CN114085858B - L-丝氨酸生产菌及其构建方法 - Google Patents

L-丝氨酸生产菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑丝氨酸生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；(2)将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE‑N上，获得第一重组表达载体；将pGEX‑kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX‑kan上，获得第二重组表达载体；(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L‑丝氨酸生产菌。本发明通过上述技术手段的结合，成功构建得到高产的L‑丝氨酸生产菌，L‑丝氨酸的产量可达110g/L。

Description

L-丝氨酸生产菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种L-丝氨酸生产菌及其构建方法。
背景技术
L-丝氨酸(L-Ser)可以促进脂肪以及脂肪酸的合成，同时还是半胱氨酸和色氨酸等物质的合成前体，具有重要的生理功能，被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。目前L-Ser的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和微生物发酵法；其中微生物发酵法原料来源广泛，能耗低，对环境友好，是L-Ser生产研究的重点。
生物体中L-Ser合成途径受到严谨的调控，且生成的L-Ser很容易被降解，这些因素限制了L-Ser的过量合成。因此，微生物发酵生产L-Ser仍比较困难。
大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，其生物化学性质、生理学性质及遗传背景等各方面均被广泛深入研究。但目前利用大肠杆菌生产L-丝氨酸的研究不多，祁庆生等以葡萄糖为发酵底物，改造大肠杆菌，敲除编码L-丝氨酸脱氨酶的基因sdaA来弱化L-丝氨酸向丙酮酸的分解代谢，过表达L-丝氨酸的合成路径的基因serAFR、serB、serC，使更多的代谢流流向目的产物的合成，敲除抑制蛋白IclR、ArcA和aceB使菌体的代谢分布发生变化，在揺瓶中使L-丝氨酸的产量达到4.5g/L，发酵罐中扩大培养使L-丝氨酸的产量达到8.34g/L。李旋等对野生型大肠杆菌MG1655进行了系统的代谢工程改造，从头构建了1株L-Ser生产菌，其主要是在基因组水平上阻断了L-Ser向丙酮酸降解，增强了L-Ser合成酶类的表达，并对L-Ser转运系统进行了改造；为进一步促进L-Ser的积累，还对SHMT的表达进行了调控，最终构建的工程菌种在5L罐上发酵28h，可生产22.31g/L的L-Ser。
上述构建大肠杆菌基因工程菌虽然在一定程度上解决了L-Ser难以过量合成的问题，但L-Ser的表达量仍有待进一步的提高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种L-丝氨酸生产菌及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种L-丝氨酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；
(2)将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE-N上，获得第一重组表达载体(pQE-serB&C)；
将pGEX-kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX-kan上，获得第二重组表达载体(pGEX-serA)；
(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L-丝氨酸生产菌。
优选的，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除sstT、sdaC、tdcC、cycA基因，再敲除mtfA、glyA、pta、sdaA基因，再敲除aceA、gpmA基因，最后敲除serA基因。通过上述敲除顺序，减小敲除难度，避免了敲掉基因后菌不长的情况出现。
优选的，步骤(2)中，serB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；serC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，步骤(2)中，质粒PQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述第一重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，步骤(2)中，pGEX-kan质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤(2)中，serAΔ197基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；作为优选，在将其整合到质粒pGEX-kan前进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
优选的，所述第二重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二方面，提供上述方法构建得到的L-丝氨酸生产菌。
本发明的第三方面，提供上述L-丝氨酸生产菌在发酵生产L-丝氨酸生产菌中的应用。
本发明的有益效果：
本发明在构建L-丝氨酸生产菌时，对影响L-丝氨酸表达的各个因素进行综合分析，通过解除合成途径中关键酶的反馈抑制、敲除分解途径和过表达合成途径等多个技术手段的组合使用，使得更多的碳源流向L-丝氨酸，从而显著提高了L-丝氨酸的产量。其中：
sstT基因编码丝氨酸/苏氨酸：Na(+)同向转运体，sdaC基因编码L-丝氨酸：H(+)同向转运体，tdcC基因编码苏氨酸/丝氨酸：H(+)同向转运体，cycA基因编码丝氨酸/丙氨酸/甘氨酸/:H(+)同向转运体，敲除sstT、sdaC、tdcC、cycA基因能够组织L-丝氨酸的吸收。
mtfA基因编码DgsA抗阻遏物，敲除后阻止了葡萄糖的不均匀代谢，同时阻止葡萄糖和PEP直接生成丙酮酸，增加了葡萄糖流向3-PHP的流量；pta基因编码磷酸乙酰转移酶，敲除后阻止了乙酰辅酶A生成乙酰磷酸，增加TCA循环的流量；glyA基因编码丝氨酸羟甲基转移酶，敲除后L-丝氨酸不转化为甘氨酸；sdaA基因编码L-丝氨酸脱氨酶，敲除后防止D-色氨酸生成。
aceA基因编码异柠檬酸裂解酶，敲除后增加三羧酸循环的流量；gpmA基因编码2,3-二磷酸甘油酸依赖性磷酸甘油酸变位酶，敲除后2,3-二磷酸甘油流向3-PHP，由于未敲除dPGM，后续也敲除了pta，所以三羧酸循环并未受影响。
serA基因编码磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)，是L-丝氨酸合成过程中的限速酶，敲掉之后再导入谷氨酸棒杆菌的serAΔ197基因，解除L-丝氨酸对酶的负反馈抑制作用。
本发明虽然敲除了大肠杆菌的多个基因，但试验发现，其对大肠杆菌的生长并未产生明显的负面影响，而且，其延滞期和达到k/2的时间比未敲除的普通大肠杆菌还要短。
进一步的，本发明再导入serAΔ197基因、serB基因和serC基因，过表达L-丝氨酸的合成途径。本发明通过上述技术手段的结合，成功构建得到高产的L-丝氨酸生产菌，L-丝氨酸的产量可达110g/L。
附图说明
图1：PQE-60质粒及其改造结构示意图；其中，A为PQE-60质粒的结构示意图；B为改造后的质粒PQE-N的结构示意图。
图2：pGEX-4T-1质粒及其改造结构示意图；其中，A为pGEX-4T-1质粒的结构示意图；B为改造后的pGEX-kan质粒的结构示意图。
图3：对基因敲除后的菌株进行验证的结果；其中，1-11分别对应为gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因的敲除验证结果；每个电泳图中，自左至右各泳道依次为：敲除抗性基因之后、pKD3敲除基因之后、需要敲除的基因、Marker。
图4：本发明构建的第一重组表达载体(pQE-serB&C)的结构示意图。
图5：本发明构建的第一重组表达载体(pQE-serB&C)的电泳验证；泳道自左至右依次为Marker、PQE-60、PQE-N、pQE-serB&C。
图6：serAΔ197基因优化前的密码子相对适应度。
图7：serAΔ197基因优化后的密码子相对适应度。
图8：本发明构建的第二重组表达载体(pGEX-serA)的结构示意图。
图9：本发明构建的第二重组表达载体(pGEX-serA)的电泳验证；泳道自左至右依次为Marker、pGEX-4T-1、pGEX-kan、pGEX-serA。
图10：本发明构建的L-丝氨酸生产菌的菌落PCR验证结果；图中，左侧泳道为Marker。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
本实施例和对比例中所使用的大肠杆菌为Escherichia coli str.K-12substr.MG1655，原种购买自美国ATCC。
PQE-N质粒(图1B)是以PQE-60质粒(图1A)为基础经基因工程改造而成，PQE-N质粒的序列如SEQ ID NO.3所示。
pGEX-kan质粒(图2B)是以pGEX-4T-1质粒(图2A)为基础经基因工程改造而成，将pGEX-4T-1质粒中的氨苄青霉素抗性标记替换为卡那霉素抗性标记。改造后的pGEX-kan质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。
PQE-N质粒和pGEX-kan质粒均为通过常规的基因工程手段改造而成，公众也可自本专利申请日起20年内从申请人处获得PQE-N质粒和pGEX-kan质粒，以用于重复本试验。
需要说明的是，本发明L-丝氨酸生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。
实施例1：大肠杆菌工程菌的构建
采用Red同源重组技术将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔsstTΔsdaCΔtdcCΔcycAΔmtfAΔglyAΔptaΔsdaAΔaceAΔgpmAΔserA)；具体过程如下：
1)线性打靶盒子的构建：
敲除质粒选择pKD3质粒，氯霉素抗性；敲除不同基因所对应的同源臂引物如下：
PKD-gpmA-F：GCAGTCGGCTTTCTCATTTTAAACGAATGAC；(SEQ ID NO.9)
PKD-gpmA-R：TTACTCCTCAAATCATCTTTTAATGATAATA。(SEQ ID NO.10)
PKD-sdaA-F：GGAAGTCCAGTCACCTTGTCAGGAGTATTAT；(SEQ ID NO.11)
PKD-sdaA-R：TTCTTACTCGCCCATCTGCAACGGATGGGCG。(SEQ ID NO.12)
PKD-mrfA-F：GGGATAGCTTGACTGTGAAAATCACAGGAGC；(SEQ ID NO.13)
PKD-mrfA-R:TAACAACTTTGCAGATTAATTAACCAATTGA。(SEQ ID NO.14)
PKD-pta-F:AACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGA；(SEQ ID NO.15)
PKD-pta-R:TCATCCGCAGCTTTGCGCTGCGGATATCTGA。(SEQ ID NO.16)
PKD-glyA-F:CAACGAGCACATTGACAGCAAATCACCGTTT；(SEQ ID NO.17)
PKD-glyA-R:GCATCTCCTGACTCAGCTAACAATAAAATTT。(SEQ ID NO.18)
PKD-sdaC-F：CTAAAAGCTGAATTATTTGCATTCCTCCAGG；(SEQ ID NO.19)
PKD-sdaC-R：ATTGCAATCTCCGCAATCTTCTACTCTCTGT。(SEQ ID NO.20)
PKD-serA-F：AGTCAGTGACCTGCCCGTTGATTTTCAGAGA；(SEQ ID NO.21)
PKD-serA-R：CCTGTCTTTTGAAATGTTGTGTGCGGATTTG。(SEQ ID NO.22)
PKD-sstT-F：GGGATGTGCGACAACACAATGAAAGGATCGA；(SEQ ID NO.23)
PKD-sst–R：TGTTTAACCCCTTTCGTCTACGGCGGAAGGG。(SEQ ID NO.24)
PKD-tdcC–F：AATTCATTCATCTCTTTTCTCATCCTGAGTT；(SEQ ID NO.25)
PKD-tdcC–R：CCTATCCTCAACGAATTAATTAAGCGTCAAC。(SEQ ID NO.26)
PKD-aceA-F：GTTAGCGTAAACCACCACATAACTATGGAGC；(SEQ ID NO.27)
PKD-aceA-R：ACAACCGTTGCTGACTGTAGGCCGGATAAGG。(SEQ ID NO.28)
PKD-cycA-F：TGAACAACACAGACAGGTACAGGAAGAAAAA；(SEQ ID NO.29)
PKD-cycA-R：CATTATCATGCTGGATGGCGCAATGCCATCC。(SEQ ID NO.30)
基因敲除的顺序为：先敲除sstT、sdaC、tdcC、cycA基因，再敲除mtfA、glyA、pta、sdaA基因，再敲除aceA、gpmA基因，最后敲除serA基因。
敲除不同基因后所使用的Test引物如下：
Test-gpmA-F：AATGTGCTCCATTGTTAGCAACAAAAAAGCC；(SEQ ID NO.31)
Test-gpmA-R:ATATTGCCGCGACGAAGCAACAGCAATGCTT。(SEQ ID NO.32)
Test-sdaA-F:TACACTATGCGCTGTTATTAGTTCGTTACTG；(SEQ ID NO.33)
Test-sdaA-R:GAATTTATACCCGCTTTCTCGTCTGCTGTAA。(SEQ ID NO.34)
Test-mrfA-F:ACATCTGTATAAGGAATTTTTAAGGTTCGTG；(SEQ ID NO.35)
Test-mrfA-R:AAATGACTTATGAAATTTAGTGTTGACAGAC。(SEQ ID NO.36)
Test-pta-F:CCGCCAGCTCAGCTGGCGGTGCTGTTTTGTA；(SEQ ID NO.37)
Test-pta-R:AACCGGAAATAATCACTATTTCCGGTTTTTT。(SEQ ID NO.38)
Test-glyA-F:ATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCATGAAC；(SEQ ID NO.39)
Test-glyA-R:TTTGGCCTTTATAGGCGGTCCTGTTGGACAA。(SEQ ID NO.40)
Test-sdaC-F:ACGGTCAGGCACCTTCCCGGGCTGAACTGGC；(SEQ ID NO.41)
Test-sdaC-R:TTCAGCTAAGTCCTTTCGCGCCGCTTTCGGG。(SEQ ID NO.42)
Test-serA-F:CGGTGTGGAGAAGGGATAAAAAAACGGGCAA；(SEQ ID NO.43)
Test-serA-R:GCATCCGCCTTTCAACATATCAAAAAATAAT。(SEQ ID NO.44)
Test-sstT-F:TCCTGAAAGATGCGTCGACAGAACGCACCAG；(SEQ ID NO.45)
Test-sstT-R:GGTTTTCTCAACTTTAAACGGATCAATTCCC。(SEQ ID NO.46)
Test-tdcC-F:GAACCACAGTTAATAACCAAAACAACCGGAA；(SEQ ID NO.47)
Test-tdcC-R:CGAAACCGGTGATTTGAGAGACGCGAGAAAG。(SEQ ID NO.48)
Test-aceA-F:TGATTTCCTGACCCTGCCAGGCTACCGCCTG；(SEQ ID NO.49)
Test-aceA-R:GCGTTCACGCCGCATCCGGCAATCGGTGCAC。(SEQ ID NO.50)
Test-cycA-F:TATCATAGACTGACTAAAGGCCGTAGAGCCT；(SEQ ID NO.51)
Test-cycA-R:CAGCTTTTAGATCACTCACCCGCCAGCGCGC。(SEQ ID NO.52)
2)电感受态的制备：
用试管摇菌过夜，第二天以1％(体积分数)的接种量至LB培养基中，30℃培养1小时后，加入0.3％(质量分数)的L-阿拉伯糖，30℃诱导2小时。冰浴冷却。用10％(体积分数)甘油洗两次，最终浓缩至200μl，以10％甘油重悬。
3)电击转化：
将2mm电转杯从70％(体积分数)乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。取100μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀。冰浴2分钟。
电转参数：2500V，200欧，25μF；电击后显示，电击时间为4.8ms。
4)复苏与涂布：
加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小时。涂布前先离心，去除部分上清后再重悬，然后涂布在AMP平板。涂干。30℃培养24个小时。筛选重组子。
5)抗性基因去除：
将质粒pCP20转入成功敲除基因的菌株中，并在30℃下培养8h，后转入42℃培养过夜。pCP20在42℃下诱导表达FLP内切酶从而将FRT位点间的抗性基因从基因组上切除掉。
对基因敲除后的菌株进行验证，结果如图3所示。结果表明：大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因已被成功敲除，大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ sstTΔ sdaCΔ tdcCΔ cycAΔ mtfAΔ glyAΔ ptaΔ sdaAΔ aceAΔ gpmAΔ serA)。
实施例2：第一重组表达载体的构建
(1)提取大肠杆菌的基因组DNA，将其作为模板，利用下述引物进行PCR扩增，得到serB基因，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示。
正向引物：5’-CCATGCCTAACATTACCTGGTG-3’；(SEQ ID NO.53)
反向引物：5’-AGCCTGAATCAGAAGTAAGATCT-3’。(SEQ ID NO.54)
以大肠杆菌的基因组DNA为模板，利用下述引物进行PCR扩增，得到serC基因，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.2所示。
正向引物：5’-CCATGGCTCAAATCTTCAATTTTA-3’；(SEQ ID NO.55)
反向引物：5’-TGAGTTCGAACGCCGTCACGGT-3’。(SEQ ID NO.56)
(2)将serB基因用sph Ⅰ和AaaI双酶切处理，将serC基因用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到经相应酶切处理后的PQE-N质粒上，构建得到第一重组表达载体(pQE-serB&C)，其结构示意图如图4所示。
对构建的第一重组表达载体进行电泳验证，结果如图5所示。结果表明：serB基因和serC基因已成功整合到PQE-N质粒上。
实施例3：第二重组表达载体的构建
将serAΔ 197基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；密码子优化前、后的密码子相对适应度如图6和图7所示。
将替换为卡那霉素抗性的pGEX-kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将经密码子优化和添加酶切位点处理的serAΔ 197基因(SEQ ID NO.7所示)整合到双酶切处理后的pGEX-kan质粒上，获得第二重组表达载体(pGEX-serA)；其结构示意图如图8所示。
将构建的第二重组表达载体进行电泳验证，结果如图9所示。结果表明：serAΔ197基因(SEQ ID NO.5所示)已成功整合到质粒pGEX-kan上。
实施例4：L-丝氨酸生产菌的构建
将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到实施例1构建的大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ sstTΔ sdaCΔ tdcCΔ cycAΔmtfAΔ glyAΔ ptaΔ sdaAΔ aceAΔ gpmAΔ serA)中，获得转化子。
将转化子在LB平板上涂布，等长出单菌落之后用影印法分别在LB琼脂平板(卡那霉素抗性，含50μg/ml卡那霉素)和AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，待两个抗性平板上都长出单菌落之后，通过对比位置，在LB平板中挑出能同时在LB琼脂平板(卡那霉素抗性)和AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
对阳性转化子进行菌落PCR验证，菌落PCR所试验的引物如下：
pQE-F:AGCGGATAACAATTTCACACAG；(SEQ ID NO.57)
pQE-R:TTCTGAGGTCATTACTGGATC。(SEQ ID NO.58)
pGEX-F:GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG；(SEQ ID NO.59)
pGEX-R:CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG。(SEQ ID NO.60)
菌落PCR验证结果如图10所示，结果表明：第一重组表达载体和第二重组表达载体已导入到受体菌中。
由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的L-丝氨酸生产菌。
对比例1：
以大肠杆菌作为L-丝氨酸生产菌A。
对比例2：
按实施例1的方法，将大肠杆菌中的sstT、sdaC、tdcC、cycA基因敲除，得到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ sstTΔ sdaCΔ tdcCΔ cycA)；按实施例4的方法将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ sstTΔ sdaCΔ tdcCΔ cycA)中，构建得到L-丝氨酸生产菌B。
对比例3：
按实施例1的方法，将大肠杆菌中的mtfA、glyA、pta、sdaA基因敲除，得到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ mtfAΔ glyAΔ ptaΔ sdaA)；按实施例4的方法将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ mtfAΔ glyAΔ ptaΔ sdaA)中，构建得到L-丝氨酸生产菌C。
对比例4：
按实施例1的方法，将大肠杆菌中的aceA、gpmA基因敲除，得到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ aceAΔ gpmA)；按实施例4的方法将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ aceAΔ gpmA)中，构建得到L-丝氨酸生产菌D。
对比例5：
按实施例1的方法，将大肠杆菌中的serA基因敲除，得到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ serA)；按实施例4的方法将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ aceAΔgpmA)中，构建得到L-丝氨酸生产菌E。
对比例6：
以大肠杆菌作为受体菌，将实施例3构建的第一重组表达载体和实施例4构建的第二重组表达载体导入到受体菌中，按实施例4的方法将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体导入到受体菌中，构建得到L-丝氨酸生产菌F。
试验例：
将实施例4、对比例1-对比例6构建的L-丝氨酸生产菌接入同样组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4 0.08g/L、FeSO4 0.06g/L、维生素B1 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、卡那霉素50ppm。
在相同进行发酵培养，发酵培养的温度为30℃，pH为7.0，溶氧(DO)为20-40％；
发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.40-0.50时，降温至28℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，诱导培养50h；
培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1g/L时开始补糖，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-1g/L；所述补料中含有葡萄糖70g/L、糖蜜50ml/L、叶酸0.4g/L。
培养结束后对L-丝氨酸含量进行测定，具体方法如下：
标准品储备液配制：取L-ser标准品10mg，用水溶解并定容至10mL，制得浓度为1mg/mL的储备液；
衍生溶液的配制：分别称取OPA15mg和NAC100mg，溶于1mL甲醇，加入4mL0.1mol/L的硼砂缓冲液(pH＝10.0)混合均匀，4℃储存备用。使用前加0.1mol/L的硼砂缓冲液(pH＝10.0)稀释至所需浓度作为工作液。
按照每0.1mL菌悬液加入1.5mL的HCI(0.02mo L/L)，冰浴下匀浆，12000r/min离心10min，取上清液，按照体积比1：3加入乙沉淀蛋白。12000r/min离心10min，取90μL离心后的上清液，加10uL内标(10ug/mLL-CAN)，20μL衍生试剂和1080μL水，涡旋混合反应3min后进样。
衍生化反应：
色谱条件
色谱柱：WatersXBridge BEH C18柱(150mm×3mm，2.5um)；流动相：13mmol/LNH4Ac溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脱：0～5min，5％～20％B；5～8mi n，20％～42.5％B；8～10min，42.5％～90％B；10～11min，90％B；11～11.5min，90％～5％B；11.5～15min，5％B。体积流量：0.4mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度为4℃；进样量：5μL。
质谱检测参数
结果计算：面积法
结果见表1。
表1：
生产菌 L-丝氨酸产量(g/L)
实施例4构建的L-丝氨酸生产菌 110g/L
对比例1构建的L-丝氨酸生产菌A 3g/L
对比例2构建的L-丝氨酸生产菌B 27g/L
对比例3构建的L-丝氨酸生产菌C 生物量增加缓慢，延长发酵周期，10g/L
对比例4构建的L-丝氨酸生产菌D 生物量增加缓慢，延长发酵周期，9g/L
对比例5构建的L-丝氨酸生产菌E 12g/L
对比例6构建的L-丝氨酸生产菌F 19g/L，杂酸含量较高
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司
<120> L-丝氨酸生产菌及其构建方法
<130> 2021
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 969
<212> DNA
<213> serB
<400> 1
atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60
ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120
ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180
gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240
ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300
ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360
gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420
gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480
cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540
ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600
gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660
accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720
ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780
gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840
aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900
gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960
cagaagtaa 969
<210> 2
<211> 1089
<212> DNA
<213> serC
<400> 2
atggctcaaa tcttcaattt tagttctggt ccggcaatgc taccggcaga ggtgcttaaa 60
caggctcaac aggaactgcg cgactggaac ggtcttggta cgtcggtgat ggaagtgagt 120
caccgtggca aagagttcat tcaggttgca gaggaagccg agaaggattt tcgcgatctt 180
cttaatgtcc cctccaacta caaggtatta ttctgccatg gcggtggtcg cggtcagttt 240
gctgcggtac cgctgaatat tctcggtgat aaaaccaccg cagattatgt tgatgccggt 300
tactgggcgg caagtgccat taaagaagcg aaaaaatact gcacgcctaa tgtctttgac 360
gccaaagtga ctgttgatgg tctgcgcgcg gttaagccaa tgcgtgaatg gcaactctct 420
gataatgctg cttatatgca ttattgcccg aatgaaacca tcgatggtat cgccatcgac 480
gaaacgccag acttcggcgc agatgtggtg gtcgccgctg acttctcttc aaccattctt 540
tcccgtccga ttgacgtcag ccgttatggt gtaatttacg ctggcgcgca gaaaaatatc 600
ggcccggctg gcctgacaat cgtcatcgtt cgtgaagatt tgctgggcaa agcgaatatc 660
gcgtgtccgt cgattctgga ttattccatc ctcaacgata acggctccat gtttaacacg 720
ccgccgacat ttgcctggta tctatctggt ctggtcttta aatggctgaa agcgaacggc 780
ggtgtagctg aaatggataa aatcaatcag caaaaagcag aactgctata tggggtgatt 840
gataacagcg atttctaccg caatgacgtg gcgaaagcta accgttcgcg gatgaacgtg 900
ccgttccagt tggcggacag tgcgcttgac aaattgttcc ttgaagagtc ttttgctgct 960
ggccttcatg cactgaaagg tcaccgtgtg gtcggcggaa tgcgcgcttc tatttataac 1020
gccatgccgc tggaaggcgt taaagcgctg acagacttca tggttgagtt cgaacgccgt 1080
cacggttaa 1089
<210> 3
<211> 2529
<212> DNA
<213> 质粒PQE-N
<400> 3
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120
ggatccagat cttaatagta attagctgag cttggactcc tgttgataga tccagtaatg 180
acctcagaac tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt 240
ggtgagaatc caagctagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 300
aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 360
ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 420
ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 480
tgcccgcctg atgaatgctc atccggactc gagaaatcat aaaaaattta tttgctttgt 540
gagcggataa caattataat agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc 600
attaaagagg agaaattaag catgccggcc gtaatagtaa ttaacatgtg agcaaaaggc 660
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 720
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 780
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 840
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 900
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 960
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1020
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 1080
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 1140
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 1200
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 1260
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 1320
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 1380
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1440
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1500
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1560
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1620
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1680
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1740
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1800
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1860
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1920
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1980
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 2040
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 2100
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 2160
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 2220
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 2280
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 2340
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 2400
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2460
taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 2520
cgtcttcac 2529
<210> 4
<211> 4570
<212> DNA
<213> pQE-serB&C
<400> 4
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggct 120
caaatcttca attttagttc tggtccggca atgctaccgg cagaggtgct taaacaggct 180
caacaggaac tgcgcgactg gaacggtctt ggtacgtcgg tgatggaagt gagtcaccgt 240
ggcaaagagt tcattcaggt tgcagaggaa gccgagaagg attttcgcga tcttcttaat 300
gtcccctcca actacaaggt attattctgc catggcggtg gtcgcggtca gtttgctgcg 360
gtaccgctga atattctcgg tgataaaacc accgcagatt atgttgatgc cggttactgg 420
gcggcaagtg ccattaaaga agcgaaaaaa tactgcacgc ctaatgtctt tgacgccaaa 480
gtgactgttg atggtctgcg cgcggttaag ccaatgcgtg aatggcaact ctctgataat 540
gctgcttata tgcattattg cccgaatgaa accatcgatg gtatcgccat cgacgaaacg 600
ccagacttcg gcgcagatgt ggtggtcgcc gctgacttct cttcaaccat tctttcccgt 660
ccgattgacg tcagccgtta tggtgtaatt tacgctggcg cgcagaaaaa tatcggcccg 720
gctggcctga caatcgtcat cgttcgtgaa gatttgctgg gcaaagcgaa tatcgcgtgt 780
ccgtcgattc tggattattc catcctcaac gataacggct ccatgtttaa cacgccgccg 840
acatttgcct ggtatctatc tggtctggtc tttaaatggc tgaaagcgaa cggcggtgta 900
gctgaaatgg ataaaatcaa tcagcaaaaa gcagaactgc tatatggggt gattgataac 960
agcgatttct accgcaatga cgtggcgaaa gctaaccgtt cgcggatgaa cgtgccgttc 1020
cagttggcgg acagtgcgct tgacaaattg ttccttgaag agtcttttgc tgctggcctt 1080
catgcactga aaggtcaccg tgtggtcggc ggaatgcgcg cttctattta taacgccatg 1140
ccgctggaag gcgttaaagc gctgacagac ttcatggttg agttcgaacg ccgtcacggt 1200
taagatctta atagtaatta gctgagcttg gactcctgtt gatagatcca gtaatgacct 1260
cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt tttattggtg 1320
agaatccaag ctagcttggc gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa 1380
atcactggat ataccaccgt tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca 1440
tttcagtcag ttgctcaatg tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt 1500
ttaaagaccg taaagaaaaa taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc 1560
cgcctgatga atgctcatcc ggactcgaga aatcataaaa aatttatttg ctttgtgagc 1620
ggataacaat tataatagat tcaattgtga gcggataaca atttcacaca gaattcatta 1680
aagaggagaa attaagcatg cctaacatta cctggtgcga cctgcctgaa gatgtctctt 1740
tatggccggg tctgcctctt tcattaagtg gtgatgaagt gatgccactg gattaccacg 1800
caggtcgtag cggctggctg ctgtatggtc gtgggctgga taaacaacgt ctgacccaat 1860
accagagcaa actgggtgcg gcgatggtga ttgttgccgc ctggtgcgtg gaagattatc 1920
aggtgattcg tctggcaggt tcactcaccg cacgggctac acgcctggcc cacgaagcgc 1980
agctggatgt cgccccgctg gggaaaatcc cgcacctgcg cacgccgggt ttgctggtga 2040
tggatatgga ctccaccgcc atccagattg aatgtattga tgaaattgcc aaactggccg 2100
gaacgggcga gatggtggcg gaagtaaccg aacgggcgat gcgcggcgaa ctcgatttta 2160
ccgccagcct gcgcagccgt gtggcgacgc tgaaaggcgc tgacgccaat attctgcaac 2220
aggtgcgtga aaatctgccg ctgatgccag gcttaacgca actggtgctc aagctggaaa 2280
cgctgggctg gaaagtggcg attgcctccg gcggctttac tttctttgct gaatacctgc 2340
gcgacaagct gcgcctgacc gccgtggtag ccaatgaact ggagatcatg gacggtaaat 2400
ttaccggcaa tgtgatcggc gacatcgtag acgcgcagta caaagcgaaa actctgactc 2460
gcctcgcgca ggagtatgaa atcccgctgg cgcagaccgt ggcgattggc gatggagcca 2520
atgacctgcc gatgatcaaa gcggcagggc tggggattgc ctaccatgcc aagccaaaag 2580
tgaatgaaaa ggcggaagtc accatccgtc acgctgacct gatgggggta ttctgcatcc 2640
tctcaggcag cctgaatcag aagtaacggc cgtaatagta attaacatgt gagcaaaagg 2700
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 2760
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 2820
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 2880
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 2940
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3000
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3060
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3120
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 3180
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 3240
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 3300
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3360
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 3420
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 3480
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 3540
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 3600
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 3660
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 3720
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 3780
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 3840
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 3900
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 3960
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 4020
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 4080
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 4140
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 4200
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 4260
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 4320
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 4380
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 4440
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 4500
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<213> pGEX-kan质粒
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caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2580
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2640
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2700
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ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc 3780
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tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc 4080
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ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat 4500
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cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 4620
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aattattttt gatggcgttg gaatt 4945
<210> 6
<211> 999
<212> DNA
<213> serAΔ197
<400> 6
gtgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60
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cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420
gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480
cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc caaccctgct 540
cgtgcagctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600
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tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840
cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga tgttgctgat 900
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<210> 7
<211> 1019
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tactagggtg tctcagaacg gtcgtccggt tgttctgatc gctgacaaac tggctcagtc 60
taccgttgac gctctgggtg acgctgttga agttcgttgg gttgacggtc cgaaccgtcc 120
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tcagatcccg gctgctgacg ctaccctgcg tgaaggtgaa tggaaacgtt cttctttcaa 420
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gttcgctcag cgtctggctg ctttcgaaac caccatcgtt gcttacgacc cgtacgctaa 540
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<210> 8
<211> 5037
<212> DNA
<213> pGEX-serA
<400> 8
acgttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 60
gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 120
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gatggacctg gcttaatagc aggtggaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 1320
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cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 1440
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caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga 3780
tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga 3840
ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga 3900
gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt 3960
ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc 4020
gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat 4080
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gcatctcctg actcagctaa caataaaatt t 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-sdaC -F
<400> 19
ctaaaagctg aattatttgc attcctccag g 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-sdaC -R
<400> 20
attgcaatct ccgcaatctt ctactctctg t 31
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-serA -F
<400> 21
agtcagtgac ctgcccgttg attttcagag a 31
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-serA -R
<400> 22
cctgtctttt gaaatgttgt gtgcggattt g 31
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-sstT-F
<400> 23
gggatgtgcg acaacacaat gaaaggatcg a 31
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-sst -R
<400> 24
tgtttaaccc ctttcgtcta cggcggaagg g 31
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-tdcC -F
<400> 25
aattcattca tctcttttct catcctgagt t 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-tdcC -R
<400> 26
cctatcctca acgaattaat taagcgtcaa c 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-aceA-F
<400> 27
gttagcgtaa accaccacat aactatggag c 31
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-aceA-R
<400> 28
acaaccgttg ctgactgtag gccggataag g 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-cycA-F
<400> 29
tgaacaacac agacaggtac aggaagaaaa a 31
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> PKD-cycA-R
<400> 30
cattatcatg ctggatggcg caatgccatc c 31
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- gpmA-F
<400> 31
aatgtgctcc attgttagca acaaaaaagc c 31
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- gpmA-R
<400> 32
atattgccgc gacgaagcaa cagcaatgct t 31
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sdaA -F
<400> 33
tacactatgc gctgttatta gttcgttact g 31
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sdaA -R
<400> 34
gaatttatac ccgctttctc gtctgctgta a 31
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- mrfA -F
<400> 35
acatctgtat aaggaatttt taaggttcgt g 31
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- mrfA -R
<400> 36
aaatgactta tgaaatttag tgttgacaga c 31
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- pta -F
<400> 37
ccgccagctc agctggcggt gctgttttgt a 31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- pta -R
<400> 38
aaccggaaat aatcactatt tccggttttt t 31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- glyA -F
<400> 39
ataaggcgtt cacgccgcat ccggcatgaa c 31
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- glyA -R
<400> 40
tttggccttt ataggcggtc ctgttggaca a 31
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sdaC -F
<400> 41
acggtcaggc accttcccgg gctgaactgg c 31
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sdaC -R
<400> 42
ttcagctaag tcctttcgcg ccgctttcgg g 31
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- serA -F
<400> 43
cggtgtggag aagggataaa aaaacgggca a 31
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- serA -R
<400> 44
gcatccgcct ttcaacatat caaaaaataa t 31
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sstT -F
<400> 45
tcctgaaaga tgcgtcgaca gaacgcacca g 31
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- sstT -R
<400> 46
ggttttctca actttaaacg gatcaattcc c 31
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- tdcC -F
<400> 47
gaaccacagt taataaccaa aacaaccgga a 31
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- tdcC -R
<400> 48
cgaaaccggt gatttgagag acgcgagaaa g 31
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- aceA -F
<400> 49
tgatttcctg accctgccag gctaccgcct g 31
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- aceA -R
<400> 50
gcgttcacgc cgcatccggc aatcggtgca c 31
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- cycA -F
<400> 51
tatcatagac tgactaaagg ccgtagagcc t 31
<210> 52
<211> 31
<212> DNA
<213> Test- cycA -R
<400> 52
cagcttttag atcactcacc cgccagcgcg c 31
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ccatgcctaa cattacctgg tg 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
agcctgaatc agaagtaaga tct 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ccatggctca aatcttcaat ttta 24
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tgagttcgaa cgccgtcacg gt 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
agcggataac aatttcacac ag 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ttctgaggtc attactggat c 21
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gggctggcaa gccacgtttg gtg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ccgggagctg catgtgtcag agg 23

Claims (6)

1.一种L-丝氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；
(2)将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE-N上，获得第一重组表达载体；serB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；serC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；质粒PQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
将pGEX-kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX-kan上，获得第二重组表达载体；pGEX-kan质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述serAΔ197基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L-丝氨酸生产菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除sstT、sdaC、tdcC、cycA基因，再敲除mtfA、glyA、pta、sdaA基因，再敲除aceA、gpmA基因，最后敲除serA基因。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第二重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.由权利要求1-4任一项所述的构建方法构建的L-丝氨酸生产菌。
6.权利要求5所述的L-丝氨酸生产菌在发酵生产L-丝氨酸中的应用。
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