CN105820991A - 一种大肠杆菌基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大肠杆菌基因工程菌。本发明提供一种大肠杆菌基因工程菌，以CCTCC M 2016070的保藏号保藏于中国典型培养物保藏中心。利用本发明所提供的大肠杆菌基因工程菌发酵生产L‑Ser，在发酵培养约35 h，L‑Ser产量可达21.7 g/L，糖转化率为17‑19%，与现有谷氨酸棒杆菌生产L‑Ser技术相比具有发酵时间短、生产强度高等优点；与现有大肠杆菌生产L‑Ser技术相比具有产量高，转化率高等优点。

Description

一种大肠杆菌基因工程菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大肠杆菌基因工程菌。
背景技术
L-丝氨酸(L-Serine,L-Ser)已广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。此外，以L-Ser为原料还可以合成具有抗癌、抗艾滋、调节人体神经系统等药物20余种；其市场潜力巨大。
目前，L-丝氨酸的生产方法主要有酶法和微生物发酵法两种，其中由于微生物发酵法具有原料廉价、产物纯度高、易提取等诸多优点，因此其育种研究获得了广泛的关注。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是最常见的两种L-丝氨酸生产菌株，其中谷氨酸棒杆菌通过基因工程改造后，发酵培养96h，L-丝氨酸的产量可达到42g/L(EffectofcofactorfolateonthegrowthofCorynebacteriumglutamicumSYPS-062andL-Serineaccumulation,AppliedBiochemistryandBiotechnology,2014.173:1607-1617.)。然而，目前构建的大肠杆菌基因工程菌的L-丝氨酸产量仍然偏低，例如：克隆表达E.coliDH5α基因组中磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和抗反馈调节的磷酸甘油酸脱氢酶基因(serAfbr)，同时敲除敲除丝氨酸脱水酶编码基因sdaA，异柠檬酸裂解酶调节因子编码基因iclR，有氧呼吸调控蛋白编码基因arcA，苹果酸合酶编码基因aceB构建而成的基因工程菌分批补料发酵后，L-Ser产量仅至8.34g/L(ConstructionofanL-serineproducingEscherichiacoliviametabolicengineering,JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2014.41:1443-1450.)。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌基因工程菌，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种大肠杆菌基因工程菌，以CCTCCM2016070的保藏号保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)。
所述大肠杆菌基因工程菌为敲除丝氨酸脱水酶编码基因sdaA构建而成的基因工程菌。
本发明第二方面提供所述大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
1)将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk，磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变株serA2，连接到载体pSC上，构建重组质粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk，标记为质粒pSC-06，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；
2)敲除大肠杆菌E.coliW3110基因组中的sdaA基因片段，得到sdaA基因失活的菌株E.coliW3110-ΔsdaA，标记为E.coliSWZ-01；
3)将质粒pSC06转化至E.coliSWZ-01的感受态细胞，获得重组大肠杆菌SWZ-01/pSC06；
4)等离子体诱变重组大肠杆菌SWZ-01/pSC06，获得诱变菌株E.coliSWZ-02/pSC-06，保藏号为：CCTCCM2016070。
本发明第三方面提供所述大肠杆菌基因工程菌在生产L-Ser中的用途。
本发明第四方面提供一种L-Ser的生产方法，包括如下步骤：在合适的条件下诱导所述大肠杆菌基因工程菌(CCTCCM2016070)生产L-Ser。
在本发明的一些实施方式中，所述L-Ser的生产方法中，在发酵培养前，可以将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serA2构建入所述所述大肠杆菌基因工程菌(CCTCCM2016070)，还可以进一步包括种子培养步骤，具体可以包括如下步骤：
1)将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serA2构建入所述大肠杆菌基因工程菌；
2)种子培养：将步骤1构建获得的大肠杆菌基因工程菌接入培养基中，在合适条件下培养获得种子培养液；
3)发酵培养：将种子培养液接种至发酵培养液中，在合适的条件下诱导生产L-Ser。
所述磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk均可参见GenbankNo.AP009048基因组中的相应基因片段，所述抗反馈调节的磷酸甘油酸脱氢酶基因serA2的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤1)中，通过pSC载体(L-丝氨酸基因工程菌的构建及发酵条件优化，大连工业大学，硕士论文，刘岩(系中科院上海高等研究院联合培养研究生)，2015)将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serA2构建入所述所述大肠杆菌基因工程菌(CCTCCM2016070)。所述pSC载体包括卡那霉素抗性基因、pR和pL两个启动子和MCS1和MCS2两个多克隆位点，载体pSC的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤3)中，在合适的条件下诱导生产L-Ser的具体条件可以为：当菌体处于对数生长前期时，在35-38℃下，发酵约32-38小时，所述对数生长期前期通常指菌体生长至OD600＝15-17的阶段。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤3)中，诱导生产L-Ser时发酵液中的葡萄糖浓度小于5g/L，发酵培养液pH为6.8-7.0。
本发明利用生产菌E.coliSWZ-02/pSC-06(大肠杆菌基因工程菌)发酵生产L-Ser，在发酵培养约35h，L-Ser产量可达21.7g/L，糖转化率为17-19％，与现有谷氨酸棒杆菌生产L-Ser技术相比具有发酵时间短、生产强度高等优点，生产得到的L-丝氨酸可以广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。此外，本发明提供的大肠杆菌基因工程菌与现有大肠杆菌生产L-Ser技术相比具有产量高，转化率高等优点。
附图说明
图1显示为重组质粒pSC06的物理图谱。
图2显示为重组质粒pSC06的酶切鉴定；M:Markeλ-EcoT14Idigest；1：SacI单酶切后的DNA片段。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1
质粒pSC06的构建：
所述重组表达载体pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk，标记为pSC-06的构建方法为：提供磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serAfbr(标记为serA2)DNA片段的是重组质粒pSC-serA2serB和pSC-serC-pgk(参见L-丝氨酸基因工程菌的构建及发酵条件优化，大连工业大学，硕士论文，刘岩(系中科院上海高等研究院联合培养学生)，2015)。以重组质粒pSC-serC-pgkDNA为模板，在上下游引物中均设计限制性内切酶SacI，扩增pR-serC-pL-pgk基因串联盒的核苷酸序列(上游引物为：P1：5’-GAGCTCACGTTAAATCTATCACCG-3’(SEQIDNO.1，下划线SacI酶切位点)。下游引物为：P2：5’-GAGCTCTTAAGCATGCGTCGACACGCGTACGTATTGATGGAGTCAGTACCGAC-3’(SEQIDNO.2下划线为限制性内切酶的核酸序列，包含的酶切位点有SacI、AflII、SphI、SalI、MluI、SnaBI))，PCR产物经胶回收、SacI单酶切后，与经相同酶切后的重组质粒pSC-serA2serB进行T4连接(pR-serC-pL-pgk基因串联盒的核苷酸序列中不具备但表达载体pSC-serA2serB多克隆位点上具有限制性内切酶SacI酶切位点)，构建重组表达质粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk，并转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，涂布至含50mg/L卡那霉素的LB平板，挑取单克隆菌落转接至含50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养，提取质粒进行限制性内切酶SacI单酶切鉴定。根据序列分析，当正向连接时重组质粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk经SacI单酶切后，应分别获得7677bp和3385bp大小的DNA片段。如图2所示，DNA凝胶电泳的结果与预期值相符。将酶切验证正向连接正确的质粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果表明重组表达质粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk构建成功，标记为质粒pSC06，质粒pSC06的物理图谱如图1。
本实施例中LB培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
实施例2
sdaA基因的敲除：
根据E.coliJW1803-2(该菌株购自美国耶鲁大学大肠杆菌菌株库，E.coliGeneticResourcesatYale,CGSC,TheColiGeneticStockCenter，其sdaA基因已经被kana插入失活)的基因组序列设计引物，具体如下：
上游引物：5’-CAGGCATTACATCTGGGTCGTTATCACC-3’(SEQIDNO.3)
下游引物：5’-GGTGCAGGAAGTTCAGCCAGAATGTC-3’(SEQIDNO.4)
该菌株信息详见：http://cgsc.biology.yale.edu/Mutation.php？ID＝102886
扩增该菌sdaA基因座及上下游约500bp片段，将该DNA片段转化含有质粒pKD46(购自美国耶鲁大学大肠杆菌菌株库)的E.coliW3110，利用Red同源重组技术敲除E.coliW3110基因组的sdaA基因片段，再转化质粒pCP20(购自美国耶鲁大学大肠杆菌菌株库)，去除kan片段后得到sdaA基因失活的菌株，标记为SWZ-01。
实施例3
大肠杆菌基因工程SWZ-01/pSC06的构建：
提取重组表达质粒pSC06电转化至大肠杆菌SWZ-01的感受态细胞，涂布于LB平板(卡那霉素Kan，50μg/ml)进行培养，挑取重组单菌落，LB液体培养基(Kan，50μg/ml)中培养10-12h后，提取质粒进行酶切验证正确后，获得重组大肠杆菌SWZ-01/pSC06。
实施例4
大肠杆菌诱变菌株SWZ-02/pSC06的获得：
以重组大肠杆菌SWZ-01/pSC06为出发菌株，接种200μL工程菌SWZ-01/pSC-06的甘油管保藏菌液至50mLLB培养基中，37℃活化培养12h后，按照5％的接种量转接至50mL新鲜LB培养基中；当菌体生长至OD600为0.8-1.0时，取20μL的菌体悬浮液，在等离子体诱变ARTP系统(ARTP-Ⅱ，北京思清源)中处理不同的时间，然后再涂布至LB培养基平板上，挑选平板上的单克隆菌体，转接至试管中进行发酵筛选培养，在约2000左右单克隆菌株筛选中，筛选获得L-Ser的高产菌株，为了避免重组质粒pSC06的核苷酸序列在等离子体诱变过程中发生突变，将筛选获得的菌株多次无抗性传代后，消除重组质粒，从而获得宿主菌SWZ-02(宿主菌的保藏号为：CCTCCM2016070)，并将前期构建保存的质粒pSC06重新电转化至宿主中，构建重组菌SWZ-02/pSC06，作为后期实验用菌。
本实施例中LB培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
实施例5
诱变菌株SWZ-02/pSC06发酵生产L-Ser：
将菌株SWZ-02/pSC06，接入含50μg/ml卡那霉素的50mlLB培养基中，50ml培养基放入250ml的培养瓶中，37℃、200rpm，培养10～12h；培养后OD600吸光值在5～6之间。
以10％(v/v)的比例转接上步种子培养液至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中发酵。发酵初始温度为35℃，当菌体生长至对数生长期前期时，升温至38℃培养，诱导菌株产L-Ser。当发酵液中初始葡糖糖基本耗尽时，开始流加800g/L的葡萄糖溶液，并调控流速使发酵液中的葡萄糖浓度小于5g/L。发酵过程中，利用流加浓氨水的方法使发酵培养基pH保持在6.8-7.0左右。发酵约35h时，停止发酵，取菌液离心，取上清液测定L-Ser的产量，发现发酵液中最高可积累21.7g/L的L-Ser。与实验室前期构建的工程菌粒(11.4g/L)相比，提高了90.4，是目前报道的大肠杆菌产L-Ser的最高产量。
上述培养过程中所使用的LB培养基和发酵培养基的组成如下：
种子培养基为LB培养基，其组分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基：3g/LMgSO4·7H2O，0.017g/LCaCl2·2H2O，3g/LKH2PO4，1g/LNaCl，5g/L(NH4)2SO4，0.07g/LFeSO4·7H2O，0.11g/LNa-Citrate·2H2O，0.2g/L酵母膏，8g/L葡萄糖和1.5mL/L微量元素液1000×母液(7g/LCoCl2·6H2O，2.5g/LCuSO4·5H2O，25g/LH3BO3，16g/LMnCl2·4H2O，1.5g/LNa2MoO4·2H2O，3g/LZnSO4·7H2O)，pH值为pH6.8-7.0。
L-Ser产量的测定方法如下：
采用高效液相色谱异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法检测发酵液中L-丝氨酸的含量，具体衍生方法参照文献：杨智、阳利龙、祝文兵、等，异硫氰酸苯酯柱前衍生化RP-HPLC法测定人血浆中10种氨基酸的浓度[J]，中国临床药理学与治疗学，2011，16(5):549-552。
而液相色谱的分析条件为：发酵液中的L-Ser浓度通过岛津LC-20A测定。采用的色谱柱为：AgilentExtendC-18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。流动相为：(A)0.05mol/L乙酸钠(pH为6.50±0.05)和(B)甲醇：乙腈：水(20：60：20)，流速为1mL/min。梯度洗脱程序为：0-12min，流动相(B)浓度保持7％；12-13min流动相(B)浓度由7％升至100％；流动相(B)浓度保持100％至18min，18-19min流动相(B)浓度由100％降至7％，19-25min流动相(B)浓度保持7％，回到初始条件。使用紫外检测器检测标样及样品中L-Ser在254nm的吸收峰值，进样体积10μL，柱温45℃。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
保藏编号：CCTCCNO：M2016070
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内
保藏日期：2016.2.23
分类命名：大肠杆菌SWZ-02EscherichiacoliSWZ-02

Claims (7)

1.一种大肠杆菌基因工程菌，其保藏号为CCTCCM2016070。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌在生产L-Ser中的用途。
3.一种L-Ser的生产方法，包括如下步骤：在合适的条件下诱导如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌生产L-Ser。
4.如权利要求3所述的L-Ser的生产方法，其特征在于，所述L-Ser的生产方法中具体可以包括如下步骤：
1)将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serA2构建入权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌；
2)种子培养：将步骤1构建获得的大肠杆菌基因工程菌接入培养基中，在合适条件下培养获得种子培养液；
3)发酵培养：将种子培养液接种至发酵培养液中，在合适的条件下诱导生产L-Ser。
5.如权利要求4所述的L-Ser的生产方法，其特征在于，通过pSC载体将磷丝氨酸磷酸酶基因serB、磷丝氨酸氨基转移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脱氢酶基因serA的抗反馈调节突变体serA2构建入权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌。
6.如权利要求4所述的L-Ser的生产方法，其特征在于，所述步骤3)中，在合适的条件下诱导生产L-Ser的具体条件为：当菌体处于对数生长前期时，在35-38℃下，发酵32-38小时。
7.如权利要求4所述的L-Ser的生产方法，其特征在于，所述步骤3)中，诱导生产L-Ser时发酵液中的葡萄糖浓度小于5g/L，发酵培养液pH为6.8-7.0。
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