CN108410841B

CN108410841B - 一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用

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Publication number: CN108410841B
Application number: CN201810070844.1A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 赵宁; 闫巧娟; 王玉川; 马俊文
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108410841A

Abstract

本发明涉及一种嗜热杜邦菌α‑淀粉酶的高效制备方法及其应用。克隆嗜热杜邦菌α‑淀粉酶基因并在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵168h，上清液酶活力达到38314.2U/mL，蛋白含量为28.7mg/mL。所述酶的最适pH和最适温度分别为6.5和60℃，在pH 4.5‑10.0的范围内和55℃以下，酶活力保持稳定。所述酶对Ca²⁺没有依赖性，且具有一定的转糖苷活性。所述酶可用于生产麦芽糖含量为51.8％的麦芽糖浆；应用于馒头和面包中，能够增大比容，减小硬度。所述酶在食品行业具有很大的应用潜力。

Description

一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体说是一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用。

背景技术

α-淀粉酶能够从淀粉分子内部随机切断α-1,4糖苷键，其产物还原性末端葡萄糖残基上C1碳原子的构型为α-构型。α-淀粉酶在自然界中分布广泛，不仅可以作用于直链淀粉，还可作用于支链淀粉，因此广泛应用于食品、造纸、饲料等多个行业中。在淀粉糖生产中，常以淀粉为原料，将α-淀粉酶与普鲁兰酶等复配，生产葡萄糖、麦芽糖等淀粉糖；在烘焙过程中加入α-淀粉酶，可以提高面包体积，改善面包组织结构；在饲料工业中，通过添加α-淀粉酶可促进幼龄动物对淀粉的消化利用，同时发现在肉鸡饲料中添加一定量的α-淀粉酶，可提高肉鸡增重(丁皓,王冠,徐丽,等.α-淀粉酶的应用研究进展.饲料博览,2012,(08):12～14)。

大多天然微生物产α-淀粉酶，存在产酶活力低、酶系复杂等问题，随着基因工程技术的发展，构建工程菌株成为外源基因高效表达的有效途径。巴斯德毕赤酵母作为较完善的真核表达系统，目前，已有多种来源α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达。Wang等将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达，经在5L发酵罐分批补料发酵168h，α-淀粉酶产量为8.3g/L，在50L发酵罐中，α-淀粉酶产量为12.2g/L(WANG J,LIY,LIU D,et al.Codon optimization significantly improves the expression levelofα-amylase gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris.[J].BioMedResearch International,2015,2015:1-9)。Parashar等克隆来源于Bacillus acidicola和Geobacillus thermoleovorans嵌合的α-淀粉酶基因，成功表达于毕赤酵母，在7L发酵罐中发酵产α-淀粉酶，最终表达量为120mg/L(PARASHAR D,SATYANARAYANA T.Production ofchimeric acidicα-amylase by the recombinant Pichia pastoris and itsapplications[J].Frontiers in Microbiology,2017,8(493):1-10)。中国发明专利201210251847.8公开了一种生产α-淀粉酶的方法，克隆大麦、地衣芽孢杆菌和曲霉的α-淀粉酶基因，构建含有以上三种α-淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将载体转化至相应的宿主菌，筛选高产酶活菌株，得到反应温度和pH适用范围更广的α-淀粉酶。201510127009.3公开了一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建，克隆枯草芽孢杆菌基因组中的低温酸性α-淀粉酶基因，并转化至毕赤酵母，获得高产低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株。可以看出α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达具有很大发展潜力，但是目前关于嗜热真菌α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达的报道较少，仅有Rhizomucor pusillus来源α-淀粉酶(HE Z,ZHANG L,MAO Y,etal.Cloning of a novel thermostable glucoamylase from thermophilic fungusRhizomucor pusillus and high-level co-expression withα-amylase in Pichiapastoris[J].BMC Biotechnology,2014,14(1):3-10)。

根据重要菌株命名的研究报道，嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)已与嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)合并(Houbraken J,de Vries R P,Samson R A.Moderntaxonomy of biotechnologically important Aspergillus and Penicilliumspecies.ADVANCES IN APPLIED MICROBIOLOGY.2014,86:199～249)。目前未见以嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)命名菌株的产酶报道，嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)仅有产木聚糖酶(滕超,范园园,曲玲玉,等.嗜热真菌Talaromycesthermophilus F1208产木聚糖酶条件优化.中国食品学报,2015,15(08):85～93)、脂肪酶(Zhang X,Li X,Xia L.Heterologous expression of an alkali and thermotolerantlipasefrom Talaromyces thermophilus in Trichoderma reesei.APPLIEDBIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY,2015,176(6):1722～1735)的报道，未见产α-淀粉酶的报道。

本发明中嗜热杜邦菌L18是实验室保存的一株嗜热真菌，将其在毕赤酵母中高效表达，并研究该酶的酶学性质及其在制备麦芽糖浆和烘焙食品中的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种蛋白质，来源于嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)L18，是以下1)或2)或3)的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基酸末端第19至494位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质为人工合成，或先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明保护上述蛋白质的编码基因(命名为TdAmyA)。

所述编码基因为以下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第55至1485位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体(即重组质粒)、表达盒、转基因细胞或重组菌。

扩增上述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-TdAmyA。

所述重组载体具体为用序列表中序列1所示的核苷酸序列替换载体pPIC9K的EcoRI和NotI识别序列间的片段(载体pPIC9K被限制性核酸内切酶EcoRI和NotI切成一个大片段和一个小片段，替换该小片段)，得到的重组质粒pPIC9K-TdAmyA。

所述重组菌可通过将所述重组载体导入酵母得到的重组毕赤酵母。所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤酵母。

本发明的另一目的在于提供一种生产所述蛋白质的方法。

所述方法是将所述重组菌进行发酵培养，得到所述的蛋白质。

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃、pH为5.0、溶氧大于20％、200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

其中步骤1)中，所述BMGY培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度物质：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34％的YNB，质量百分浓度4×10^-5％生物素和体积百分比1％的甘油；

步骤3)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油加进培养基的速度为30mL/h/1L起始发酵液，时间为4h；

步骤4)中，所述甲醇的流加速度为6mL/h/1L起始发酵液。

上述蛋白质在麦芽糖浆生产中的应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白质在馒头、面包中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种来源于嗜热杜邦菌的α-淀粉酶及其编码基因。重组巴斯德毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达38314.2U/mL，蛋白含量可达28.73mg/mL，实现了高效表达。将粗酶液过DEAE52弱阴离子交换层析，纯化得到电泳级纯酶。该α-淀粉酶的最适反应pH为6.5，在pH 4.5-10.0保温30min，残余酶活力在80％以上；最适反应温度为60℃，在55℃下保持较好的稳定性。本发明提供的α-淀粉酶可水解淀粉液化液生产麦芽糖浆并应用于馒头和面包中能够增大比容，减小硬度。本发明提供的α-淀粉酶在食品工业上具有很大应用潜力。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为α-淀粉酶在5L发酵罐中高密度发酵的产酶历程图(A)和SDS-PAGE电泳图(B)(▲：酶活；□：蛋白浓度；■：菌体湿重)；

图2为α-淀粉酶的纯化电泳图(M：标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液)；

图3为SDS-PAGE法(A)和凝胶过滤法(B)测α-淀粉酶分子量示意图；

图4为α-淀粉酶的最适pH(A)和pH稳定性(B)测定曲线图(柠檬酸(■)；柠檬酸-Na₂HPO₄(○)；MES(●)；PB(△)；MOPS(★)；CHES(▲)；CAPS(□))；

图5为α-淀粉酶的最适反应温度(A)、温度稳定性(B)和半衰期(C)测定曲线图(55℃(■),60℃(▲),65℃(╳))；

图6为α-淀粉酶水解不同底物的历程图；

图7为α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响曲线图；

图8为水解温度对麦芽糖含量的影响曲线图；

图9为水解时间对麦芽糖含量的影响曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂如分子试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原料等，如无特殊说明均可从商业途径获得。

以下实施例中α-淀粉酶酶活力的测定方法及定义如下：

在试管中加900μL 1％(w/v)的可溶性淀粉，在60℃水浴中保温2min，加100μL用缓冲液(50mM MES pH 6.5)稀释适当倍数的酶液反应10min，加1mL DNS试剂终止反应，将试管移至沸水中煮10min，用自来水冷却至室温，在540nm下测吸光值。淀粉酶酶活力定义：在以上条件下，每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以U表示。

实施例1.嗜热杜邦α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的表达

1、重组菌的构建及高拷贝筛选

设计上游引物TdAmyAEcoRIF：

5’-CCATGTACGTAGCGACCCCGGCTGAGTGG-3’

设计下游引物TdAmyANotIR：

5’-CCGCCTAGGCTACGCGGACGCACACAGACC-3’

以嗜热杜邦α-淀粉酶的cDNA和DNA为模板，PCR扩增所述蛋白的氨基酸的编码基因序列。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，循环34次，72℃后延伸10min。以DNA为模板扩增得到长约1931bp的片段，该基因含有8个内含子，以cDNA为模板得到长约1431bp的片段，编码476个氨基酸。Signal P分析表明信号肽由18个氨基酸编码，且预测该基因编码的蛋白质分子量为51.9kDa，等电点为4.33，该基因含有3个N端糖基化位点，6个O端糖基化位点。通过Blastp比对，分析氨基酸序列，α-淀粉酶基因TdAmyA编码的氨基酸序列与已报道的米曲霉(Aspergillus oryzae RIB40，POC1B4)来源α-淀粉酶的同源性最高，最高为65％，(Wirsel S,Lachmund A,Wildhardt G,et al.Threeα-amylase genes of Aspergillus oryzae exhibit identical intron-exonorganization.MOLECULAR MICROBIOLOGY,1989,3(1):3～14)。

对PCR扩增产物回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的酵母表达载体pPIC9K的载体骨架片段以T4DNA连接酶进行连接，连接后的质粒转入DH5α感受态中，涂于LB Amp⁺板上，挑取单菌落进行菌落PCR，将条带正确的菌落进行测序，比对后得到阳性克隆。将得到的重组载体命名为pPIC9K-TdAmyA。将得到的重组载体pPIC9K-TdAmyA以限制性内切酶SalⅠ线性化后得到电转化巴斯德毕赤酵母GS115，构成重组菌。

将得到的重组菌涂布MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，从MD平板得到的His⁺转化子经灭菌水刮取后取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为1、2和4mg/mL)。30℃下培养3-5d后，挑取转化子于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)摇瓶培养16-18h，3000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的PB缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬菌体至OD₆₀₀为1.0左右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量10mL培养基，温度30℃，转速200rpm。

2、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵

将步骤二获得的产酶水平高的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵。发酵方法及培养基(种子培养基BMGY、发酵基本培养基BSM、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基)的配制参照Pichia Fermentation Process Guidelines(VersionB，053002，Invitrogen)。整个发酵过程采用种子液培养、基础培养、甘油流加培养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

1)种子液培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株，接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液。

2)基础培养：将种子液接种到5L发酵罐中(装有1.5L发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加入PTM₁4.35mL/L起始发酵液，接种量10％，转速600rpm，温度30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始甘油流加培养阶段。

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，控制温度30℃，pH 5.0，始终监视溶氧，通过调整流加速度保持溶氧大于20％。流加时间4-6h，菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油。

4)100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，监控溶氧大于20％，控制温度30℃，pH 6.0。

发酵过程中取样测菌体湿重、蛋白质含量和酶活力，见图1。发酵过程中菌体湿重、蛋白含量和酶活力变化如图1A所示，发酵过程中蛋白的SDS-PAGE电泳图如图1B所示。高密度发酵168h时酶活力达到最高，发酵上清液酶活力为38314.2U/mL，蛋白浓度为28.73mg/mL。

实施例2.α-淀粉酶的纯化和酶学性质

1、α-淀粉酶的纯化

将发酵液于4℃、10000rpm离心10min，取上清置于50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中在4℃下透析过夜，透析后的酶液于4℃、10000rpm离心10min。处理后的酶液进行DEAE52弱阴离子柱纯化。层析柱预先用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)缓冲液平衡，流速为1.0mL/min；将酶液以1.0mL/min流速上样；用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min；用含有0-500mM NaCl的50mM PB(pH 8.0)缓冲液冲洗柱子至OD₂₈₀小于0.1，流速为1.0mL/min，收集洗脱后的溶液，并用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图2所示，得到电泳级纯酶，α-淀粉酶的纯化结果见表2，纯酶的比酶活为2814.3U/mg，回收率为82.2％，纯化倍数为2.1。用SDS-PAGE法和凝胶S-100层析法测α-淀粉酶的分子量，结果如图3所示。

表2α-淀粉酶的纯化表

由SDS-PAGE(如图3A所示)和凝胶S-100(如图3B所示)分析，采用SDS-PAGE测定α-淀粉酶TdAmyA的分子量约为61.2kDa(如图3A所示)，Sephacryl S-100HR凝胶层析测定其分子量为59.2kDa(如图3B所示)。

2、α-淀粉酶的酶学性质

1)最适反应pH及pH稳定性

最适pH的测定：在60℃条件下，测定重组α-淀粉酶TdAmyA在不同缓冲体系中的酶活力。选择缓冲液的pH范围及体系如下(50mM)：柠檬酸(pH：3.0-6.0)，柠檬酸-Na₂HPO₄(pH：3.0-7.0)，MES(pH：5.5-7.0)，磷酸盐缓冲液(pH：6.0-8.0)，MOPS(pH：6.5-7.5)，CHES(pH：8.0-10.0)，CAPS(pH：10.0-11.0)，用以上缓冲液配制1％可溶性淀粉底物和稀释酶液，按照DNS法测定α-淀粉酶酶活力，以酶活力的最高点设为100％。

pH稳定性的测定：用上述不同体系缓冲液适当稀释酶液，40℃保温处理30min，然后迅速冰水浴30min，在最适pH条件下，DNS法测定残余酶活力，以未做处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力占空白对照酶活力的百分比。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应pH为6.5(如图4A所示)，在pH 4.5-10.0处理30min，残余酶活力在80％以上(如图4B所示)。

2)最适反应温度、温度稳定性和半衰期

最适温度：用最适缓冲液配制可溶性淀粉底物，在最适pH条件下，DNS法测定温度对重组α-淀粉酶TdAmyA酶活力的影响，即是在40-90℃条件下测定酶活力，设定酶活力最高点为100％。

温度稳定性：用最适pH缓冲液配制可溶性淀粉底物并适当稀释纯酶液，在各温度下保温30min，然后迅速冰水浴30min，DNS法测定重组α-淀粉酶TdAmyA残余酶活力，以未做处理的酶液作为对照。

半衰期的测定：将纯酶液用最适pH缓冲液适当稀释，在不同温度55-65℃下处理0-4h，间隔不同时间取样，按照DNS法测定残余酶活力，以未做处理酶液为对照，计算残余酶活力占对照组的百分比，以取样时间为横坐标，残余酶活百分比的对数值为纵坐标，制作标准曲线，计算重组α-淀粉酶TdAmyA在不同温度下，酶活衰变至最高酶活50％所用的时间。

结果表明，α-淀粉酶的最适反应温度为60℃(如图5A所示)，在55℃以下保持较好的稳定性(如图5B所示)，α-淀粉酶在55℃、60℃、65℃时半衰期分别为523.9min，92.6min、51.0min(如图5C所示)。

3)底物特异性

分别以10mg/mL的可溶性淀粉、红薯淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、糯米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、普鲁兰糖、直链淀粉、支链淀粉和三种环糊精(α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精)为底物，测定重组α-淀粉酶TdAmyA的底物特异性。在60℃，pH 6.5MES(50mM)缓冲液的条件下，反应10min。采用DNS法测定酶活力，以可溶性淀粉为底物测得的酶活力设定为100％，每分钟反应生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位，结果见表3。

表3α-淀粉酶TdAmyA的底物特异性

结果表明该酶对多种底物均有水解活性，其中对直链淀粉的水解能力最强(117.8％)，其次是红薯淀粉(109.2％)、玉米淀粉(103.2％)、小麦淀粉(92.02％)、大米淀粉(88.21％)、马铃薯淀粉(50.05％)，对糯米淀粉、支链淀粉、普鲁兰糖及γ-糊精的水解程度较低，表现相对酶活均在50％以下，对α-糊精和β-糊精没有水解活性。

4)水解特性

以10mg/mL的可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、三种麦芽寡糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖)、普鲁兰糖为底物，按照2U/mL添加重组α-淀粉酶TdAmy，在50℃水浴条件下，反应12h，分别在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12h时取样，水解产物采用薄层层析法(TLC)分析。

薄层层析法分析水解产物(TLC)条件：展层液为正丁醇：乙酸：水按照2:1:1(v/v/v)配成，将点样后的硅胶板放入展层液中展开2次，吹干后放入显色剂(硫酸：甲醇＝5:95，v/v)浸润，吹干后放入130℃烤箱中显色5min，以麦芽寡糖(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖)的混合物作为标准品，结果如图6所示。

该酶水解以淀粉多糖为底物(直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉)时，生成的产物主要是麦芽二糖和麦芽三糖，有极少量聚合度较高的麦芽寡糖和葡萄糖生成。以麦芽寡糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五塘)为底物时，产物主要是麦芽二糖和少量葡萄糖，还有一些聚合度大于本身底物的麦芽寡糖生成，说明该酶有一定的转糖苷活性。

实施例3.嗜热杜邦菌α-淀粉酶在制备麦芽糖浆中的应用

1)糖含量测定

色谱条件：氨基键合柱，柱温45℃；流动相：乙腈：水＝60：40，流速1mL/min，进样体积10μL，糖化液过0.22μm滤膜，稀释一定倍数备用。

糖化完成后计算各糖含量和水解率如下：

干物质质量测定：阿贝折光仪直接测定(GB/T 20885—2007)。

2)α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在温度55℃，液化液自然pH(pH 5.9)的条件下，按照液化液质量分别添加重组α-淀粉酶TdAmyA 40、45、50、55、60、65、70、75、80U/g，水解8h，HPLC检测其各糖的含量，考察重组α-淀粉酶TdAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响，并计算在最优加酶量下的水解率。

α-淀粉酶加酶量对麦芽糖含量的影响如图7所示。加酶量为65U/g时，麦芽糖含量达到最大，为51.79％，此时的水解率为67.2％。

3)水解温度对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，按照65U/g的加酶量，在液化液自然pH(pH 5.9)的条件下，温度分别为50、55、60、65℃的条件下水解8h，HPLC检测其各糖的含量，考察水解温度对麦芽糖含量的影响，并计算在最佳水解温度下的水解率。

水解温度对麦芽糖含量的影响如图8所示。温度为55℃时，糖化液中麦芽糖含量最高。

4)水解时间对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在加酶量65U/g、温度55℃和自然pH(pH5.9)的条件下分别水解4、6、8、12、16、18、24h，HPLC检测其各糖的含量，考察水解时间对麦芽糖含量的影响，并计算在最佳水解时间下的水解率。

水解时间对麦芽糖含量的影响如图9所示。水解时间为8h时，麦芽糖含量达到最大，最大为51.75％。

实例4.嗜热杜邦菌α-淀粉酶在面包中的应用

1)面包制作方法

500g高筋面粉中加入6g酵母，250g水，75g糖，5g盐，低速搅拌2min，高速搅拌3min，加入30g黄油，搅拌，盖上保鲜膜，静置10min，分割(150g/个)室温成型5min，38℃，80％相对湿度条件下发酵90min，最后焙烤20min(面火180℃，底火200℃)，待面包冷却2h后测定面包的比容。采用置换法测定面包的比容。

2)比容及质构指标的测定

采用菜籽置换法测定面包的比容。将面包切成20mm片状，采用直径为35mm的探头挤压面包片，设置参数：测试类型为TPA质构分析，形变目标为40％，触发点负载为5g，测试速度为1.00mm/s，返回速度为1.00mm/s。测定各项质构指标。

表4面包的指标变化

加酶量在20000U/Kg时，比容最大，增大8.4％；加酶量在25000U/Kg时，硬度最小，减小21.6％。

实例5.嗜热杜邦菌α-淀粉酶在馒头中的应用

1)馒头制作方法

500g面粉中加入4g酵母，240g水，低速搅拌成团，高速搅拌4min，分割(110g/个)，38℃，80％相对湿度条件下发酵40min，最后蒸制15min，待馒头冷却1h后测定馒头的比容。采用置换法测定馒头的比容。

2)比容及质构指标的测定

采用菜籽置换法测定馒头的比容。将馒头切成20mm片状，采用直径为35mm的探头挤压馒头片，设置参数：测试类型为TPA质构分析，形变目标为30％，触发点负载为5g，测试速度为1.00mm/s，返回速度为1.00mm/s。测定各项质构指标。

表5馒头的指标变化

加酶量在20000U/Kg时，比容达到最大，相对于对照比容增大8.1％，硬度减小17.31％。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 中国农业大学

<120> 一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 嗜热杜邦菌（Thermomyces dupontii）

<400> 1

atgaaaactc tcgcggcaat tgctgctctc ctgtcgccca cgctggtccg ggcagcgacc 60

ccggctgagt ggaaagctca gtcgatctat ttcatgctga cggaccggtt tgcgcggacc 120

gataattcga ccacggctcc ctgtgacacc accgccgcga aatattgcgg gggaacctgg 180

cagggtatca tcaataacct ggattacatc caggacatgg gcttcacagc catctggatt 240

actccggtga cagcccagtg ggacgacgac gtggatgctg cagatgccac gtcgtatcac 300

ggctactggc agaaggacct atacgctctg aattcgaaat atggtactgc cgacgacctg 360

aaggctctgg ctgatgccct tcacgcccgt gggatgcttc tcatggtcga cgtcgtggct 420

aatcattttg gctacggcgg ttctcacagc gaggtggatt actccatctt caatcctttc 480

aacagcgagg aatacttcca cccgttctgc ctcatcgagg actacagcaa ccagcgacaa 540

gtcgaagaat gctggctggc tgatgttccg gcgacactgc ctgacgtgga cacgaccaag 600

cccgaggtca ggcaactctt caacgactgg atcaagagtc tggtggcgaa ctactccatc 660

gatggactgc gcgtcgatac cgtcaagcat gtggagaaag atttctggcc aggcttcaac 720

gaagctgccg gcgtgtatgc tgtcggcgag gtgtttgacg gcaacccggc atacacctgc 780

ccgtaccagg aagtgctgga tggtgttttg aactatccga tctactatct tgcgcttgat 840

gcgttcaagt ctgtcggcgg caacctcggc ggcttggccc aggccatcag caccgtgcaa 900

gagagctgca aggattccaa cctgctcggc aatttcctcg agaatcacga cattcctcgc 960

tttgcctcgt tcacggatga ccttgctctc gcgaagaatg gcctcgcttt tatcatgctc 1020

tcggacggca ttccgatcat ctacgcgggc caggagcagc actacgccgg tgaccatgat 1080

ccgacgaatc gtgaggcagt ttggctctct ggctacaaca ccgaggcgga gctgtaccaa 1140

ttcatcaaga aggccaatgg catccgcaac ttggctatca gccaagatga ggaatacacc 1200

tccttcaaga cccaggtgat ctaccaggac gattcgaccc ttgccatccg taagggtggc 1260

atcgtcaccg ttctgagcaa cgaaggctcc tccggcggag accgcaccgt gtccgtcacg 1320

gggaccgggt tcgaggcagg cacggaattg acagatgtca tctcctgcaa gaccgtgact 1380

gcgggggaca acggaagtgt cgaggtgccc ttgtctggtg gattgccaag cgtgctctat 1440

ccgagctccc agttggccga gagcggtctg tgtgcgtccg cgtag 1485

<210> 2

<211> 494

<212> PRT

<213> 嗜热杜邦菌（Thermomyces dupontii）

<400> 2

Met Lys Thr Leu Ala Ala Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Thr Leu Val

1 5 10 15

Arg Ala Ala Thr Pro Ala Glu Trp Lys Ala Gln Ser Ile Tyr Phe Met

20 25 30

Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Pro Cys

35 40 45

Asp Thr Thr Ala Ala Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile Ile

50 55 60

Asn Asn Leu Asp Tyr Ile Gln Asp Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile

65 70 75 80

Thr Pro Val Thr Ala Gln Trp Asp Asp Asp Val Asp Ala Ala Asp Ala

85 90 95

Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Gln Lys Asp Leu Tyr Ala Leu Asn Ser

100 105 110

Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ala Asp Ala Leu His

115 120 125

Ala Arg Gly Met Leu Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Phe Gly

130 135 140

Tyr Gly Gly Ser His Ser Glu Val Asp Tyr Ser Ile Phe Asn Pro Phe

145 150 155 160

Asn Ser Glu Glu Tyr Phe His Pro Phe Cys Leu Ile Glu Asp Tyr Ser

165 170 175

Asn Gln Arg Gln Val Glu Glu Cys Trp Leu Ala Asp Val Pro Ala Thr

180 185 190

Leu Pro Asp Val Asp Thr Thr Lys Pro Glu Val Arg Gln Leu Phe Asn

195 200 205

Asp Trp Ile Lys Ser Leu Val Ala Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg

210 215 220

Val Asp Thr Val Lys His Val Glu Lys Asp Phe Trp Pro Gly Phe Asn

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Val Tyr Ala Val Gly Glu Val Phe Asp Gly Asn Pro

245 250 255

Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Glu Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr

260 265 270

Pro Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu Asp Ala Phe Lys Ser Val Gly Gly Asn

275 280 285

Leu Gly Gly Leu Ala Gln Ala Ile Ser Thr Val Gln Glu Ser Cys Lys

290 295 300

Asp Ser Asn Leu Leu Gly Asn Phe Leu Glu Asn His Asp Ile Pro Arg

305 310 315 320

Phe Ala Ser Phe Thr Asp Asp Leu Ala Leu Ala Lys Asn Gly Leu Ala

325 330 335

Phe Ile Met Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu

340 345 350

Gln His Tyr Ala Gly Asp His Asp Pro Thr Asn Arg Glu Ala Val Trp

355 360 365

Leu Ser Gly Tyr Asn Thr Glu Ala Glu Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Lys

370 375 380

Ala Asn Gly Ile Arg Asn Leu Ala Ile Ser Gln Asp Glu Glu Tyr Thr

385 390 395 400

Ser Phe Lys Thr Gln Val Ile Tyr Gln Asp Asp Ser Thr Leu Ala Ile

405 410 415

Arg Lys Gly Gly Ile Val Thr Val Leu Ser Asn Glu Gly Ser Ser Gly

420 425 430

Gly Asp Arg Thr Val Ser Val Thr Gly Thr Gly Phe Glu Ala Gly Thr

435 440 445

Glu Leu Thr Asp Val Ile Ser Cys Lys Thr Val Thr Ala Gly Asp Asn

450 455 460

Gly Ser Val Glu Val Pro Leu Ser Gly Gly Leu Pro Ser Val Leu Tyr

465 470 475 480

Pro Ser Ser Gln Leu Ala Glu Ser Gly Leu Cys Ala Ser Ala

485 490

Claims

1.一种蛋白质，来源于嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)L18，是以下1)或2)的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基酸第19至494位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述蛋白质的编码基因，其特征在于：为以下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第55至1485位所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌，其特征在于：

所述重组载体为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-TdAmyA；

所述重组菌是通过将所述重组载体导入酵母得到的重组毕赤酵母；所述酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

4.如权利要求1所述蛋白质的生产方法，其特征在于：所述方法是将权利要求3所述重组菌进行发酵培养，得到所述的蛋白质；

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将所述重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃、pH为5.0、溶氧大于20％、200rpm条件下振荡过夜培养至OD600为2-6，得到种子液；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％；

步骤3)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油加进培养基的速度为30mL/h/1L起始发酵液；

步骤4)中，所述甲醇的流加速度为6mL/h/1L起始发酵液。

5.如权利要求1所述的蛋白质在麦芽糖浆生产中的应用。