JP6929499B2 - アルファ−グルコシダーゼ酵素を用いた二糖およびオリゴ糖の酵素性加水分解 - Google Patents
アルファ−グルコシダーゼ酵素を用いた二糖およびオリゴ糖の酵素性加水分解 Download PDFInfo
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a)少なくとも75%のアルファ−1,3−グリコシド結合;
b)25%未満のアルファ−1,6−グリコシド結合;
c)10%未満のアルファ−1,3,6−グリコシド結合;
d)5000ダルトン未満のMw;
e)20℃の水中12wt%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
f)4〜40の範囲のデキストロース当量(DE);
g)Association of Analytical Communities(AOAC)法2009.01により測定した場合の10%未満の消化性;
h)25℃でpH7の水中少なくとも20%(w/w)の溶解度;および
i)5未満の多分散指標(PDI)。
a)10%〜30%のアルファ−1,3−グリコシド結合;
b)65%〜87%のアルファ−1,6−グリコシド結合;
c)5%未満のアルファ−1,3,6−グリコシド結合;
d)5000ダルトン未満の重量平均分子量(Mw);
e)20℃の水中12wt%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
f)4〜40、好ましくは10〜40の範囲のデキストロース当量(DE);
g)Association of Analytical Communities(AOAC)法2009.01により測定した場合の10%未満の消化性;
h)25℃でpH7の水中、少なくとも20%(w/w)の溶解度;および
i)5未満の多分散指標(PDI)。
a)25〜35のアルファ−1,3−グリコシド結合;
b)55〜75%のアルファ−1,6−グリコシド結合;
c)5〜15%のアルファ−1,3,6−グリコシド結合;
d)5000ダルトン未満の重量平均分子量;
e)20℃の水中12wt%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
f)4〜40の範囲のデキストロース当量(DE);
g)Association of Analytical Communities(AOAC)法2009.01により測定した場合の10%未満の消化性;
h)25℃で水中、少なくとも20%(w/w)の溶解度;および
i)5未満の多分散指標。
a)少なくとも95%のアルファ−1,6−グリコシド結合;
b)1%以下のアルファ−1,3−グリコシド結合;
c)2%未満のアルファ−1,3,6−グリコシド結合;
d)1.5%未満のアルファ−1,4−グリコシド結合;
e)20000ダルトン未満の重量平均分子量;
f)20℃の水中12wt%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
g)1〜30の範囲のデキストロース当量(DE);
h)Association of Analytical Communities(AOAC)法2009.01により測定した場合の10%未満の消化性;
i)25℃でpH7の水中、少なくとも20%(w/w)の溶解度;および
j)5未満の多分散指標。
a)一連の、
i)1%〜50%のアルファ−1,3−グリコシド結合;または
ii)10%より大きいが40%未満のアルファ−1,4−グリコシド結合;または
iii)i)およびii)の何らかの組み合わせ;
b)1〜50%のアルファ−1,2−グリコシド結合;
c)0〜25%のアルファ−1,3,6−グリコシド結合;
d)98%未満のアルファ−1,6−グリコシド結合;
e)300kDa未満の重量平均分子量;
f)20℃の水中12wt%で0.25パスカル秒(Pa・s)未満の粘度;
g)Association of Analytical Communities(AOAC)法2009.01により測定した場合の20%未満の消化性;
h)25℃でpH7の水中、少なくとも20%(w/w)の溶解度;および
i)26未満、好ましくは5未満の多分散指標。
1.少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を含む糖においてアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法であって、糖が二糖またはオリゴ糖であり、方法が、適切な条件下で糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることを含み、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、糖の量が、接触前に存在した糖の量と比較して減少している、方法。
2.アルファ−グルコシダーゼ酵素が固定化されている、実施形態1に記載の方法。
3.糖がロイクロースである、実施形態1に記載の方法。
4.接触工程後のロイクロースの濃度が、接触前に存在したロイクロースの濃度の50%未満である、実施形態3に記載の方法。
5.適切な条件が、
(i)グルカン合成反応、または
(ii)グルカン合成反応から得られる分画
を含み、糖がグルカン合成反応の副産物である、実施形態1、2、3または4に記載の方法。
6.グルカン合成反応が、少なくとも1つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、実施形態5に記載の方法。
7.分画がグルカン合成反応のろ液である、実施形態6に記載の方法。
8.グルカン合成反応が、
(i)グルコシルトランスフェラーゼの生成物、または
(ii)1つ以上のアルファ−1,3−グリコシド結合または1つ以上のアルファ−1,6−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物である、少なくとも1つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、実施形態5に記載の方法。
9.分画がグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である、実施形態8に記載の方法。
10.アルファ−グルコシダーゼ酵素がトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼである、実施形態1〜9の何れか1つに記載の方法。
11.糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることにより生成される組成物であって、糖が二糖またはオリゴ糖であり、かつ少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を含み、酵素が、糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、組成物が、接触前に存在した糖の量と比較して減少した量の糖を含む、組成物。
12.糖がロイクロースである、実施形態11に記載の組成物。
13.糖が(i)グルカン合成反応、または(ii)グルカン合成反応から得られる分画にあり、糖がグルカン合成反応の副産物である、実施形態11または12に記載の組成物。
14.グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法であって、
(a)グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
(b)工程(a)の分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得るために、工程(a)の加水分解分画からフルクトースを分離することとを含む、方法。
15.(a)グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
(b)生成物を得るために微生物を用いて工程(a)の分画を発酵させることであって、発酵が、工程(a)の後または工程(a)と同時に行われる、発酵せせることと、
(c)任意選択により(b)の生成物を単離することと
を含み、(b)の生成物の収率が、アルファ−グルコシダーゼ酵素と接触していないグルカン合成反応の分画を発酵させる生成物収率と比較して上昇している、発酵方法。
本明細書中で使用される略語の一部の意味は次のとおりである:「g」はグラムを意味し、「h」は時間を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「psi」はポンド/平方インチを意味し、「wt%」は重量パーセントを意味し、「μm」はマイクロメートルを意味し、「%」はパーセントを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「mL/分」はミリリットル/分を意味し、「m」はメートルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「min」は分を意味し、「mol%」はモルパーセントを意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mg/g」はミリグラム/グラムを意味し、「rpm」は1分間あたりの回転数を意味し、「MPa」はメガパスカルを意味する。
別段の断りがない限り、試薬は全てSigma−Aldrich(St.Louis,MO)から得た。スクロースはVWR(Radnor,PA)から得た。
イソプロピルベータ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導発現系を用いて、大腸菌(E.coli)株DH10Bにおいてストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)gtfJ酵素(配列番号3)を発現させた。配列番号3は、GENBANK認識番号47527のS.サリバリウス(S.salivarius)gtfJアミノ酸配列と比較するとN末端に42個の残基欠失があるが、開始メチオニンを含む。簡潔に述べると、大腸菌(E.coli)においてgtfJ酵素を発現させるためにコドン最適化されたDNA配列から配列番号3を発現させるために、大腸菌(E.coli)DH10B細胞を形質転換した。このDNA配列は、発現ベクター、pJexpress404(登録商標)(DNA2.0,Menlo Park CA)中に含有された。形質転換細胞をLB培地(10g/Lトリプトン;5g/L酵母抽出物、10g/L NaCl)中で0.025の初期光学密度(600nmでのOD)になるように接種し、250rpmで振盪させながらインキュベーター中で37℃で増殖させた。培養物のOD600が0.8〜1.0に到達したら、1mM IPTGを添加することによって、培養物に対して誘導を行った。誘導した培養物を振盪器に置き、誘導後3時間で回収した。
25g/Lデキストラン(MW 約1500、Sigma−Aldrich、Cat.#31394)の存在下または非存在下で、37℃および125rpmオービタル振盪で、pH5.5の25mMまたは50mM酢酸ナトリウム緩衝液中の200g/LスクロースとともにGTF酵素を含有する1〜10%(v/v)粗製タンパク質抽出物を温置することによって、グルコシルトランスフェラーゼ活性アッセイを行った。反応混合物の1アリコートを1時間、2時間および3時間の時点で採取し、90℃で5分間加熱してGTFを不活性化させた。13,000×gで5分間の遠心によって不溶性物質を除去し、続いて0.2μmRC(再生セルロース)膜に通してろ過した。85℃で2本のAMINEX HPX−87Cカラムシリーズ(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して、HPLCによって、得られたろ液を分析して、スクロース濃度を定量した。各時点でのスクロース濃度を反応時間に対してプロットし、直線プロットの傾きから反応初速度を決定した。GTF活性1単位は、アッセイ条件下で1分間に1マイクロモルのスクロースを消費するために必要とされる酵素の量として定義した。
GENBANK(登録商標)においてGI:212533325として特定されるペニシリウム・マルネッフェイ(Penicillium marneffei)ATCC(登録商標)18224(商標)ムタナーゼをコードする遺伝子をGenScript(Piscataway,NJ)によって合成した。選択のためのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)アセトアミダーゼを用いて、CBHIプロモーターおよびターミネーターの調節下で、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)中の関心のある遺伝子を発現させるために設計されたベクターであるプラスミドpTrex3にSacIIおよびAscI制限部位に、タンパク質配列(MUT3325;配列番号47)をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)をサブクローニングした。得られたプラスミドをT.リーゼイ(T.reesei)に遺伝子銃注入によって形質転換した。遺伝子銃形質転換の詳細な方法は、参照により本明細書中に組み込まれるPCT特許出願公開国際公開第2009/126773A1号パンフレットに記載されている。安定なクローンTRM05−3からの胞子がある1cm2寒天プラグを使用して、産生培地(下記)に接種した。28℃および220rpmで4〜5日間、振盪フラスコ中で培養物を増殖させた。分泌されたタンパク質を回収するために、4000gで10分間の遠心によって細胞塊を最初に除去し、0.2μm滅菌フィルターに通して上清をろ過した。SDS−PAGEによってムタナーゼMUT3325(配列番号47)の発現を確認した。
ストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)ATCC(登録商標)33478(商標)により産生された分泌酵素を用いて、ムタナーゼ活性を決定するために必要とされる不溶性ムタンポリマーを調製した。具体的に、S.ソブリヌス(S.sobrinus)ATCC(登録商標)33478(商標)のグリセロール保存物の1ループをBHI寒天プレート(ブレインハートインフュージョン寒天、Teknova,Hollister,CA)上に画線し、37℃で2日間プレートを温置した。ループを用いて数個のコロニーを拾い、Teknovaからのオリジナル培地ボトル中2×100mL BHI液体培地に接種し、培養物を37℃で温置し、24時間にわたり静置した。得られた細胞を遠心によって除去し、得られた上清を0.2μm滅菌フィルターに通してろ過し;2×101mLのろ液を回収した。ろ液に2×11.2mLの200g/Lスクロースを添加した(最終スクロース20g/L)。反応物を37℃で撹拌せずに67時間温置した。得られた多糖ポリマーを5000×gで10分間の遠心によって回収した。上清を慎重にデカントした。不溶性ポリマーを40mLの滅菌水で4回洗浄した。得られたムタンポリマーを48時間、凍結乾燥した。ムタンポリマー(390mg)を39mLの滅菌水中で懸濁して、10mg/mL懸濁液を得た。超音波処理によってムタン懸濁液をホモジェナイズした(大きい塊が消失するまで40%振幅。全部で約10分)。ホモジェナイズした懸濁液を分注し、4℃で保存した。
反応物から定期的に試料を採取し、屈折率検出器を備えるAgilent(登録商標)1260HPLCを用いて分析した。0.6mL/分の流速および85℃の脱イオン水を有するAminex(登録商標)HP−87Cカラム(BioRad,Hercules,CA)を使用して、gtf反応におけるスクロース、グルコース、ロイクロースおよびフルクトースレベルを定量した。0.6mL/分の流速および85℃の脱イオン水を有するAminex(登録商標)HP−42Aカラム(BioRad)を使用して、gtf反応における可溶性オリゴ糖副産物(DP2〜DP7)を定量した。
5mm低温三重共鳴パルスフィールド勾配(PFG)プローブを用いて、1Hに対して500MHzで作動するAgilent DD2分光計上でNMRデータを得た。「presat」実験において残留水シグナルに対する共鳴上にオブザーブ送信機周波数(observe transmitter frequency)を慎重に置き、次いで全位相サイクル(32の倍数)および10msの混合時間でNOESY実験の最初のスライスを使用することによって、水抑制を得た。6410Hzのスペクトル幅、5.1sの捕捉時間、65536個のデータ点、4sプレサチュレーションおよび5.85μsの90°パルスで、1次元1Hスペクトルを得た。試料温度を25℃に維持した。メチル共鳴を0ppmに設定して、450μLのD2Oおよび12.4mM DSS(4,4−ジメチル−4−シラペンタン−1−スルホン酸ナトリウム塩)内部参照を含有する60μLのD2Oとともに、5mmNMR管に50μLを添加することによって、試料を調製した。異なるアノマー結合に対する化学シフト割り当ては、Goffinら(2009,Bull Korean Chem.Soc.30:2535−2541から得た。ピーク割り当ては、アルファ(1,3)結合に対して5.35ppm、ロイクロースに対して5.1ppm、およびアルファ(1,6)結合に対して4.95であった。還元末端(RE)は、アルファREに対して5.2、およびベータREに対して4.65を割り当てた。
スクロースの重合による糖シロップの生成
この実施例は、グルカン合成反応におけるgtf酵素を用いたスクロースの重合によって可溶性糖の混合物を生成させた一般的方法を開示する。具体的には、グルカン合成反応のろ液を調製し、次いでこれを濃縮してシロップにした。
グルカン合成反応のろ液中での糖の加水分解における酵素の効果
この実施例は、グルカン合成反応の濃縮ろ液中のロイクロースおよび/またはオリゴ糖副産物の濃度を低下させるための、様々なグルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)、トランスグルコシダーゼ(EC2.4.1.24)、ベータ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)、アルファ−アミラーゼ(EC3.2.1.1)およびグルコシダーゼ(EC3.2.1)酵素の活性を測定する。全てアルファ−グルコシダーゼであるDIAZYME RDF ULTRA、トランスグルコシダーゼ(EC2.4.1.24)およびグルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)などのある種の酵素は、これらの副産物の量を減少させることにおいて特に有効であり、その結果、処理済みろ液中で単糖(グルコースおよびフルクトース)の対応する増加が起こることが分かった。
酵素加水分解前後のグルカン反応ろ液成分の結合分布の比較
この実施例は、グルカン合成反応の濃縮ろ液中に存在するロイクロースおよびオリゴ糖副産物に対するトランスグルコシダーゼ(EC2.4.1.24)およびベータ−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)酵素の加水分解活性を測定する。トランスグルコシダーゼは、これらの副産物の量を減少させ、その結果、処理済みろ液中で単糖(グルコースおよびフルクトース)の対応する増加が起こることが分かった。
固定化酵素を用いたグルカン反応ろ液中でのロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解
この実施例は、グルカン合成反応から得られたろ液中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するために固定化グルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)およびトランスグルコシダーゼ(EC2.4.1.24)を使用することを記載する。具体的には、グルカン合成反応のろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖DP2、DP3およびHS(高級糖類、DP4+)の加水分解における、固定化トランスグルコシダーゼTG L−2000(配列番号1、Genencor/DuPont Industrial Biosciencesより入手)および固定化グルコアミラーゼGC−147(Genencor/DuPont Industrial Biosciencesより入手)の効果を調べた。
クロマトグラフィーによるグルカン反応ろ液からのフルクトースの濃縮
この実施例は、グルカン反応ろ液中のフルクトースがクロマトグラフィーを通じてどのようにさらに濃縮され得るかを開示する。
クロマトグラフィーによる加水分解グルカン反応ろ液からのフルクトースの濃縮
この実施例は、オリゴ糖およびロイクロースが加水分解されたグルカンろ液からのフルクトース単離の結果、非加水分解グルカンろ液からフルクトースを単離した場合と比較して、高純度フルクトースシロップの収率が上昇することを明らかにする。
グルカン合成反応のろ液を発酵させることによるエタノールの生成
この実施例は、グルカンろ液のエタノールへの酵母発酵を開示する。
加水分解されたグルカンろ液を発酵させることによるエタノールの生成
この実施例は、ロイクロースおよびオリゴ糖副産物成分が予め糖化されたグルカンろ液を発酵させた結果、エタノール収率が上昇することを明らかにする。
グルカンろ液溶液の同時糖化および発酵
この実施例は、グルカンろ液を含有するフィードの同時糖化および発酵の結果、発酵特性が向上することを開示する。
様々なアルファ−グルコシダーゼの調製
この実施例は、前述の実施例のいくつかで使用したこれらのアルファ−グルコシダーゼ(トランスグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、DIAZYME RDF ULTRA)に加えて、様々なアルファ−グルコシダーゼを調製することを開示する。以下で提供される実施例11、12、15および16において、アルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合またはアルファ−1,3および/またはアルファ−1,6グルコシル−グルコース結合を含むオリゴ糖に対する加水分解活性についてこれらのさらなるアルファ−グルコシダーゼを試験した。
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、アスペルギルス・クラバツス(Aspergillus clavatus)の株を選択した。アスペルギルス・クラバツス(Aspergillus clavatus)において同定された遺伝子の1つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Aclglu1」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号4で提供される。配列番号4によりコードされる対応するタンパク質は配列番号5で提供される。Aclglu1は、PFAM検索(pfam.sanger.ac.uk web link)に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー31に属する。N末端で、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.,2011,Nature Methods,8:785−786)により予想した場合、タンパク質(配列番号5)は、19アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Aclglu1が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるAclglu1の成熟型のアミノ酸配列は配列番号6で示される。
合成Aclglu1遺伝子をpTrex3gM発現ベクター(参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0136197号明細書に記載)にクローニングし、得られたプラスミドをpJG294と名付けた。DNA配列決定によってAclglu1遺伝子の配列を確認した。
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)の株を選択した。ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)において同定された遺伝子の1つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Nfiglu1」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号7で提供される。配列番号7によりコードされる対応するタンパク質は、配列番号8で提供される。Nfiglu1は、PFAM検索(pfam.sanger.ac.uk web link)に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー31に属する。N末端で、タンパク質(配列番号8)は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.,2011,Nature Methods,8:785−786)により予想した場合、19アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Nfiglu1が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるNfiglu1の成熟型のアミノ酸配列は配列番号9で示される。
合成Nfiglu1遺伝子をpTrex3gM発現ベクター(米国特許出願公開第2011/0136197号明細書に記載)にクローニングし、得られたプラスミドをpJG295と名付けた。DNA配列決定によってNfiglu1遺伝子の配列を確認した。
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)の株を選択した。ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)において同定された遺伝子の1つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Ncrglu1」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号10で提供される。配列番号10によりコードされる対応するタンパク質は配列番号11で提供される。Ncrglu1は、PFAM検索(pfam.sanger.ac.uk web link)に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー31に属する。N末端で、タンパク質(配列番号11)は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.,2011,Nature Methods,8:785−786)で予想した場合、22アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Ncrglu1が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるNcrglu1の成熟型のアミノ酸配列は配列番号12で示される。
合成Ncrglu1遺伝子をpTrex3gM発現ベクター(米国特許出願公開第2011/0136197号明細書に記載)にクローニングし、得られたプラスミドをpJG296と名付けた。Ncrglu1遺伝子の配列をDNA配列決定によって確認した。
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ラサモソニア・コンポスティコラ(Rasamsonia composticola)の株を選択した。ラサモソニア・コンポスティコラ(Rasamsonia composticola)において同定された遺伝子の1つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「TauSec098」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号13で提供される。配列番号13によりコードされる対応するタンパク質は配列番号14で提供される。TauSec098は、PFAM search(pfam.sanger.ac.uk web link)に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー31に属し、N末端CBM20ドメインを含有する。N末端で、タンパク質(配列番号14)は、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.,2011,Nature Methods,8:785−786)に予想されるように22アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在から、TauSec098が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるTauSec098の成熟型のアミノ酸配列は配列番号15で示される。
Generay Biotech Co.(Shanghai,China)によって合成TauSec098遺伝子をトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(pTTT由来プラスミド)にクローニングし、得られたプラスミドをpGX256−TauSec098と名付けた。TauSec098遺伝子の配列をDNA配列決定によって確認した。
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ラサモソニア・コンポスティコラ(Rasamsonia composticola)の株を選択した。ラサモソニア・コンポスティコラ(Rasamsonia composticola)において同定された遺伝子の1つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「TauSec099」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号16で提供される。配列番号16によりコードされる対応するタンパク質は配列番号17で提供される。TauSec099は、PFAM検索(pfam.sanger.ac.uk web link)に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー31に属する。N末端で、SignalP version 4.0(Nordahl Petersen et al.,2011,Nature Methods,8:785−786)により予想した場合、このタンパク質(配列番号17)は17アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在から、TauSec099が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるTauSec099の成熟型のアミノ酸配列は配列番号18で示される。
Generay Biotech Co.(Shanghai,China)によって合成TauSec099遺伝子がトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(pTTT由来プラスミド)にクローニングされ、得られたプラスミドをpGX256−TauSec099と名付けた。TauSec0998遺伝子の配列をDNA配列決定によって確認した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)亜種ロンガム(longum)JDM301からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「BloGlu1」を同定した。BloGlu1遺伝子に対する核酸配列(配列番号19、GENBANK、受入番号NC014169.1、位置140600〜142414の相補配列)および配列番号19によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列(配列番号20)がGENBANK受入番号YP_003660432.1で見出された。
BloGlu1タンパク質全体(配列番号20)をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号21をもたらす)、Generay Biotech Co.(Shanghai,China)によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BloGlu1が得られた。p3JM−BloGlu1プラスミドは、最適化BloGlu1配列(配列番号21)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
アルファ−グルコシダーゼ、BloGlu2をビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)から同定した。BloGlu2のアミノ酸配列(配列番号22)がNCBIデータベース(GENBANK受入番号WP_007054665.1)で見出された。
BloGlu2タンパク質をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号23をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BloGlu2が得られた。配列番号23は配列番号24のアミノ酸配列をコードする。p3JM−BloGlu2プラスミドは、最適化BloGlu2配列(配列番号23)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)亜種ロンガム(longum)F8からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「BloGlu3」を同定した。BloGlu3遺伝子に対する核酸配列(配列番号25、GENBANK受入番号NC_021008.1、位置2130627〜2132441)および配列番号25によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列(配列番号26)がGENBANK受入番号YP_007768249.1で見出された。
BloGlu3タンパク質全体(配列番号26)をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号27をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BloGlu3が得られた。p3JM−BloGlu3プラスミドは、最適化BloGlu3配列(配列番号27)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
ビフィドバクテリウム・シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum)からアルファ−グルコシダーゼ、BpsGlu1を同定した。NCBIデータベース(GENBANK受入番号WP_022858408.1)においてBpsGlu1のアミノ酸配列(配列番号28)が見出された。
BpsGlu1タンパク質をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号29をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BpsGlu1が得られた。配列番号29は、配列番号30のアミノ酸配列をコードする。p3JM−BpsGlu1プラスミドは、最適化BpsGlu1配列(配列番号29)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
ビフィドバクテリウム・サーモフィルム(Bifidobacterium thermophilum)RBL67からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「BthGlu1」を同定した。BthGlu1遺伝子の核酸配列(配列番号31、GENBANK受入番号NC_020546.1、位置150690〜152495)および配列番号31によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列(配列番号32)は、GENBANK受入番号YP_007592840.1で見出された。
BthGlu1タンパク質全体(配列番号32)をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号33をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BthGlu1が得られた。p3JM−BthGlu1プラスミドは、最適化BthGlu1配列(配列番号33)のプラスミドの発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
ビフィドバクテリウム・ブレブ(Bifidobacterium breve)からアルファ−グルコシダーゼ、BbrGlu2を同定した。BbrGlu2のアミノ酸配列(配列番号34)がNCBIデータベース(GENBANK受入番号WP_003827971.1)で見出された。
BbrGlu2タンパク質をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号35をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BbrGlu2が得られた。配列番号35は、配列番号36のアミノ酸配列をコードする。p3JM−BbrGlu2プラスミドは、最適化BbrGlu2配列(配列番号35)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
ビフィドバクテリウム・ブレブ(Bifidobacterium breve)ACS−071−V−Sch8bからアルファ−グルコシダーゼ遺伝子「BbrGlu5」を同定した。BbrGlu5遺伝子(配列番号37、GENBANK受入番号NC_017218.1、位置2241075〜2242895の配列の相補体)の核酸配列および配列番号37によってコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列(配列番号38)がGENBANK受入番号YP_005583701.1で見出された。
BbrGlu5タンパク質全体(配列番号38)をコードするDNA配列をB.サブチリス(B.subtilis)での発現に対して最適化し、次いで合成し(配列番号39をもたらす)、Generay Biotech Co.によってp3JMプラスミドに挿入され、p3JM−BbrGlu5が得られた。p3JM−BbrGlu5プラスミドは、最適化BbrGlu5配列(配列番号39)の発現を推進するためのaprEプロモーターを含有する。
2つのクロマトグラフィー工程を使用して、AclGlu1(配列番号6)およびNcrGlu1(配列番号12)の両方のアルファ−グルコシダーゼを精製した。各精製に対して、振盪フラスコからの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加し、2Mの最終濃度にした。20mM Tris pH8.0、2M硫酸アンモニウムで予め平衡化した50mLフェニルHPカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質(配列番号6または配列番号12)を1M硫酸アンモニウム、20mM Tris pH8.0でカラムから溶出させた。個々の分画をプールし、濃縮し、VIVAFLOW 200限外ろ過装置(Sartorius Stedim)を用いて緩衝液を20mM Tris pH8.0(緩衝液A)に交換した。得られた溶液を、緩衝液Aで予め平衡化した40mL Q HPカラムに適用した。標的タンパク質を緩衝液A中の0.3M NaClでカラムから溶出させた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、10K AMICON ULTRA−15装置を用いて濃縮し、使用するまで−20℃で40%グリセロール中で保存した。
2つの疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を使用してNfiGlu1アルファ−グルコシダーゼ(配列番号9)を精製した。振盪フラスコからの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加し、1Mの最終濃度にした。20mM Tris pH8.0、1M硫酸アンモニウムで予め平衡化した50mLフェニルHPカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質(配列番号9)はカラムを通過した。フロースルー分画をプールし、その後、硫酸アンモニウムを添加し、2Mの最終濃度にした。20mM Tris pH8.0、2M硫酸アンモニウムで予め平衡化した同じフェニルHPカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質を1M硫酸アンモニウム、20mM Tris pH8.0でカラムから溶出させた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、10K AMICON ULTRA−15装置を用いて濃縮し、使用するまで−20℃で40%グリセロール中で保存した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーを介してTauSec098(配列番号15)およびTauSec099(配列番号18)の両アルファ−グルコシダーゼを精製した。各精製に対して、7L発酵槽からの約180mLの濃縮粗製ブロスに硫酸アンモニウムを添加し、1Mの最終濃度にした。次いでこの溶液を20mM酢酸ナトリウムpH5.0、1M硫酸アンモニウム(緩衝液A)で予め平衡化した50mL HIPREPフェニル−FFセファロースカラム(GE Healthcare)上に載せた。3カラム体積(CV)で同じ緩衝液で洗浄した後、各3CVを用いて75%、50%および0%緩衝液Aで、続いて2CVのMILLIQ H2Oでカラムを段階的に溶出した。SDS−PAGEによって全分画を分析した。標的タンパク質(配列番号15または配列番号18)はフロースルー分画中に主に存在し、それを濃縮し、10KDa AMICON ULTRA−15装置を用いて過剰な硫酸アンモニウムを除去するために緩衝液を交換した。90%純度を超えた最終生成物を使用するまで−80℃で40%グリセロール中で保存した。
BloGlu1(配列番号20)、BloGlu2(配列番号24)およびBloGlu3(配列番号26)アルファ−グルコシダーゼを全て3工程で精製した。各精製に対して、1L DASGIP発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して60%飽和にした。溶液を4℃で1時間撹拌し、次いで8000×gで30分間遠心した。得られたペレットを20mM Tris pH8.0(緩衝液A)中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、1Mの最終濃度にし;次いでこの標品を20mM Tris pH8.0、1M硫酸アンモニウム(緩衝液B)で予め平衡化した40mL HiPrep(商標)フェニルFFカラム上に載せた。洗浄後、各3カラム体積で75%、50%および0%緩衝液BおよびH2Oでカラムを段階的に溶出した。SDS−PAGE、活性アッセイを使用して全分画を分析した。標的タンパク質(配列番号20、配列番号24または配列番号26)を含有する分画をプールし、濃縮し、続いて20mMリン酸ナトリウムpH7.0、0.15M NaClで予め平衡化したHiLoad(商標)26/60Superdex(商標)75カラム上に載せた。次いで標的タンパク質を含有するフロースルー分画をプールし、10K AMICON ULTRA−15装置を用いて濃縮し、使用するまで−20℃で40%グリセロール中で保存した。
BpsGlu1(配列番号30)およびBthGlu1(配列番号32)の両アルファ−グルコシダーゼを2工程で精製した。各精製に対して、1L DASGIP発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して60%飽和にした。溶液を4℃で1時間撹拌し、次いで8000×gで30分間遠心した。得られたペレットを20mM Tris pH8.0(緩衝液A)中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、1Mの最終濃度にし;次いでこの標品を20mM Tris pH8.0、1M硫酸アンモニウム(緩衝液B)で予め平衡化した40mL HiPrep(商標)フェニルFFカラム上に載せた。洗浄後、それぞれ3カラム体積で、75%、50%および0%緩衝液BおよびH2Oでカラムを段階的に溶出した。SDS−PAGEおよび活性アッセイを使用して全分画を分析した。標的タンパク質(配列番号30または配列番号32)は0%緩衝液B溶出工程からの溶出液中に存在し;この溶出液をプールし、10K AMICON ULTRA−15装置を用いて濃縮した。95%純度より高かった最終生成物を使用するまで−20℃で40%グリセロール中で保存した。
BbrGlu2(配列番号36)およびBbrGlu5(配列番号38)の両アルファ−グルコシダーゼを4工程で精製した。各精製に対して、1L DASGIP発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して60%飽和にした。溶液を4℃で1時間撹拌し、次いで8000×gで30分間遠心した。得られたペレットを20mM HEPES pH7.0(緩衝液A)中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、1Mの最終濃度にし;次いでこの標品を20mM HEPES pH7.0、1M硫酸アンモニウムで予め平衡化したHiPrep(商標)フェニルFFカラム上に載せた。標的タンパク質(配列番号36または配列番号38)を0.5M硫酸アンモニウムでカラムから溶出させた。個々の分画をプールし、濃縮し、VIVAFLOW200限外ろ過装置(Sartorius Stedim)を用いて緩衝液を緩衝液Aに交換した。得られた溶液を緩衝液Aで予め平衡化したHiPrep(商標)Q FF16/10カラムに適用した。標的タンパク質を緩衝液A中の0〜0.5M NaClの直線状勾配でカラムから溶出させた。標的タンパク質を含有する分画をプールし、濃縮し、続いて20mM HEPES pH7.0、0.15M NaClで予め平衡化したHiLoad(商標)26/60Superdex(商標)75カラム上に載せた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、10K AMICON ULTRA−15装置を用いて濃縮し、使用するまで−20℃で40%グリセロール中で保存した。
様々なグリコシド結合に対する加水分解活性に対するアルファ−グルコシダーゼの試験
この実施例は、アルファ−グルコシダーゼがこのクラスの酵素(EC3.2.1.20)にこれまで関連付けられていたものを超える加水分解活性を有し得るか否かを試験することを開示する。実施例10からのアルファ−グルコシダーゼは、アルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合およびアルファ−1,3およびアルファ−1,6グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性を有することが示された。
アルファ−グルコシダーゼとともに基質を温置した場合の特定の基質(イソマルトース、マルトース、パノース、ロイクロースまたはニゲロース)からのグルコースの放出に基づいて、実施例10で開示される各アルファ−グルコシダーゼの基質特異性をアッセイした。共役グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ(GOX/HRP)法(1980,Anal.Biochem.105:389−397)を用いてグルコース放出速度を測定した。グルコースと反応した共役GOX/HRP酵素から生成されたペルオキシドによる2,2’−アジノ−ビス3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)の酸化の速度としてグルコース放出を定量した。
比活性(単位/mg)=傾斜(酵素)/傾斜(std)×1000(1)
(式中、1単位=1μmolグルコース/分)
を用いて、グルコース標準曲線に基づき、各アルファ−グルコシダーゼの特異的な活性を計算した。ニゲロースの場合、酵素活性を示すために、10ppmの酵素用量での反応速度の値を直接使用した。
アルファ−グルコシダーゼを用いたグルカン反応ろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解
この実施例は、グルカン合成反応から得られたろ液中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼを使用することを記載する。具体的に、不溶性グルカン(ポリアルファ−1,3−グルカン)合成反応のろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖DP2、DP3およびHS(高級糖類、DP4+)の加水分解における実施例10で開示されるアルファ−グルコシダーゼの効果を試験した。
第一に、グルカン合成反応の濃縮ろ液を実施例1のように調製した。
11種類の異なるアルファ−グルコシダーゼ(実施例10)の活性ならびに2種類のベンチマーク酵素、オリゴ−1,6−グルコシダーゼ(Megazymeより購入)およびトランスグルコシダーゼ(TG L−2000)の活性を上記で調製した精製オリゴ糖分画に対して個々に評価した(表18)。60℃でpH5.0のオリゴ糖基質(2.9%乾燥固体)および2mM塩化カルシウムを含有する溶液中で各アルファ−グルコシダーゼ(1mg/mLで調薬)を温置した。50μLの0.5M NaOHを添加することによって、温置24時間後に各反応を反応停止させた。
1または2種類のアルファ−グルコシダーゼおよびポリアルファ−1,3−グルカン合成反応から得た濃縮ろ液を含む反応物を調製した(表3)。4ppmの酵素を用いてアルファ−グルコシダーゼ反応を行うか、または混合物の場合、1:1の比で、4ppmの最終用量で各酵素を使用した。各反応において濃縮ろ液を10%乾燥固体で載せた。各反応物は、pH5.0で2mM塩化カルシウムをさらに含み、60℃または65℃で行った。23時間温置後、50μLの0.5M NaOHを添加することによって、反応を停止させた。
gtf−S/MUT3325反応からのオリゴマー/ロイクロース分画の単離
9.5Lの最終総体積中で蒸留脱イオン水中でスクロース(4.50kg)を溶解させ、80℃で5分間で撹拌しながら、得られた溶液を加熱し、次いで47℃に冷却した。撹拌しながら、0.6g/Lのgtf−S酵素(GTF0459、配列番号42)および10g/Lのムタナーゼ(MUT3325、配列番号47)を含有する15.0mLの粗製抽出物を含有する500グラムの粗製抽出物を撹拌しながら添加した(酵素調製のための一般的方法を参照)。撹拌しながら37wt%HClの1:10(v/v)希釈液をゆっくりと添加することによって、得られた混合物のpHをpH5.5〜pH6.0に直ちに調整した。スクロース変換がHPLC分析によって>95%になるまで、反応温度およびpHをそれぞれ47℃およびpH5.5〜6.0に維持し、その後、反応混合物をpH7.0〜7.5に直ちに調整し、90℃に20分間加熱し、次いで粒子および沈殿物を除去するために即時ろ過するため、25℃に冷却した。次の樹脂および条件:Ca2+型のFINEX CS 11 GC SAC、カラムi.d=9.3cm、樹脂ベッド高1.58m、T=70℃、流速=51mL/分、直線的流速=0.44m/h、フィードサイズ=0.6L=171g、フィードRI−DS=25.1g/100g、試料間隔=3分を用いたIEX/SECカラムクロマトグラフィーの前に、得られたろ液を5℃で保持した。30分〜67分で回収されたカラム分画を合わせ、66%溶解固形物になるまで蒸発によって濃縮し、一般的方法に記載のとおりHPLCにより分析した。表21は、このようにして調製された単離分画のオリゴ糖および単糖成分を示す。
Gtf−C反応からのオリゴマー/ロイクロース分画の単離
蒸留脱イオン水中でスクロース(4.50kg)を溶解させて最終総体積を9.5Lにし、得られた溶液を80℃で5分間、撹拌しながら加熱し、次いで47℃に冷却した。撹拌しながら、0.41g/Lのgtf−C酵素(GTF0088BsT1、配列番号45)を含有する500グラムの粗製抽出物を撹拌しながら添加した(酵素調製に対する一般的方法を参照)。撹拌しながら37wt%HClの1:10(v/v)希釈液をゆっくりと添加することによって、得られた混合物のpHをpH5.5〜pH6.0に直ちに調整した。スクロース変換がHPLC分析によって>95%になるまで、反応温度およびpHをそれぞれ47℃およびpH5.5〜6.0に維持し、その後、反応混合物を直ちにpH7.0〜7.5に調整し、90℃に20分間加熱し、次いで粒子および沈殿物を除去するために即時ろ過するため、25℃に冷却した。次の樹脂および条件:Ca2+型のFINEX CS 11 GC SAC、カラムi.d=9.3cm、樹脂ベッド高1.58m、T=70℃、流速=50mL/分、直線的流速=0.44m/h、フィードサイズ=0.6L=171g、フィードRI−DS=25.8g/100g、試料間隔=3分を用いたIEX/SECカラムクロマトグラフィー前に、得られたろ液を5℃で保持した。34分〜72分で回収したカラム分画を合わせ、蒸発により濃縮して67%溶解固形物にし、一般的方法に記載のようにHPLCによって分析した。表22は、このように調製された単離分画のオリゴ糖および単糖成分を示す。
Gtf−S/MUT3325およびGtf−C反応からのオリゴマー/ロイクロース分画を用いたアルファ−グルコシダーゼの一次スクリーニング
この実施例は、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応から得られるクロマトグラフィー分画中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼを使用することを記載する。具体的に、実施例13および14で調製された分画中のロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解における、実施例10で開示されるアルファ−グルコシダーゼの効果について試験を行った。
Gtf−S/MUT3325およびGtf−C反応からのオリゴマー/ロイクロース分画を用いたアルファ−グルコシダーゼの選択スクリーニング
この実施例は、実施例15に加えて、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応から得られるクロマトグラフィー分画中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためのアルファ−グルコシダーゼの使用を記載する。
1.少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を含む糖においてアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法であって、前記糖が二糖またはオリゴ糖であり、前記方法が、適切な条件下で前記糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることを含み、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、前記糖の量が、前記接触前に存在した前記糖の量と比較して減少している、方法。
2.前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が固定化されている、前記1に記載の方法。
3.前記糖がロイクロースである、前記1に記載の方法。
4.前記接触工程後のロイクロースの濃度が、前記接触前に存在したロイクロースの濃度の50%未満である、前記3に記載の方法。
5.前記適切な条件が、
(i)グルカン合成反応、または
(ii)前記グルカン合成反応から得られる分画
を含み、前記糖が前記グルカン合成反応の副産物である、前記1に記載の方法。
6.前記グルカン合成反応が、少なくとも1つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、前記5に記載の方法。
7.前記分画が前記グルカン合成反応のろ液である、前記6に記載の方法。
8.前記グルカン合成反応が、
(i)グルコシルトランスフェラーゼの生成物、または
(ii)1つ以上のアルファ−1,3−グリコシド結合または1つ以上のアルファ−1,6−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物である、少なくとも1つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、前記5に記載の方法。
9.前記分画が前記グルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である、前記8に記載の方法。
10.前記アルファ−グルコシダーゼ酵素がトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼである、前記1に記載の方法。
11.糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることにより生成される組成物であって、前記糖が二糖またはオリゴ糖であり、かつ少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を含み、前記酵素が、前記糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、前記組成物が、前記接触前に存在した前記糖の量と比較して減少した量の前記糖を含む、組成物。
12.前記糖がロイクロースである、前記11に記載の組成物。
13.前記糖が(i)グルカン合成反応、または(ii)前記グルカン合成反応から得られる分画にあり、前記糖が前記グルカン合成反応の副産物である、前記11に記載の組成物。
14.グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法であって、
(a)グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
(b)工程(a)の前記分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得るために、工程(a)の前記加水分解分画からフルクトースを分離することと
を含む、方法。
15.(a)グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダ
ーゼ酵素と接触させることであって、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも1つのアルファ−1,5グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
(b)生成物を得るために微生物を用いて工程(a)の前記分画を発酵させることであって、前記発酵が、工程(a)の後または工程(a)と同時に行われる、発酵させることと、
(c)任意選択により(b)の前記生成物を単離することと
を含み、(b)の前記生成物の収率が、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素と接触していない前記グルカン合成反応の分画を発酵させる生成物の収率と比較して上昇している、発酵方法。
Claims (12)
- (i)グルカン合成反応物または(ii)その分画に存在するロイクロースの量を減少させる方法であって、グルカン合成反応物またはその分画をトランスグルコシダーゼと接触させる工程を含み、ロイクロースの量が、接触工程前に存在したロイクロースの量と比較してグルカン合成反応物またはその分画内で減少し、ロイクロースはグルカン合成反応の副産物であり、グルカン合成反応が、少なくとも1つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成し、不溶性アルファ−グルカン生成物のグリコシド結合の少なくとも80%がアルファ−1,3−グリコシド結合である、方法。
- トランスグルコシダーゼが固定化されている、請求項1に記載の方法。
- 不溶性アルファ−グルカン生成物のグリコシド結合の少なくとも90%がアルファ−1,3−グリコシド結合である、請求項1に記載の方法。
- 不溶性アルファ−グルカン生成物のグリコシド結合の少なくとも95%がアルファ−1,3−グリコシド結合である、請求項3に記載の方法。
- 不溶性アルファ−グルカン生成物が、少なくとも100の数平均重合度を有する、請求項1に記載の方法。
- グルカン合成反応物をトランスグルコシダーゼと接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分画をトランスグルコシダーゼと接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分画が、グルカン合成反応のろ液である、請求項7に記載の方法。
- 前記分画が、グルカン合成反応の上清である、請求項7に記載の方法。
- 前記分画がグルカン合成反応物のクロマトグラフィー分画である、請求項7に記載の方法。
- フルクトースを濃縮する方法であって、
(a)請求項1に記載の方法にしたがい請求項1に記載の分画に存在するロイクロースの量を減少させ、それによってフルクトースを含む加水分解分画を提供する工程、および
(b)工程(a)の加水分解分画からフルクトースを分離し、工程(a)の加水分解分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得る工程、
を含む、方法。 - 発酵方法であって、
(a)請求項1に記載の方法にしたがい請求項1に記載の分画に存在するロイクロースの量を減少させる工程、
(b)微生物を用いて前記分画を発酵させて生成物を得る工程であって、発酵が、工程(a)の後または工程(a)と同時に行われる、工程、および
(c)任意選択により(b)の生成物を単離する工程、
を含み、(b)の生成物の収率が、トランスグルコシダーゼと接触していない前記分画を発酵させる生成物の収率と比較して上昇する、方法。
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