CN108699579A

CN108699579A - 使用具有耐热性及耐酸性的酸热菌菌种衍生的脱支酶从淀粉糖制备葡萄糖的方法以及由此制备的葡萄糖

Info

Publication number: CN108699579A
Application number: CN201780014775.6A
Authority: CN
Inventors: 安准甲; 尹烂媖; 金成俌; 朴承源
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2018-10-23
Also published as: US20190136277A1; EP3399043A4; WO2017116217A1; KR20170080537A; KR20180105623A; EP3399043A1

Abstract

本申请涉及通过使用淀粉糖作为原材料且使用酸热菌菌种衍生的酶提高将制备的葡萄糖的制备产率。本申请可取代通过水解逆反应而产生苦味的酸糖化方法，且与使用脱支酶的传统酶促糖化方法相比，具有能够降低成本的优点，这是因为可通过减少糖化反应的副反应来确保相对高的产率。

Description

使用具有耐热性及耐酸性的酸热菌菌种衍生的脱支酶从淀粉糖制备葡萄糖的方法以及由此制备的葡萄糖

技术领域

本发明涉及一种使用从酸热菌菌种衍生的脱支酶(debranching enzyme)、及糖化酶从淀粉糖制备葡萄糖的方法。

背景技术

根据主要成分，生物质可宽泛地分为糖(sugar)生物质、淀粉(starch)生物质以及纤维素(cellulose)生物质。糖易于从甘蔗中获得且可直接由生物摄取，而无需额外的预处理或糖基化。然而，由于淀粉的高分子量，例如玉米生物质等淀粉生物质不能直接用于微生物。因此，需要将淀粉分解成葡萄糖。此过程需要水且因此被称为水解(hydrolysis)。

淀粉主要通过酶水解，正如我们消化大米一样。我们食用的熟米通过从唾液腺分泌的酶在胃中降解为葡萄糖，且葡萄糖被转移到体细胞，然后用于代谢过程。将淀粉转换成葡萄糖的第一过程是使淀粉的结构松散，正如我们通过加热煮米饭一样，结果酶可以接近淀粉并将其分解成葡萄糖。此酶促降解过程是由固有的复杂机制组成。

酶促糖基化是将淀粉转换为葡萄糖的过程。根据此过程，淀粉通过源自微生物的α-淀粉酶液化，并且液化淀粉与脱支酶及糖化酶反应从而生成葡萄糖。

发明内容

技术问题

(pullulanase，诺维信公司)是从假单胞菌菌种(Pseudomonas sp.)中分离的普鲁兰酶，且主要用作酶促糖基化的脱支酶。然而，由于其对具有窄范围[DP(聚合度)4到5]的聚合度的淀粉糖的特异性，不适用于对存在于淀粉糖中的各种长度(DP 3到30)的支链进行水解，从而导致葡萄糖产率低。

技术解决方案

本发明涉及一种使用新颖脱支酶从淀粉糖制备葡萄糖的方法，且具体来说涉及一种包括以下步骤的制备葡萄糖的方法：向含有选自由淀粉、支链淀粉及麦芽糖糊精组成的群组中的一种或多种淀粉糖的底物溶液中，同时添加从耐热及耐酸的酸热菌菌种衍生的脱支酶及糖化酶，以使所述酶与淀粉糖反应。

更具体来说，利用异淀粉酶(Isoamylase)作为从酸热菌菌种衍生的脱支酶对淀粉糖进行处理，以使存在于淀粉糖中的各种长度的支链水解，从而使得能够以高的产率从淀粉糖制备葡萄糖。

本发明的另一目的是提供一种以预定单位比率使用从酸热菌菌种衍生的异淀粉酶与糖化酶从而以高的产率从淀粉糖制备葡萄糖的方法。

为了实现本发明的以上及其他目的，本发明的一个方面提供一种从淀粉糖制备葡萄糖的方法，所述方法包括利用从酸热菌菌种衍生的脱支酶及糖化酶对含有淀粉糖的底物溶液进行处理。

具体来说，所述从酸热菌菌种衍生的脱支酶可通过包括以下步骤的方法来制备：将对所述从酸热菌菌种衍生的脱支酶进行编码的基因插入到载体中以制备表达载体，将所述表达载体转化成细胞，且对经转化的所述细胞进行培养。所述方法还可包括对所得培养物进行离心分离和/或破坏。所述培养物可通过所属领域中已知的任何合适的技术来破坏，合适的技术例如为超声波均质机。

所述载体可为pET-28a(+)。

所述从酸热菌菌种衍生的脱支酶可为异淀粉酶(isoamylase)。脱支酶在α-1，6-键上具有水解活性，尤其是对具有宽范围3到30的聚合度(DP；Degree of Polymerization)的淀粉糖具有特异性，从而提高葡萄糖产率。

所述糖化酶是可催化脱支淀粉糖或淀粉糖水解成葡萄糖的酶。添加糖化酶使得能够从通过脱支酶裂开的淀粉糖链最终制备葡萄糖。举例来说，糖化酶可选自α-淀粉酶、β-淀粉酶及葡糖淀粉酶。具体来说，糖化酶可为葡糖淀粉酶。此糖化酶在pH 3到pH 7、更具体来说pH 3到pH 6的范围内催化糖基化。糖化酶的反应温度可为40℃到70℃、尤其是55℃到65℃。

酸热菌菌种可为解纤维酸热菌菌株。举例来说，解纤维酸热菌菌株可为解纤维酸热菌菌株11B[43068^TM]。所述菌株衍生的异淀粉酶(isoamylase)是按照在序列编号第1号中所述的序列进行编码，且具有在序列编号第2号中所述的氨基酸序列。

可利用表达载体来转化的细胞可为例如大肠杆菌、属于芽孢杆菌属的微生物、酵母(例如，面包酵母)、属于棒状杆菌属的微生物及植株中的任一者。

淀粉糖可为选自由例如淀粉、支链淀粉及麦芽糖糊精组成的群组中的任一种或多种。具体来说，淀粉糖可为支链淀粉型淀粉。支链淀粉及麦芽糖糊精可通过向淀粉中添加α-淀粉酶来制备。

淀粉糖可从选自例如玉米、木薯、马铃薯及大米中的任一种农作物衍生出，但可并非仅限于此。

淀粉糖可为液化淀粉糖。

底物溶液可利用从酸热菌菌种衍生的脱支酶及糖化酶在pH 2到pH 6、更优选为pH3到pH 5、最优选为pH 4.3下进行处理。

底物溶液可利用从酸热菌菌种衍生的脱支酶及糖化酶在40℃到70℃、更优选为50℃到65℃、最优选为65℃的温度下进行处理。

从酸热菌菌种衍生的脱支酶活性对糖化酶的单位比率(unit ratio)可介于2∶1到60∶1、具体来说10∶1到60∶1、更具体来说10∶1到40∶1范围内。

需要脱支酶的帮助来超过糖化酶的反应平衡。葡萄糖产率与酶活性的单位比率成比例地增加。然而，如果糖化酶活性对从酸热菌菌种衍生的脱支酶活性的单位比率超过1∶60，则葡萄糖产率可能会降低。糖化酶在淀粉糖降解为葡萄糖中起主要作用，且脱支酶在糖基化中起辅助作用。因此，如果从酸热菌菌种衍生的脱支酶活性对糖化酶活性的单位比率小于2∶1，则无法实现糖化酶在淀粉糖的降解中的作用，从而导致葡萄糖产率低。

本发明的另一方面提供一种在所述从淀粉糖制备葡萄糖中使用从酸热菌菌种衍生的脱支酶的方法。

本发明的再一方面提供一种在40℃到70℃的温度及pH 2到pH 6下从解纤维酸热菌衍生的脱支酶。脱脂酶在α-1，6-键上具有水解活性且对链长度、尤其是与DP 3和4、DP 3或大于3、或者DP 4或大于4对应的链长度具有良好的选择性，从而提高葡萄糖产率。

脱支酶在40℃到70℃、更优选为50℃到65℃、最优选为60℃的温度下具有活性。

脱支酶在pH 2到pH 6、更优选为pH 3到pH 5、最优选为pH 4.3的pH下具有活性。

有利效果

根据本发明，与使用传统市售脱支酶(普鲁兰酶)相比，使用从酸热菌菌种衍生的脱支酶(异淀粉酶)使得能够以高的产率从淀粉糖制备葡萄糖。

另外，对在多重酶促反应中使用的糖化酶与脱支酶之间的比进行调整，以使得淀粉糖的水解中的副产物(DP2)的量及未反应的产物(DP3、DP4+)的量减少，从而提高从淀粉糖得到的葡萄糖的产率。

具体来说，在根据本发明的从淀粉糖制备葡萄糖的方法中使用的脱支酶在强酸和/或高温条件下维持其活性，因此会大大提高葡萄糖的产率。

附图说明

图1示出用于淀粉糖的降解的若干水解酶及路径。

图2示出用于淀粉糖的降解的若干脱支酶及路径。

具体实施方式

将参照以下实例更详细地阐述本发明。这些实例仅为说明性的以帮助理解本发明，且不应被视为限制本发明的范围。

实例1：基因分离及重组蛋白制备

1)重组大肠杆菌的制备

对于PCR分别使用了包括以下部分的正向引物序列及反向引物序列：从耐热及耐酸的解纤维酸热菌衍生的脱支酶基因的末端序列以及限制酶NdeI及HindIII的识别序列二者。

(正向)5’GAA-TTC-ATG-CCG-GAA-3’

(反向)5’GAA-TTC-TTA-GAG-GAC-3’

结果，获得了2.1kb的PCR产物。将所获得的DNA片段插入pET-28a(+)载体中，并转染成大肠杆菌BL21(DE3)。DNA具有在序列编号第1号中所述的序列。将经转化的大肠杆菌铺展在含有卡那霉素(kanamycin)的平板培养基上。首先筛选出卡那霉素(kanamycin)抗性菌株并在液体培养基中进行了单独培养。对卡那霉素抗性菌株的DNA进行纯化并利用NdeI及HindIII二者进行了消化。发现了最终所选择的菌株具有2.1kb及5.3kb的DNA片段。使用自动测序器对序列进行了分析。结果，发现了此序列相同于所期望的脱支酶的基因序列。

2)重组蛋白制备

通过以下步骤从耐酸/耐热的解纤维酸热菌(Acidothermus cellulolyticus)衍生出脱支酶(异淀粉酶)。

利用冷冻存储的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)对含有5ml LB液体培养基的试管(test tubes)进行了接种。将接种体在37℃下在细菌培养器中进行了培养，直到达到在600nm下为2.0的吸光度。将培养肉汤添加到2L烧瓶中的500ml LB液体培养基中，然后进行了主要培养。当培养物的吸光度在600nm下达到0.4时，添加了0.1mM IPTG(异丙醇β-D-1-硫代半乳糖苷)以诱导脱支酶的质量表达。在培养期间在180rpm下进行搅拌的条件下将温度维持为37℃。即使在添加了IPTG之后，仍在120rpm进行搅拌的条件下继续在20℃进行了培养。将经转化的菌株的培养肉汤在6,000×g及4℃下离心分离了20分钟并用50mM三氯缓冲液洗涤了两次。然后，添加了Ni-NTA结合缓冲液(50mM磷酸钠、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0)，且使用超声波均质机对细胞溶液进行了破坏。在13,000×g及4℃下将细胞裂解液离心分离了20分钟。将上清液收集作为酶萃取液并利用Ni-NTA超流柱进行了纯化，以准确地表现酶的特性。发现了在通过SDS-PAGE进行确定时，经纯化的酶具有约75kDA的分子量。

实例2：通过HPLC来测量酶促活性

1)通过HPLC在以下条件下测量了从耐酸/耐热的微生物(解纤维酸热菌)衍生的脱支酶(异淀粉酶)的活性。活性测量HPLC分析条件如下。

HPLC分析条件

-检测器：RID

-流率：0.6ml/min

-样本注射体积：10μl

-分析柱：比奥-拉德HPX 87C

-溶剂：去离子水

将分析的总时间设定为20分钟。

通过以下方式确认了从耐酸/耐热的微生物(解纤维酸热菌)衍生的脱支酶(异淀粉酶)的活性：以玉米淀粉作为原材料通过与糖化酶(葡糖淀粉酶)发生多重酶促反应来制备葡萄糖。酶促反应条件如下。

首先，以1∶4的总单位比率(total unit)使用了在实例1中制备的糖化酶(葡糖淀粉酶，杜邦公司)与脱支酶(异淀粉酶，50mM乙酸钠缓冲液，pH 4.3)。在60℃的温度下将与右旋糖当量(DE(Dextrose Equivalent)9.5)的液化淀粉的多重酶促反应执行了72小时。通过在100℃加热5分钟结束了反应。然后，通过HPLC测量了所制备的葡萄糖的量。分析的结果显现出从玉米淀粉得到的葡萄糖的产率为96.2％。根据与酶促反应产物对应的峰值的面积之间的比率计算出葡萄糖产率。

实例3：使用从酸热菌菌种衍生的脱支酶(异淀粉酶)及市售脱支酶(普鲁兰酶)制备的葡萄糖的产率的比较

探究了使用从解纤维酸热菌衍生的脱支酶及市售脱支酶(普鲁兰酶，诺维信公司)从淀粉得到的葡萄糖的产率。酶促反应条件如下。

首先，以1∶4的总单位比率(total unit)使用了糖化酶(葡糖淀粉酶，杜邦公司)与各脱支酶(异淀粉酶、普鲁兰酶)。在60℃的温度下将与液化淀粉(DE 9.5)的多重酶促反应执行了72小时。通过在100℃加热5分钟结束了反应。然后，通过HPLC根据与酶促反应产物对应的峰值的面积之间的比率测量了所制备的葡萄糖的量。结果，与使用市售脱支酶(普鲁兰酶)的反应相比，使用从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)的反应产生了更高的葡萄糖产率。分析了包含二糖(DP2)及更高糖的淀粉糖。结果，当使用从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)时，未反应的产物(DP3、DP4+)的比例降低了，表明葡萄糖的产率为相对高。

[表1]

如表1所示，与使用已知对于大量制备来说最佳的普鲁兰酶相比，使用本申请中的从解纤维酸热菌衍生的异淀粉酶因其更高的活性而得到更高的葡萄糖产率。具有相对高的聚合度的未反应的产物DP3及DP4的比例在使用所述异淀粉酶时比在使用普鲁兰酶时更小。通过这些结果，可以得到将本发明的异淀粉酶应用于酶促反应会提高葡萄糖产率。

实例4：随着从酸热菌菌种衍生的脱支酶(异淀粉酶)的浓度变化而引起的葡萄糖产率的变化

探究了随着从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)的浓度变化而引起的葡萄糖产率的变化。酶促反应条件如下。在60℃的温度下将与液化淀粉(DE 9.5)的多重酶促反应执行了72小时，其中分别以1∶2、1∶10、1∶20及1∶60的总单位比率(total unit)使用了糖化酶(葡糖淀粉酶，杜邦公司)与脱支酶。通过在100℃下加热5分钟而结束了反应。然后，通过HPLC根据与酶促反应产物对应的峰值的面积之间的比率测量了所制备的葡萄糖的量。结果，脱支酶(异淀粉酶)对糖化酶的比率越高，则葡萄糖产率越高。这些结果显示出由于从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)的更高活性使得制备更少量的在淀粉水解中形成的副产物(DP2)且糖化酶引起更大量的未反应的产物(DP4)降解，从而提高葡萄糖产率。

[表2]

如表2所示，在糖化酶对异淀粉酶的总单位比率从1∶2增加到1∶60的情况下，葡萄糖是以高的产率进行制备。即，葡萄糖的产率随着异淀粉酶对糖化酶的比率增加而提高。

实例5：随着在从酸热菌菌种衍生的脱支酶(异淀粉酶)及糖化酶的多重反应中糖化酶的浓度变化而引起的葡萄糖产率的变化

探究了随着在脱支酶(异淀粉酶)及糖化酶的多重反应中糖化酶(葡糖淀粉酶，杜邦公司)的浓度变化而引起的葡萄糖产率的变化。酶促反应条件如下。在60℃的温度下将与液化淀粉(DE 9.5)的多重酶促反应执行了72小时，其中分别以1∶0.05、1∶0.04、1∶0.03及1∶0.02的总单位比率(total unit)使用了脱支酶与糖化酶。通过在100℃下加热5分钟而结束了反应。然后，通过HPLC根据与酶促反应产物对应的峰值的面积之间的比率测量了所制备的葡萄糖的量。结果，糖化酶的比例越小，则葡萄糖产率越高。当淀粉水解反应中的糖化酶(葡糖淀粉酶)达到水解平衡时，形成了副产物(DP2)。此问题通过降低糖化酶的浓度以减少副产物的形成而得以解决，从而提高葡萄糖的相对产率。

[表3]

如表3所示，当脱支酶对糖化酶的总单位比率从1∶0.05变为1∶0.03时，葡萄糖产率提高。即，糖化酶的比例越小，葡萄糖产率越高。

比较例1：从各种菌株衍生的异淀粉酶的支链淀粉降解活性的比较(在糖基化条件(60℃，pH 4.3)下进行活性评价

[表4]

比较了在糖基化条件下从各种菌株衍生的异淀粉酶的支链淀粉降解活性。结果示于表4中。发现了仅从解纤维酸热菌及海洋红嗜热盐菌衍生的酶对支链淀粉的降解有活性。然后，比较了经这两种酶处理之后的葡萄糖的产率。

比较例2：在经从解纤维酸热菌及海洋红嗜热盐菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)处理之后葡萄糖产率的比较

探究了在经从解纤维酸热菌及海洋红嗜热盐菌衍生的脱支酶处理之后从淀粉得到的葡萄糖的产率。酶促反应条件如下。

首先，在60℃的温度下将与液化淀粉(DE 9.5)的多重酶促反应执行了72小时，其中以1∶2到1∶60的总单位比率(total unit)使用了糖化酶(葡糖淀粉酶，杜邦公司)与各脱支酶(异淀粉酶，普鲁兰酶)。通过在100℃下加热5分钟而结束了反应。然后，通过HPLC根据与酶促反应产物对应的峰值的面积之间的比率测量了所制备的葡萄糖的量。结果，与当使用从海洋红嗜热盐菌衍生的脱支酶时(参见表5的结果)相比，当使用从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)时(参见表6的结果)获得了更高的葡萄糖产率。另外，分析了包含二糖(DP2)及更高糖的淀粉糖。结果，当使用从解纤维酸热菌衍生的脱支酶(异淀粉酶)时，降低了不降解为葡萄糖的未反应的产物(DP2DP4+)的比例，从而表明葡萄糖的相对高的产率。

[表5]

[表6]

如表5及表6所示，与当使用从海洋红嗜热盐菌衍生的脱支酶时相比，当使用从解纤维酸热菌衍生的异淀粉酶时获得了更高的葡萄糖产率以及更小比例的具有相对高聚合度的未反应产物DP2及DP4。即，将本发明的异淀粉酶应用于酶促反应会提高葡萄糖产率。

<110> CJ 第一制糖株式会社

<120> 使用具有耐热性及耐酸性的酸热菌菌种衍生的脱支酶从淀粉糖制备葡萄

糖的方法以及由此制备的葡萄糖

<130> P16-6213

<150> KR 2015/0191033

<151> 2015-12-31

<160> 2

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 2139

<212> DNA

<213> 用以编码从解纤维酸热菌ATCC 43068衍生的异淀粉酶的DNA序列（ DNAsequece for encoding isoamylase derived from Acidothermus cellulolyticus ATCC43068）

<400> 1

atgccggaac cgacgacgca atccctcgag gtctggccgg gcgatccgta tccgctcggt 60

gccacgtatg acggggcggg cacgaacttc gccgttttct ccgaggtcgc cgagcagatc 120

gagctctgcc tcttcgacga cgacgggaat gagactcggg tcaccctccc ggagtacgac 180

gcattcgtct ggcacggcta cctgccgggg atcggcccgg ggacacggta cgggttccgc 240

gtgcacggcc cctatgaccc cgcccgcggt ctgcggtgca atccggcgaa actcctcctc 300

gacccatacg ccaaagccat cgacggggac attgacggtc acgaatcgct cttcggttac 360

cgattcggcg atccggcgag ccgcaacgat gaagactccg cgccgcacat gatgaagtcg 420

gttgtcatca atccgttctt cgactggcgc aatgaccatc cgctccgcac gccgtaccac 480

gagtcgatca tttacgaggc gcacgtgcgc ggcatgacga tgacgcaccc ggagattccc 540

gagcatttgc gcggtacgta cgccgcgctc gcgcacccgg tgatgctcga ctacctgtct 600

tccctgggag tgacggccgt cgagctgatg ccggtgcatc aattcgtcac cgataccgcg 660

ctgcgggagc gcggcctgcg caattactgg ggatacaaca cgatcggctt ctttgccccg 720

cacaacggat attccgcatc cggcagtaga ggcgagcagg tgcaggagtt caaggccatg 780

gtccgcgccc tgcatgaagc cggtatcgag gtgatcctgg acgtcgtcta taaccacact 840

gctgaaggca atcacctcgg gcctaccctc tcattccgcg gcctggacaa cgcggcgtat 900

taccgcctgg cggatgacga tcccagccgg tacgtcgact acaccggcac cggtaacagt 960

ttcaacgccc gcaatccgca tgccttgcag ctcatcatgg attccctccg ttactggatt 1020

ctcgagatgc acgtcgacgg gttccggttc gaccttgcgt ccgcgttggc ccgtgaattg 1080

cacgacgtcg accggctctc ggccttcttc gacctcgtac agcaggatcc ggtggtgagc 1140

caggtcaagc tcatcgccga gccgtgggac gtcggcgagg gcggttacca ggtcggcaat 1200

ttcccgccgc tgtggagcga gtggaacggt aaataccgcg acacggtgcg ggatttctgg 1260

cgcggtgagc cggcgactct cggtgaattc gcctcccggc tgaccggctc ctcggacctg 1320

tacgcgagct cgggccgccg tccgatggcg tccatcaact tcgtcacctg ccacgacggc 1380

ttcaccttgc acgacctggt ctcgtacaac gagaagcaca acgaggccaa cggtgaggga 1440

aaccgtgacg gcagcgacga caatcggtca tggaactgcg gtgtcgaagg acccacggac 1500

gacgtgcaca tcatcgcgct tcgggagcaa caaaagcgca atttcctcac gacgctcctg 1560

ctctcgcagg gcgttcccat gattctgcac ggggacgagt tcgggcgaac ccaacggggc 1620

aacaacaacg cctactgcca ggacaacgaa atctcctgga tggattggcg gctcgcagtc 1680

gagcacgagg tgcaactcag cttcacccga aagctcacca cgttccggaa agaacacccg 1740

gtcttccgcc ggcggcggtt cttcgacggc aagccggttc cgcatgtcgc cggcgaggca 1800

ctgccggata tcgcctggtt caccccggcc gcggcgctga tgaccgagac ggactgggag 1860

accgggtatg ccaagagcct gaccgtcttc gtcaacggcg atgcgatccc gtcacccgac 1920

cgccgcggcc agccggtgcg ggacgattcc ttcctgttgc tgttcaacgc cgacgcgaac 1980

gacctcgaat tccgccttcc cgacgaggag tacggccagc gatgggaggc cgtcatcgac 2040

accaccgatc ccctgctcat cgatcccccg acgtacaagg cacaggcggc ggtcaccgtg 2100

ccggctcgat gcgttctggt gctgcgccgt gtcctctaa 2139

<210> 2

<211> 712

<212> PRT

<213> 从解纤维酸热菌ATCC 43068衍生的异淀粉酶（Isoamylase derived fromAcidothermus cellulolyticus ATCC 43068）

<400> 2

Met Pro Glu Pro Thr Thr Gln Ser Leu Glu Val Trp Pro Gly Asp Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Tyr Asp Gly Ala Gly Thr Asn Phe Ala Val

20 25 30

Phe Ser Glu Val Ala Glu Gln Ile Glu Leu Cys Leu Phe Asp Asp Asp

35 40 45

Gly Asn Glu Thr Arg Val Thr Leu Pro Glu Tyr Asp Ala Phe Val Trp

50 55 60

His Gly Tyr Leu Pro Gly Ile Gly Pro Gly Thr Arg Tyr Gly Phe Arg

65 70 75 80

Val His Gly Pro Tyr Asp Pro Ala Arg Gly Leu Arg Cys Asn Pro Ala

85 90 95

Lys Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Ile Asp Gly Asp Ile Asp

100 105 110

Gly His Glu Ser Leu Phe Gly Tyr Arg Phe Gly Asp Pro Ala Ser Arg

115 120 125

Asn Asp Glu Asp Ser Ala Pro His Met Met Lys Ser Val Val Ile Asn

130 135 140

Pro Phe Phe Asp Trp Arg Asn Asp His Pro Leu Arg Thr Pro Tyr His

145 150 155 160

Glu Ser Ile Ile Tyr Glu Ala His Val Arg Gly Met Thr Met Thr His

165 170 175

Pro Glu Ile Pro Glu His Leu Arg Gly Thr Tyr Ala Ala Leu Ala His

180 185 190

Pro Val Met Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Gly Val Thr Ala Val Glu

195 200 205

Leu Met Pro Val His Gln Phe Val Thr Asp Thr Ala Leu Arg Glu Arg

210 215 220

Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly Tyr Asn Thr Ile Gly Phe Phe Ala Pro

225 230 235 240

His Asn Gly Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Glu Gln Val Gln Glu

245 250 255

Phe Lys Ala Met Val Arg Ala Leu His Glu Ala Gly Ile Glu Val Ile

260 265 270

Leu Asp Val Val Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro

275 280 285

Thr Leu Ser Phe Arg Gly Leu Asp Asn Ala Ala Tyr Tyr Arg Leu Ala

290 295 300

Asp Asp Asp Pro Ser Arg Tyr Val Asp Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Ser

305 310 315 320

Phe Asn Ala Arg Asn Pro His Ala Leu Gln Leu Ile Met Asp Ser Leu

325 330 335

Arg Tyr Trp Ile Leu Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu

340 345 350

Ala Ser Ala Leu Ala Arg Glu Leu His Asp Val Asp Arg Leu Ser Ala

355 360 365

Phe Phe Asp Leu Val Gln Gln Asp Pro Val Val Ser Gln Val Lys Leu

370 375 380

Ile Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly Glu Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn

385 390 395 400

Phe Pro Pro Leu Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Thr Val

405 410 415

Arg Asp Phe Trp Arg Gly Glu Pro Ala Thr Leu Gly Glu Phe Ala Ser

420 425 430

Arg Leu Thr Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Ala Ser Ser Gly Arg Arg Pro

435 440 445

Met Ala Ser Ile Asn Phe Val Thr Cys His Asp Gly Phe Thr Leu His

450 455 460

Asp Leu Val Ser Tyr Asn Glu Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Glu Gly

465 470 475 480

Asn Arg Asp Gly Ser Asp Asp Asn Arg Ser Trp Asn Cys Gly Val Glu

485 490 495

Gly Pro Thr Asp Asp Val His Ile Ile Ala Leu Arg Glu Gln Gln Lys

500 505 510

Arg Asn Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Ile

515 520 525

Leu His Gly Asp Glu Phe Gly Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala

530 535 540

Tyr Cys Gln Asp Asn Glu Ile Ser Trp Met Asp Trp Arg Leu Ala Val

545 550 555 560

Glu His Glu Val Gln Leu Ser Phe Thr Arg Lys Leu Thr Thr Phe Arg

565 570 575

Lys Glu His Pro Val Phe Arg Arg Arg Arg Phe Phe Asp Gly Lys Pro

580 585 590

Val Pro His Val Ala Gly Glu Ala Leu Pro Asp Ile Ala Trp Phe Thr

595 600 605

Pro Ala Ala Ala Leu Met Thr Glu Thr Asp Trp Glu Thr Gly Tyr Ala

610 615 620

Lys Ser Leu Thr Val Phe Val Asn Gly Asp Ala Ile Pro Ser Pro Asp

625 630 635 640

Arg Arg Gly Gln Pro Val Arg Asp Asp Ser Phe Leu Leu Leu Phe Asn

645 650 655

Ala Asp Ala Asn Asp Leu Glu Phe Arg Leu Pro Asp Glu Glu Tyr Gly

660 665 670

Gln Arg Trp Glu Ala Val Ile Asp Thr Thr Asp Pro Leu Leu Ile Asp

675 680 685

Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Gln Ala Ala Val Thr Val Pro Ala Arg Cys

690 695 700

Val Leu Val Leu Arg Arg Val Leu

705 710

Claims

1.一种从淀粉糖制备葡萄糖的方法，包括利用从耐热及耐酸的酸热菌菌种衍生的脱支酶以及糖化酶对含有淀粉糖的底物溶液进行处理。

2.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中从所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶是通过以下方式来制备：将对所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶进行编码的基因插入载体中以制备表达载体，将所述表达载体转化成细胞，且大量制备经转化的所述细胞。

3.根据权利要求2所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中所述载体是pET-28a(+)。

4.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中从所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶是异淀粉酶(isoamylase)。

5.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中所述酸热菌菌种是解纤维酸热菌。

6.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中经转化的细胞是大肠杆菌、属于芽孢杆菌属的微生物、酵母、属于棒状杆菌属的微生物及植株中的任一者。

7.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中所述淀粉糖是支链淀粉型淀粉。

8.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中所述淀粉糖是液化淀粉糖。

9.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中所述淀粉糖是从选自玉米、木薯、马铃薯及大米中的任一种农作物衍生出。

10.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中含有所述淀粉糖的所述底物溶液是利用从所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶及所述糖化酶在pH 2到pH 6下进行处理。

11.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中含有所述淀粉糖的所述底物溶液是利用从所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶及所述糖化酶在40℃到70℃的温度下进行处理。

12.根据权利要求1所述的从淀粉糖制备葡萄糖的方法，其中从所述酸热菌菌种衍生的所述脱支酶对所述糖化酶的总单位比率是2∶1到60∶1。

13.一种使用从耐热及耐酸的酸热菌菌种衍生的脱支酶的方法，其中在从淀粉糖制备葡萄糖的过程中使用。

14.一种从解纤维酸热菌衍生的脱支酶，其是在40℃到70℃的温度及pH 2到pH 6下具有活性。