CN113969256A - 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株及其构建方法和应用。该基因工程菌株可以在40‑50℃条件下发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖，通过敲除起始菌中的6‑磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6‑磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，N‑乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因，阻断了N‑乙酰氨基葡萄糖的分解代谢途径，并引入过表达6‑磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6‑磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，使得N‑乙酰氨基葡萄糖可以在胞外积累。本发明解决了现有技术中生产N‑乙酰氨基葡萄糖发酵温度低、成本高等问题，实现了N‑乙酰氨基葡萄糖在高于40℃条件下的高温发酵生产，具有较高的工业化利用价值。

Description

一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)是生物体内多种多糖的组成单位，由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高，并广泛应用于食品、制药和化妆品行业。在食品行业，它可以作为食品抗氧化剂，婴幼儿食品添加剂，以及糖尿病患者甜味剂。在制药行业，它作为新型生化药品，在临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物。同时它也主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿瘤起到抑制和治疗作用。除此之外，N-乙酰氨基葡萄糖对于骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。在化妆品行业，它可以与D-葡萄糖醛酸形成高分子粘多糖生产透明质酸，有广阔的前景，市场巨大。
N-乙酰氨基葡萄糖的生产方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法为通过酸水解甲壳素得到N-乙酰氨基葡萄糖，需要从蟹壳和虾壳中提取甲壳素，再经过酸水解得到氨基葡萄糖，之后利用浓盐酸水解N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰直接生成氨基葡萄糖，乙酸酐可使氨基葡萄糖乙酸化生产N-乙酰氨基葡萄糖。但该方法对环境不友好，同时污染大，且产品不适用于海鲜过敏症患者。与化学法相比，酶催化法和微生物发酵法属于环境友好型生产方法，但是酶催化法需要使用酶催化几丁质降解进而合成N-乙酰氨基葡萄糖，受制于底物虾蟹壳预处理困难、关键酶活性低、产物分离纯化困难，导致规模化生产难度较大。微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖是目前最具前景的方法，也是本领域重点研究方向。
相对于40℃以下的低温发酵，高温发酵具有最小化污染的风险，提高原料转化速率，并且能够降低热交换成本等优势。到目前为止，关于微生物通过代谢工程改造生产N-乙酰氨基葡萄糖的报道中，发酵温度均为38℃及以下，没有高温生产N-乙酰氨基葡萄糖的专利及报道。因此，很有必要开发一种低成本的、强健的微生物平台来高温高产N-乙酰氨基葡萄糖。
嗜热细菌比如凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，可以在高温条件下(40℃及以上)生长、并利用有机碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)进行发酵生产。例如其中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580是一株兼性厌氧、革兰氏阳性、内生孢子型细菌，它能够利用各种五碳糖和六碳糖，具有较快的细胞生长速率，从而可以缩短发酵周期。它的遗传操作稳定并且是美国食品和药物管理局公认的GRAS(generally regardedas safe)菌株，并且该菌株可以在高达50℃的高温条件下进行高温发酵。这些优点表明菌株ATCC 14580可作为一株理想的平台菌株。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种可以在高温条件下生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以嗜热地衣芽孢杆菌为例，通过消除地衣芽孢杆菌的N-乙酰氨基葡萄糖的分解代谢途径，引入N-乙酰氨基葡糖生产的代谢途径，实现N-乙酰氨基葡萄糖的胞外积累，使得N-乙酰氨基葡萄糖可以在高温条件下高效生产。本发明所提出的菌株构建思路可应用于多种产品的高温生产菌株的开发，所提出的菌株和发酵工艺在N-乙酰氨基葡萄糖的工业高温发酵生产方面具有良好的应用前景。
本发明的一个方面提供了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株，该基因工程菌株可以在40-50℃条件下发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，该基因工程菌株的起始菌为嗜热菌。
进一步地，该基因工程菌株的起始菌为芽孢杆菌。
优选地，该基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌等。
优选地，该基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580，所述地衣芽孢杆菌ATCC 14580可以从ATCC网站直接购买获得。
进一步地，该基因工程菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BNGS1，保藏号为CCTCC NO:M2020054，于2020年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
进一步地，该基因工程菌株的起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢和向胞内转运的途径被阻断。
优选地，该N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢的途径，通过6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因中一种或多种的失活或缺失而被阻断；向胞内转运N-乙酰氨基葡萄糖的途径，通过N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP和nagP基因中的一种或两种的失活或缺失而被阻断。
进一步地，该基因工程菌株中被引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和 6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
进一步地，该6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，该 6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，该6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因可根据地衣芽孢杆菌全基因组DNA 序列GenBank No.NC_006270.3为模板通过PCR扩增得到。
优选地，该6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化基因可根据酿酒酵母全基因组GenBankNo.NM_001179949获得，并进行密码子优化进行全基因合成。
本发明的另一方面还提供了如上所述的基因工程菌株的构建方法。在一个具体实施例中，该方法包括，使起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6- 磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因中的一种或多种失活或缺失；引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
进一步地，该方法包括以下步骤：
A.敲除起始菌中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N- 乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP基因和nagP基因，得到敲除菌株；
B.构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因以及6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶 GNA1基因双表达载体；
C.将该双表达载体转入到步骤A所得到的敲除菌株中，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的该基因工程菌株。
进一步地，该双表达载体的构建方法为引入启动子，将表达载体与所述启动子，glmS基因，GNA1基因进行串联表达。
优选地，该表达载体为pHY300PLK。
优选地，该启动子分别为Pals，P43，Pst以及Papre。
进一步地，Pals启动子序列如SEQ ID NO.3所示，P43启动子序列如SEQ ID NO. 4所示，Pst启动子序列如SEQ ID NO.5所示，Papre启动子序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因来源于地衣芽孢杆菌或其它具有相同功能嗜热酶的微生物，例如凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌等。
优选地，6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1基因来源于酿酒酵母或其它具有相同功能嗜热酶的微生物，例如马克思克鲁维酵母、红棕拿逊酵母等。
优选地，该起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580。
本发明的还有一方面还提供了如上所述的基因工程菌株的应用，尤其是在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
进一步地，该生产的发酵温度为25℃-50℃。
优选地，该生产的发酵温度为40℃-50℃。
进一步地，该生产采用的碳源为葡萄糖、甘油、木糖或阿拉伯糖等。
进一步地，将基因工程菌株进行种子培养得到种子培养液，然后以葡萄糖为碳源在发酵培养基中进行二次活化，最后转入发酵罐中进行发酵，得到N-乙酰氨基葡萄糖。具体包括如下步骤：
1)种子培养：将基因工程菌株液接到种子培养基中，加入四环素抗性，在50 ℃，200rpm条件下，培养12-16h，进行种子活化；
2)摇瓶培养：按5％接种量，将活化的种子转入装有发酵培养基的摇瓶中，加入四环素抗性，在50℃，200rpm条件下，过夜培养，进行二次活化；
3)发酵培养：按4％接种量，转入发酵罐中，加入四环素抗性，加入碳源在 40℃-50℃进行分批补料发酵，培养至发酵结束。
优选地，步骤1)中的种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠，优选含有：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
优选地，步骤2)中的发酵培养基包括以下成分：酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和葡萄糖，优选含有：12g/L酵母粉，6g/L蛋白胨，6g/L硫酸铵，18.75g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，30g/L葡萄糖。
优选地，步骤2)中的摇瓶为500毫升锥形瓶，发酵培养基装液量为75毫升。
优选地，步骤3)中的发酵培养基包括以下成分：酵母粉、玉米浆干粉、硫酸铵、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和葡萄糖，优选含有：12g/L酵母粉，6g/L 玉米浆干粉，6g/L硫酸铵，18.75g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，30 g/L葡萄糖。
优选地，步骤3)中的发酵条件为：3mol/L盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节 pH使其维持7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速为600rpm，葡萄糖浓度持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行补糖。
本申请提供的基因工程菌株，实现了N-乙酰氨基葡萄糖的高温生产。与此同时，在基因工程菌株进行发酵过程中，由于是组成型表达，所以不需要添加诱导剂。另外在发酵过程中对降温需求很低，且高温生产大大提升了发酵速率，同时因为高温可以阻止其它微生物生长，可以实现开放发酵，有效降低了生产成本。本发明实现了在40℃-50℃较高温度下发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，具有较高的工业化利用价值。本发明所提出的菌株构建思路可应用于多种产品的高温生产菌株的开发，所提出的菌株和发酵工艺在N-乙酰氨基葡萄糖的工业高温发酵生产方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为在地衣芽孢杆菌工程菌中N-乙酰氨基葡萄糖的合成和代谢途径。
具体实施方式
在本申请工程菌中的N-乙酰氨基葡萄糖的合成和代谢途径如附图1所示：谷胺酰胺(Gln)作为氨基酸供体，氨基葡萄糖合酶通过glmS基因编码转化6-磷酸果糖(F-6-P)生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN-6-P)，6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN-6-P)在6- 磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶(GNA1)作用下转化为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖 (GlcNAc-6-P)，再经磷酸化酶催化脱磷酸生成N-乙酰氨基葡萄糖，然后分泌到细胞外，由于6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因被敲除失活或敲除减少了N-乙酰氨基葡萄糖前体在细胞内的消耗，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP基因和nagP基因被敲除，所以在无法转运的情况下，工程菌株能够在细胞外积累高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖。
本申请通过在嗜热地衣芽孢杆菌中构建一条高温发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路，增强N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达，同时，失活或敲除导致N-乙酰氨基葡萄糖消耗和回流的基因，阻止N-乙酰氨基葡萄糖的回流消耗，使得工程菌株能积累高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖。
本发明的一个方面提供了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株，该基因工程菌株可以在40-50℃条件下发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖。
在一个具体实施例中，该基因工程菌株的起始菌株中的N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径被阻断。
在另一个具体实施例中，该N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径，通过6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP和nagP基因中的一种或多种的失活或缺失而被阻断。
本文中“阻断”是指，通过各种基因工程的方法，将某一途径阻断。包括将该途径中的一种或多种催化酶的基因失活或缺失，从而使该途径不能进行。
本领域技术人员可知，起始菌株也可以不含上述被缺失或失活的酶或被阻断的途径，如6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因， N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因等，那么在构建基因工程菌株时，这些基因或途径自然缺失，不需要额外进行基因工程操作使其失活或缺失或被阻断。
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。
下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：敲除地衣芽孢杆菌nagP基因
1、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为nagP-U-F: GGTACCCGGGAGCTCATGAATGAGGAGGATCACACAGTC(SEQ ID NO.7)和下游引物为nagP-U-R: GAAGGGGCTTATCTTAGTTAAAACCCCTTTCGATGATATT(SEQ ID NO.8)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到nagP基因上游800bp 片段。
2、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为nagP-D-F: AAAGGGGTTTTAACTAAGATAAGCCCCTTCTGAGGAAG(SEQ ID NO.9)和下游引物为nagP-D-R:GCGTCGGGCGATATCGAGGCGGACGAATACTTTGAC (SEQ ID NO.10)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到 nagP基因下游800bp片段。
3、将上述两种PCR产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pKVM，得到敲除载体pKVM-△nagP。
4、将敲除载体pKVM-△nagP转化到大肠杆菌S17-1中，与地衣芽孢杆菌进行接合转移，并通过同源重组敲除原理进行nagP基因的敲除，引物选择nagP-U-F: GGTACCCGGGAGCT CATGAATGAGGAGGATCACACAGTC(SEQ ID NO.7)，以及nagP-D-R:GCGTCGGGCGATATCGAGGCGGACGAATACTTTGAC(SEQ ID NO.10)，能扩增到1600bp的片段证明已经筛选到了正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，得到敲除菌株MW3△nagP。
实施例2：继续敲除地衣芽孢杆菌gamP基因
1、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为gamP-U-F: GGTACCCGGGAGCTCTAGGGTAAAACCGTATGCCGC(SEQ ID NO.11)和下游引物为gamP-U-R:AAGCAACTTCAGTTTTCCGGCATTCTCCTTATGTCAA(SEQ ID NO.12)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到gamP 基因上游800bp片段。
2、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为gamP-D-F: AAGGAGAATGCCGGAAAACTGAAGTTGCTTTTGAGGAATC(SEQ ID NO.13) 和下游引物为gamP-D-R:GCGTCGGGCGATATCGGAAATTTCTCTGCCAGCTGC (SEQ ID NO.14)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到 gamP基因下游800bp片段。
3、将上述两种PCR产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pKVM，得到敲除载体pKVM-△gamP。
4、将敲除载体pKVM-△gamP转化到大肠杆菌S17-1中，与地衣芽孢杆菌敲除菌株MW3△nagP进行接合转移，并通过同源重组敲除原理进行gamP基因的敲除，引物选择gamP-U-F:GGTACCCGGGAGCTCTAGGGTAAAACCGTATGCCGC (SEQ ID NO.11)，以及gamP-D-R: GCGTCG GGCGATATCGGAAATTTCTCTGCCAGCTGC(SEQ ID NO.14)，能扩增到1600bp的片段证明已经筛选到了正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，得到敲除菌株MW3△nagP△gamP。
实施例3：继续敲除地衣芽孢杆菌gamA基因
1、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为gamA-U-F: GGTACCCGGGAGCTCGGTCAAGAGGGAGGGTTCACTT(SEQ ID NO.15)和下游引物为gamA-U-R: TGTCAGTCATTCAATGTTTTTCTCCTTTCCACAAAATAAA(SEQ ID NO.16)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到gamA基因上游800bp 片段。
2、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为gamA-D-F: GGAAAGGAGAAAAACATTGAATGACTGACAAAATCGGTTA(SEQ ID NO.17) 和下游引物为gamA-D-R:GCGTCGGGCGATATCTCATATCGGGGATCGGCTT (SEQ ID NO.18)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到 gamA基因下游800bp片段。
3、将上述两种PCR产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pKVM，得到敲除载体pKVM-△gamA。
4、将敲除载体pKVM-△gamA转化到大肠杆菌S17-1中，与地衣芽孢杆菌敲除菌株MW3△nagP△gamP进行接合转移，并通过同源重组敲除原理进行gamA 基因的敲除，引物选择gamA-U-F: GGTACCCGGGAGCTCGGTCAAGAGGGAGGGTTCACT(SEQ ID NO.15)T，以及gamA-D-R:GCGTCGGGCGATATCTCATATCGGGGATCGGCTT(SEQ ID NO. 18)，能扩增到1600bp的片段证明已经筛选到正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，得到敲除菌株MW3△nagP△gamP△gamA。
实施例4：继续敲除地衣芽孢杆菌基因簇nagAB
1、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为nagAB-U-F:GGTACCCGGGAGCTCCCGCACGGTCAGCTTA(SEQ ID NO.19)和下游引物为nagAB-U-R: GGGAATCTTTTTTGATACAACTCTAGTTGTCTAGACCAAT(SEQ ID NO.20)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到nagAB基因簇上游800bp片段。
2、根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为nagAB-D-F: ACAACTAGAGTTGTATCAAAAAAGATTCCCACATT(SEQ ID NO.21)和下游引物为nagAB-D-R:GCGTCGGGCGATATCCCTCTTCATATCAATGACGAA(SEQ ID NO.22)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到nagAB 基因簇下游800bp片段。
3、将上述两种PCR产物纯化后各取1微升为模板，以无缝克隆技术将其插入到载体pKVM，得到敲除载体pKVM-△nagAB。
4、将敲除载体pKVM-△nagAB转化到大肠杆菌S17-1中，与地衣芽孢杆菌敲除菌株MW3△nagP△gamP△gamA进行接合转移，并通过同源重组敲除原理进行 nagAB基因簇的敲除，引物选择nagAB-U-F: GGTACCCGGGAGCTCCCGCACGGTCAGCTTA(SEQ ID NO.19)，以及nagAB-D-R:GCGTCGGGCGATATCCCTCTTCATATCAATGACGAA(SEQ ID NO. 22)，能扩增到1600bp的片段证明已经筛选到了正确的双交换阳性菌落，基因敲除成功，得到敲除菌株MW3△nagP△gamP△gamA△nagAB。
实施例5：GNA1和glmS双表达载体的构建
根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为Pals-F:TATCGATAAGCTTGATATCGAAGGTGACGCCTATTTCACT (SEQ ID NO.23)和下游引物为Pals-R: GTCCGGCAGGCTCATAGCCCTCACTCCTCCATT(SEQ ID NO.24)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到Pals启动子序列。
根据P43启动子进行全基因合成，设计引物为：上游引物为P43-F: TATCGATAAGCTT GATATCGTGTCGACGTGCATGCAG(SEQ ID NO.25)和下游引物为P43-R:GTCCGGCAGGCTCATAGCCCTCACTCCTCCTATAAT(SEQ ID NO.26)。并经PCR扩增得到P43启动子序列。
根据Pst启动子进行全基因合成，设计引物为：上游引物为Pst-F: TATCGATAAGCTT GATATCGCATGATGTGGGCGTTTTT(SEQ ID NO.27)和下游引物为Pst-R:GTCCGGCAGGCTCATAGCCCTCACTCCTCCATT(SEQ ID NO. 28)。并经PCR扩增得到Pst启动子序列。
根据PaprE启动子进行全基因合成，设计引物为：上游引物为PaprE-F: TATCGATAAGC TTGATATCGCAGCATAATGAACATTTACTCATG(SEQ ID NO. 29)和下游引物为PaprE-R:GTCCGGCAG GCTCATAGCCCTCACTCCTCCATT(SEQ ID NO.30)。并经PCR扩增得到PaprE启动子序列。
根据酿酒酵母全基因组GenBank No.NM_001179949获得6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1基因，并进行密码子优化进行全基因合成，并进行PCR扩增得到优化后的GNA1序列，设计引物为：上游引物为gna1-F: GGAGGAGTGAGGGCTATGAGCCTGCCGGACG(SEQ ID NO.31)，下游引物为： gna1-R:TACAATACCACACATTTTGCGGATCTGCATTTC(SEQ ID NO.32)。
根据地衣芽孢杆菌MW3基因组(GenBank No.NC_006270.3)序列设计引物：上游引物为glmS-F: ATGCAGATCCGCAAAATGTGTGGTATTGTAGGTTATATTG(SEQ ID NO.33) 和下游引物为glmS-R: CGGCCGCTCTAGAACTAGTGCTACTCCACCGTCACACTCTT(SEQ ID NO.34)。以地衣芽孢杆菌MW3基因组DNA为模板经PCR扩增得到glmS基因序列。
将PCR扩增回收得到的Pals启动子序列，GNA1以及glmS三个基因片段各取 1微升，与pHY300PLK载体进行无缝克隆构建，得到载体 pHY300PLK-Pals-GNA1-glmS。
将PCR扩增回收得到的P43启动子序列，GNA1以及glmS三个基因片段各取 1微升，与pHY300PLK载体进行无缝克隆构建，得到载体 pHY300PLK-P43-GNA1-glmS。
将PCR扩增回收得到的Pst启动子序列，GNA1以及glmS三个基因片段各取1 微升，与pHY300PLK载体进行无缝克隆构建，得到载体pHY300PLK-Pst-GNA1- glmS。
将PCR扩增回收得到的PaprE启动子序列，GNA1以及glmS三个基因片段各取 1微升与pHY300PLK载体进行无缝克隆构建，得到载体 pHY300PLK-PaprE-GNA1-glmS。
实施例6：BNGS1，BNGS2，BNGS3及BNGS4工程菌的构建
将pHY300PLK-Pals-GNA1-glmS载体通过电转导入到敲除菌株MW3△nagP△ gamP△gamA△nagAB中，即为能合成N-乙酰氨基葡萄糖的地衣芽孢杆菌，命名为 BNGS1。
将pHY300PLK-P43-GNA1-glmS载体通过电转导入到敲除菌株MW3△nagP△ gamP△gamA△nagAB中，即为能合成N-乙酰氨基葡萄糖的地衣芽孢杆菌，命名为 BNGS2。
将pHY300PLK-Pst-GNA1-glmS载体通过电转导入到敲除菌株MW3△nagP△ gamP△gamA△nagAB中，即为能合成N-乙酰氨基葡萄糖的地衣芽孢杆菌，命名为 BNGS3。
将pHY300PLK-PaprE-GNA1-glmS载体通过电转导入到敲除菌株MW3△nagP △gamP△gamA△nagAB中，即为能合成N-乙酰氨基葡萄糖的地衣芽孢杆菌，命名为BNGS4。
实施例7：重组地衣芽孢杆菌BNGS1摇瓶发酵
1、种子和发酵培养基
种子培养基为LB培养基(成分为氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L)，液体培养时添加四环素抗性25mg/L。
发酵培养基包括以下成分：12g/L酵母粉，6g/L蛋白胨，6g/L硫酸铵，18.75 g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，30g/L葡萄糖。
2、摇瓶发酵过程
将BNGS1菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h，培养时加四环素抗性25mg/L。按5％接种量转接至500毫升锥形瓶，装液量75毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养时添加四环素抗性25mg/L，发酵时长50h，培养温度40℃，取样1mL后在12000rpm转速下，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
3、检测方法
柱子型号：Aminex HPX-87H
流动相：0.005mol/L硫酸溶液
流速：0.5mL/min
柱温：60.0℃
进样量：20.00uL
检测器：示差检测器
检测器温度：35℃
经检测，50小时摇瓶发酵后，发酵液中的N-乙酰氨基葡萄糖达2.3g/L。
实施例8：重组地衣芽孢杆菌BNGS2摇瓶发酵
将BNGS2菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h，培养时加四环素抗性25mg/L。按5％接种量转接至500毫升锥形瓶，装液量75毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养时添加四环素抗性25mg/L，发酵时长50h，培养温度40℃，取样1mL后在12000rpm转速下，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
经检测，50小时摇瓶发酵后，发酵液中的N-乙酰氨基葡萄糖达1.5g/L。
实施例9：重组地衣芽孢杆菌BNGS3摇瓶发酵
将BNGS3菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h，培养时加四环素抗性25mg/L。按5％接种量转接至500毫升锥形瓶，装液量75毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养时添加四环素抗性25mg/L，发酵时长50h，培养温度40℃，取样1mL后在12000rpm转速下，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
经检测，50小时摇瓶发酵后，发酵液中的N-乙酰氨基葡萄糖达0.57g/L。
实施例10：重组地衣芽孢杆菌BNGS4摇瓶发酵
将BNGS4菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h，培养时加四环素抗性25mg/L。按5％接种量转接至500毫升锥形瓶，装液量75毫升发酵培养基中进行摇瓶发酵，培养时添加四环素抗性25mg/L，发酵时长50h，培养温度40℃，取样1mL后在12000rpm转速下，离心5min，并用0.22微米水相滤膜过滤，利用高效液相色谱进行检测。
经检测，50小时摇瓶发酵后，发酵液中的N-乙酰氨基葡萄糖达0.32g/L。
实例11：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在37℃条件下分批补料发酵，1L发酵罐
1、种子培养：将BNGS1菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h。培养时加四环素抗性25mg/L。
2、摇瓶培养：按5％接种量转接到装有75毫升的发酵培养基中(摇瓶体积 500mL)，摇瓶培养时添加四环素抗性25mg/L。在50℃，200rpm转速下过夜培养。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至1L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速 600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵70小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到12g/L。
实例12：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在50℃条件下分批补料发酵，1L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至1L全自动发酵罐中，培养温度50℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速 600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵70小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到2.8g/L。
实例13：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在37℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵69.5小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到50.9g/L。
实例14：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在37℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵73小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到52.5g/L。
实例15：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在40℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度40℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持7.0，通气量1.5vvm，初始搅拌转速600 r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵54小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到28.1g/L。
实例16：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在40℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度40℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵56小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到34.6g/L。
实例17：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在45℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度45℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵50小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达到24g/L。
实例18：重组地衣芽孢杆菌BNGS1在50℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例11。
2、摇瓶培养：同实施例11。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度50℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵24小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达4.1g/L。
实例19：重组地衣芽孢杆菌BNGS2在37℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：将BNGS2菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h。培养时加四环素抗性25mg/L。
2、摇瓶培养：按5％接种量转接到装有75毫升的发酵培养基中(摇瓶体积 500mL)，摇瓶培养时添加四环素抗性25mg/L。在50℃，200rpm转速下过夜培养。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵64小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达23.6g/L。
实例20：重组地衣芽孢杆菌BNGS2在45℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例19。
2、摇瓶培养：同实施例19。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度45℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵49小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达11.6g/L。
实例21：重组地衣芽孢杆菌BNGS3在37℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：将BNGS3菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h。培养时加四环素抗性25mg/L。
2、摇瓶培养：按5％接种量转接到装有75毫升的发酵培养基中(摇瓶体积 500mL)，摇瓶培养时添加四环素抗性25mg/L。在50℃，200rpm转速下过夜培养。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵64小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达10.8g/L。
实例22：重组地衣芽孢杆菌BNGS3在45℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例21。
2、摇瓶培养：同实施例21。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度45℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵58小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达7.2g/L。
实例23：重组地衣芽孢杆菌BNGS4在37℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：将BNGS4菌株种子液接到5mL LB中，在50℃，200rpm转速下培养12-16h。培养时加四环素抗性25mg/L。
2、摇瓶培养：按5％接种量转接到装有75毫升的发酵培养基中(摇瓶体积500mL)，摇瓶培养时添加四环素抗性25mg/L。在50℃，200rpm转速下过夜培养。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度37℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵64小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达6.1g/L。
实例24：重组地衣芽孢杆菌BNGS4在45℃条件下分批补料发酵，50L发酵罐
1、种子培养：同实施例23。
2、摇瓶培养：同实施例23。
3、发酵培养：以4％(v/v)的接种量，将活化的种子液转接至50L全自动发酵罐中，培养温度45℃，添加四环素抗性工作浓度25mg/L，添加3mol·L-1的盐酸溶液及25％(v/v)的氨水调节pH使其维持在7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速600r·min-1。葡萄糖浓度要持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行连续恒流补糖，培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱检测。
经检测，发酵58小时，发酵液中乙酰氨基葡萄糖含量可达2.9g/L。
实施例25：BNGS1菌种稳定性测试
将发酵结束后的BNGS1菌液在25mg/mL的LB固体平板上划线，在50℃条件下培养18h后，挑取10个单菌落分别接到装有75mL发酵培养基的500mL摇瓶中，摇床温度为40℃，转速为200rpm，葡萄糖浓度为30g/L，在接种后70h用HPLC 检测N-乙酰氨基葡萄糖产量稳定性，其产量浓度在2.24g/L-2.41g/L之间。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
安徽银创生物科技股份有限公司
<120> 一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcctgc cggacggctt ttatatccgc cgcatggaag aaggcgacct ggaacaggtc 60
acggaaacgc tgaaagtcct gacgacggtc ggcacgatca cgccggaaag ctttagcaaa 120
ctgatcaaat attggaacga agcgacggtc tggaacgaca acgaagacaa aaaaatcatg 180
cagtataacc cgatggtcat cgtcgacaaa cgcacggaaa cggtcgcggc gacgggcaac 240
atcatcatcg aacgcaaaat catccatgaa ctgggcctgt gcggccatat cgaagacatc 300
gcggtcaaca gcaaatatca gggccagggc ctgggcaaac tgctgatcga ccagctcgtc 360
actatcggct tcgactacgg ctgctataaa atcatcctgg actgcgacga aaagaatgtc 420
aaattctacg aaaaatgcgg ctttagcaac gcgggcgtcg aaatgcagat ccgcaaataa 480
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<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtgtggta ttgtaggtta tattggccag cttgatgcaa aggaaatttt acttaaaggt 60
ttggagaagc tggagtatcg cggctacgat tcagctggaa tcgctgtagc gaacgaagac 120
ggcgtacacg tgtttaaaga aaaaggacgg atcgccgatc ttcgcgcagc cgttgatgca 180
aacgtgaagt cacaagcggg aatcggacac acgcgctggg cgactcacgg agaaccgagc 240
cgtctaaacg ctcatccgca tcaaagcgca tcaggccgtt ttacacttgt tcataacggc 300
gtcatcgaaa actatgttca actgacgcgc gaatatttac acgatgtaac ccttaaaagc 360
gatacggata cagaggttgt cgttcaagtg atcgagcaat tcgtcaataa cggccttgac 420
acagaagaag cgttccgcca aacgctcatg ctgctcaaag gctcttatgc gattgcatta 480
ttcgatcatg aaaacaaaga aacaatctat gttgcgaaaa ataaaagccc gcttcttgtc 540
ggccttggag acaatttcaa tgttgtcgcg tctgatgcga tggcgatgct tcaagtgaca 600
aacgaatacg tggagcttat ggataaagaa atggtgattg tcacagacaa aaaagtcgtg 660
atcaaaaacc tcgacggaga attgatgtca cgtgcctcat atattgcaga gcttgatgcg 720
agcgatatcg aaaaaggcac ataccctcac tacatgttaa aagaaatcga tgaacagccg 780
cttgtcatgc ggaaaatcat tcagacgtac caagatgaaa acggcaagct ctccattcct 840
ggagacattt caaacgctgt tgctgaagcc gaccgcgtct atatcattgc ctgcggaact 900
agctaccatg caggtcttgt cggcaagcaa tttattgaaa catgggcgaa agttccggct 960
gaagtccatg tcgcaagcga attctcttac aatatgccat tgctttctga gaagccgctg 1020
tttatcttta tttctcaaag cggagaaacg gctgacagcc gcgcggttct cgtacaggtg 1080
aaaaagctcg gacacaaagc gctgacattg accaacgtac cgggatccac gctttcccgt 1140
gaagcggact atacgctttt actgaatgcc ggccctgaaa tcgcggtagc gtcaacaaaa 1200
gcatatacgg cgcaaatcgc cgttctcgca attttggcag ccgtgactgc ggaaagccgc 1260
ggcaaagaac tcggctttga tcttgtcaaa gagctcggca ttatcggaaa cgcgatggaa 1320
gccctttgcg accaaaaaga cgaaatggaa atgatcgccc gtgaatactt gaccgtaaca 1380
cgcaatgcat ttttcatcgg ccgcggcctc gactatttcg tctgcctcga aggatccctg 1440
aagctgaaag agatttctta cattcaagct gaaggcttcg ccggcggcga attgaagcac 1500
ggtacgatcg cattgatcga agacggcaca ccggtcatcg cccttgcgac acaggagcac 1560
gtcaacttaa gcatccgcgg aaacgtcaaa gaagtgacag cccgcggcgc caacccttgc 1620
gtgatctccc tgaaaggcct ggaagaagca gacgaccgct tcgtcctgcc tgaagtgcat 1680
ccggagctcg caccgctcgt ctccgtcatc ccgctgcagc tgatcgcata ctacgcagcg 1740
ctgcaccgcg gctgtgacgt tgataagcca cggaacctgg cgaagagtgt gacggtggag 1800
tag 1803
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atgttcagcc gaagagctgc ttttccgaaa tgcagttctt cggcaacaac cataaaataa 120
cgaagatggc gcagctccat taatcactca ttcctttctg aatgcgattt cagtcgtttt 180
acatattaat tgtaagacaa agaagtattg gaaaacaatt tccacaagat gtatatttaa 240
taatacaata attttattaa aaattcattg taaatgaatg aaaatggagg agtgagggct 300
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tgtcgacgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacggagc ggaatttcca 60
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tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 180
tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 240
ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttacc gtgatttcgt gtatcattgg 300
tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 360
ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 420
attataggag gagtgagggc t 441
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgatgtgg gcgttttttt tatacaaaaa aacgcactga tttacaaaac cttaacattc 60
ggttcaaacc ctttttacat agaaccttta ctctatacgt gtaggacaaa ttacacatta 120
tacgcggagg agtgagggct 140
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cagcataatg aacatttact catgtctatt ttcgttcttt tctgtatgaa aatagttatt 60
tcgagtctct acggaaatag cgagagatga tatacctaaa tagagataaa atcatctcaa 120
aaaaatgggt ctactaaaat attattccat ctattacaat aaattcacag aatagtcttt 180
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tgtcagtcat tcaatgtttt tctcctttcc acaaaataaa 40
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ggaaaggaga aaaacattga atgactgaca aaatcggtta 40
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ggtacccggg agctcccgca cggtcagctt a 31
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gtccggcagg ctcatagccc tcactcctcc att 33
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tatcgataag cttgatatcg tgtcgacgtg catgcag 37
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gtccggcagg ctcatagccc tcactcctcc tataat 36
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ggaggagtga gggctatgag cctgccggac g 31
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tacaatacca cacattttgc ggatctgcat ttc 33
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atgcagatcc gcaaaatgtg tggtattgta ggttatattg 40
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cggccgctct agaactagtg ctactccacc gtcacactct t 41

Claims (28)

1.一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株在40-50℃条件下发酵生产所述N-乙酰氨基葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为嗜热菌。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为芽孢杆菌。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BNGS1，保藏号为CCTCC NO:M2020054，于2020年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心。
7.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢途径和向胞内转运的途径被阻断。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖及所述N-乙酰氨基葡萄糖中间产物分解代谢的途径，通过6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因中一种或多种的失活或缺失而被阻断；向胞内转运N-乙酰氨基葡萄糖的途径，通过N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP和nagP基因中的一种或两种的失活或缺失而被阻断。
9.根据权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株中被引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
10.根据权利要求8所述的基因工程菌株，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。
11.根据权利要求9所述的基因工程菌株，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。
12.一种如权利要求1-11任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括，使起始菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因中的一种或多种失活或缺失；引入过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因。
13.一种如权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述包括以下步骤：
A.敲除起始菌中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶nagB和gamA基因，6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶nagA基因，以及N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白gamP基因和nagP基因，得到敲除菌株；
B.构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因以及6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1基因双表达载体；
C.将所述双表达载体转入到步骤A所得到的所述敲除菌株中，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的所述基因工程菌株。
14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述双表达载体的构建方法为引入启动子，将表达载体与所述启动子，glmS基因，GNA1基因进行串联表达。
15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pHY300PLK。
16.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述启动子分别为Pals，P43，Pst以及Papre。
17.根据权利要求16所述的构建方法，其特征在于，所述Pals启动子序列如SEQ ID NO.3所示，所述P43启动子序列如SEQ ID NO.4所示，所述Pst启动子序列如SEQ ID NO.5所示，所述Papre启动子序列如SEQ ID NO.6所示。
18.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶glmS基因来源于地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。
19.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1基因来源于酿酒酵母、马克思克鲁维酵母或红棕拿逊酵母。
20.根据权利要求12或13所述的构建方法，其特征在于，所述起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580。
21.根据权利要求1-11中任一项所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述生产的发酵温度为40℃-50℃。
23.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述生产采用的碳源为葡萄糖、甘油、木糖或阿拉伯糖。
24.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述生产包括以下步骤：
1)种子培养：将所述基因工程菌株液接到种子培养基中，加入四环素抗性，在50℃，200rpm条件下，培养12-16h，进行种子活化；
2)摇瓶培养：按5％接种量，将步骤1)中活化的种子转入装有发酵培养基的摇瓶中，加入四环素抗性，在50℃，200rpm条件下，培养12-16h，进行二次活化；
3)发酵培养：按4％接种量，将步骤3)中二次活化的种子转入发酵罐中，加入四环素抗性，加入碳源在40℃-50℃进行分批补料发酵，培养至发酵结束。
25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中的种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
26.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中的发酵培养基包括以下成分：酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和葡萄糖。
27.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中的发酵培养基包括以下成分：酵母粉、玉米浆干粉、硫酸铵、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和葡萄糖。
28.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中的发酵条件为：3mol/L盐酸溶液及体积比为25％的氨水调节pH使其维持7.0，通气量为1.5vvm，初始搅拌转速为600rpm，葡萄糖浓度持续控制在30g/L，待糖浓度消耗至3-4g/L时进行补糖。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836361A (zh) * 2022-04-11 2022-08-02 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115287314B (zh) * 2022-09-15 2023-08-01 深圳柏垠生物科技有限公司 可拉酸发酵放大工艺

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195094A (zh) * 2014-08-01 2014-12-10 张帆 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN105176879B (zh) * 2015-10-14 2017-12-12 江南大学 一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
CN106479945B (zh) * 2015-12-29 2019-10-01 山东润德生物科技有限公司 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌
CN108570441A (zh) * 2018-05-15 2018-09-25 大自然生物集团有限公司 重组枯草芽孢杆菌及其过表达谷氨酰胺合成酶促进合成乙酰氨基葡萄糖的方法
CN108546668A (zh) * 2018-05-15 2018-09-18 大自然生物集团有限公司 重组枯草芽孢杆菌及其过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法
CN108998402B (zh) * 2018-08-28 2020-05-29 江南大学 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836361A (zh) * 2022-04-11 2022-08-02 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用
CN114836361B (zh) * 2022-04-11 2023-09-12 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用

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