CN109439708B - 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法。所述大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3可用于生产可拉酸，具体方法为：采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。所述大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3保藏号为：CCTCC 2018200。本发明第一次通过一株大肠杆菌突变株，在37℃时通过酸诱导发酵生产，不仅产量高，而且细胞生长快，发酵时间短，提供了高效产可拉酸的技术方法。

Description

一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法。

背景技术

微生物胞外多糖包括细菌多糖、真菌多糖等，是菌体在生命活动过程中为了适应环境的变化、提高自身生存机率而合成的多糖，都具有各自独特的作用和独特的生物学活性。在细菌生命活动中，它所产生的荚膜多糖或是粘液多糖不仅有保持细胞内外水分平衡、防止细胞失水、保护细胞同时帮助其抵抗有害物质的作用。微生物胞外多糖在工业上也有广泛的应用。如黄原胶、结冷胶和热凝胶等都具有多种重要的生物活性和生理功能，并且由于可以通过发酵大规模生产，因此较植物多糖成本低廉，已在食品、轻工、石油等许多工业领域得到广泛的应用。进一步发展微生物多糖的工业应用，需要加强基础研究，其中包括提高微生物生产胞外多糖的能力研究。

可拉酸（colanic acid）是一种以松散形式包裹在大肠杆菌外的一种胞外酸性多糖，是一种M-抗原。可拉酸主要由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成，是一种高分子量的杂多糖，能使菌株表现出菌株粘液化现象，岩藻糖是一种兼具营养学及免疫学研究方面重要的一种糖组份，其提取及生产成本很高，具有很好的应用及工业价值。在逆境环境条件下，粘液化突变菌株较野生菌株有较强的存活力。2017年在杂志cell上首次报道了可拉酸化合物能够明显延长秀丽杆线虫的寿命，很多研究者拭目以待可拉酸在哺乳动物的实验研究。大肠杆菌生产可拉酸的产量很低，在已有的文献报道中，最高产量在1g/l。因此提高微生物发酵生产可拉酸的产量是很重要的科学研究。由于可拉酸导致的菌液粘液化现象，生产可拉酸的大肠杆菌的生长状态不理想，在已有的文献报道中，可拉酸浓度最高时菌株的OD₆₀₀在5.0左右。因此，生产高密度菌株是提高可拉酸产量的重要限速步骤。

在已有的研究结果中，大肠杆菌生产可拉酸的最适温度在20℃左右，且产量低，发酵时间长。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3生产可拉酸的方法。旨在解决现有大肠杆菌种分泌可拉酸效率低的问题。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3。

所述大肠杆菌种为实验室保藏的模式大肠杆菌菌种Escherichia coli S17-1的突变菌株，菌株S17-3已于2018年4月16 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC 2018200。本发明分离的埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5 – 3.0 um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。

经形态学鉴定和16S rDNA序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和S17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，保藏号为：CCTCC 2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pBhya-CAB的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌，细菌的密度（OD₆₀₀，600纳米光波时的吸光值）可达到32.0以上，是普通大肠杆菌的最高生长密度的3倍以上。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物。

进一步地，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的16S rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

本发明的第二方面他提供了前述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产可拉酸的用途。

所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

具体的，采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3生产可拉酸时，包括步骤：将埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。

进一步地，将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产可拉酸。

进一步地，将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。

所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明的第三方面提供了一种生产可拉酸的方法，所述方法包括步骤：采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。

所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

进一步地，所述方法包括步骤：将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产可拉酸。

进一步地，所述方法包括步骤：将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。

进一步地，所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步地，培养所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的培养基为LB培养基或2YT 培养基中的任意一种。

进一步地，所述培养基中葡萄糖浓度为15-30 g/L。经过试验发现，当培养基中的葡萄糖浓度为15-30 g/L均可以实现与实施例中所列举的葡萄糖浓度相同的效果。

进一步地，所述培养基中抗生素为氨苄青霉素，浓度为20-100 ug/mL。

进一步地，所述培养基的初始pH为4.5-5.0。

进一步地，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3采用摇床培养。

更进一步地，所述摇床培养转数为150-300 rpm。经过试验发现，当摇床培养转数为150-300 rpm均可以实现与实施例中所列举的摇床培养转数相同的效果。

进一步地，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3培养的温度为37 ℃摇瓶培养时不控氧容量，生物反应器控制培养时设置氧容量为30%或以上。

进一步地，所述转染可以采用现有技术中的转染方法，例如电转染的方法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明第一次通过一株大肠杆菌突变株，在37℃时通过酸诱导发酵生产，不仅产量高，而且细胞生长快，发酵时间短，提供了高效产可拉酸的技术方法。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：Escherichia coli S17-3

保藏号为：CCTCC 2018200；

保藏日期：2018年4月16 日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。

附图说明

图1为质粒pBCAB结构示意图。

图2为质粒pETACAB的结构示意图。

图3为质粒pBhya-CAB的结构示意图。

图4为可拉酸发酵表达的曲线图。

图5为纯化后的可拉酸。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates ；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999 ；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的获得及鉴定、保藏

Escherichia coli S17-3为世界各地实验室均会使用的模式大肠杆菌Escherichia coli S17-1的突变株，该大肠杆菌在发明人的实验室中经历过紫外诱变，以及长时间的培养，紫外诱变及自然的随机突变均有可能造成微生物的性状改变。该菌株由其培养性能的改变，以及后续的基因组测序和比较，均证实已经发生了多个基因位点的突变，并于2018年4月16 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC 2018200。

本发明分离的埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，具有此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5 um-3 um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐，在富含葡萄糖为碳源的培养基中生长迅速。

经形态学鉴定和16S rDNA序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和S17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3，保藏号为：CCTCC 2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pBhya-CAB的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物，非常适合高密度发酵培养。

此外，对Escherichia coli S17-3进行基因鉴定的方法，包括如下步骤：

采用16S rDNA序列分析实现菌株的分子生物学鉴定。首先取对数期菌体，离心后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取，以基因组DNA为模板, 再以引物对3P-F（agagtttgatcctggctcag，SEQ ID NO.12）以及3P-R: （ggttaccttgttacgactt，SEQ IDNO.13）为引物对进行PCR扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 sec、55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，30个循环；72 ℃延伸10 min。获得的PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化并回收，并送至上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，测序结果利用NCBI的Genank数据库进行比对分析。

结果如下，经PCR扩增的S17-3菌的16S rDNA的碱基长度为1430 bp，序列具体如SEQ ID NO.14所示，具体为：

Gggggaaagtctaaccatgtcagtcgaacggtaacaggaagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccca

实施例2 大肠杆菌S17-3高密度生长体系的构建方法

a．重组质粒pETACAB，pBhya-CAB的构建

构建的重组质粒pETACAB的图谱如图2所示。首先通过双酶切（酶切位点Nde I和Hind III）从实验室储存的质粒pET-A切下3870 bp片段（所述3870 bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

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然后对质粒pBCAB进行三酶切（酶切位点分别为Nde I，Hind III 和ApaL I），获得长度为3721 bp的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

ttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccat，其中质粒pBCAB是由公司合成，该质粒中phb基因是对罗氏真养菌聚羟基丁酸酯（PHB）合成途径phaCAB中的phb基因进行密码子优化由人工合成，优化得到的phb基因序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

ttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccat。

通过酶切获得的两个DNA片段（SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2）通过T4 DNA 连接酶连接，并转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到重组质粒pETACAB，质粒示意图如图2所示。其序列如SEQ ID NO.4所示。具体如下：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctagagggaaaccgttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca

构建的重组质粒pBhya-CAB图谱如图3所示。重组质粒pBhya-CAB的构建

如下：利用引物1P-F（tctgcacatgggttaagctttgcggccgcactcgagacgcgccctgtagcggcgcatt

，SEQ ID NO.5）和1P-R（ggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgcccc SEQ ID NO.6），以质粒pBCAB为模板，扩增得到2279 bp片段，标记为pBlu片段（pBlu的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体如下：

ggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcaga。

再利用引物2P-F（ggatccgaattccttctcttttactcgtttagcaacc，SEQ ID NO.8）以及2P-R（ctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgc ，SEQ ID NO.9），以质粒pETACAB （图2）为模板，扩增得到4018 bp片段，记为PCAB片段，所述PCAB片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体如下：

acccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattc）。

扩增得到的pBlu片段和PCAB片段互有有同源互补序列，经过overlap PCR获得环状PCR产物后转化大肠杆菌DH5α，经氨苄抗生素（100 ug/ml）筛选，获得含有重组质粒pBhya-CAB的转化子，该质粒的示意图如图3所示，其序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

其中双酶切体系为：

三酶切体系为：

酶切反应在37℃水浴锅，反应4h。酶切产物经Axygen PCR清洁试剂盒回

收纯化。酶切后的两片段经T4 DNA ligation 进行酶连。

其中，由引物对1P-F，1P-R扩增片段pBlue片段的PCR反应体系如下：

PCR程序如下：

1）95℃，3 min；

2）95℃，15 sec；

3）56℃，15 sec；

4）72℃，2.5 min；

5）循环从2）到4），30次；

6）72℃，5 min；

7）4℃，保存。

同样地，按照相同的PCR反应体系和PCR程序扩增PCAB片段，其中模板为质粒pETACAB，引物为2P-F，2P-R。

将片段pBlue和PCAB进行Overlap PCR的反应体系如下：

反应程序与扩增片段pBlue一样。

验证筛选阳性克隆pBhya-CAB进行的菌落PCR体系如下：

PCR程序如下：

1）98℃，2 min

2）98℃，30 sec

3）55℃，30 sec

4）72℃，4.5 min

5）循环从2)到4)，30次

6）72℃，5 min

7）4℃，保存。

b. 质粒转化获得重组大肠杆菌

重组质粒pETACAB和pBhya-CAB分别电转到菌株BW25113，该菌株也是一株模式大肠杆菌，其基因型为LacI ^q rrnB _T14 ΔlacZ _WJ16 hsdR514 ΔaraBAD _AH33 ΔrhaBAD _LD78，参考文献Baba et al. (2006)和S17-3（本发明的埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3），分别得到重组菌株BW25113/pETACAB，BW25113/pBhya-CAB，S17-3/pETACAB，S17-3/pBhya-CAB。

实施例3 重组大肠杆菌在初始低pH值发酵生产可拉酸

以重组大肠杆菌S17-3/pBhya-CAB为生产菌种，做摇瓶发酵：用接种环挑取大肠杆菌S17-3/pBhya-CAB接种到装3 ml LB的试管，37 ℃，200 r/min 摇床过夜培养。将过夜培养的大肠杆菌以1%的接种量接种到装有50 mL液体LB培养基的500 mL摇瓶中，培养基中加20 g/L的葡萄糖以及50 ul的100 ug/ml 的氨苄抗生素，同样在37℃、200 r/min摇床中进行发酵培养。培养基初始pH使用3 M的盐酸控制在pH 4.5。发酵24 h取样测定可拉酸产量。测定可拉酸产量的方法为：首先配制岩藻糖母液 10 g/L ，将母液稀释成1至10 g/L 的浓度梯度。取4.5 ml硫酸水溶液(6:1 v/v)中加入50 ul的标品溶液，100℃煮沸20 min。冷却至室温，分别测定A396nm和A427nm的吸光值(，随后加入100ul的1M的半胱氨酸盐酸盐，再次测定A’396nm和A’427nm的吸光值。计算△A396-△A427( △A396= A’396nm - A396nm ，△A427 = A’427nm - A427nm )。以岩藻糖浓度为横坐标，以△A396-△A427为纵坐标，绘制标准曲线。得到y = 0.0676x + 0.0194 (R² = 0.9968)。根据岩藻糖标准曲线得到生产的可拉酸中含有的岩藻糖的浓度，并通过可拉酸中岩藻糖所在百分含量(36.61%)得到可拉酸的含量。菌株在摇瓶发酵24h测得可拉酸浓度为10.22 g/l。

采用上罐分批不补料的方式进行发酵，在5 L罐中，用盐酸控制发酵罐的初始pH在4.5左右，发酵罐培养基为3 L LB及20 g/l 的葡萄糖，罐内温度控制在37℃。通风搅拌，溶氧控制为30%左右。取样并测定可拉酸浓度，两者随发酵时间变化曲线的结果如图4所示，在32 h左右，可拉酸的浓度在16 g/l 左右，葡萄糖的转化率约为80%。

实施例4 重组大肠杆菌发酵生产可拉酸分离纯化

发酵液沸水煮10~15 min，静置至室温。取一定量的发酵液，按等体积比加水稀释，10000 rcf 离心30 min，去菌体取上清。再按等体积比水稀释上清，10000 rcf 离心30min，去菌体取上清，直至离心后的上清澄清，确保发酵菌体去除干净。将澄清的上清在透析袋中4℃透析48 h。取出后的上清使用旋转仪进行蒸发浓缩，在浓缩液中加三倍体积的无水乙醇，4℃，静置16 h，然后于4℃以10000 g，离心30 min，去上清，再加预冷的无水乙醇洗两次，沉淀自然晾干，加去离子水打匀，再用3倍体积的无水乙醇进行醇沉，并重复以上醇沉过程两次，得到纯化后可拉酸纯，最后将可拉酸置于冷冻干燥机过夜冻干。成品如图5所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatggcacgt ctctcctcct tgcgacaccg gcaggacacc gggcgcttat ggtcggcaag 60

cgacgtccct gtagcaaggc aaaccatcgc ttcacgtgag atgctgaaaa cgaaagctca 120

tccttctgca ctggcgcacg tcgccagaaa gtattgttaa taaagcgtag tgaaactttt 180

gcacaaaaca atacaaactg tgtggattta tcttttagcg ataaaaatgg acctattttt 240

cttttggccg ggcggtgggg atgtttagcc ggttgctaaa cgagtaaaag agaaggaatt 300

cggatcctag agggaaaccg ttgtggtctc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga 360

tcgagatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt 420

tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac 480

gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa 540

tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca 600

ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg 660

tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata 720

ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc 780

gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc 840

cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta 900

tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg 960

cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc 1020

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 1080

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 1140

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 1200

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg 1260

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cctgccactg acgagaccat tccagccagg tagccgggtc gaacggaccc ggggtaactt 3840

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ggcacgtctc tcctccttgc gacaccggca ggacaccggg cgcttatggt cggcaagcga 3960

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caaaacaata caaactgtgt ggatttatct tttagcgata aaaatggacc tatttttctt 4140

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 2279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

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<400> 8

ggatccgaat tccttctctt ttactcgttt agcaacc 37

<210> 9

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<212> DNA

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<210> 10

<211> 4018

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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accgtcgata acctgtttgg taacgttgaa cagagaggtc aggttggtgt cgataacagc 420

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agcgatacgc tgggtcattt atcattcctc ctttatttac gttcaacagc cagagcaaca 780

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cagccagagc gtccagaccc gggataccag aagcagcagc gtgaccgtta ccttcggtac 3600

cctgccactg acgagaccat tccagccagg tagccgggtc gaacggaccc ggggtaactt 3660

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caaaacaata caaactgtgt ggatttatct tttagcgata aaaatggacc tatttttctt 3960

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<210> 11

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

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gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

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gcaccagcac caccacccag ggtagcttca cgcagctgaa cgtgaccttc gtcaacgaaa 3120

acgtccagga taccggtgtc agcgaagtcc agcagggtgg tcagcagggt aacagaagca 3180

gccgggtgtt caccacgagc agccagaaca gccagagcgg tagaaacgat ggtaccacca 3240

acgcagaaac ccagaacgtt gattttgtcc tgaccagaga tgtcacgagc aacttcgata 3300

gcacggatag cagcgtgttc gatgtagtcg tcccaggtag aaccagccat agaagcgtcc 3360

gggttacgcc aagaaaccag gaaaacggtg tgaccctgtt caacaacgtg acgaaccaga 3420

gaagattccg gctgcaggtc caggatgtag tatttgttga tgcacggcgg aaccatcagc 3480

agcggacgag cgtgaacttt gtcggtcagc ggtttgtact gcagcagctg gaagtattcg 3540

ttttcgaaaa caacagcacc ttcggtaaca gcaacgttac gaccaacttc gaaagcagat 3600

tcgtcggtct gagagatttt accacgggtc aggtcttcca tcatgttacg aacaccagca 3660

cgcagagatt caccaccaga ttcgatcagc agacgctgag cttccgggtt ggtagccagg 3720

aagttagccg gagacatagc gtcaacccac tgagagatag cgaaacggat acgctgacgg 3780

gttttagcgt cagcttcaac agcgtcagcc agttcggtca gagcacgagc gttcagcagg 3840

tagaaagcag cagcgaaacg gtacggcagg ttggtacgcc aagcgtcacc agcgaaacga 3900

cggtcgtgca gcggaccggt agcttcagct ttaccttcag ccatagcctg ccacagagca 3960

gagaagtctt tcatgtaacg ctgctggatg tcacccagct gagccggagc gattttaaca 4020

ccagccagag cgtccagacc cgggatacca gaagcagcag cgtgaccgtt accttcggta 4080

ccctgccact gacgagacca ttccagccag gtagccgggt cgaacggacc cggggtaact 4140

ttgaacggct gagatttacc ttcctgggta gaagcagcag cacctttacc ggtagccata 4200

tggcacgtct ctcctccttg cgacaccggc aggacaccgg gcgcttatgg tcggcaagcg 4260

acgtccctgt agcaaggcaa accatcgctt cacgtgagat gctgaaaacg aaagctcatc 4320

cttctgcact ggcgcacgtc gccagaaagt attgttaata aagcgtagtg aaacttttgc 4380

acaaaacaat acaaactgtg tggatttatc ttttagcgat aaaaatggac ctatttttct 4440

tttggccggg cggtggggat gtttagccgg ttgctaaacg agtaaaagag aaggaattcg 4500

gatcctttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 4560

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 4620

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4680

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 4740

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 4800

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 4860

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 4920

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 4980

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 5040

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 5100

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 5160

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 5220

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 5280

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 5340

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 5400

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 5460

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 5520

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 5580

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 5640

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 5700

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 5760

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 5820

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 5880

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 5940

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 6000

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 6060

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 6120

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 6180

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 6240

cgaaaagtgc cac 6253

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 14

<211> 1430

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggggaaagt ctaaccatgt cagtcgaacg gtaacaggaa gaagcttgct tctttgctga 60

cgagtggcgg acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg 120

gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct tcgggcctct 180

tgccatcgga tgtgcccaga tgggattagc tagtaggtgg ggtaacggct cacctaggcg 240

acgatcccta gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat 360

gccgcgtgta tgaagaaggc cttcgggttg taaagtactt tcagcgggga ggaagggagt 420

aaagttaata cctttgctca ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc 540

acgcaggcgg tttgttaagt cagatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcatct 600

gatactggca agcttgagtc tcgtagaggg gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg 660

cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacgaag actgacgctc 720

aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780

atgtcgactt ggaggttgtg cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaagtcga 840

ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc 960

cacggaagtt ttcagagatg agaatgtgcc ttcgggaacc gtgagacagg tgctgcatgg 1020

ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1080

cctttgttgc cagcggtccg gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacgacc agggctacac acgtgctaca 1200

atggcgcata caaagagaag cgacctcgcg agagcaagcg gacctcataa agtgcgtcgt 1260

agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat 1320

cagaatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380

gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg gcgctaccca 1430

Claims (8)

1.一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3用于生产可拉酸的用途，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3保藏号为CCTCC 2018200。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是指采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3生产可拉酸时，包括步骤：将埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是指将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产可拉酸，其发酵生产的碳源为葡萄糖；所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种生产可拉酸的方法，所述方法至少包括以下步骤：采用埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，以葡萄糖为碳源进行培养，并收集分泌物，分离获得可拉酸，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3保藏号为：CCTCC 2018200。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的培养基为LB培养基或2YT 培养基中的任意一种。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3作为生产菌种，其培养基条件为：培养基中葡萄糖浓度为15-30 g/L，培养基中抗生素为氨苄青霉素，浓度为20-100 ug/mL；培养基的初始pH为4.5-5.0。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌种Escherichia coli S17-3采用摇床培养，所述摇床的转数为150-300 rpm。

8.如权利要求4所述的方法， 其特征在于，所述方法包括：将质粒pBhya-CAB转染至埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3的基因组中，获得重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli，将重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli用于生产可拉酸；所述质粒pBhya-CAB的序列如SEQ ID NO.11所示。

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