CN116426447A - 一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中的应用 - Google Patents

一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中的应用，通过枯草芽孢杆菌异源表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶得到。本发明制备得到的重组枯草芽孢杆菌实现了低聚糖脱支酶的胞外高效分泌表达，且通过信号肽优化可进一步提高酶活，不仅有利于后期的大规模生产和分离纯化，粗酶液的酶活最高可达467.82U/mL，在异麦芽低聚糖水解方面有巨大应用潜力，填补了目前常用脱支酶底物特异性方面的空白。

Description

一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中的应用。
背景技术
淀粉是由葡萄糖为基本单位聚合而成的多糖，是自然界中含量最丰富的碳水化合物之一，是人和动物的主要营养来源，也是最主要的工业原材料之一。淀粉中的糖苷键主要包括α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，虽然α-1,6-糖苷键只占总糖苷键的6％左右，却使淀粉链形成分支结构。水解α-1,4-糖苷键的淀粉酶不能或只能缓慢作用于α-1,6-糖苷键，虽然后者在淀粉中含量较低，却限制了淀粉水解效率，形成无法利用的极限糊精。
脱支酶是一类能够专一高效水解淀粉及多糖类底物分支点处的α-1,6-糖苷键，将支链底物水解形成直链底物的水解酶。脱支酶的使用能够加快淀粉酶解反应的速度，缩短酶解时间，提高产品的转化率，降低其它酶制剂的使用量。脱支酶在淀粉加工行业中具有重要的应用价值，目前已广泛应用于葡萄糖浆、高麦芽糖浆、环糊精、分支环糊精、抗性淀粉、啤酒酿造、焙烤和洗涤剂等加工领域。
低聚糖脱支酶作为一类特殊的脱支酶，可以作用于由α-1,6-糖苷键构成的异麦芽低聚糖等分支寡糖，水解其中的分支点，生成以葡萄糖为主的产物。且一般情况下随着寡糖链长的增加，低聚糖脱支酶的作用效率下降。低聚糖脱支酶广泛存在于在细菌、真菌、哺乳动物中，已有许多研究者对天然来源的低聚糖脱支酶进行纯化及性质的测定。然而采用天然菌株生产低聚糖脱支酶存在三个缺点：一是天然菌株发酵周期长，产酶能力低下。二是粗酶液纯化方式困难，难以大规模生产。三是天然菌的安全性有待考量，在食品、医药等领域的应用受到限制。为了满足工业应用的需要，有必要应用基因工程手段，采用更加高效安全的表达系统对低聚糖脱支酶进行克隆表达和发酵优化，以期减少发酵时间、扩大生产规模、提高产量。
目前，对于低聚糖脱支酶的异源表达主要集中在大肠杆菌表达系统，然而现有报道中低聚糖脱支酶几乎都在胞内表达，需要通过破碎菌体才能获得酶液，造成大规模回收酶液困难。同时，重组低聚糖脱支酶在大肠杆菌中还会以水解活力极低的包涵体形式存在，包涵体的活化需要复杂的过程，而且得率较低，从而导致酶蛋白无法利用，降低产量。
枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，是原核表达常用的一种宿主菌，虽然相较于大肠杆菌较为麻烦，但由于枯草芽孢杆菌是食品级工程菌，可广泛应用于食品、农业、发酵等领域，因此更具研究前景。相较于其它细菌型表达系统，枯草芽孢杆菌表达系统具有明显的优势，如：无致病性，为食品级安全使用菌等。因此，将具有良好应用前景的低聚糖脱支酶通过基因工程手段，选择合适的异源表达系统，从而实现其高效分泌表达和分离纯化，对于低聚糖脱支酶的工业化应用具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种胞外分泌表达低聚糖脱支酶的重组枯草芽孢杆菌，且通过信号肽筛选使得低聚糖脱支酶的酶活进一步提高，实现了低聚糖脱支酶的高效分泌表达。
本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶。
进一步地，编码所述低聚糖脱支酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述低聚糖脱支酶的编码基因上游插入信号肽LipA。
进一步地，信号肽LipA的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述信号肽LipA的基因序列如SEQ ID NO.12所示。具体地，氨基酸序列为：
LAKKDEHLRKPEWLKIKLNTNENYTGLKKLMREN。
进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为表达载体。
进一步地，以B.subtilis WB600为宿主。
进一步地，上述重组枯草芽孢杆菌由以下步骤构建得到：将信号肽编码基因融合至低聚糖脱支酶编码基因N端，再连接至表达载体上得到重组质粒，将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，构建得到所述重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种低聚糖脱支酶胞外表达系统，包括上述重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种生产低聚糖脱支酶的方法，应用上述重组枯草芽孢杆菌或低聚糖脱支酶胞外表达系统进行发酵。
进一步地，所述发酵为，将重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中活化，再接种至发酵培养基中进行发酵。
进一步地，种子培养基为LB培养基，发酵培养基为TB培养基。
本发明的第四个目的是提供一种水解异麦芽低聚糖的方法，包括将上述重组枯草芽孢杆菌或低聚糖脱支酶胞外表达系统或两者发酵得到的重组低聚糖脱支酶添加至含有异麦芽低聚糖的反应体系中的步骤。
进一步地，所述异麦芽低聚糖包括但不限于异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、潘糖等。
进一步地，催化反应条件为45～55℃、pH 5.5～6.0。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过通过将来源于Paenibacillus sp.STB16的低聚糖脱支酶基因与pP43NMK载体连接，并将重组质粒在枯草芽孢杆菌中进行表达，实现了重组低聚糖脱支酶的胞外分泌表达，本发明的方法安全、高效，其制备得到的低聚糖脱支酶胞外粗酶液的催化活力可达259.90U/mL，且通过信号肽筛选再次对胞外酶活进行优化，经过信号肽LipA优化后的重组菌酶活明显提高，大约是未经优化前酶活的1.9倍。
(2)本发明促进了低聚糖脱支酶在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌表达，且表达水平较高，这在一定程度上创新了低聚糖脱支酶在异源表达系统中的现有表达水平，可进一步促进低聚糖脱支酶在食品工业中的生产应用。
(3)本发明的低聚糖脱支酶能够作用于异麦芽低聚糖，使得底物接近完全水解，填补了目前常用脱支酶底物特异性方面的空白，在淀粉加工工业领域中具有较高的潜在应用前景。
附图说明
图1为实施例2构建的重组低聚糖脱支酶的SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白标准分子量；泳道1：枯草芽孢杆菌胞外上清液；
图2为实施例3构建的重组低聚糖脱支酶水解异麦芽低聚糖的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO4 16.432g/L，KH2PO42.314g/L，丙三醇(甘油)5g/L，pH 7.0。
LB固体培养基：在LB培养基的基础上添加1.5％(w/v)琼脂粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
重组低聚糖脱支酶酶活测定方法如下：吸取800μL底物对硝基苯α-D-葡萄糖苷(pNPG，10mM)于离心管中，加入150μL磷酸缓冲液(500mM，pH6.0)混匀后50℃保温5min，加入50μL稀释后的待测酶液反应5min后加入1mL Na2CO3溶液(1M)终止反应，于410nm下测定吸光值。以高温灭活的酶液作为空白对照。
本发明涉及的序列：
低聚糖脱支酶，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，编码基因oga的核苷酸序列为SEQ IDNO.2。具体地，氨基酸序列为：
MLLFPFESRSRSIPTGGWQMKRAWWKESVVYQIYPRSFQDSNGDGIGDIPGIVSRLDYLQELGVDVVWLCPVYDSPNDDNGYDIRDYRRIMDEFGTLEDWERLLEDLHARGMKLIMDLVVNHSSDEHAWFSESRKSRDGEHRDYYIWRDGKGGAEPNNWSSFFSGSAWKYDGETDQYYLHLFSSKQPDLNWENGKVRREVYNMMAWWLDKGIDGFRMDVINLISKVPGLPDAPGEGRYRSGADYFMNGPRVHEYLQEMNREVLSRYDIMTVGETPGVTPEQAALYVGEDRGELNMVFQFEHMDIDSGPGGKWDVQPWRLTDFKRVMGKWQRELQDRGWNSLYLNNHDQPRMVSRFGDDKNFRKQSAKMLGTLLHTLQGTPYIYQGEELGMTNVRFGSIEDYRDIETLNMYKEATGAGRPAEAVMASVYSKGRDNARTPMQWDGSAHGGFTTGTPWIASNPNYTEINAEDARRDPDSIFHYYRRLIALRKQHDVIVYGRYEALLEEDERIYAYTRMLDGERLLVVLNFFGEEADCSLPEKIRFESAEPLIGNYGNGADRDWRSLKLRPYEALVLRLQG。
信号肽BglS，氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
信号肽Epr，氨基酸序列为SEQ ID NO.5，核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
信号肽AprE，氨基酸序列为SEQ ID NO.7，核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
信号肽YwbN，氨基酸序列为SEQ ID NO.9，核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
信号肽LipA，氨基酸序列为SEQ ID NO.11，核苷酸序列为SEQ ID NO.12。
信号肽WapA，氨基酸序列为SEQ ID NO.13，核苷酸序列为SEQ ID NO.14。
酶活定义：
在上述条件下，每分钟水解生成1μmol的对硝基苯酚(pNP)为1个酶活力单位。
反应产物的检测方法：
取反应后的上层清液稀释适当倍数后过0.22μm水系膜。以一定浓度梯度的标准品为对照进行定性定量分析，采用ICS-5000高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析产物中各组分含量。流动相由250mM(w/v)氢氧化钠和1M(w/v)乙酸钠组成，流速为0.5mL/min，柱温保持在35℃。
实施例1重组枯草芽孢杆菌分泌表达系统的构建
(1)以含有目的基因序列的重组质粒pET-28a(+)/oga作为模板，设计两端引物R1及F1；以质粒pP43NMK作为模板，分别设计两端引物R2及F2，经PCR扩增后得到低聚糖脱支酶基因及pP43NMK载体线性片段。
表1：PCR扩增用引物
Figure BDA0004118961000000061
其中所涉及的PCR扩增程序为：5×PrimerSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerSTAR GXLDNA Polymerase 1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃2min)；最后68℃保温10min。
(2)使用同源重组方法将低聚糖脱支酶基因与pP43NMK载体片段进行连接，得到重组表达载体pP43NMK/oga。连接体系为：目的基因片段2μL，pP43NMK载体片段1μL，5×CEⅡBuffer 4μL,ExnaseⅡ2μL,ddH2O 11μL。
(3)将上述反应混合物置于37℃孵育30min；之后将连接产物转化至大肠杆菌E.coli JM109，并将转化子涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃培养箱过夜培养。挑取单菌落接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h，提取质粒进行测序验证，将测序正确的表达载体pP43NMK/oga转化至枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，获得基因工程菌B.subtilis WB600(pP43NMK/oga)。
实施例2重组低聚糖脱支酶的发酵生产
具体步骤如下：
(1)将实施例1制备得到的基因工程菌B.subtilis WB600(pP43NMK/oga)在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落接种至含有10μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，于37℃、200r/min摇床培养10～12h，制备得到种子液；
(2)将上述制备得到的种子液按2％～4％(v/v)的接种量转接至50mL含有10μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，，25～30℃、200rpm下摇瓶培养48～96h，制备得到发酵液；
(3)将发酵液在4℃、10000rpm条件下离心20min，收集上清液即为低聚糖脱支酶粗酶液。
对上清液进行酶活测定以及SDS-PAGE蛋白电泳验证，经测定低聚糖脱支酶的酶活为259.90U/mL，且蛋白电泳显示(图1)在目标分子量附近有较粗的蛋白条带，表明低聚糖脱支酶在成功在枯草芽孢杆菌系统中实现胞外分泌表达。
实施例3信号肽优化
以pP43NMK/oga为模板，分别设计并合成对应的引物，通过PCR的方法将信号肽BglS、Epr、AprE、YwbN、LipA、WapA融合到oga基因的N端。
表2不同信号肽使用的引物
Figure BDA0004118961000000081
按照实施例1的方法进行载体构建和质粒转化，获得对应重组菌B.subtilisWB600(pP43NMK/oga/BglS)、B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/Epr)、B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/AprE)、B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/YwbN)、B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/LipA)、B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/WapA)。按照实施例2的方法进行不同重组菌的发酵产酶，以未融合信号肽表达的重组菌株作为对照，测定融合不同信号肽重组菌株的产酶情况，结果如表3所示。
表3：不同信号肽重组菌株的胞外酶活数据
Figure BDA0004118961000000091
从上表中可以看出，添加不同信号肽的低聚糖脱支酶表达量有显著差异，信号肽BglS、Epr、AprE、YwbN、WapA共表达的酶活低于对照组，而经过信号肽LipA优化后的重组菌酶活明显提高，大约是对照组酶活的1.9倍。信号肽LipA能够提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌系统中的分泌速度，使得胞外蛋白回收效率更高，更容易进行分离纯化，可以得到高纯度且稳定的目的蛋白，因而更具优势。
实施例4重组低聚糖脱支酶水解异麦芽低聚糖的产物分析
分别配置1mg/mL的异麦芽低聚糖标品溶液，包括异麦芽糖(IG2)、异麦芽三糖(IG3)、潘糖(P)、异麦芽四糖(IG4)以及异麦芽五糖(IG5)，按5U/mg加酶量加入由B.subtilis WB600(pP43NMK/oga/LipA)表达的重组低聚糖脱支酶，在50℃下反应24h。反应结束后沸水浴进行灭酶处理，10000rpm离心5min，取上清液稀释一定倍数后过0.22μm水系滤膜，以一定浓度梯度的混合标准品为对照，采用HPAEC-PAD对反应产物进行定性定量分析。结果如图2和表4所示。
表4：低聚糖脱支酶作用于IG2-IG5的产物分析
Figure BDA0004118961000000101
低聚糖脱支酶作用于不同DP值异麦芽低聚糖后各产物组分含量如表4所示。低聚糖脱支酶水解IG3和P的底物转化率达到100％，水解IG3的主要产物是G1，水解P的主要产物是G1和G2。虽然低聚糖脱支酶水解IG2、IG4和IG5的底物转化率没有达到100％，但是接近完全水解，产物中有极少量其他DP值糖的存在，这可能是由于葡萄糖的抑制作用以及反应时间过长酶解效率下降导致的。
对比例1
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，调整表达载体为pET-28a(+)质粒，结果显示，制备得到的重组低聚糖脱支酶只能实现胞内表达，需要通过破碎菌体才能获得酶液，造成大规模回收酶液困难。
对比例2
具体实施方式同对比例1，区别在于，调整表达载体为pET-20b(+)和pET-22b(+)质粒，结果显示，制备得到的重组低聚糖脱支酶只能在胞内以不溶性包涵体的形式存在，没有实现低聚糖脱支酶的可溶性表达。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：编码所述低聚糖脱支酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述低聚糖脱支酶的编码基因上游插入信号肽LipA。
4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：信号肽LipA的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述信号肽LipA的基因序列如SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK为表达载体。
6.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：以B.subtilis WB600为宿主。
7.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌由以下步骤构建得到：将信号肽编码基因融合至低聚糖脱支酶编码基因N端，再连接至表达载体上得到重组质粒，将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，构建得到所述重组枯草芽孢杆菌。
8.一种低聚糖脱支酶胞外表达系统，其特征在于：包括权利要求1-7任一项所述的重组枯草芽孢杆菌。
9.一种生产低聚糖脱支酶的方法，其特征在于：应用权利要求1-7任一项所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的低聚糖脱支酶胞外表达系统进行发酵。
10.一种水解异麦芽低聚糖的方法，其特征在于：包括将权利要求1-7任一项所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求8所述的低聚糖脱支酶胞外表达系统或发酵得到的重组低聚糖脱支酶添加至含有异麦芽低聚糖的反应体系中的步骤。
CN202310227539.XA 2023-03-10 2023-03-10 一种低聚糖脱支酶胞外表达系统及其在水解异麦芽低聚糖中的应用 Pending CN116426447A (zh)

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