CN115287314B - 可拉酸发酵放大工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可拉酸发酵放大工艺，该工艺包括以下步骤：将LBG培养基加入发酵罐中，全程控制pH值5.2，发酵培养第0‑4h，培养基溶氧控制在15‑25％；发酵培养第4‑12h，培养基溶氧控制在5‑10％；发酵培养第12‑24h，溶氧控制在25‑35％；经过24h发酵得到可拉酸；所用的工程菌是采用CRISPR/Cas9技术敲除出发菌株的核心糖合成模块相关基因簇waaL‑waaQ。本发明根据可拉酸工程菌的结构特点，对其层级放大发酵过程中的系列参数做了优化。同时在不同规模发酵过程中，对溶氧量的需求规律是不同的。本发明对上述过程的相关参数做了改进和优化，实现了可拉酸在大容量发酵罐中的放大发酵培养。

Description

可拉酸发酵放大工艺
技术领域
本发明涉及可拉酸发酵放大工艺。
背景技术
可拉酸(Colanic acid，CA)是一种细菌胞外多糖，由大多数大肠杆菌菌株以及肠杆菌科的其他物种产生，是菌体在生命活动过程中为了适应环境的变化、提高自身生存几率而合成的多糖。CA分子量较大，松散地包裹在菌体表面，使得菌体显示粘液状态，防止细胞失水、保护细胞同时抵御有害物质。在不利于生长的环境条件下，例如干燥、低压及低pH值下，粘液化菌株比野生菌株具有更强的生存力。
CA作为一种独特的活性生物聚合物，具有特殊的生物学特性和生理参数，具有广泛的应用前景。例如，CA由于其多孔的纤维素结构和位于胶体表面的大量亲水基团，是一种天然的水凝胶，具有优异的补水能力和柔软的质地，是未来化妆品和医疗保健市场的良好候选产品。
在以斑马鱼为模型的体内研究中发现，含有岩藻糖的多糖或寡糖具有明显的抗炎功能。另有研究表明，岩藻糖分子或者含有岩藻糖的多糖或寡糖可以更加容易渗入真皮中，增加皮肤厚度以及促进胶原结构更加细密化，因此岩藻糖及富含岩藻糖的多糖或寡糖可以减缓皮肤衰老。而CA是由D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸以及侧链上非化学计量修饰的O-乙酰和丙酮酸组成，其中L-岩藻糖含量高达约30％，这意味着CA在抗炎、增强免疫力及抗衰老等方面将具有巨大的应用潜力。
因此获取大量该多糖原料是未来进一步进行有效研究的基础。而至今没有见到该多糖规模化发酵的先例。
发明内容
本申请的目的在于提供可拉酸发酵放大工艺，实现了可拉酸在大容量发酵罐中的放大发酵培养，可拉酸浓度达到15.8g/L。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
可拉酸100-500L发酵罐发酵放大工艺，包括以下步骤：
将LBG培养基或改良LBG培养基加入发酵罐中，全程控制pH值5.2，接种量5％，温度为37℃；发酵培养第0-4h，培养基溶氧控制在15-25％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第4-12h，培养基溶氧控制在5-10％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第12-24h，溶氧控制在25-35％，通气量调整至3-4vvm；经过24h发酵后，发酵液中含有高浓度的可拉酸；
所述发酵罐的规格优选300L；
所述改良LBG培养基的组成是(g/L)：酵母粉5-10，蛋白胨15，NaCl 10，葡萄糖20；所述酵母粉的用量优选10；
所述的培养基，其加入量占发酵罐体积的30％-70％；
所述的接种量，接种的是含有高产可拉酸的工程菌的种子液或发酵液；
所述种子液的OD600值为2-4；
所述的工程菌是以BL21、MG1655、W3110菌株中的任何一株为出发菌株，但不局限于所述的上述菌株，采用CRISPR/Cas9技术敲除核心糖合成模块相关基因簇waaL-waaQ，具体包括以下步骤：
(1)敲除框的构建：以出发菌株基因组为模板，用引物LQ-arm1-F/R、LQ-arm2-F/R扩增waaL-waaQ基因簇上下游同源臂LQ-arm1和LQ-arm2，通过融合PCR，获得重组同源臂片段LQ-arm；
(2)含sgRNA质粒的构建：合成引物LQ-N20-F/R，以pTarget质粒为模板，全质粒PCR；环化PCR产物直接加入快切酶DpnI消化(37℃，1h)、柱回收；回收产物取5ul转化进DH5ɑ感受态，37℃培养，涂布Spc板，挑取阳性菌落提取pTarget-LQ质粒；
(3)敲除步骤：将LQ-arm片段和pTarget-LQ质粒转入出发菌株中，得到工程菌ΔLQ；
所述基因簇waaL-waaQ与细胞脂多糖的合成直接相关，该基因簇的敲除会显著改变菌株的生长性状和特征；同时基因簇waaL-waaQ合成细胞脂多糖所需的前体物质与CA合成所需前体物质有相同的成分。
所述的工程菌ΔLQ由于敲除了基因簇waaL-waaQ，抑制了基因簇waaL-waaQ与CA合成相互竞争前体能量物质，改变了菌株代谢流流向CA合成的路径，从而提高了物质利用率及CA产率。
所述的发酵液，沸水煮10-15min灭活工程菌，静置至室温；加水稀释、离心(10000g离心30min)、取上清液，重复该操作直至上清液澄清，确保工程菌去除干净；上清液透析至少48h，适度浓缩后，加入无水乙醇静置至少12h，离心(10000g离心30min)去上清，所得沉淀以无水乙醇洗涤若干次，沉淀自然晾干后，加去离子水打匀，加入无水乙醇醇沉若干次，得到纯化后的可拉酸。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本申请根据可拉酸工程菌的结构特点，对其层级放大(摇瓶、10L发酵罐、100-500L发酵罐)发酵过程中的系列参数做了优化。同时发现，在CA的不同规模发酵过程中，对溶氧量的需求规律是不同的；尤其在100-500L发酵罐中，溶氧量并非越高越好。本申请对上述过程中的相关参数做了改进和优化，实现了可拉酸在大容量发酵罐中的放大发酵培养，可拉酸浓度达到15.8g/L。
附图说明
图1是不同pH值下可拉酸产量。
图2是不同温度下可拉酸产量。
图3是不同接种量下可拉酸产量。
图4是不同装液量下可拉酸产量。
图5是不同培养基下可拉酸产量。
图6是实施例7中可拉酸产量。
图7是实施例8中可拉酸产量。
图8是实施例9中可拉酸产量。
图9是不同溶氧方案下可拉酸产量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1工程菌株的构建
以BL21为出发菌株，采用CRISPR/Cas9技术敲除核心糖合成模块相关基因簇waaL-waaQ，得到工程菌ΔLQ；具体包括以下步骤：
a)敲除框的构建：以BL21菌株基因组为模板，用引物LQ-arm1-F/R、LQ-arm2-F/R扩增waaL-waaQ基因簇上下游同源臂LQ-arm1和LQ-arm2。通过融合PCR，获得重组同源臂片段LQ-arm。引物序列见表1。
b)pTarget-LQ质粒的构建：合成引物LQ-N20-F/R，以pTarget质粒为模板，全质粒PCR。环化PCR产物直接加入快切酶DpnI消化(37℃，1h)、柱回收；回收产物取5ul转化进DH5ɑ感受态，37℃培养，涂布Spc板。挑取2-3个阳性菌落送测序。提取测序正确的pTarget-LQ质粒(浓度在200-300ng/ul)备用。
c)基因簇敲除。将LQ-arm片段和pTarget-LQ质粒转入出发菌株中，通过PCR验证得到敲除正确的工程菌ΔLQ，即为高产可拉酸的工程菌。
表1引物序列
实施例2发酵初始pH值优化
以实施例1构建得到的工程菌ΔLQ为出发菌株，采用LBG培养基，1％接种量，500mL摇瓶发酵培养，用稀盐酸调整培养基初始pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在37℃发酵培养24h，然后收集发酵液上清比较可拉酸产量。结果见图1，发酵结果显示当初始pH值4.5时CA产量最高，达到0.8g/L。
所述的接种量是含有工程菌的种子液占培养基总体积(种子液+培养基)的百分比(下同)；所述种子液的OD600值为2-4(下同)。
实施例3发酵初始温度优化
以实施例1构建得到的工程菌ΔLQ为出发菌株，采用LBG培养基，1％接种量，500mL摇瓶发酵培养，在pH值4.5条件下，分别在30℃、32℃、35℃和37℃下培养24h，然后收集发酵液上清比较产量。结果见图2，发酵结果显示当温度为37℃时CA产量最高为0.8g/L。
实施例4菌株接种量优化
以实施例1构建得到的工程菌ΔLQ为出发菌株，采用LBG培养基，500mL摇瓶发酵培养，在pH值4.5及37℃条件下，分别设置了1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％不同接种量进行优化比较，培养24h，收集发酵液上清比较产量。结果见图3，发酵结果显示当接种量为5％时CA产量最高，达到2.5g/L。
由于该工程菌敲除了一个长度为11k的基因簇waaL-waaQ，在一定程度改变了工程菌最佳合成CA的菌密度，因此造成了最佳接种量的变化。
实施例5发酵装液量优化
以实施例1构建得到的工程菌ΔLQ为出发菌株，采用LBG培养基，500mL摇瓶发酵培养，装液量分别设置为50ml，100ml，200ml和300ml，在pH值4.5、37℃及5％接种量条件下进行优化比较，培养24h，收集发酵液上清比较产量。结果见图4，发酵结果显示当装液量为200ml时CA产量最高，达到6.7g/L。
通过分析比较4种不同的装液量发现对CA的产量产生了明显的影响。由于各组变量中只有装液量的差异，而装液量的不同会影响发酵液中的溶氧状态，因此可能本质的原因是由于摇瓶中溶氧状态的差异，造成了产量的差异。
一般而言，装液量越少，发酵液中溶氧越高，装液量越大溶氧将越低。当装液量从50ml逐步增加至200ml时，CA的产量在不断的增高，说明该工程菌在溶氧降低的情况下更有利于产物的合成。
而当装液量从200ml增加为300ml时，产量出现了明显的下降，该结果说明当溶氧低于一定值时将不利于产物的合成。
综上分析，该工程菌可能最适的溶氧状态在某一个特殊的范围中，溶氧不能太高也不能太低。
实施例6发酵培养基优化
以实施例1构建得到的工程菌ΔLQ为出发菌株，在pH值4.5、37℃及5％接种量条件下，采用五种培养基(g/L)：LB(酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10)、LBG(酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，葡萄糖20)、TBG1(酵母粉24，蛋白胨12，甘油5，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54，葡萄糖20)、TBG2(酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54，葡萄糖20)、M9O(Na2HPO4·12H2O40.2,NH4Cl 1，KH2PO4 3，NaCl 3，CaCl2 0.014，MgSO4 0.24，葡萄糖21.47)进行优化比较，500mL摇瓶发酵培养，装液量200ml，培养24h，收集发酵液上清比较产量。结果见图5，发酵结果显示当使用LBG培养基时CA产量最高为6.7g/L。
实施例7 10-L罐发酵工艺优化1
将摇瓶发酵的参数移植到10-L罐发酵。
控制初始pH值4.5，接种量5％(种子液同实施例2，下同)，温度为37℃，使用LBG培养基，装液量为5L，通过控制转速和通气量发酵过程中全程将溶氧控制在10％～20％水平(通气量在1-3vvm)；接种后全程不调控pH。培养24h，随着发酵的进行发酵液pH会出现先上升后下降的现象最终稳定在pH值5.2。最终得到的CA产量为7.3g/L，不甚理想，结果见图6。
实施例8 10-L罐发酵工艺优化2
基于实施例7结果发现在发酵罐中以初始pH值4.5(后续不控pH)发酵时，发酵液的pH值最终会稳定在5.2。因此有可能pH值5.2情况下最适合该菌株的生长状态。
进一步优化初始工艺为：通过流加盐酸或者氨水全程控制(发酵罐自动调节；下同)pH值5.2，接种量5％，温度为37℃，通过控制转速和通气量发酵过程中全程将溶氧控制在10％～20％水平(通气量在1-3vvm)。最终得到的CA产量有进一步提升，达到了9.8g/L，结果见图7。
该方案不同于摇瓶发酵的最适pH值4.5，是首次通过发酵优化发现。以往做条件优化的报道都是在摇瓶中分析，数据是基于摇瓶初始pH值为准，通过摇瓶设置不同初始pH进行优化，得到的最优pH直接应用于发酵罐，而没有考虑发酵罐与摇瓶的差异性。
实施例9 10-L罐发酵工艺优化3
基于上述结果进一步对发酵培养基LBG进行了优化，分别采用培养基LBG2(酵母粉5，蛋白胨15，NaCl 10，葡萄糖20)和LBG3(酵母粉10，蛋白胨15，NaCl 10，葡萄糖20)，结果显示当使用LBG3时产量最高，达到12.0g/L，结果见图8。
由于在整个发酵过程中没有进行补料，LBG3相对于LBG和LBG2含有更高比例的酵母粉和蛋白胨，以及可能具有更为合理的碳氮比例，因此最终的产量会更高。
实施例10 300-L罐发酵工艺优化1
基于10-L发酵罐得到的工艺，进一步将该工艺放大到300-L发酵罐中，使用LBG3培养基，装液量为100L，全程控制pH值5.2，将工程菌ΔLQ的种子液按5％(种子液体积/培养基体积总体积)接种量接种至发酵罐中，温度为37℃，通过控制转速和通气量发酵过程中全程将溶氧控制在10％～20％水平(通气量在1-3vvm)。在发酵罐中培养24h收集样品检测产量为10.1g/L，OD600为10，其结果不如10-L发酵罐中的产量。对应的结果如图9所示。
实施例11 300-L罐发酵工艺优化2
由于发酵罐体系放大，产量出现了下降，推测是由于罐体放大造成了溶氧情况出现差异，因此进一步对300-L发酵罐中溶氧工艺进行控制优化。使用LBG3培养基，控制pH5.2，接种量5％，温度为37℃。
由于300-L发酵罐中全程控制溶氧为10-20％没有得到较好的结果，因此考虑控制溶氧在5-10％、20-30％、30-40％，分三种情况进行研究。
结果发现全程控制溶氧在5-10％时，细胞生长不太好，最终OD600仅为8，产量为9g/L。
控制溶氧在20-30％时，细胞生长良好，OD600达到15，但是产量并不高，为9.2g/L，可能由于菌株一直生长并没有效地进行产物合成。
控制溶氧在30-40％时，细胞生长良好，OD600达到19，但是产量进一步降低至5.2g/L(图9)，可能由于菌株一直生长导致并没有能量物质供应到产物的合成中。
为了平衡菌体的生长以及产物的合成，在后续的研究中控制溶氧不超过30％，同时为了提高菌体生长密度，需要根据菌体生长特点按不同时间段对溶氧情况进行调整。
发酵培养0-4h溶氧控制在15-25％水平，此阶段通气量为2vvm不变，通过转速与溶氧偶联控制，此阶段控制较高的溶氧让菌体快速适应和生长，达到较高的初始密度；第4-12h溶氧控制在5-10％水平，此阶段通气量为2vvm保持不变，通过转速与溶氧偶联控制，经过前面4h菌株的适应和初始菌密度的积累，此阶段降低溶氧降低菌株的生长速率，一定程度上生长消耗的能量物质将应用于产物的合成；第12-24h溶氧控制在25-35％区间，通气量调整至3-4vvm，同时调整转速与溶氧偶联控制，该阶段菌株达到稳定及衰亡期，通过提高溶氧情况在一定程度上可提高菌株的活力，进一步积累产物。最终通过分阶段控制溶氧，OD600达到14，产量进一步提高，达到15.8g/L，结果如图9所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.可拉酸300 L发酵罐发酵放大方法，其特征在于包括以下步骤：
将LBG3培养基加入发酵罐中，装液量为100L，全程控制pH值5.2，接种量5%，温度为37℃；发酵培养第0-4 h，培养基溶氧控制在15-25%，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第4-12 h，培养基溶氧控制在5-10%，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第12-24 h，溶氧控制在25-35%，通气量调整至3-4 vvm；经过24 h发酵后，发酵液中含有高浓度的可拉酸；
所述的接种，接种的是含有高产可拉酸的工程菌的种子液或发酵液，所述种子液或发酵液的OD600值为2-4；
所述的工程菌是以BL21为出发菌株，采用CRISPR/Cas9技术敲除核心糖合成模块相关基因簇waaL-waaQ；
所述LBG3培养基的组成是（g/L）：酵母粉10，蛋白胨 15，NaCl 10，葡萄糖 20。
2.根据权利要求1所述的发酵放大方法，其特征在于：所述的工程菌由以下步骤制得：
（1）敲除框的构建：以出发菌株基因组为模板，用引物LQ-arm1-F/R、LQ-arm2-F/R扩增waaL-waaQ基因簇上下游同源臂LQ-arm1和LQ-arm2，通过融合PCR，获得重组同源臂片段LQ-arm；
（2）含sgRNA质粒的构建：合成引物LQ-N20-F/R，以pTarget质粒为模板，全质粒PCR；环化PCR产物直接加入快切酶DpnI消化、柱回收；回收产物转化进DH5ɑ 感受态，37℃培养，涂布Spc板，挑取阳性菌落提取pTarget-LQ质粒；
（3）敲除步骤：将LQ-arm片段和pTarget-LQ质粒转入出发菌株中，得到工程菌ΔLQ；
所述引物的序列如下表所示：
引物名称 5’-3’序列 LQ-arm1-F cgcgctattgttacaagaggaagcctg LQ-arm1-R atttcgaaaaatcctggtcataaaggttttacctttataatgatgataacttttccaaaactgcttgactg LQ-arm2-F gttatcatcattataaaggtaaaacctttatgaccaggatttttcgaaatggcttttccac LQ-arm2-R cttcttcattttgcgcagcaatcagcg LQ-N20-F acattgccagtcttgcacctgttttagagctagaaatagcaagtt LQ-N20-R actagtattatacctaggactgagc
。
3.根据权利要求1所述的发酵放大方法，其特征在于：所述的发酵液，沸水煮10-15 min灭活工程菌，静置至室温；加水稀释、离心、取上清液，重复该操作直至上清液澄清，确保工程菌去除干净；上清液透析至少48 h，适度浓缩后，加入无水乙醇静置至少12 h，离心去上清，所得沉淀以无水乙醇洗涤若干次，沉淀自然晾干后，加去离子水打匀，加入无水乙醇醇沉若干次，得到纯化后的可拉酸。
4.根据权利要求3所述的发酵放大方法，其特征在于：所述离心是10000 g离心30 min。
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