZFgs006菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例7(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将metA-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例7(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用thrBUp(SEQ ID No.28)/thrBDown(SEQ ID No.29)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1600bp。
(5)挑取实施例7(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热激感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用thmUp(SEQ ID No.28)/thrBDown(SEQ ID No.29)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为100bp。
(6)挑取实施例7(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明thrB基因突变成功，得到ZFgs007(ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrB)菌株。
实施例9：pET28am-Kana质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。pET28am为本实验室在pET28a基础上进行启动子替换改造，无需添加IPTG或乳糖进行诱导，下游基因可高效表达。基因表达的测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。本实施例中，来源于质粒pKD4的Kana片段插入pET28am载体的突变启动子上游。
(4)PCR扩增：以28amF1(SEQ ID No.30)/28amR1(SEQ ID No.31)为引物，以pET28am为模板，PCR扩增获得pET28am1片段，约5300bp，胶回收。以28am-Kana-F1(SEQ IDNo.32)/28am-Kana-R1(SEQ ID No.33)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得28am1-Kana片段，约1600bp，胶回收。
(5)重组反应：利用DpnI对胶回收的pET28am1片段进行处理，消除可能混入的pET28am质粒，然后利用一步法定向无缝克隆试剂盒将该处理过的pET28am1片段与实施例8(1)获得的回收片段28am1-Kana片段进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。
(6)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定获得在质粒pET28am突变启动子上游插入Kana片段的载体质粒pET28am-Kana。
实施例10：替换PEPC基因启动子的菌株ZFgs008(PpET28am：PEPC，Δ1dhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrB)的制备。
(1)PCR扩增：以Ppepc-Kana-F(SEQ ID No.34)/Ppepc-PpET28am-R(SEQ IDNo.35)为引物，以质粒pET28am-Kana为模板，PCR扩增获得Ppepc-Kana-PpET28am片段，约1700bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例8获得的ZFgs007菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例9(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将Ppepc-Kana-PpET28am抗性盒片段电击转化进入实施例9(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用PpepcUp(SEQ ID No.36)/PpepcDown(SEQ ID No.37)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1700bp。
(5)挑取实施例9(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PpepcUp(SEQ ID No.36)/PpepcDown(SEQ ID No.37)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为200bp。
(6)挑取实施例9(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因PEPC的启动子被pET28am突变载体的启动子替换，得到ZFgs008(PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrB)菌株。
实施例11：替换AspA基因启动子的菌株ZFgs009(PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdhdpsΔthrB)的制备。
(1)PCR扩增：以PaspA-Kana-F(SEQ ID No.38)/PaspA-PpET28am-R(SEQ IDNo.39)为引物，以质粒pET28am-Kana为模板，PCR扩增获得PaspA-Kana-PpET28am片段，约1700bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例9获得的ZFgs008菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例10(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements ofphage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PaspA-Kana-PpET28am抗性盒片段电击转化进入实施例10(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用PaspAUp(SEQ ID No.40)/PaspADown(SEQ ID No.41)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1700bp。
(5)挑取实施例10(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PaspAUp(SEQ ID No.40)/PaspADown(SEQ ID No.41)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为200bp。
(6)挑取实施例10(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因AspA的启动子被pET28am突变载体的启动子替换，得到ZFgs009(PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，Δ1dhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrB)菌株。
实施例12：替换metL基因启动子的菌株ZFgs010(PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapA ΔthrB)的制备。
(1)PCR扩增：以PmetL-Kana-F(SEQ ID No.42)/PmetL-PpET28am-R(SEQ IDNo.43)为引物，以质粒pET28am-Kana为模板，PCR扩增获得PhdhA-Kana-PpET28am片段，约1700bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例10获得的ZFgs009菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例11(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements ofphage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将Phdh-Kana-PpET28am抗性盒片段电击转化进入实施例11(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用PmetLUp(SEQ ID No.44)/PmetLDown(SEQ ID No.45)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为1700bp。
(5)挑取实施例11(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PmetLUp(SEQ ID No.44)/PmetLDown(SEQ ID No.45)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为200bp。
(6)挑取实施例11(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因HDH的启动子被pET28am突变载体的启动子替换，得到ZFgs010(PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，Δ1dhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapA ΔthrB)菌株。
实施例13：pET28am-gene质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。pET28am为本实验室在pET28a基础上进行的插入基因启动子的改造，无需添加IPTG或乳糖进行诱导，下游基因可高效表达。基因表达的测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。此处所指的gene为外源基因AspDH和PC。
(1)全基因合成：根据来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因PC(AF038548.1)的序列(SEQ ID No.46)，全基因合成该基因，并命名为CgPC，并在序列两端加入NdeI和XhoI的酶切位点；根据来源于(Rhodopseudomonas palustris)的基因AspDH(CP000250.1)的序列(SEQ ID No.47)，全基因合成该基因，并命名为RpAspDH，并在序列两端加入NdeI和XhoI的酶切位点。
(2)将实施例12(1)中获得的基因分别用NdeI/XhoI双酶切，胶回收的基因片段，分别与经过同样双酶切的质粒pET28am的酶切片段进行连接，连接产物经过转化、菌落PCR鉴定、测序鉴定后获得三个质粒载体pET28am-CgPC、pET28am-RpAspDH。
实施例14：pET28am-gene-Kana质粒的制备
本实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。测序反应在华大公司测序，但不局限于此公司。pET28am为本实验室在pET28a基础上进行的插入基因启动子的改造，无需添加IPTG或乳糖进行诱导，下游基因可高效表达。本实施例中，来源于质粒pKD4的Kana片段分别插入实施例12中获得的pET28am-gene载体的T7终止子下游。此处所指的gene为外源基因CgPC和RpAspDH。
(1)PCR扩增：以28amF2(SEQ ID No.48)/28amR2(SEQ ID No.49)为引物，分别以实施例13中获得的两个质粒载体pET28am-CgPC、pET28am-RpAspDH为模板，PCR扩增获得pET28am-CgPC片段(约8806bp)、pET28am-RpAspDH片段(约6130bp)，胶回收。以28am-Kana-F2(SEQ ID No.50)/28am-Kana-R2(SEQ ID No.51)为引物，以质粒pKD4为模板，PCR扩增获得28am2-Kana片段，约1600bp，胶回收。
(2)重组反应：利用DpnI分别对胶回收的pET28am-CgPC片段和pET28am-RpAspDH片段进行处理，消除可能混入的质粒，然后利用一步法定向无缝克隆试剂盒分别将该处理过的pET28am-CgPC片段和pET28am-RpAspDH片段与实施例13中(1)获得的回收片段28am2-Kana片段进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。
(3)测序鉴定：阳性克隆送测序公司进行测序，确定获得在质粒pET28am-geneT7终止子下游Kana片段的载体质粒pET28am-gene-Kana。此处的基因分别是RpAspDH、CgPC，获得pET28am-RpAspDH-Kana和pET28am-CgPC-Kana质粒。
实施例15：插入PC基因的菌株ZFgs011(PpET28am：CgPC，PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapA ΔthrB)的制备。
(1)PCR扩增：以PEPCD-PpET28am-F(SEQ ID No.52)/PEPCD-Kana-R(SEQ IDNo.53)为引物，以质粒pET28am-CgPC-Kana为模板，PCR扩增获得PpET28am-CgPC-Kana片段，约5000bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例12获得的ZFgs010菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例14(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PpET28am-CgPC-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例14(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用PEPCDUp(SEQ ID No.54)/PEPCDDown(SEQ ID No.55)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为5000bp。
(5)挑取实施例14(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用PEPCDUp(SEQ ID No.54)/PEPCDDown(SEQ ID No.55)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为3500bp。
(6)挑取实施例14(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因CgPC已经插入到菌株ZF007的染色体中，得到ZFgs011(PpET28am：CgPC，PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapA ΔthrB)菌株。
实施例16：插入AspDH基因的菌株ZFgs012(PpET28am：RpAspDH，PpET28am：CgPC，PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdapAΔthrBΔgdh)的制备。
(1)PCR扩增：以gdh-PpET28am-F(SEQ ID No.56)/gdh-Kana-R(SEQ ID No.57)为引物，以质粒pET28am-PaeAspDH-Kana为模板，PCR扩增获得PpET28am-RpAspDH-Kana片段，约2400bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将质粒pKD46转化入实施例14得的ZFgs011菌株制备的感受态细胞(热激感受态细胞的制备和质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》)，获得含有pKD46的大肠杆菌细胞。
(3)挑取实施例15(2)中获得的大肠杆菌细胞的单菌落，在含有氨苄青霉素的三角瓶中培养，28℃，200r/min培养至菌液浓度为OD600达到0.3左右加入10mM的阿拉伯糖进行诱导至OD600达到0.4，参照文献(Genetic requirements of phage lambda red-mediatedgene replacement in Escherichia coli K-12.J Bacteriol，2000，182(8)：2336-2340)收集菌体，制备电击感受态细胞。
(4)将PpET28am-RpAspDH-Kana抗性盒片段电击转化进入实施例15(3)中获得的感受态细胞。电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF，转化完成后涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，长出的单菌落利用gdhUp(SEQ ID No.58)/gdhDown(SEQ ID No.59)引物进行菌落PCR验证，阳性片段约为2400bp。
(5)挑取实施例15(4)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转接培养至OD600达到0.3-0.4，参照《分子克隆实验指南》制备热击感受态细胞，并将质粒pCP20转入。转化完成后涂布于含有氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养，次日挑取单克隆利用gdhUp(SEQ ID No.58)/gdhDown(SEQ ID No.59)引物进行菌落PCR验证，阳性片段长度为900bp。
(6)挑取实施例15(5)中获得的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后稀释后涂布于LB平板上，次日挑取单菌落分别接种于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，若都不能生长，表明基因RpAspDH已经插入到菌株ZFgs008的染色体中，得到ZFgs012(PpET28am：RpAspDH，PpET28am：CgPC，PpET28am：metL，PpET28am：AspA，PpET28am：PEPC，ΔldhAΔpflBΔptaΔadhEΔmetAΔdhdpsΔthrBΔgdh)菌株。
实施例17：应用：利用高丝氨酸生产菌发酵生产高丝氨酸
将构建的高丝氨酸基因工程菌ZFgs012接入装有50ml种子培养基的500mL三角瓶中，置于摇床培养，转速为200r/min，温度37℃，培养12h。按5％的接种量接入5L自控发酵罐，初始转速200r/min，通气量0.4L/L·min，温度37℃，流加氨水控制pH值在7.0左右，待发酵液中葡萄糖浓度降低至1％(m/v)时，流加50％(m/v)葡萄糖并控制残糖浓度在1％(m/v)左右，发酵周期48h。发酵结束后，利用HPLC测定发酵液上清中的高丝氨酸含量为52.3g/L，糖酸转化率达44.6％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用
<130> 2020
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gaataaataa caatttcaca 60
caggaaacag tattc 75
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
aagtcttatg aaactcgccg tttatagcac aaaacagtac gacaagaagt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
aagtcttatg aaactcgccg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
ttaaaccagt tcgttcgggc agg 23
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttaccaa gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
ttacatagat tgagtgaagg tacgagtaat aacgtcctgc tgctgttctt atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 8
atgtccgagc ttaatgaaaa g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 9
ttacatagat tgagtgaagg 20
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
gtgtcccgta ttattatgct gatccctacc ggaaccagcg gtgtaggctg gagctgcttc 60
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 11
atgtgcggaa tgctgcgtgc gcagaaagtg acggatttaa cgcggcgagt atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
gtgtcccgta ttattatgct g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 13
atgtgcggaa tgctgcgtgc g 21
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 14
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 15
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 15
gcaaaacgtt cacgtacagc gtcataaaca gagtcaacaa caacaacaga atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 16
atggctgtta ctaatgtcgc tg 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 17
gcaaaacgtt cacgtacagc 20
<210> 18
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 18
atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 19
ttaatccagc gttggattca tgtgccgtag atcgtatggc gtgatctggt atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 20
atgccgattc gtgtgccgga c 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 21
ttaatccagc gttggattca tg 22
<210> 22
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 22
atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 23
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 23
ttacagcaaa ccggcatgct taagcgccgc tctgaccgtc tcacgaccac atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 24
atgttcacgg gaagtattgt c 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 25
ttacagcaaa ccggcatgct 20
<210> 26
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 26
atggttaaag tttatgcccc ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 27
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 27
ttagttttcc agtactcgtg cgcccgccgt atccagccgg caaatatgaa atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 28
atggttaaag tttatgcccc g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 29
ttagttttcc agtactcgtg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 30
gatcccgcga aattaatacg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 31
gagatctcga tcctctacgc 20
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 32
ggcgtagagg atcgagatct cgtgtaggct ggagctgctt c 41
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 33
tcgtattaat ttcgcgggat catgggaatt agccatggtc c 41
<210> 34
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 34
cgtgaaggat acagggctat caaacgataa gatggggtgt ctggggtaat gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 35
ttgccgagca tactgacatt actacgcaat gcggaatatt gttcgttcat ggtatatctc 60
cttcttaaag 70
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 36
cgtgaaggat acagggctat c 21
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 37
ttgccgagca tactgacatt ac 22
<210> 38
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 38
taaagtgatc cagattacgg tagaaatcct caagcagcat atgatctcgg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 39
acttccctgg tacccaacag atcttcttcg atacgaatgt tgtttgacat ggtatatctc 60
cttcttaaag 70
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 40
taaagtgatc cagattacgg tag 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 41
acttccctgg tacccaacag atc 23
<210> 42
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 42
atgagtgtga ttgcgcaggc aggggcgaaa ggtcgtcagc tgcataaatt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 43
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 43
ttacaacaac tgtgccagcc ggttgatatc cgactgaatc gccccggcgg ggtatatctc 60
cttcttaaag 70
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 44
atgagtgtga ttgcgcaggc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 45
ttacaacaac tgtgccagcc 20
<210> 46
<211> 3474
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 46
gtgactgcta tcacccttgg cggtctcttg ttgaaaggaa taattactct agtgtcgact 60
cacacatctt caacgcttcc agcattcaaa aagatcttgg tagcaaaccg cggcgaaatc 120
gcggtccgtg ctttccgtgc agcactcgaa accggtgcag ccacggtagc tatttacccc 180
cgtgaagatc ggggatcatt ccaccgctct tttgcttctg aagctgtccg cattggtacc 240
gaaggctcac cagtcaaggc gtacctggac atcgatgaaa ttatcggtgc agctaaaaaa 300
gttaaagcag atgccattta cccgggatac ggcttcctgt ctgaaaatgc ccagcttgcc 360
cgcgagtgtg cggaaaacgg cattactttt attggcccaa ccccagaggt tcttgatctc 420
accggtgata agtctcgcgc ggtaaccgcc gcgaagaagg ctggtctgcc agttttggcg 480
gaatccaccc cgagcaaaaa catcgatgag atcgttaaaa gcgctgaagg ccagacttac 540
cccatctttg tgaaggcagt tgccggtggt ggcggacgcg gtatgcgttt tgttgcttca 600
cctgatgagc ttcgcaaatt agcaacagaa gcatctcgtg aagctgaagc ggctttcggc 660
gatggcgcgg tatatgtcga acgtgctgtg attaaccctc agcatattga agtgcagatc 720
cttggcgatc acactggaga agttgtacac ctttatgaac gtgactgctc actgcagcgt 780
cgtcaccaaa aagttgtcga aattgcgcca gcacagcatt tggatccaga actgcgtgat 840
cgcatttgtg cggatgcagt aaagttctgc cgctccattg gttaccaggg cgcgggaacc 900
gtggaattct tggtcgatga aaagggcaac cacgtcttca tcgaaatgaa cccacgtatc 960
caggttgagc acaccgtgac tgaagaagtc accgaggtgg acctggtgaa ggcgcagatg 1020
cgcttggctg ctggtgcaac cttgaaggaa ttgggtctga cccaagataa gatcaagacc 1080
cacggtgcag cactgcagtg ccgcatcacc acggaagatc caaacaacgg cttccgccca 1140
gataccggaa ctatcaccgc gtaccgctca ccaggcggag ctggcgttcg tcttgacggt 1200
gcagctcagc tcggtggcga aatcaccgca cactttgact ccatgctggt gaaaatgacc 1260
tgccgtggtt ccgactttga aactgctgtt gctcgtgcac agcgcgcgtt ggctgagttc 1320
accgtgtctg gtgttgcaac caacattggt ttcttgcgtg cgttgctgcg ggaagaggac 1380
ttcacttcca agcgcatcgc caccggattc attgccgatc acccgcacct ccttcaggct 1440
ccacctgctg atgatgagca gggacgcatc ctggattact tggcagatgt caccgtgaac 1500
aagcctcatg gtgtgcgtcc aaaggatgtt gcagctccta tcgataagct gcctaacatc 1560
aaggatctgc cactgccacg cggttcccgt gaccgcctga agcagcttgg cccagccgcg 1620
tttgctcgtg atctccgtga gcaggacgca ctggcagtta ctgataccac cttccgcgat 1680
gcacaccagt ctttgcttgc gacccgagtc cgctcattcg cactgaagcc tgcggcagag 1740
gccgtcgcaa agctgactcc tgagcttttg tccgtggagg cctggggcgg cgcgacctac 1800
gatgtggcga tgcgtttcct ctttgaggat ccgtgggaca ggctcgacga gctgcgcgag 1860
gcgatgccga atgtaaacat tcagatgctg cttcgcggcc gcaacaccgt gggatacacc 1920
ccgtacccag actccgtctg ccgcgcgttt gttaaggaag ctgccagctc cggcgtggac 1980
atcttccgca tcttcgacgc gcttaacgac gtctcccaga tgcgtccagc aatcgacgca 2040
gtcctggaga ccaacaccgc ggtagccgag gtggctatgg cttattctgg tgatctctct 2100
gatccaaatg aaaagctcta caccctggat tactacctaa agatggcaga ggagatcgtc 2160
aagtctggcg ctcacatctt ggccattaag gatatggctg gtctgcttcg cccagctgcg 2220
gtaaccaagc tggtcaccgc actgcgccgt gaattcgatc tgccagtgca cgtgcacacc 2280
cacgacactg cgggtggcca gctggcaacc tactttgctg cagctcaagc tggtgcagat 2340
gctgttgacg gtgcttccgc accactgtct ggcaccacct cccagccatc cctgtctgcc 2400
attgttgctg cattcgcgca cacccgtcgc gataccggtt tgagcctcga ggctgtttct 2460
gacctcgagc cgtactggga agcagtgcgc ggactgtacc tgccatttga gtctggaacc 2520
ccaggcccaa ccggtcgcgt ctaccgccac gaaatcccag gcggacagtt gtccaacctg 2580
cgtgcacagg ccaccgcact gggccttgcg gatcgtttcg aactcatcga agacaactac 2640
gcagccgtta atgagatgct gggacgccca accaaggtca ccccatcctc caaggttgtt 2700
ggcgacctcg cactccacct cgttggtgcg ggtgtggatc cagcagactt tgctgccgat 2760
ccacaaaagt acgacatccc agactctgtc atcgcgttcc tgcgcggcga gcttggtaac 2820
cctccaggtg gctggccaga gccactgcgc acccgcgcac tggaaggccg ctccgaaggc 2880
aaggcacctc tgacggaagt tcctgaggaa gagcaggcgc acctcgacgc tgatgattcc 2940
aaggaacgtc gcaatagcct caaccgcctg ctgttcccga agccaaccga agagttcctc 3000
gagcaccgtc gccgcttcgg caacacctct gcgctggatg atcgtgaatt cttctacggc 3060
ctggtcgaag gccgcgagac tttgatccgc ctgccagatg tgcgcacccc actgcttgtt 3120
cgcctggatg cgatctctga gccagacgat aagggtatgc gcaatgttgt ggccaacgtc 3180
aacggccaga tccgcccaat gcgtgtgcgt gaccgctccg ttgagtctgt caccgcaacc 3240
gcagaaaagg cagattcctc caacaagggc catgttgctg caccattcgc tggtgttgtc 3300
accgtgactg ttgctgaagg tgatgaggtc aaggctggag atgcagtcgc aatcatcgag 3360
gctatgaaga tggaagcaac aatcactgct tctgttgacg gcaaaatcga tcgcgttgtg 3420
gttcctgctg caacgaaggt ggaaggtggc gacttgatcg tcgtcgtttc ctaa 3474
<210> 47
<211> 819
<212> DNA
<213> Rhodopseudomonas palustris
<400> 47
atgcgcagcg gccgggcccc gcagcgcgtc gccattgccg ggctcggcgc catcggcaag 60
gcgatcgcgc gtgaactcga tcgcgggctc gacgggctga cgctcggcgc cgtcgccagc 120
ggcgacccgg agaagcatcg cgccttcctc gacggcctgc ggacgacgcc gccggtggtc 180
ccgctggatc agttgcacgc ccacgcagac ctcgtgatcg aggcggcgcc gagcaggctg 240
ctgcgcgcga tcgtcgagcc gttcgtcagc cgcggcagga ccgcgatcgt gctcagcgcc 300
gcggcgctgc tgcagaacga ggacctgatc gatctggcca atctgaacgg cggccagatc 360
atcgtgccga ccggcgcgct gatcgggctc gacgccgtca ctgccgccgc cgtcggcacg 420
attcattcgg tgcggatgat cacccgcaag ccggtcgatg gcctgcgcgg cgcgccgttc 480
atcgtcgaca acggcatcga cctcgacgga ttgcgcgaac cgctgaaact gttcgaaggc 540
accgcgcgcg aagccggcaa gggctttccg gccaatctca acgtcgcggt ggcgctgtcg 600
ctggccggca tcgggccgga tcgcaccatg gtggagatct gggccgatcc gggcgtcacc 660
cgcaacaccc accgcatcga ggtcgatgcg gattcggcgc ggttcgcgat gacgatcgag 720
aacgtgccgt ccgacaatcc ccgcaccggc ctgatcacgc cgctgtcggt gatcgcgctg 780
ctgcgcaagc aatccgccgc gctgcgggtc gggacctga 819
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 48
acagggcgcg tcccattcgc c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 49
agcggcgcat taagcgcggc g 21
<210> 50
<211> 41
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 50
ggcgaatggg acgcgccctg tgtgtaggct ggagctgctt c 41
<210> 51
<211> 41
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 51
cgccgcgctt aatgcgccgc tatgggaatt agccatggtc c 41
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 52
aggtatgcgt aataccggct aatcttcctc ttctgcaaac cctcgtgctt atcgagatct 60
cgatcccgcg 70
<210> 53
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 53
atgcagacag aaatatattg aaaacgaggg tgttagaaca gaagtatttc atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 54
aggtatgcgt aataccggct aatc 24
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 55
atgcagacag aaatatattg aaaac 25
<210> 56
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 56
atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg atcgagatct 60
cgatcccgcg 70
<210> 57
<211> 70
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 57
ttaaatcaca ccctgcgcca gcatcgcatc ggcaaccttc acaaaaccgg atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 58
atggatcaga catattctct gg 22
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 59
ttaaatcaca ccctgcgcca gc 22

Claims (8)

1.一株高丝氨酸生产菌，其特征在于，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21153，保藏地址为中国北京。
2.一种权利要求1所述的高丝氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.敲除大肠杆菌W3110中不利于高丝氨酸合成的基因，获得基因敲除菌株；所述基因选自ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA、thrB中的一个或多个；
B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中有利于高丝氨酸合成的基因的表达，获得基因增强菌株；所述基因选自PEPC、AspA、metL的中的一个或多个；
C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入有利于高丝氨酸合成的外源基因，获得高丝氨酸生产菌ZFgs012，所述外源基因选自PC和/或AspDH。
3.根据权利要求2所述的高丝氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.敲除大肠杆菌W3110中的基因1dhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA和thrB，获得基因敲除菌株；
B.增强在步骤A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC、AspA和metL，使这些基因表达量增加，获得基因增强菌株；
C.在步骤B中所述的基因增强菌株中引入外源基因PC和AspDH，获得高丝氨酸的生产菌ZFgs012。
4.根据权利要求2或3所述的高丝氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，步骤B中获得基因增强菌株是采取启动子替换，替换的启动子来源于pGEX-4T1的Tac启动子，并突变lacI操纵子序列。
5.权利要求1所述的高丝氨酸生产菌在生产高丝氨酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生产高丝氨酸的方法为：将高丝氨酸生产菌ZFgs012接入装有50ml种子培养基的500mL三角瓶中，置于摇床培养，转速为200r/min，温度37℃，培养12h；按5％的接种量接入5L装有发酵液的自控发酵罐中，初始转速200r/min，通气量0.4L/L·min，温度37℃，流加氨水控制pH值在7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低至1％时，流加浓度为50％的葡萄糖并控制残糖浓度在1％，发酵周期为48h；所述浓度为m/v。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述种子培养基为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵液组成如下：葡萄糖6％、NaCl0.08％、硫酸铵1％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉0.5％、KH2PO4 0.3％、MgSO4 0.1％、豆粕水解液1％、玉米浆2％、生物素100μg/L、烟酰胺5mg/L、腺苷1mg/L、DL-蛋氨酸0.1g/L、L-异亮氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.1g/L和L-赖氨酸0.1g/L，pH为7.0。
CN202011461387.2A 2020-12-08 2020-12-08 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用 Active CN112592875B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011461387.2A CN112592875B (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011461387.2A CN112592875B (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112592875A true CN112592875A (zh) 2021-04-02
CN112592875B CN112592875B (zh) 2022-06-10

Family

ID=75192821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011461387.2A Active CN112592875B (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112592875B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085858A (zh) * 2021-10-30 2022-02-25 新泰市佳禾生物科技有限公司 L-丝氨酸生产菌及其构建方法
WO2023240794A1 (zh) * 2022-06-15 2023-12-21 江南大学 一种生产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504613A (zh) * 2017-02-27 2018-09-07 苏州引航生物科技有限公司 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
CN109055290A (zh) * 2018-07-27 2018-12-21 浙江工业大学 一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN110272857A (zh) * 2019-06-03 2019-09-24 鲁东大学 β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504613A (zh) * 2017-02-27 2018-09-07 苏州引航生物科技有限公司 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
CN109055290A (zh) * 2018-07-27 2018-12-21 浙江工业大学 一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN110272857A (zh) * 2019-06-03 2019-09-24 鲁东大学 β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU PENG等: "Multiplex design of the metabolic network for production of L-homoserine of Escherichia coli", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085858A (zh) * 2021-10-30 2022-02-25 新泰市佳禾生物科技有限公司 L-丝氨酸生产菌及其构建方法
CN114085858B (zh) * 2021-10-30 2024-04-05 新泰市佳禾生物科技有限公司 L-丝氨酸生产菌及其构建方法
WO2023240794A1 (zh) * 2022-06-15 2023-12-21 江南大学 一种生产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112592875B (zh) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110272857B (zh) β-丙氨酸生产菌及其制备方法和用途
CN110699394B (zh) 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN112592875B (zh) 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN114457123B (zh) 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN117384817B (zh) 一种对香豆酸生产菌株及其构建方法与应用
CN112063572B (zh) 一种高产o-乙酰-l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
JP4309223B2 (ja) 染色体上のｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニン生成変異微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法
CN117844728B (zh) 一种l-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用
CN117866867B (zh) 一种咖啡酸生产菌株及其构建方法与应用
CN111705030A (zh) 高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株
CN117683802B (zh) 一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株及其构建与生产方法
CN109456987B (zh) 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用
CN117866866A (zh) 一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
JPH06277082A (ja) アラニンの製造法
CN112779200B (zh) 高产l-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建与应用
JP4334565B2 (ja) 染色体内のｔｄｃＢＣ及びｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された微生物及びこれを用いてＬ−トレオニンを製造する方法
CN118006652B (zh) 一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用
US11479795B2 (en) Genetically engineered bacterium for sarcosine production as well as construction method and application
CN116536237B (zh) 改造的大肠杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用
CN114606253B (zh) 一种无外源氨基酸作用下高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN118165907B (zh) 一种γ-氨基丁酸生产菌株及其构建方法与应用
WO2024011666A1 (zh) 一种l-高丝氨酸高产菌株及其构建方法和应用
CN113817659B (zh) 一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法
WO2023246071A1 (zh) 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220808

Address after: No.1666, East Ring Road, juancheng County, Heze City, Shandong Province 274600

Patentee after: SHANDONG YANGCHENG BIOTECH Co.,Ltd.

Address before: 264025 No. 186 Hongqi Middle Road, Zhifu District, Shandong, Yantai

Patentee before: LUDONG University