CN114836361B - 一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用 - Google Patents

一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用，属于生物工程技术领域。以模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7为基础，通过游离质粒表达含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请筛选得到适宜于GlcN生产的酶活高、转化率高、耐高温且稳定性高的具有N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的脱乙酰酶，应用于工业生产中，不会被噬菌体侵蚀，且不需要提取转乙酰酶和酶解后的灭酶等纯化步骤，工艺流程简化。

Description

一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)，又称为葡萄糖胺，其分子式为C6H13O5N。GlcN是天然的氨基单糖，在自然界中广泛存在，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)是甲壳素(又称为几丁质)的结构单元。在微生物或动物来源的多糖中，GlcN通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)或以3-O-α-羧乙基-D-葡萄糖胺(胞壁酸)的形式存在。在人体的软骨组织、结缔组织和细胞膜中，GlcN是代谢过程中多种生物大分子合成的中间产物。
由于GlcN逐渐被普及和广泛使用，在过去的十多年，全球GlcN的需求量在不断增加，刺激了其工业化生产的发展。目前，GlcN的工业化生产方法主要是通过酸水解反应得到，但酸水解反应往往需要较苛刻的反应条件。利用酸解法生产GlcN有两种途径：一种是利用几丁质生产GlcN，通过来源于甲壳类动物的几丁质在高温条件下的酸水解得到GlcN；另一种是利用GlcNAc生产GlcN，将微生物发酵法得到的GlcNAc进行酸水解，脱乙酰基得到GlcN。但是在酸水解的过程中需要大量的酸试剂，会产生大量的废酸，这会造成环境污染，同时也容易造成设备的损耗，并且在产品安全方面会存在潜在的问题。目前正在寻求能够应用于GlcN的工业化生产的环境友好型生产方法。从植物中提取GlcN这一生产过程需要长时间的提取和高温，并且产量过低，不适用于工业化生产。之后的研究报道了生产GlcN和GlcNAc的生物技术方法，但是在使用重组大肠杆菌发酵生产GlcN的过程中，GlcN降解速度快，并且其降解产物对宿主细胞具有抑制作用，这限制了GlcN产量的增加。且通过改造后的工程菌株的产量仍不是很高，且发酵过程中所需的葡萄糖较多，工业化成本高。虽然目前已有多种生产GlcN的环境友好型方法，但都尚未应用于GlcN的工业化大规模生产。因此，目前需要一种环境友好的，转化率高、低成本且工艺简单的GlcN生产方法来取代现有的传统酸解法脱乙酰工艺。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株；本发明所要解决的另一技术问题在于提供该解淀粉芽孢杆菌工程菌株在高产氨基葡萄糖中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株，以模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7为基础，通过游离质粒表达含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列连接在N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的N端。
进一步的，以枯草杆菌游离质粒为表达载体构建的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株。
进一步的，本申请所用的枯草杆菌游离质粒为质粒pMA5。
本申请成功构建了含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的重组质粒pMA5-AMS-PDdac，并转化至解淀粉芽孢杆菌，获得高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株。
所述的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株在制备氨基葡萄糖中的应用。
进一步的，包括以下步骤：将高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株活化后，接种到LB培养基，恒温震荡条件下培养至OD660大于3.0，得到种子液；将种子液以2-10％的接种量接种于含有N-乙酰氨基葡萄糖底物的发酵培养基，恒温震荡条件下进行逐级放大发酵培养，得到氨基葡萄糖。
进一步的，所述恒温震荡条件为30～37℃、100～250rpm。
进一步的，所述发酵培养基的配方为：牛肉膏1.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米粉2.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L。
进一步的，N-乙酰氨基葡萄糖底物的浓度为40g/L。
含有所述的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株的发酵液也在本申请的保护范围内。
进一步的，发酵液的制备工艺如下：将高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株接种在发酵培养基中，在30～37℃、100～250rpm条件下培养，得到高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株的发酵液。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供解淀粉芽孢杆菌在发酵过程中进行催化反应，以解淀粉芽孢杆菌作为生产菌株，与大肠杆菌相比，其体内没有内毒素和外毒素，且在工业生产中不会受到噬菌体侵蚀，不仅安全可靠，更为工业化绿色生产氨基葡萄糖提供了有效的参考与借鉴。
(2)本技术从基因资源库中定向发掘新型脱乙酰酶基因，并利用基因克隆表达手段筛选得到适宜于GlcN生产的酶活高、转化率高、耐高温且稳定性高的具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性的脱乙酰酶。
(3)与传统的酶法制氨基葡萄糖相比，本技术使用了微生物发酵法，与传统酶法相比，不需要提取转乙酰酶和酶解后的灭酶等一系列纯化步骤，减少了工艺流程。
附图说明
图1为质粒构建Nde I/Xho I双切验证图；
图2为不同N-乙酰氨基葡萄糖添加量对解淀粉芽孢杆菌生长的影响图；
图3为不同N-乙酰氨基葡萄糖添加量对解淀粉芽孢杆菌脱乙酰基酶活的影响图；
图4为不同N-乙酰氨基葡萄糖添加量对氨基葡萄糖转化率的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例所使用的材料和试剂盒如下：E.coli DH5α感受态(南京诺唯赞生物科技有限公司)，引物合成与DNA测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)，2×Phanta MaxMaster Mix高保真酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)，限制性内切酶Xho I和Nde I(Takara)，DNA marker(南京诺唯赞生物科技有限公司)，质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，胶回收试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，一步克隆连接Exnase II试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，pMA5质粒为芽孢杆菌表达质粒。
以下实施例所使用的菌株为模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7，可通过商业化购买获得。
实施例1分泌N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建
分别以解淀粉芽孢杆菌DMS7基因组为模板，利用引物AMS-F和AMS-R扩增淀粉酶(AMS)基因信号肽的核苷酸序列；利用引物PDdac-F和PDdac-R扩增不含原始信号肽的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因核苷酸序列(PDdac)。
AMS-F：5’-aaaaggagcgatttacatatgATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTGC-3’；
AMS-R：5’-ggtattttgggtaaggcagcCCGACTACAAAAACATTAGCCGT-3’；
PDdac-F：5’-ccgactacaaaaacattagATGGATAATGCAACACGGTTTCGGG-3’；
PDdac-R：5’-gactctagaggatccctcgagCCATAAAACCCATTCCGTCG-3’；
PCR扩增体系为：DNA 2μL，引物F和引物R：各2μL，2×Phanta Max Master Mix高保真酶：12.5μL，ddH2O：6.5μL；
PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s；然后55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；
扩增得到的淀粉酶(AMS)基因信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
分别回收PCR扩增产物和基因片段，利用重叠PCR进行融合成片段重叠PCR扩增体系为：AMS和PDdac基因片段：各2μL，引物F和引物R：各2μL，2×Phanta Max Master Mix高保真酶：12.5μL，ddH2O：4.5μL；
重叠PCR反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s；然后55℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；
融合后的DNA片段AMS-PDdac的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其与经过限制性内切酶Xho I和Nde I双酶切后的质粒pMA5，使用一步克隆法Exnase II作用下进行连接，转化产物分别转化至大肠杆菌GM2163。从氨苄青霉素抗性平板分别挑取转化子转接于5mL含有25μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养，经质粒提取后经限制性内切酶Xho I和Nde I双酶切质粒，重组质粒pMA5-AMS-PDdac构建成功的结果如图1所示，则为阳性克隆菌株。
将验证成功的重组质粒pMA5-AMS-PDdac转化至解淀粉芽孢杆菌，涂布于含25μg/ml卡那霉素抗性的固体培养基上，37℃培养12-16h得到初步阳性克隆；经抗性培养基筛选得到酵母转化子转接液体培养后，使用芽孢杆菌质粒提取试剂盒进行质粒双酶切验证，根据电泳结果判断，含有861bp片段的质粒对应的菌株即为含有N-乙酰氨基葡萄糖转乙酰酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌。
实施例2重组解淀粉芽孢杆菌在制备氨基葡萄糖中的应用
将构建成功的重组重组解淀粉芽孢杆菌在30～37℃条件下进行活化，将菌株接到LB培养基，30～37℃、100～250rpm培养10-16h至OD660大于3.0。
将培养好的种子液以2-10％的接种量接种于含有N-乙酰氨基葡萄糖底物的发酵培养基，在30～37℃、100～250rpm条件下进行好氧培养60h。其中，所述的发酵培养基包含如下组分：牛肉膏1.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米粉2.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L。
利用7.5L发酵罐放大，以原料10～50g/L N-乙酰氨基葡萄糖为底物进行催化发酵，以比较不同浓度的前体N-乙酰氨基葡萄糖对氨基葡萄糖产量的影响，发酵结束后通过测定重组菌株发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖转乙酰酶活性、N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的含量，比较不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖添加量对氨基葡萄糖合成的影响。从测定数据中可知，40g/L的添加量具有最大的氨基葡萄糖转化率和N-乙酰氨基葡萄糖转乙酰基转移酶活性，同时在40g/L N-乙酰氨基葡萄糖培养基中，解淀粉芽孢杆菌DMS7具有最大生长量。
序列表
<110> 扬州日兴生物科技股份有限公司
<120> 一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株及其应用
<130> 1
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列(Artificial)
<400> 1
atgaagttag catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc agtgatcaat 60
tacaagag 68
<210> 2
<211> 836
<212> DNA
<213> 密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因(Artificial)
<400> 2
atgaagttag catactccct cttgcttcca ttggcaggag tcagtgcttc agtgatcaat 60
tacaagagga taatgcaaca cggtttcggg aaatacctgt ggcggcacgt ggcacaccgg 120
aagacgaatg gcaaccatgg ctcgcttcaa ctcctttttt acctgcacct ctcgctgaat 180
gtgatcgatt agttgtggtg gccccgcacc cagatgatga ggtgttaggt gttggtgccc 240
ttatggccac cgcagcggct gcgggcatcc cagttatggt tgtcgcagtg acagatggag 300
cagcatcaca tcctgatagc acaaccctta cccctgatgc acttgcggcc gctagaatcg 360
cggaatccaa ccaggccaca gccttgctcg gagttggtga accgttacgc ttaggcattc 420
cggatggcgc agtctcagcc catgaacatg aattgattac gcgacttgtc gatgtgttga 480
ccgcaaccag cggcgaaggc gagcgcgttt gggtactggc tacatggcgc ggggatggcc 540
atccagatca tgaggctaca ggcagagcgg cagccgaagc gtgctcaatg acaggccata 600
gattagtcga gtatcctgtc tggatgtggc attgggctcg gcctgccgat ccggcggttc 660
cgtggaatag aattcgcgtc ctgacccctg ccgcagaaat tttggccaga aaacgtcgcg 720
ctgtcgatga atttagaacg caaattcttc ctcttagcga ggatcctcgt gatgccgcca 780
ttcttccacc atgggtcttg gcgagattaa tgagaacgac ggaatgggtt ttatgg 836
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> AMS-F(Artificial)
<400> 3
aaaaggagcg atttacatat gatgaagtta gcatactccc tcttgc 46
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> AMS-R(Artificial)
<400> 4
ggtattttgg gtaaggcagc ccgactacaa aaacattagc cgt 43
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> PDdac-F(Artificial)
<400> 5
ccgactacaa aaacattaga tggataatgc aacacggttt cggg 44
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> PDdac-R(Artificial)
<400> 6
gactctagag gatccctcga gccataaaac ccattccgtc g 41

Claims (8)

1.一种高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，以模式菌株解淀粉芽孢杆菌DMS7为基础，通过游离质粒表达含有淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列的密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述密码子优化的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述淀粉酶基因的信号肽的核苷酸序列连接在N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因的N端。
2.根据权利要求1所述的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述游离质粒为质粒pMA5。
3.权利要求1所述的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株在制备氨基葡萄糖中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株活化后，接种到LB培养基，恒温震荡条件下培养至OD660大于3.0，得到种子液；将种子液以2-10％的接种量接种于含有N-乙酰氨基葡萄糖底物的发酵培养基，恒温震荡条件下进行逐级放大发酵培养，得到氨基葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述恒温震荡条件为30～37℃、100～250rpm。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：牛肉膏1.0g/L、蛋白胨5.0g/L、玉米粉2.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，N-乙酰氨基葡萄糖底物的浓度为40g/L。
8.含有权利要求1所述的高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备工艺如下：将高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株接种在发酵培养基中，在30～37℃、100～250rpm条件下培养，得到高产氨基葡萄糖的解淀粉芽孢杆菌工程菌株的发酵液。
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