JPS61141890A - アルコ−ルの製造法 - Google Patents
アルコ−ルの製造法Info
- Publication number
- JPS61141890A JPS61141890A JP59264965A JP26496584A JPS61141890A JP S61141890 A JPS61141890 A JP S61141890A JP 59264965 A JP59264965 A JP 59264965A JP 26496584 A JP26496584 A JP 26496584A JP S61141890 A JPS61141890 A JP S61141890A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucoamylase
- yeast
- rhizopus
- gene
- starch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/939—Rhizopus
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組み換えＤＮＡ技術によって育種されたリゾプ
ｘ、オリザｘ （Ｒｈ１ｚｏｐｕａ ｏｒｉｚａｅ ）
のグルコアミラーゼを生産する酵母を用いたグルコアミ
ラーゼ及びエチルアルコールの製造法に関する。
ｘ、オリザｘ （Ｒｈ１ｚｏｐｕａ ｏｒｉｚａｅ ）
のグルコアミラーゼを生産する酵母を用いたグルコアミ
ラーゼ及びエチルアルコールの製造法に関する。
（従来技術）
グルコアミラーゼはデンプンを非還元末端よシ分解しグ
ルコースを生成する酵素で、デンプンよ）エチルアルコ
ールを生産する工程で、デンプンを糖化する際に広く用
いられている。なかでも糸状菌リゾプス属が生産するグ
ルコアミラーゼは生産量及び酵素活性が高く、シかも特
に一般のグルコアミラーゼと違って、生デンプンにも作
用すること及び至適ｐＨ等種々の酵素化学的性質から醸
造用に最も適したものである。このため、リゾプス属の
グルコアミラーゼは、醸造用のデンプンを、無蒸煮法ま
たは低温蒸煮法（特願昭５５−１７８５２３号および特
願昭４９−１３６８１３号参照）で糖化するために使用
されている。
ルコースを生成する酵素で、デンプンよ）エチルアルコ
ールを生産する工程で、デンプンを糖化する際に広く用
いられている。なかでも糸状菌リゾプス属が生産するグ
ルコアミラーゼは生産量及び酵素活性が高く、シかも特
に一般のグルコアミラーゼと違って、生デンプンにも作
用すること及び至適ｐＨ等種々の酵素化学的性質から醸
造用に最も適したものである。このため、リゾプス属の
グルコアミラーゼは、醸造用のデンプンを、無蒸煮法ま
たは低温蒸煮法（特願昭５５−１７８５２３号および特
願昭４９−１３６８１３号参照）で糖化するために使用
されている。
しかしながら、リゾプス属のグルコアミラーゼを生産す
るためにはふすま等を主成分とした固体培養法を用いる
ことが多く、タンク培養が可能な液体培養法に比較して
酵素の生産コストが上昇する。従ってグルコアミラーゼ
を利用したアルコール生産においても生産コストの上昇
につながるという問題がある。
るためにはふすま等を主成分とした固体培養法を用いる
ことが多く、タンク培養が可能な液体培養法に比較して
酵素の生産コストが上昇する。従ってグルコアミラーゼ
を利用したアルコール生産においても生産コストの上昇
につながるという問題がある。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、上記問題を解決するため、リゾプスのグ
ルコアミラーゼ遺伝子を発現可能な形で酵母に導入し、
この酵母を直接低温蒸煮でん粉または生でん粉に作用さ
せれば、デンプンからエチルアルコールを生産する工程
で、デンプンの糖化に必要なリゾプスのグルコアミラー
ゼの添加量を減少させるかあるいは全く添加することな
くエチルアルコールの生産コストを減少させることがで
きるのではないかとの着想の下に種々の研究を行い本発
明を完成した。
ルコアミラーゼ遺伝子を発現可能な形で酵母に導入し、
この酵母を直接低温蒸煮でん粉または生でん粉に作用さ
せれば、デンプンからエチルアルコールを生産する工程
で、デンプンの糖化に必要なリゾプスのグルコアミラー
ゼの添加量を減少させるかあるいは全く添加することな
くエチルアルコールの生産コストを減少させることがで
きるのではないかとの着想の下に種々の研究を行い本発
明を完成した。
（発明の構成）
本発明はリゾプス属に属する糸状菌由来のグルコアミラ
ーゼ遺伝子を組込んだ発現可能な組換ベクターによって
形質転換された酵母を用いて、澱粉質原料を糖化・発酵
せしめることを特徴とするアルコールの製造法である。
ーゼ遺伝子を組込んだ発現可能な組換ベクターによって
形質転換された酵母を用いて、澱粉質原料を糖化・発酵
せしめることを特徴とするアルコールの製造法である。
本発明で使用する澱粉質原料には、穀類、キャラサバ、
カンショ、ジャガイモ等の地下澱粉差びに精製澱粉が含
まれる。
カンショ、ジャガイモ等の地下澱粉差びに精製澱粉が含
まれる。
本発明の方法によシ微生物にリゾプスグルコアミラーゼ
を生産させるには、グルコアミラーゼ生産性のリゾプス
属糸状菌、好ましくはリゾプス・オリザエのグルコアミ
ラーゼ遺伝子を適当な手段で調製し、この遺伝子を宿主
の形質発現系で認識されるプロモーター領域やテール領
域等の情報発現機構を含むＤＮＡ断片とともに、宿主内
で複製可能なプラスミドベクターに挿入し、このベクタ
ーで宿主を形質転換してやればよい。宿主が酵母でちる
ときは、形質転換酵母により、リゾプスグルコアミラー
ゼが生産され菌体外へ放出されるから、でんぷん（無蒸
煮であってもよい）はこの酵素で糖化され、これを酵母
がアルコールへ変化させるため、高価な糖化酵素剤を添
加することなくアルコールが生産される。このように、
でん粉を予め糖化することなく、酵母を作用させてアル
コールを生産しうるとは従来全く考えられていなかった
ことである。
を生産させるには、グルコアミラーゼ生産性のリゾプス
属糸状菌、好ましくはリゾプス・オリザエのグルコアミ
ラーゼ遺伝子を適当な手段で調製し、この遺伝子を宿主
の形質発現系で認識されるプロモーター領域やテール領
域等の情報発現機構を含むＤＮＡ断片とともに、宿主内
で複製可能なプラスミドベクターに挿入し、このベクタ
ーで宿主を形質転換してやればよい。宿主が酵母でちる
ときは、形質転換酵母により、リゾプスグルコアミラー
ゼが生産され菌体外へ放出されるから、でんぷん（無蒸
煮であってもよい）はこの酵素で糖化され、これを酵母
がアルコールへ変化させるため、高価な糖化酵素剤を添
加することなくアルコールが生産される。このように、
でん粉を予め糖化することなく、酵母を作用させてアル
コールを生産しうるとは従来全く考えられていなかった
ことである。
アルコールの製造における原料の蒸煮すなわち糊化工程
には、高温蒸煮法（蒸煮温度１２０Ｃ以上）、低温蒸煮
法（蒸煮温度６０Ｃ〜８５Ｃ）および無蒸煮法（蒸煮し
ない）などが知られているが１本発明の微生物によるア
ルコール製造方法は、いずれを採用してもよい。
には、高温蒸煮法（蒸煮温度１２０Ｃ以上）、低温蒸煮
法（蒸煮温度６０Ｃ〜８５Ｃ）および無蒸煮法（蒸煮し
ない）などが知られているが１本発明の微生物によるア
ルコール製造方法は、いずれを採用してもよい。
なお、宿主として酵母を用いればアルコールとりゾプス
グルコアミラーゼが同時に生産されるが、後者のみを目
的とするときは、宿主として枯草菌を用いることも可能
である。
グルコアミラーゼが同時に生産されるが、後者のみを目
的とするときは、宿主として枯草菌を用いることも可能
である。
本発明によれば、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ
の調製法も提供され、かつその塩基配列も明らかにされ
た。
の調製法も提供され、かつその塩基配列も明らかにされ
た。
即ち、本発明の方法で上記グルコアミラーゼの生産を可
能ならしめるために使用するＤＮＡ断片の塩基配列は１
例えばリゾプス・オリザエの染色体ＤＮＡよシクロー二
ングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列と、
リゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよシ調製したグルコア
ミラーゼｃ−ＤＮＡの塩基配列を適宜組合せて調製でき
る。なお酵母内で、当該グルコアミラーゼを発現せしむ
るために、遺伝子組換によシ、プロモーター領域および
／またはテール領域（３′末非翻訳部分）として形質転
換微生物に適したものを使用することが好ましい（特開
昭５８−１４６２８１号参照）。例えば酵母内で発現さ
せるために、特願昭５７−１８４２９１号および特願ｔ
９５７−１８４２９３号に記載された、グリセルアルデ
ヒ）＃−３−７オス７エイトデハイビロゲナーゼ遺伝子
（ＧＡＰ−ＤＨ）のプロモーター領域（ＰＧＡＰ）、テ
ール領域（ＴＧＡＰ）、抑制性酸性フォスファターゼ遺
伝子（ＰＨ０５）のプロモーター領域（Ｐｐｈｏ５）お
よび３−７オスフオグリセロキナーゼ（ＰＧＭ）のプロ
モーター領域（ＰＰＧＫ）を後記実施例に示す如く使用
できる。本発明においてはまた、前記ＤＮＡ塩基配列及
びＤＮＡ断片を持つ複製可能な種々のプラスミドベクタ
ーの構築方法も提供される。
能ならしめるために使用するＤＮＡ断片の塩基配列は１
例えばリゾプス・オリザエの染色体ＤＮＡよシクロー二
ングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列と、
リゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよシ調製したグルコア
ミラーゼｃ−ＤＮＡの塩基配列を適宜組合せて調製でき
る。なお酵母内で、当該グルコアミラーゼを発現せしむ
るために、遺伝子組換によシ、プロモーター領域および
／またはテール領域（３′末非翻訳部分）として形質転
換微生物に適したものを使用することが好ましい（特開
昭５８−１４６２８１号参照）。例えば酵母内で発現さ
せるために、特願昭５７−１８４２９１号および特願ｔ
９５７−１８４２９３号に記載された、グリセルアルデ
ヒ）＃−３−７オス７エイトデハイビロゲナーゼ遺伝子
（ＧＡＰ−ＤＨ）のプロモーター領域（ＰＧＡＰ）、テ
ール領域（ＴＧＡＰ）、抑制性酸性フォスファターゼ遺
伝子（ＰＨ０５）のプロモーター領域（Ｐｐｈｏ５）お
よび３−７オスフオグリセロキナーゼ（ＰＧＭ）のプロ
モーター領域（ＰＰＧＫ）を後記実施例に示す如く使用
できる。本発明においてはまた、前記ＤＮＡ塩基配列及
びＤＮＡ断片を持つ複製可能な種々のプラスミドベクタ
ーの構築方法も提供される。
糸状菌は、リゾプス属に属するものでグルコアミラーゼ
を生産するものであれば、いずれの種でもよく、リゾプ
ス・オリザエ（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ）、
リゾプス・７オルモサエンシス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓｆｏ
ｒＩｌｌｌｌｏｓａｅｎｓｉｓ）、リゾプス者ヤバニカ
ス（Ｒｈｌｚｏ戸ｊａｖａｎｉｃｕｓ ）、リゾプスｅ
サイランデンシス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｔｈａｉｌａｎ
ｄｅｎｓｉｓ）などがめげられる。
を生産するものであれば、いずれの種でもよく、リゾプ
ス・オリザエ（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ）、
リゾプス・７オルモサエンシス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓｆｏ
ｒＩｌｌｌｌｏｓａｅｎｓｉｓ）、リゾプス者ヤバニカ
ス（Ｒｈｌｚｏ戸ｊａｖａｎｉｃｕｓ ）、リゾプスｅ
サイランデンシス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｔｈａｉｌａｎ
ｄｅｎｓｉｓ）などがめげられる。
特にリゾプス・オリザエに属するＳＡＭＯＯ３４（微工
研菌寄第７９６０号（ＦＦＲＭＰ−７９６０））は、生
澱粉分解に適したグルコアミラーゼを産生ずることが本
発明者らＫよって確認されている。
研菌寄第７９６０号（ＦＦＲＭＰ−７９６０））は、生
澱粉分解に適したグルコアミラーゼを産生ずることが本
発明者らＫよって確認されている。
なお、ＳＡＷ ００３４の細菌学的性質は次のとおりで
ある。
ある。
培養所見（バレイショ・ブトつ糖寒天培地、２８Ｃ９培
養） 培養１８目でコロニーは直径５−５．５ ｍ、コロニー
は白色、コロニーの裏面も白色、培養２日月でコロニー
はプレート（直径９ｃｍ）の全面にひろがる。コロニー
は成熟とともに灰色になる。
養） 培養１８目でコロニーは直径５−５．５ ｍ、コロニー
は白色、コロニーの裏面も白色、培養２日月でコロニー
はプレート（直径９ｃｍ）の全面にひろがる。コロニー
は成熟とともに灰色になる。
匍匍枝は無色又は黄かつ色、成板はかつ色、胞子のう柄
は一般に成板から生じるが、匍匍枝から直接生じること
もある。胞子のう柄は早生または群生、胞子のう枝が二
叉に分岐することもある。
は一般に成板から生じるが、匍匍枝から直接生じること
もある。胞子のう柄は早生または群生、胞子のう枝が二
叉に分岐することもある。
長さ２２０−１２００ｐｍ、胞子のりは球形ないし亜球
形、暗かつ色、直径６０−１５０μｍ、柱軸は球形ない
し亜球形。胞子のり胞子は球形、亜球形又は多角形、表
面に筋がある。５−１ｓＸ３−７μｍ、厚膜胞子は亜球
形又は円筒形、６−１３Ｘ４−９μｍ、接合胞子は観察
できなかった。３７Ｃで生育可能。
形、暗かつ色、直径６０−１５０μｍ、柱軸は球形ない
し亜球形。胞子のり胞子は球形、亜球形又は多角形、表
面に筋がある。５−１ｓＸ３−７μｍ、厚膜胞子は亜球
形又は円筒形、６−１３Ｘ４−９μｍ、接合胞子は観察
できなかった。３７Ｃで生育可能。
以上、胞子のう胞子が柱軸を持つ暗かつ色の胞子のう中
に形成され、更に胞子のう柄がかつ色であり、また成板
を持つことから、本発明の菌株（ＳＡＭ−００３４）は
Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ＰＡＫ属する真菌であると考えられ
る。そこでＩｎｕｉ、 Ｔ、 、 Ｙ、 Ｔａｋｅｄａ
＆ ）Ｌエエｚｕｋａ、 １９６ ｊ、 ’ｒａＸＯ
ｎｏｍｉｃａｘ ５ｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｇｅｎｕｓＲ
ｈｉｚｏｐｕｓ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｅｒ
ａｌ ａｎｄ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ、 ｖｏｌ、 １１ 、 Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、
１２１ ｐｐ。
に形成され、更に胞子のう柄がかつ色であり、また成板
を持つことから、本発明の菌株（ＳＡＭ−００３４）は
Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ＰＡＫ属する真菌であると考えられ
る。そこでＩｎｕｉ、 Ｔ、 、 Ｙ、 Ｔａｋｅｄａ
＆ ）Ｌエエｚｕｋａ、 １９６ ｊ、 ’ｒａＸＯ
ｎｏｍｉｃａｘ ５ｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｇｅｎｕｓＲ
ｈｉｚｏｐｕｓ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｎｅｒ
ａｌ ａｎｄ ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ、 ｖｏｌ、 １１ 、 Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、
１２１ ｐｐ。
Ｚｙｃｈａ、 Ｈ，、Ｒ，Ｓｉｅｐｍａｎｎ ａｎｄ
Ｇ、 Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ。
Ｇ、 Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ。
１９６９゜Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ、 Ｅｉｎｅ Ｂｅｓｃ
ｈｒｅｉｂｕｎｇ ａｌｌｅｒＧａｔｔｕｎｇｅｎ ｕ
ｎｄ Ａｒｔｅｎ ｄｉｅｓｅｒ Ｐｉｌｚｇｒｕｐｐ
ｅ。
ｈｒｅｉｂｕｎｇ ａｌｌｅｒＧａｔｔｕｎｇｅｎ ｕ
ｎｄ Ａｒｔｅｎ ｄｉｅｓｅｒ Ｐｉｌｚｇｒｕｐｐ
ｅ。
３３５ ｐｐ、 Ｖｅｒｌａｇ ｖｏｎ Ｊ、 Ｃｒ
ａｍｅｒ、 Ｌｅｈｒｅ。
ａｍｅｒ、 Ｌｅｈｒｅ。
Ｄｏｍｓｃｈ、 Ｋ、 Ｈ，、Ｗ、 Ｇａｍ５ ａｎｄ
Ｔ、 −Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ。
Ｔ、 −Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ。
１９８０ 、 Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ５ｏｉｌ
Ｆｕｎｇｉ、 Ｔｏｌ、 １゜８５９ｐｐ、 Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏｎ、 に準
拠して既知のＲｈ１ｚｏｐｕｓ属の種類と菌学的性質を
比較すると、本菌株は、３７ｒで生育可能であり、胞子
のう胞子の表ｆに筋があり、胞子のり柄が長さ２２０−
１２００μ扉、胞子のうが直径６０−１５０μｍ、胞子
のう胞子が５−１５ｘ３−７μｍであることから、本菌
株をＲｈ１ｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅと同定した。
Ｆｕｎｇｉ、 Ｔｏｌ、 １゜８５９ｐｐ、 Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏｎ、 に準
拠して既知のＲｈ１ｚｏｐｕｓ属の種類と菌学的性質を
比較すると、本菌株は、３７ｒで生育可能であり、胞子
のう胞子の表ｆに筋があり、胞子のり柄が長さ２２０−
１２００μ扉、胞子のうが直径６０−１５０μｍ、胞子
のう胞子が５−１５ｘ３−７μｍであることから、本菌
株をＲｈ１ｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅと同定した。
グルコアミラーゼ遺伝子の単離
グルコアミラーゼ遺伝子の単離は、リゾプス属のｍ−Ｒ
ＮＡよシ調表したｃ−ＤＮＡとして得るか、またはリゾ
プス属の染色体ＤＮＡから例えばクリエールらの方法（
Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｏｌ、 １２ 、 ｐ３９−
４４（１９７５） ］によって得ることができる。
ＮＡよシ調表したｃ−ＤＮＡとして得るか、またはリゾ
プス属の染色体ＤＮＡから例えばクリエールらの方法（
Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｏｌ、 １２ 、 ｐ３９−
４４（１９７５） ］によって得ることができる。
後者の方法は、通常イントロンの配列を含有しており、
そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場合は発現できな
い。これら非真核生物中で発現できる遺伝子を得るＫは
、ｍ−ＲＮＡからのＣ−ＤＩｆＡの一部と、染色体から
の遺伝子のイントロンを含まない配列部分のＤＮＡをハ
イブリッドさせる方法によっても得ることができる。両
者をハイブリッドさせる際に、一方又は両方のＤＮＡ部
分に適当な制限酵素切断部位が存在しない場合は、イン
ビトロミュータジエネシスの手法を用いることにより適
当な制限酵素部位を作成しハイブリッドさせることが可
能である。
そのまま、大腸菌や酵母を宿主とする場合は発現できな
い。これら非真核生物中で発現できる遺伝子を得るＫは
、ｍ−ＲＮＡからのＣ−ＤＩｆＡの一部と、染色体から
の遺伝子のイントロンを含まない配列部分のＤＮＡをハ
イブリッドさせる方法によっても得ることができる。両
者をハイブリッドさせる際に、一方又は両方のＤＮＡ部
分に適当な制限酵素切断部位が存在しない場合は、イン
ビトロミュータジエネシスの手法を用いることにより適
当な制限酵素部位を作成しハイブリッドさせることが可
能である。
かくして得られるグルコアミラーゼ遺伝子は、第１図の
〔〕内のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはこれと
同等の酵素活性を有するアミノ酸に対応する塩基配列で
ある。
〔〕内のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはこれと
同等の酵素活性を有するアミノ酸に対応する塩基配列で
ある。
すなわちリゾプス属由来のグルコアミラーゼ構造遺伝子
は、第１図のＮ末端から２６−６０４番目のアミノ酸配
列をコードするＭＡであり、または、同図に付した塩基
配列の番号１９０−１９６２に相当する。アミノ酸配列
のＮ末端から１−２５番に相当する部分は、シグナルイ
プチドに対する領域と考えられ、宿主の細胞外への分泌
に関与するものと考えられる。
は、第１図のＮ末端から２６−６０４番目のアミノ酸配
列をコードするＭＡであり、または、同図に付した塩基
配列の番号１９０−１９６２に相当する。アミノ酸配列
のＮ末端から１−２５番に相当する部分は、シグナルイ
プチドに対する領域と考えられ、宿主の細胞外への分泌
に関与するものと考えられる。
上述のグルコアミラーゼ遺伝子を単離する好適な方法の
例を以下述べる。グルコアミラーゼ生産菌であるリゾプ
ス属に属する糸状菌から全ＤＮＡを単離する。
例を以下述べる。グルコアミラーゼ生産菌であるリゾプ
ス属に属する糸状菌から全ＤＮＡを単離する。
単離の方法は、クリエールの方法（先述）を改変した方
法による。まず、リゾプスを胞子形成させ、その胞子を
集める。これを破砕し、その後クリエールの方法に従っ
て処理し、最後にゲル濾過を行なう。ついでこのＤＮＡ
を制限酵素Ｈ４ｎａ ｍを用いて消化し、公知のベクタ
ーｐＢＲ３２２のＢｉｎｄ■サイトにクローニングし、
リゾプスの遺伝子２イブラリ−を大腸菌に作成する。ラ
イブラリーとして取得するにはアンピシリン耐性または
テトラサイクリン耐性の形質転換体を得れば良い。
法による。まず、リゾプスを胞子形成させ、その胞子を
集める。これを破砕し、その後クリエールの方法に従っ
て処理し、最後にゲル濾過を行なう。ついでこのＤＮＡ
を制限酵素Ｈ４ｎａ ｍを用いて消化し、公知のベクタ
ーｐＢＲ３２２のＢｉｎｄ■サイトにクローニングし、
リゾプスの遺伝子２イブラリ−を大腸菌に作成する。ラ
イブラリーとして取得するにはアンピシリン耐性または
テトラサイクリン耐性の形質転換体を得れば良い。
次いで、実施例で述べる様なグルコアミラーゼＤＮＡ検
出用のプローブ（ＤＮＡオリゴマー）を作成し、コロニ
ーハイプリダゼーションを行ない、このプローブとハイ
プリダイスするコロニーを増殖させ、プラスミドＤＬＡ
を抽出する。
出用のプローブ（ＤＮＡオリゴマー）を作成し、コロニ
ーハイプリダゼーションを行ない、このプローブとハイ
プリダイスするコロニーを増殖させ、プラスミドＤＬＡ
を抽出する。
以下に本発明を実Ｍ’Ｎによって詳細に説明する。
実施例
（ａ）ｌ）ＤＮＡの調製とクローニンググルコアミラー
ゼ生産菌リゾプス・オリザエから全ＤＮＡを単離した。
ゼ生産菌リゾプス・オリザエから全ＤＮＡを単離した。
ＤＮＡの単離は、騨母で用いられているクリエールらの
方法（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａＩ。
方法（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａＩ。
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ’
Ｖｏｌ １２ 、 ３９−４４ 。
Ｖｏｌ １２ 、 ３９−４４ 。
（１９７５））を改変して行なった。薄く切ったじゃが
芋をオートクレーブで滅菌後、その上にリゾプス・オリ
ザエの菌体を増殖させ胞子を形成させた。それらの胞子
を集め、０．１５ Ｍ ＮａＣ１０，０５Ｍ ＥＤＴＡ
溶液に懸濁し、ガラス球を用いた細胞破砕装置ダイノミ
ルを用いて１５秒間処理によシ菌体を破砕した。その後
の操作は、クリエールらの方法に従ったが、最後にバイ
第２ビ社のバイオゲルＡ３ｍゲルを用いてゲル濾過を行
ない全ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄｍを用いて消化し、ｐＢＲ３２２のＨｌｎｄ ｍサイ
トにクロー二／グし、リゾプスの遺伝子ライプ２リーを
大腸菌ＷＡ８０２株に作製した。大腸菌の形質転換は常
法を用いた。ライブラリーとしてアンピシリン耐性形質
転換体を取得した。
芋をオートクレーブで滅菌後、その上にリゾプス・オリ
ザエの菌体を増殖させ胞子を形成させた。それらの胞子
を集め、０．１５ Ｍ ＮａＣ１０，０５Ｍ ＥＤＴＡ
溶液に懸濁し、ガラス球を用いた細胞破砕装置ダイノミ
ルを用いて１５秒間処理によシ菌体を破砕した。その後
の操作は、クリエールらの方法に従ったが、最後にバイ
第２ビ社のバイオゲルＡ３ｍゲルを用いてゲル濾過を行
ない全ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄｍを用いて消化し、ｐＢＲ３２２のＨｌｎｄ ｍサイ
トにクロー二／グし、リゾプスの遺伝子ライプ２リーを
大腸菌ＷＡ８０２株に作製した。大腸菌の形質転換は常
法を用いた。ライブラリーとしてアンピシリン耐性形質
転換体を取得した。
Ｉ）形質転換体の選択及びグルコアミラーゼ遺伝子の特
性決定 形質転換体の選択は、ニトロセルロー７７紙を用いた通
常；ロニーハイプリダイゼーショント呼ばれる方法で行
なった。はじめにグルコアミラーゼＤＮＡ検出用のプロ
ーブを作製する為、精製したリゾプスのグルコアミラー
ゼを各種プロテアーゼで分解し、生成したイプチト９を
分離精製した。
性決定 形質転換体の選択は、ニトロセルロー７７紙を用いた通
常；ロニーハイプリダイゼーショント呼ばれる方法で行
なった。はじめにグルコアミラーゼＤＮＡ検出用のプロ
ーブを作製する為、精製したリゾプスのグルコアミラー
ゼを各種プロテアーゼで分解し、生成したイプチト９を
分離精製した。
それらのイプチト＃についてアミノ酸分析と一次構造決
定を常法に従って行なった。その結果、部分構造として
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｈｌｓ−Ａ
Ｊａ−８ｅｒからなるアミノ酸配列を得た。同時にこの
グルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配列は、ＡＪａ−
８ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであシ、さらにＣ末端はＡｌａ
−Ａｌａでちる事も見い出した。次いで目的のプローブ
作成のため、前述のアミノ酸配列の一部に対応するＴｈ
ｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａの部分について、
そのアミノ酸に対応するコドンから、５’−ＡＣＮＴＧ
ＧＴＣＮＣＡＱＧＣ−３’の１４個の塩基からなる３２
種の合成りＮＡオリゴマーをトリエステル固相法によシ
合成した。ここでＮは任意の塩基、ａはピリミジンのＴ
あるいはＣを示す。
定を常法に従って行なった。その結果、部分構造として
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｈｌｓ−Ａ
Ｊａ−８ｅｒからなるアミノ酸配列を得た。同時にこの
グルコアミラーゼのＮ末端のアミノ酸配列は、ＡＪａ−
８ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであシ、さらにＣ末端はＡｌａ
−Ａｌａでちる事も見い出した。次いで目的のプローブ
作成のため、前述のアミノ酸配列の一部に対応するＴｈ
ｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａの部分について、
そのアミノ酸に対応するコドンから、５’−ＡＣＮＴＧ
ＧＴＣＮＣＡＱＧＣ−３’の１４個の塩基からなる３２
種の合成りＮＡオリゴマーをトリエステル固相法によシ
合成した。ここでＮは任意の塩基、ａはピリミジンのＴ
あるいはＣを示す。
これらのＤＮＡオリゴマーを（ｒ−３２Ｐ）ＡＴＰとで
４−ポリヌクレオテジルキナーゼを用いて標識し、グル
コアミラーゼ遺伝子の検出用プローブとじて用いた。コ
ロニーハイブリダイゼーションの方法によって、これら
のプローブとノ・イブリダイズする大腸菌の形質転換体
コロニーを増殖させ、この増殖物からプラスミドＤＮＡ
を抽出した。抽出物を各種制限酵素で処理したのちアガ
ロース電気泳動を行ない、ＤＮＡフラグメントの解析を
行なった。その結果、前記プローブとハイブリダイズす
るコロニにおいて、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片
は、４．３ｋｌ）からなシ、ＢａｍＨＩ 、 Ｋｐｎ
Ｉ 。
４−ポリヌクレオテジルキナーゼを用いて標識し、グル
コアミラーゼ遺伝子の検出用プローブとじて用いた。コ
ロニーハイブリダイゼーションの方法によって、これら
のプローブとノ・イブリダイズする大腸菌の形質転換体
コロニーを増殖させ、この増殖物からプラスミドＤＮＡ
を抽出した。抽出物を各種制限酵素で処理したのちアガ
ロース電気泳動を行ない、ＤＮＡフラグメントの解析を
行なった。その結果、前記プローブとハイブリダイズす
るコロニにおいて、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片
は、４．３ｋｌ）からなシ、ＢａｍＨＩ 、 Ｋｐｎ
Ｉ 。
ＭｌｕＩおよび５ａｃＩで一ケ所切断され、さらにＤｒ
ａＩで２ケ所、ＢｇｌＴｌで３ケ所切断されるが、Ａｃ
ｃｌ、Ｂａ１ｌ、Ｃ１ａｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｐａｌ、Ｐ
ｓｔｒ。
ａＩで２ケ所、ＢｇｌＴｌで３ケ所切断されるが、Ａｃ
ｃｌ、Ｂａ１ｌ、Ｃ１ａｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｐａｌ、Ｐ
ｓｔｒ。
ＰｖｕＩＩ、５ｃａＩおよびＸｈｏｔ では切断されな
いことが判明した。この断片を持つプラスミドをｐＲＧ
Ａ３９ と命名した。
いことが判明した。この断片を持つプラスミドをｐＲＧ
Ａ３９ と命名した。
（ｂ）＋）ＲＮＡのｖ＠製とｃＤＮＡ（７）りｏ ＝
ン／リゾプス・オリザエの気中菌糸から全ＲＮＡを単離
した。これには、グアニジウムチオシアネートの使用を
含む公知の平頭を用いた。オリゴ−ｄＴセルロースクロ
マトグラフィを用い全ＲＮＡからポリアデニル化ＲＮＡ
をｍ−ＲＮＡ分画として分取した。このｍ−ＲＮＡを用
い岡山−バーブ法（Ｏｋａｙａｍａ。
ン／リゾプス・オリザエの気中菌糸から全ＲＮＡを単離
した。これには、グアニジウムチオシアネートの使用を
含む公知の平頭を用いた。オリゴ−ｄＴセルロースクロ
マトグラフィを用い全ＲＮＡからポリアデニル化ＲＮＡ
をｍ−ＲＮＡ分画として分取した。このｍ−ＲＮＡを用
い岡山−バーブ法（Ｏｋａｙａｍａ。
Ｈ，＆ Ｂｅｒｇ、Ｐ、 、 Ｍｏ４ Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、 ２．１６１（１９８２））によシｃＤＮＡの
遺伝子ライブラリーを大腸菌ＷＡ８０２中に作製した。
ｏｌ、 ２．１６１（１９８２））によシｃＤＮＡの
遺伝子ライブラリーを大腸菌ＷＡ８０２中に作製した。
ｌ）形質転換体の選択及びグルコアミラーゼｃＤＮＡの
特性決定 目的酵素のｃＤＮＡを有する形質転換体の選択は、前述
のコロニーハイブリダイゼーションの方法で行なった。
特性決定 目的酵素のｃＤＮＡを有する形質転換体の選択は、前述
のコロニーハイブリダイゼーションの方法で行なった。
グルコアミラーゼｃＤＮＡ検出用のプローブとして前記
（ａ）０で得たグルコアミラーゼ遺伝子の２．Ｏｋｂ
ＤｒａＩ断片を用いた。この断片を〔α−３２ｐ）ａｃ
’ｒ、ｐ、ＤＮＡポリメーラーゼＩ及びＤＮＡアーゼＩ
を使用するニックトランスレーション法によって標識し
、グルフアミラーゼｃＤＮＡ検出用のプローブとして用
いた。このブローブトハイブリダイズする形質転換体コ
ロニーを増殖させ、プラスミ）”ＤＮＡを抽出した。各
種制限酵素で処理したのち、アガロース電気泳動を行な
いＤＮＡ７９グメントの解析を行なった。プローブとハ
イブリダイズするコロニーのプラスミドが挿入されたＤ
ＮＡ断片は、１．７ｋｂの大きさであった。このプラス
ミｒをｐＣＧＡ２３９と命名した。
（ａ）０で得たグルコアミラーゼ遺伝子の２．Ｏｋｂ
ＤｒａＩ断片を用いた。この断片を〔α−３２ｐ）ａｃ
’ｒ、ｐ、ＤＮＡポリメーラーゼＩ及びＤＮＡアーゼＩ
を使用するニックトランスレーション法によって標識し
、グルフアミラーゼｃＤＮＡ検出用のプローブとして用
いた。このブローブトハイブリダイズする形質転換体コ
ロニーを増殖させ、プラスミ）”ＤＮＡを抽出した。各
種制限酵素で処理したのち、アガロース電気泳動を行な
いＤＮＡ７９グメントの解析を行なった。プローブとハ
イブリダイズするコロニーのプラスミドが挿入されたＤ
ＮＡ断片は、１．７ｋｂの大きさであった。このプラス
ミｒをｐＣＧＡ２３９と命名した。
（。） ＤＮＡ配列解析
プラスミドｐＲＧＡ３９及びｐＣＧＡ２３９から各種制
限酵素を用いて分解し、アガロースゲルでＤＮＡ断片を
単離し、組み換えファージＭ１３を用いたジデオキシ法
によシ塩基配列を決定した。ｐＲＧＡ３９の解析結果こ
の遺伝子には、数十ｂｐからなるイントロンが４ケ所存
在する事が確認された（第２図にイントロンの存在部位
を示す）。また、ｐＣＧＡ２３９は完全長のグルコアミ
ラーゼに対応するｃ Ｄ Ｎ Ａではなく、アミノ酸に
して約５０個欠けたものであった。ｐＲＧＡ−３９およ
びｐＣＧＡ２３９の遺伝子地図の比較を第４図に示した
。
限酵素を用いて分解し、アガロースゲルでＤＮＡ断片を
単離し、組み換えファージＭ１３を用いたジデオキシ法
によシ塩基配列を決定した。ｐＲＧＡ３９の解析結果こ
の遺伝子には、数十ｂｐからなるイントロンが４ケ所存
在する事が確認された（第２図にイントロンの存在部位
を示す）。また、ｐＣＧＡ２３９は完全長のグルコアミ
ラーゼに対応するｃ Ｄ Ｎ Ａではなく、アミノ酸に
して約５０個欠けたものであった。ｐＲＧＡ−３９およ
びｐＣＧＡ２３９の遺伝子地図の比較を第４図に示した
。
（ｄ） 発現用グルコアミラーゼＤＮＡの構築クロー
ン化されたｃＤＮＡは、完全長ではない。
ン化されたｃＤＮＡは、完全長ではない。
そこでｐＣＧＡ２３９とｐＲＧＡ３９を組み換えること
によシ、グルコアミラーゼのプロモーター（リゾプス由
来）を持つ完全長のｃＤＮＡを作製した。その際、組み
換えに利用できる適当表制限酵素サイトがこれらのプラ
スミド９中に存在しないため新しく、インビトロ−（ユ
ータジエネシスの方法でＳａｔ ＩのサイトをｐＣＧＡ
２３９及びｐＲＧＡ３９Ｃ）同じ七ころに新しく作シ、
組み換えを行なった（第５図参照）。インビトローシュ
ータジエネシスの方法は、モリナガらの方法（Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ、 ｙ、＠ ｅｔａｌ。
によシ、グルコアミラーゼのプロモーター（リゾプス由
来）を持つ完全長のｃＤＮＡを作製した。その際、組み
換えに利用できる適当表制限酵素サイトがこれらのプラ
スミド９中に存在しないため新しく、インビトロ−（ユ
ータジエネシスの方法でＳａｔ ＩのサイトをｐＣＧＡ
２３９及びｐＲＧＡ３９Ｃ）同じ七ころに新しく作シ、
組み換えを行なった（第５図参照）。インビトローシュ
ータジエネシスの方法は、モリナガらの方法（Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ、 ｙ、＠ ｅｔａｌ。
Ｂ！、Ｑ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＭ ２，６３６−６３９
（１９８４））に従った。
（１９８４））に従った。
こうして得られたプラスミドｐＣＧＡ４３９は、５ａｌ
Ｉのサイトを作製したためにＮ末から５３番目のアミノ
酸コドンが本来のリジンからアスパラギン酸に変わって
いる。そこで再びインビトローミュータジエネシスの方
法を用いて、本来の環基配列に戻った完全長のグル；ア
ミラーゼＤＮＡを含むプラスミ１ｊｐｃＧＡ４４９を得
た。プラスミドｐＣＧＡ４４９は工業技術院微生物工業
技術研究所にＳＡＭＯＯ３９の名称でブタはスト条約の
下に寄託され、受託番号Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−６７３が付
与されている。
Ｉのサイトを作製したためにＮ末から５３番目のアミノ
酸コドンが本来のリジンからアスパラギン酸に変わって
いる。そこで再びインビトローミュータジエネシスの方
法を用いて、本来の環基配列に戻った完全長のグル；ア
ミラーゼＤＮＡを含むプラスミ１ｊｐｃＧＡ４４９を得
た。プラスミドｐＣＧＡ４４９は工業技術院微生物工業
技術研究所にＳＡＭＯＯ３９の名称でブタはスト条約の
下に寄託され、受託番号Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−６７３が付
与されている。
ｐＣＧＡ４４９中の完全長グルコアミラーゼＤＮＡは、
第２図における矢印左部分と第３図における矢印布部分
が結合したものである。
第２図における矢印左部分と第３図における矢印布部分
が結合したものである。
（ｅ） 酵母における発現ベクターの構築前記（、ｉ
）で得たｐＣＧＡ４４９を酵母で効率良く発現させるた
め特ＢＦ３５９−ｚｓ７ｏ３７号に開示された酸性ホス
ファターゼのプロモーター（Ｐｐｈｏ５）、を有するｐ
ＹＧ工Ｆ’Ｌｍ２１２ から、ＥｃｏＲＩ−８ａＡ！Ｉ
で切シ出される約８．３ｋｌ）の断片を用いた。このＥ
ｃｏＲＩ−８ａＪｊＩサイトにｐＣＧＡ４４９を組み込
む為に′ｐＣＧＡ４４９のＰｖｕＴｌサイトをＸｈｏＩ
リンカ−を用いてＸｈｏｔサイ）Ｋ変更し、プラスミド
ｐＣＧＡ４５０を作製した（第６Ａ図）にのプラスミド
をＸｈｏｌおよびＥｃｏＲ４で切断し、アガロースゲル
電気泳動で、２．２ｋｂの断片を分離し、Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼを用いて前述の８．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−８ａ
ｌＩ断片にライゲーションし、この結果得られたＰｐｈ
ｏ５をプロモーターとして含むプラスミド１をｐＹＧＡ
２１４９と命名した。このプラスミドを大腸菌９ｉ’Ａ
８０２株中で増殖させて分離した（第６Ａ図参照）。ｐ
ＹＧ工Ｆ”Ｌｍ２１２ の発現プロ％−１−Ｐｐｈｏ５
とグリセロアルデヒド＃−３−リン酸脱水素酵素のプロ
モーター（ＰＧＡＰ”特願昭５７−１８４２９１号参照
）に変えたプラスミドｐＹＧ工ＦＬｍ２２２を作製しく
第６Ｂ図）、上と全く同じ方法でｐＹＧＡ２２４９を作
製しく図示せず）、プラスミドを分離した。
）で得たｐＣＧＡ４４９を酵母で効率良く発現させるた
め特ＢＦ３５９−ｚｓ７ｏ３７号に開示された酸性ホス
ファターゼのプロモーター（Ｐｐｈｏ５）、を有するｐ
ＹＧ工Ｆ’Ｌｍ２１２ から、ＥｃｏＲＩ−８ａＡ！Ｉ
で切シ出される約８．３ｋｌ）の断片を用いた。このＥ
ｃｏＲＩ−８ａＪｊＩサイトにｐＣＧＡ４４９を組み込
む為に′ｐＣＧＡ４４９のＰｖｕＴｌサイトをＸｈｏＩ
リンカ−を用いてＸｈｏｔサイ）Ｋ変更し、プラスミド
ｐＣＧＡ４５０を作製した（第６Ａ図）にのプラスミド
をＸｈｏｌおよびＥｃｏＲ４で切断し、アガロースゲル
電気泳動で、２．２ｋｂの断片を分離し、Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼを用いて前述の８．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−８ａ
ｌＩ断片にライゲーションし、この結果得られたＰｐｈ
ｏ５をプロモーターとして含むプラスミド１をｐＹＧＡ
２１４９と命名した。このプラスミドを大腸菌９ｉ’Ａ
８０２株中で増殖させて分離した（第６Ａ図参照）。ｐ
ＹＧ工Ｆ”Ｌｍ２１２ の発現プロ％−１−Ｐｐｈｏ５
とグリセロアルデヒド＃−３−リン酸脱水素酵素のプロ
モーター（ＰＧＡＰ”特願昭５７−１８４２９１号参照
）に変えたプラスミドｐＹＧ工ＦＬｍ２２２を作製しく
第６Ｂ図）、上と全く同じ方法でｐＹＧＡ２２４９を作
製しく図示せず）、プラスミドを分離した。
さらにｐＣＧＡ４４９の代シにｐＣＧＡ４６９を用いて
同様の操作によシｐ ＹＧ Ｉ Ｆ Ｌｍ ２１２から
ｐＹＧＡ２１６９（第６Ａ図右下）、ｐＹＧＩＦＬｍ２
２２からｐＹＧＡ２２６９ （図示せず）を作製し、プ
ラスミドを分離した。その際、ｐＹＧＩＦＬｍ２２２は
、ｐＹＧＩＦＬｍ２１２（ＳＢＭ２７４ ＦＥＲＭＰ
−７７２７）と特願昭５７−１８４２９１号に開示され
たプラスミドｐＹｇａｐ８７（ＳＢＭ１５１ Ｆ’ＫＲ
Ｍ ＢＰ−３８２）を用いて作製した（第６Ｂ図参照）
。すなわち、ｐＹＧ工１’Ｌｍ２１２ 中唯−のＢａ
ｍＨ１サイトをＢａｍＨＩで開裂後、ＤＮＡポリメラー
ゼＩによ＃）フィルインし、Ｂｉｎｄｍ リンカ−を用
いてＨｉｎｄ ｍサイトに変更したプラスミド’ｐＹＧ
工Ｆ’Ｌｍ２１２Ｈを作製した。またｐＹｇａｐ８７
のグリセロアルデヒ）’−３−１ｊン酸脱水素酵素の
構造遺伝子開始コドンＡＴＧの直前にインビトローミュ
ークジエネシスによシＥｃｏＲＩのサイトを作り、プラ
スミドｐＹｇａｐ８７Ｅを作製した。
同様の操作によシｐ ＹＧ Ｉ Ｆ Ｌｍ ２１２から
ｐＹＧＡ２１６９（第６Ａ図右下）、ｐＹＧＩＦＬｍ２
２２からｐＹＧＡ２２６９ （図示せず）を作製し、プ
ラスミドを分離した。その際、ｐＹＧＩＦＬｍ２２２は
、ｐＹＧＩＦＬｍ２１２（ＳＢＭ２７４ ＦＥＲＭＰ
−７７２７）と特願昭５７−１８４２９１号に開示され
たプラスミドｐＹｇａｐ８７（ＳＢＭ１５１ Ｆ’ＫＲ
Ｍ ＢＰ−３８２）を用いて作製した（第６Ｂ図参照）
。すなわち、ｐＹＧ工１’Ｌｍ２１２ 中唯−のＢａ
ｍＨ１サイトをＢａｍＨＩで開裂後、ＤＮＡポリメラー
ゼＩによ＃）フィルインし、Ｂｉｎｄｍ リンカ−を用
いてＨｉｎｄ ｍサイトに変更したプラスミド’ｐＹＧ
工Ｆ’Ｌｍ２１２Ｈを作製した。またｐＹｇａｐ８７
のグリセロアルデヒ）’−３−１ｊン酸脱水素酵素の
構造遺伝子開始コドンＡＴＧの直前にインビトローミュ
ークジエネシスによシＥｃｏＲＩのサイトを作り、プラ
スミドｐＹｇａｐ８７Ｅを作製した。
ｐＹＧＩＦＬｍ２１２Ｈｆ： ＥｃｏＲＩで切断し、さ
らにＨｔｎａｍで部分的に切断後、アガロースゲル電気
泳動で、８．Ｏｋｂの断片を分離した。またｐＹｇａｐ
８７ＥｔＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｍで切断後アガロースゲ
ル電気泳動で１．１ｋｂの断片を分離し、ｐＹＧ工ＦＬ
ｍ２１２Ｈの８．０ｋｂの断片とライゲーション後大腸
菌を形質転換してプラスミド１、ｐＹＧＩＦＬｍ２２２
を得た。
らにＨｔｎａｍで部分的に切断後、アガロースゲル電気
泳動で、８．Ｏｋｂの断片を分離した。またｐＹｇａｐ
８７ＥｔＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｍで切断後アガロースゲ
ル電気泳動で１．１ｋｂの断片を分離し、ｐＹＧ工ＦＬ
ｍ２１２Ｈの８．０ｋｂの断片とライゲーション後大腸
菌を形質転換してプラスミド１、ｐＹＧＩＦＬｍ２２２
を得た。
（ｆ） 酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現
前述のプラスミドｐＹＧＡ２１４°９を用い酵母Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＸＳ
−３０−２Ａ（ＭＡＴａ。
前述のプラスミドｐＹＧＡ２１４°９を用い酵母Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＸＳ
−３０−２Ａ（ＭＡＴａ。
ｌｅｕ ２ 、 ｈｉｓ ３． ｔｒｐ １． ｕｒａ
３）およびＸＳ−Ｘ５−３９−２Ｂ（＆＋ ｌｅｕ
２． ｈｉｓ ３． ｔｒｐ １． ｕｒａ ３）を
形質転換し、トリプトファンの栄養要求性で形質転換体
を選択した。形質転換は、ＬｉＣｌ２を用いたイトウら
の方法（Ｉｔｏ、Ｈ，、ｅｔａ４ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、。
３）およびＸＳ−Ｘ５−３９−２Ｂ（＆＋ ｌｅｕ
２． ｈｉｓ ３． ｔｒｐ １． ｕｒａ ３）を
形質転換し、トリプトファンの栄養要求性で形質転換体
を選択した。形質転換は、ＬｉＣｌ２を用いたイトウら
の方法（Ｉｔｏ、Ｈ，、ｅｔａ４ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、。
１５３、（１９８３））で行なった。得られた形質転換
株を５ゴのＹＥＰＤ培地（１チ酵母エキス、２チポリＲ
プトン、２チグルコース）に−白金耳植菌後４８時間後
にサンプリングを行なった。エツインドル７チューブに
て１０００ Ｏｒｐｍ ５分間の遠心分離によシ上清
とイレットに分け、その上清を用いてグルコアミラーゼ
の活性を測定した。、グルコアミラーゼ活性の測定は可
溶でんぷん溶液（１０％可溶でんぷん−２０ｍＭ酢酸緩
衝液ｐＨｓ、ｏ）ｓｏｏμｊに前述の上清２００μｌを
加え３７Ｃで反応後の遊離グルコースの量で求めた。
株を５ゴのＹＥＰＤ培地（１チ酵母エキス、２チポリＲ
プトン、２チグルコース）に−白金耳植菌後４８時間後
にサンプリングを行なった。エツインドル７チューブに
て１０００ Ｏｒｐｍ ５分間の遠心分離によシ上清
とイレットに分け、その上清を用いてグルコアミラーゼ
の活性を測定した。、グルコアミラーゼ活性の測定は可
溶でんぷん溶液（１０％可溶でんぷん−２０ｍＭ酢酸緩
衝液ｐＨｓ、ｏ）ｓｏｏμｊに前述の上清２００μｌを
加え３７Ｃで反応後の遊離グルコースの量で求めた。
グルコースの量はグルコスタット（藤沢薬品）を用いて
定量した。活性は、２時間反応で測定したところＸＳ−
３０−２Ａ中のｐＹＧＡ２１４９では、０．００４ ｕ
／ｌｔｔ、ｌ、 ＸＳ−３０−２Ｂ中のｐＹＧＡ２１４
９では、０、 ＯＯ８ｕ／Ｍとなシ酵母の性によ９２倍
の差があった（第７図参照）。１ユニツトは、１分間に
１μｍｏＡ！ｅ のグルコースを遊離する活性とした
。
定量した。活性は、２時間反応で測定したところＸＳ−
３０−２Ａ中のｐＹＧＡ２１４９では、０．００４ ｕ
／ｌｔｔ、ｌ、 ＸＳ−３０−２Ｂ中のｐＹＧＡ２１４
９では、０、 ＯＯ８ｕ／Ｍとなシ酵母の性によ９２倍
の差があった（第７図参照）。１ユニツトは、１分間に
１μｍｏＡ！ｅ のグルコースを遊離する活性とした
。
ｐＹＧＡ２１４９を含まない酵母では、上清に活性は認
められなかった。
められなかった。
さらにプロモータとしてＰＧＡＰを利用している場合そ
の活性は０．４０ ｕ／Ｍとなシ５０〜１００倍のグル
コアミラーゼ活性が出現した。またプロモーターとして
酸性ホスファターゼＰｈｏ５を利用した場合グルコアミ
ラーゼ活性は、培地中のリン酸濃度に影響され出現した
。たとえば、通常のＹＰＤ培地で３０Ｃ４８時間培養後
におけるこの菌のグルコアミラーゼ活性は０であるが、
硫酸マグネシウムとアンモニア水を用いてＹＰＤ中のリ
ン酸を除いた培地（Ｒｕｂｉｎ、 Ｇ、 Ｍ、 Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
の活性は０．４０ ｕ／Ｍとなシ５０〜１００倍のグル
コアミラーゼ活性が出現した。またプロモーターとして
酸性ホスファターゼＰｈｏ５を利用した場合グルコアミ
ラーゼ活性は、培地中のリン酸濃度に影響され出現した
。たとえば、通常のＹＰＤ培地で３０Ｃ４８時間培養後
におけるこの菌のグルコアミラーゼ活性は０であるが、
硫酸マグネシウムとアンモニア水を用いてＹＰＤ中のリ
ン酸を除いた培地（Ｒｕｂｉｎ、 Ｇ、 Ｍ、 Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
４１．１９７−２０２．（１９７４））ではＰ。ＡＰの
場合と同程度のグルコアミラーゼ活性が出現する。
場合と同程度のグルコアミラーゼ活性が出現する。
培養後の上溝についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行なった場合、グルコアミラーゼ蛋白は、全菌
体外蛋白質の５０チ以上である。
気泳動を行なった場合、グルコアミラーゼ蛋白は、全菌
体外蛋白質の５０チ以上である。
さらにそれらの活性がリゾプス由来のグルコアミラーゼ
によるものである事を免疫学的手法によシ確認した。ｎ
Ｉ製したグルコアミラーゼを用い、ウサギによる抗体を
作製した。この抗体を用い通常クエスタンプロツテイン
グと呼ばれる方法で、検出した。これには、前述の活性
を測定した４８時間培養後の上清１，５コを濃縮して用
いた。その３分の１量を１０チポリアクリルアミビ電気
泳動し、泳動後、ゲル中のたんばく質を電気泳動的にニ
トロ−セルロース戸紙上に移動させ、固定した。
によるものである事を免疫学的手法によシ確認した。ｎ
Ｉ製したグルコアミラーゼを用い、ウサギによる抗体を
作製した。この抗体を用い通常クエスタンプロツテイン
グと呼ばれる方法で、検出した。これには、前述の活性
を測定した４８時間培養後の上清１，５コを濃縮して用
いた。その３分の１量を１０チポリアクリルアミビ電気
泳動し、泳動後、ゲル中のたんばく質を電気泳動的にニ
トロ−セルロース戸紙上に移動させ、固定した。
こうして得られたニトロセルロー１７紙を酵素免疫実験
法の手法を用い・ぞ−オキシダーゼの反応で検出した。
法の手法を用い・ぞ−オキシダーゼの反応で検出した。
その結果リゾプスのグルコアミラーゼと分子量的にほぼ
同じ位置にグルコアミラーゼの抗体と反応するバンドが
存在し、たしかに、リゾプス由来のグルコアミラーゼが
酵母によシ発現している事を確認した。その結果を第８
図に示した。
同じ位置にグルコアミラーゼの抗体と反応するバンドが
存在し、たしかに、リゾプス由来のグルコアミラーゼが
酵母によシ発現している事を確認した。その結果を第８
図に示した。
（ｇ） でんぷんを炭素源とした場合の増殖酵母ＸＳ
−３０−２Ｂ株についてｐＹＧＡ２１４９の有無につい
て炭素源を変えた場合の増殖について検討した。ＸＳ−
３０−２ＢｔＹＥＰＤ培地で、ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹ
ＧＡ２１４９） を１％カザミノ酸及びウラシルを含
む最少培地（０，６７％Ｄｉｆｃｏ、 Ｙｅａｓｔｎｉ
ｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ、 ２ ％グルコース）で２
４時間３０Ｃで振とう培養し々培とした。５００ｄの坂
ロフラスコにＹＥＰＤ培地または、ＹＥＰＳ培地（１チ
酵母エキス、２チポリＲブト／、２％可溶性でんぷん）
を１００ｄ作製し、オートクレーブ滅菌後３０Ｃにて前
項溶液をｌ ｗｒｌ加え、その後の増殖を６６０ ｎｍ
の吸光度によって比較した。その結果、プラスミドｐＹ
ＧＡ２１４９を保持しないＸＳ−３０−２Ｂ株は、ＹＥ
ＰＳ培地では、はとんど増殖しないが、ｐＹＧＡ２１４
９を保持する株は、ＹＥＰＳ培地でもＹＥＰＤ培地と同
程度の増殖速度で増殖しうる。この事実は、明らかＫＸ
Ｓ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９）がグルコアミラー
ゼを生産し、でんぷんを分解して利用している結果であ
る（第９図参照）。
−３０−２Ｂ株についてｐＹＧＡ２１４９の有無につい
て炭素源を変えた場合の増殖について検討した。ＸＳ−
３０−２ＢｔＹＥＰＤ培地で、ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹ
ＧＡ２１４９） を１％カザミノ酸及びウラシルを含
む最少培地（０，６７％Ｄｉｆｃｏ、 Ｙｅａｓｔｎｉ
ｔｒｏｇｅｎｅ ｂａｓｅ、 ２ ％グルコース）で２
４時間３０Ｃで振とう培養し々培とした。５００ｄの坂
ロフラスコにＹＥＰＤ培地または、ＹＥＰＳ培地（１チ
酵母エキス、２チポリＲブト／、２％可溶性でんぷん）
を１００ｄ作製し、オートクレーブ滅菌後３０Ｃにて前
項溶液をｌ ｗｒｌ加え、その後の増殖を６６０ ｎｍ
の吸光度によって比較した。その結果、プラスミドｐＹ
ＧＡ２１４９を保持しないＸＳ−３０−２Ｂ株は、ＹＥ
ＰＳ培地では、はとんど増殖しないが、ｐＹＧＡ２１４
９を保持する株は、ＹＥＰＳ培地でもＹＥＰＤ培地と同
程度の増殖速度で増殖しうる。この事実は、明らかＫＸ
Ｓ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９）がグルコアミラー
ゼを生産し、でんぷんを分解して利用している結果であ
る（第９図参照）。
（ｈｌ 形質転換算器によるアルコ−化の生産１）可
溶性でんぷんを用いたアルコール発酵培地はＹＰｓ（１
％薄保母エキス２％ポリイブトンｉ １％、２チまたは
５％可溶性でんぷん）２００ｄを５００ｍ１マイヤー中
で１２１Ｃ１１′５分間オートクレーブ滅菌したものを
用いた。
溶性でんぷんを用いたアルコール発酵培地はＹＰｓ（１
％薄保母エキス２％ポリイブトンｉ １％、２チまたは
５％可溶性でんぷん）２００ｄを５００ｍ１マイヤー中
で１２１Ｃ１１′５分間オートクレーブ滅菌したものを
用いた。
酵母は次のものを使用した：
■ ＸＳ−３０−２Ｂ （グルコアミラーゼ遺伝子を持
たぬコントロール） ■ ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９で形質転換〕
この酵母はリゾプスのプロモーターを持つ。
たぬコントロール） ■ ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１４９で形質転換〕
この酵母はリゾプスのプロモーターを持つ。
■ ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２１６９で形質転換〕
この酵母はＰｈｏ５プロモーターを持つ。
この酵母はＰｈｏ５プロモーターを持つ。
■ ＸＳ−３０−２Ｂ（ｐＹＧＡ２２６９”ｔ’形’ｊ
ｔ転換）この酵母はＰ。ＡＰプロモーターを持つ。
ｔ転換）この酵母はＰ。ＡＰプロモーターを持つ。
酵母の前々培を得るため、１チカザミノ酸、ウラシル、
アデニンを含む最少培地５ｄに１白金耳植菌し、２８Ｃ
で２０時間振とう培養した。次いでこの前々培をＹＰＤ
培地に２％植菌し、２８Ｃで２４時間靜置場養して々培
とした。但し、■の酵母については、Ｐｂｏ２を誘導す
るために低すン酸ＹＰＤ培地で培養した。この々培をＹ
ＰＳ培地に５チ植菌し、２８Ｃで静置培養してエタノー
ルの生産ｔ−ｍべた。なお■の酵母については低すン酸
ＹＰＳ培地で行った。各酵母について１．２および５％
のでんぷんでのエタノールの生産並びに酵母・つ増殖を
測定した。その結果を次表１および２に示す。
アデニンを含む最少培地５ｄに１白金耳植菌し、２８Ｃ
で２０時間振とう培養した。次いでこの前々培をＹＰＤ
培地に２％植菌し、２８Ｃで２４時間靜置場養して々培
とした。但し、■の酵母については、Ｐｂｏ２を誘導す
るために低すン酸ＹＰＤ培地で培養した。この々培をＹ
ＰＳ培地に５チ植菌し、２８Ｃで静置培養してエタノー
ルの生産ｔ−ｍべた。なお■の酵母については低すン酸
ＹＰＳ培地で行った。各酵母について１．２および５％
のでんぷんでのエタノールの生産並びに酵母・つ増殖を
測定した。その結果を次表１および２に示す。
表２
４８時間目について
２％でんぷん利用
Ｉ）低温蒸煮法（ＬＴＣ）によるアルコール発酵粉砕と
うもろこし１４０Ｉｉを仕込水４０２ｄ中に加え、さら
にα−アミラーゼ製剤（ターマミル）ｏ、ｓＩＩを増粘
防止剤として、メタ重亜硫駿カリ１６０ｐｐｍを殺菌剤
として添加し、８００〜８２ＧＫ５分間保持した後急冷
した。
うもろこし１４０Ｉｉを仕込水４０２ｄ中に加え、さら
にα−アミラーゼ製剤（ターマミル）ｏ、ｓＩＩを増粘
防止剤として、メタ重亜硫駿カリ１６０ｐｐｍを殺菌剤
として添加し、８００〜８２ＧＫ５分間保持した後急冷
した。
尊母の前々培および々培は１）と同じ菌を用いて同様に
行ない、この々培を酒母として上記低温蒸煮でんぷんに
加え、２８Ｃで培養した。培嬰は、他の成分を添加しな
いもの、カザミノ酸、ウラシル、アデニンを補ったもの
、および更に０．４％ベルコースを加えたものの３水準
について行い、ＣＯ□減少量による発酵の進行状態およ
びアルコール生成量を調べた。コントロールは、リゾプ
スグルコアミラーゼを通常量で用いた非形質転換酵母の
場合も調べた。結果を表３、表４および第１０図に示す
。これらの結果から判るとおシ、本発明の酵母によれば
、リゾプスグルコアミラーゼ製剤を添加することなく、
無蒸煮又は低温蒸煮でんぷんから直接アルコールを製造
することが可能である。
行ない、この々培を酒母として上記低温蒸煮でんぷんに
加え、２８Ｃで培養した。培嬰は、他の成分を添加しな
いもの、カザミノ酸、ウラシル、アデニンを補ったもの
、および更に０．４％ベルコースを加えたものの３水準
について行い、ＣＯ□減少量による発酵の進行状態およ
びアルコール生成量を調べた。コントロールは、リゾプ
スグルコアミラーゼを通常量で用いた非形質転換酵母の
場合も調べた。結果を表３、表４および第１０図に示す
。これらの結果から判るとおシ、本発明の酵母によれば
、リゾプスグルコアミラーゼ製剤を添加することなく、
無蒸煮又は低温蒸煮でんぷんから直接アルコールを製造
することが可能である。
第１図は、本発明のグルコアミラーゼのイントロンを含
まない構造遺伝子の塩基配列をシグナルＲプチド領域と
ともに示す図であり、 第２図はリゾプス・オリザエの染色体ＤＮＡよシクロー
ニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
示す図であり、 第３図はリゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよシ得たｃＤ
ＮＡをクローニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＣ末
端側の塩基配列を示す図であり、第４図は、リゾプス・
オリザエの染色体ＤＮＡよりクローニングしたグルコア
ミラーゼ遺伝子と、リゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよ
シ調製したグルコアミラーゼ遺伝子との比較図であり、
第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４図の二つの遺
伝子を組合せて、プラスミドＪベクター中にて、イント
ロンのない完全長のｃＤＮＡを構成し、さらに酵母中で
効率良く発現させるために、プロモーター及びテールを
組込む方法を示す一連の流れ図であって、第５図はｐＣ
ＧＡ４６９に到るまでの図、第６Ａ図はｐＹＧＡ２１４
９およびｐＹＧＡ２１６９に到るまでの図、そして第６
Ｂ図はｐＹＧＩＦＬｍ２２２に到るまでの図であシ、 第７図は、形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産
を示すグラフであり、 第８図は、形質転換酵母の生産したグルコアミラーゼの
電気泳動図であシ、 第９図は、でんぷん炭素源とした場合の形質転換酵母の
増殖曲線グラフであシ、 第１Ｏ図は、形質転換酵母によるアルコールの生産を示
すグラフである。 特許巴願人 チンドリー株式会社 （外５名） 第２図（ｂ） ＝天の浄曹（１否にλ更なし亀 コ 第３図（ａ） ロゴ＾ｃＴｇ′ｒ晶Ｔロスαχ心軸−Ｘτ口℃＾Ｃんに
ταシλτＡ図面のン＝’（１谷に、；、になしコ。 第３図（ｂ） ＣＡＡＧＣ，ｋＡＡＣＴ ＣＴＴＧＧＴＴＣ’ｒＴ α
℃τＧＴ入Ａ、ＣＴＧＧＴＴＡＣＧＣ？Ｇ〜〜リリノＪ
請スＡ 第９図 Ｊｆ４−↑間 〔晴■ 第１０図 時間（ヨ枚） 手続補正Ｉｔ（方式） １．事件の表示 昭和５９年特許Ｗ４第２６４９６５号 ２、発明の名称 アルコールの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 （１９０） サントリー株式会社４、代理
人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ピル ２０６号室 ５、補正命令の日付 昭和６０年 ３月２６日 （
発送日）６、補正の対象 図面の慣１〜３（２１ ７、補正の内容 別紙の通り（なお、内容には変更なし）手続補正書 昭和６０年 ６月７７日 ２、発明の名称 アルコールの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 基部（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１） 明細書の記載を次のとおり補正する。 頁 行 補正前 補正後１
１４ ｏｒｉｚａｅ ｏｒｙｚａｅ
８８ＩＩｚｕｋａ ｌ１ｚｕｋａ９ １
３ 非真核生物 の宿主９ １６ ハイ
ブリッドさせ 組み換えるる １４ ８ コロニ コロニー２１９１
０％ １６０％ ２３ ｉ ３ Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ
Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ２４ １．７，８ ＹＥＰ
Ｓ ＹＰＳ（２）第１０図を別紙のとおり
補正する。 以 上
まない構造遺伝子の塩基配列をシグナルＲプチド領域と
ともに示す図であり、 第２図はリゾプス・オリザエの染色体ＤＮＡよシクロー
ニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
示す図であり、 第３図はリゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよシ得たｃＤ
ＮＡをクローニングしたグルコアミラーゼ遺伝子のＣ末
端側の塩基配列を示す図であり、第４図は、リゾプス・
オリザエの染色体ＤＮＡよりクローニングしたグルコア
ミラーゼ遺伝子と、リゾプス・オリザエのｍ−ＲＮＡよ
シ調製したグルコアミラーゼ遺伝子との比較図であり、
第５図、第６Ａ図および第６Ｂ図は、第４図の二つの遺
伝子を組合せて、プラスミドＪベクター中にて、イント
ロンのない完全長のｃＤＮＡを構成し、さらに酵母中で
効率良く発現させるために、プロモーター及びテールを
組込む方法を示す一連の流れ図であって、第５図はｐＣ
ＧＡ４６９に到るまでの図、第６Ａ図はｐＹＧＡ２１４
９およびｐＹＧＡ２１６９に到るまでの図、そして第６
Ｂ図はｐＹＧＩＦＬｍ２２２に到るまでの図であシ、 第７図は、形質転換酵母によるグルコアミラーゼの生産
を示すグラフであり、 第８図は、形質転換酵母の生産したグルコアミラーゼの
電気泳動図であシ、 第９図は、でんぷん炭素源とした場合の形質転換酵母の
増殖曲線グラフであシ、 第１Ｏ図は、形質転換酵母によるアルコールの生産を示
すグラフである。 特許巴願人 チンドリー株式会社 （外５名） 第２図（ｂ） ＝天の浄曹（１否にλ更なし亀 コ 第３図（ａ） ロゴ＾ｃＴｇ′ｒ晶Ｔロスαχ心軸−Ｘτ口℃＾Ｃんに
ταシλτＡ図面のン＝’（１谷に、；、になしコ。 第３図（ｂ） ＣＡＡＧＣ，ｋＡＡＣＴ ＣＴＴＧＧＴＴＣ’ｒＴ α
℃τＧＴ入Ａ、ＣＴＧＧＴＴＡＣＧＣ？Ｇ〜〜リリノＪ
請スＡ 第９図 Ｊｆ４−↑間 〔晴■ 第１０図 時間（ヨ枚） 手続補正Ｉｔ（方式） １．事件の表示 昭和５９年特許Ｗ４第２６４９６５号 ２、発明の名称 アルコールの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 （１９０） サントリー株式会社４、代理
人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ピル ２０６号室 ５、補正命令の日付 昭和６０年 ３月２６日 （
発送日）６、補正の対象 図面の慣１〜３（２１ ７、補正の内容 別紙の通り（なお、内容には変更なし）手続補正書 昭和６０年 ６月７７日 ２、発明の名称 アルコールの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 基部（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１） 明細書の記載を次のとおり補正する。 頁 行 補正前 補正後１
１４ ｏｒｉｚａｅ ｏｒｙｚａｅ
８８ＩＩｚｕｋａ ｌ１ｚｕｋａ９ １
３ 非真核生物 の宿主９ １６ ハイ
ブリッドさせ 組み換えるる １４ ８ コロニ コロニー２１９１
０％ １６０％ ２３ ｉ ３ Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ
Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ２４ １．７，８ ＹＥＰ
Ｓ ＹＰＳ（２）第１０図を別紙のとおり
補正する。 以 上
Claims (1)
- （１）澱粉質原料からのアルコールの製造法において、
リゾプス属に属する糸状菌由来のグルコアミラーゼ遺伝
子を組込んだ発現可能な組換ベクターによって形質転換
された酵母を用いて、澱粉質原料を糖化・発酵せしめる
ことを特徴とするアルコールの製造法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59264965A JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
| CA000497522A CA1267373A (en) | 1984-12-15 | 1985-12-12 | Process for producing alcohol |
| AT85115912T ATE67518T1 (de) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Verfahren zur herstellung von alkohol. |
| EP85115912A EP0185327B1 (en) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Process for producing alcohol |
| BR8506271A BR8506271A (pt) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Processo para produzir etanol |
| DE8585115912T DE3584149D1 (de) | 1984-12-15 | 1985-12-13 | Verfahren zur herstellung von alkohol. |
| MX000957A MX166006B (es) | 1984-12-15 | 1985-12-16 | Procedimiento para producir alcohol |
| US07/338,395 US5084385A (en) | 1984-12-15 | 1989-04-14 | Process for producing alcohol using yeast transformed by rhizopus glucoamylase gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59264965A JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61141890A true JPS61141890A (ja) | 1986-06-28 |
| JPH0481428B2 JPH0481428B2 (ja) | 1992-12-24 |
Family
ID=17410660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59264965A Granted JPS61141890A (ja) | 1984-12-15 | 1984-12-15 | アルコ−ルの製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5084385A (ja) |
| EP (1) | EP0185327B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61141890A (ja) |
| AT (1) | ATE67518T1 (ja) |
| BR (1) | BR8506271A (ja) |
| CA (1) | CA1267373A (ja) |
| DE (1) | DE3584149D1 (ja) |
| MX (1) | MX166006B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63133984A (ja) * | 1986-08-21 | 1988-06-06 | ロベルト バン デン ベルグ | 組換えｄｎａ技術によって構築されるデンプン分解酵素産生微生物及びその発酵法用途 |
| JPS63245664A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Suntory Ltd | グルコアミラーゼ生産形質転換酵母によるアルコールの生産方法 |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2599755B1 (fr) * | 1986-06-10 | 1990-04-20 | Transgene Sa | Bloc d'expression d'une amyloglucosidase dans une levure, levure transformee et procede de preparation d'enzyme |
| DK293787A (da) * | 1986-06-10 | 1987-12-11 | Transgene Sa | Ekspression af en amyloglucosidase |
| US5151354A (en) * | 1986-08-21 | 1992-09-29 | Cornelius Hollenberg | Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms |
| EP0257115A1 (en) * | 1986-08-21 | 1988-03-02 | Heineken Technisch Beheer B.V. | Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes |
| GB8621118D0 (en) * | 1986-09-01 | 1986-10-08 | Whitbread & Co Plc | Stabilised polypeptides |
| US5270175A (en) * | 1991-07-12 | 1993-12-14 | Dna Plant Technology Corporation | Methods and compositions for producing metabolic products for algae |
| US5604128A (en) * | 1991-08-13 | 1997-02-18 | Sankyo Company, Limited | Isolated cultures of Pestalotiopsis funerea IFO 5427 and Pestalotiopsis negleta FERM BP-3501 |
| EP0528612A3 (en) * | 1991-08-13 | 1993-06-23 | Sankyo Company Limited | Amylase capable of digesting raw starch |
| US5322778A (en) * | 1991-10-31 | 1994-06-21 | Genencor International, Inc. | Liquefaction of granular starch slurries using an antioxidant with alpha amylase |
| US5665585A (en) * | 1992-09-03 | 1997-09-09 | Alko-Yhiot Oy | Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma |
| US5514584A (en) * | 1993-06-11 | 1996-05-07 | Midwest Research Institute | Cloning of cellulase genes from acidothermus cellulolyticus |
| US6468662B1 (en) * | 1996-05-07 | 2002-10-22 | Reichhold, Inc. | Low monomer containing laminating resin compositions |
| US20030203454A1 (en) * | 2002-02-08 | 2003-10-30 | Chotani Gopal K. | Methods for producing end-products from carbon substrates |
| EP1525300A4 (en) * | 2002-02-08 | 2006-03-15 | Genencor Int | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ETHANOL FROM CARBON SUBSTRATES |
| US20040063184A1 (en) * | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| CN102210376B (zh) * | 2003-03-10 | 2014-12-31 | 波伊特研究股份有限公司 | 利用生淀粉生产乙醇的方法 |
| US20050233030A1 (en) * | 2004-03-10 | 2005-10-20 | Broin And Associates, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation |
| US20050239181A1 (en) * | 2004-03-10 | 2005-10-27 | Broin And Associates, Inc. | Continuous process for producing ethanol using raw starch |
| US7019391B2 (en) | 2004-04-06 | 2006-03-28 | Bao Tran | NANO IC packaging |
| WO2006119386A2 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Broin And Associates, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation |
| US7919289B2 (en) | 2005-10-10 | 2011-04-05 | Poet Research, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material |
| CN101680006A (zh) * | 2007-05-08 | 2010-03-24 | 诺维信公司 | 发酵方法 |
| US8815552B2 (en) * | 2009-03-03 | 2014-08-26 | Poet Research, Inc. | System for fermentation of biomass for the production of ethanol |
| US9068206B1 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-30 | Poet Research, Inc. | System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol |
| US20100233771A1 (en) * | 2009-03-03 | 2010-09-16 | Mcdonald William F | System for pre-treatment of biomass for the production of ethanol |
| US8450094B1 (en) | 2009-03-03 | 2013-05-28 | Poet Research, Inc. | System for management of yeast to facilitate the production of ethanol |
| EP3775179A1 (en) * | 2018-03-27 | 2021-02-17 | Cargill, Incorporated | Methods for ethanol production using engineered yeast |
| US20230340444A1 (en) * | 2020-04-17 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc. | Glucoamylase and methods of use thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2089836B (en) * | 1980-12-16 | 1984-06-20 | Suntory Ltd | Process for producing alcohol by fermentation without cooking |
| IE54046B1 (en) * | 1981-08-25 | 1989-05-24 | Celltech Ltd | Expression vectors |
| JPS5974988A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
| JPH0716432B2 (ja) * | 1982-10-20 | 1995-03-01 | サントリー株式会社 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
| NO840200L (no) * | 1983-01-28 | 1984-07-30 | Cefus Corp | Glukoamylase cdna. |
| IL75210A0 (en) * | 1984-05-22 | 1985-09-29 | Bioteknika International | Yeast vector |
| JPH0630586B2 (ja) * | 1984-12-15 | 1994-04-27 | サントリー株式会社 | グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
-
1984
- 1984-12-15 JP JP59264965A patent/JPS61141890A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-12 CA CA000497522A patent/CA1267373A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 DE DE8585115912T patent/DE3584149D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 AT AT85115912T patent/ATE67518T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 BR BR8506271A patent/BR8506271A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-12-13 EP EP85115912A patent/EP0185327B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-16 MX MX000957A patent/MX166006B/es unknown
-
1989
- 1989-04-14 US US07/338,395 patent/US5084385A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63133984A (ja) * | 1986-08-21 | 1988-06-06 | ロベルト バン デン ベルグ | 組換えｄｎａ技術によって構築されるデンプン分解酵素産生微生物及びその発酵法用途 |
| JPS63245664A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Suntory Ltd | グルコアミラーゼ生産形質転換酵母によるアルコールの生産方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0185327B1 (en) | 1991-09-18 |
| US5084385A (en) | 1992-01-28 |
| MX166006B (es) | 1992-12-16 |
| EP0185327A2 (en) | 1986-06-25 |
| DE3584149D1 (de) | 1991-10-24 |
| JPH0481428B2 (ja) | 1992-12-24 |
| BR8506271A (pt) | 1986-08-26 |
| EP0185327A3 (en) | 1987-07-15 |
| CA1267373A (en) | 1990-04-03 |
| ATE67518T1 (de) | 1991-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS61141890A (ja) | アルコ−ルの製造法 | |
| US4863864A (en) | Glucoamylase gene of rhizopus oryzae | |
| US11421212B2 (en) | Engineered yeast strains with signal sequence-modified glucoamylase polypeptides and enhanced ethanol production | |
| US10364421B2 (en) | Modified glucoamylase enzymes and yeast strains having enhanced bioproduct production | |
| CN104169417B (zh) | 具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其编码多核苷酸 | |
| CN109385413B (zh) | 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用 | |
| NZ207000A (en) | Dna coding for fungal glucoamylase | |
| US11203790B2 (en) | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same | |
| EP3487996A1 (en) | Serine protease variants and polynucleotides encoding same | |
| EP3487995B1 (en) | Serine protease variants and polynucleotides encoding same | |
| US11939619B2 (en) | Glucoamylase engineered yeast and fermentation methods | |
| US5763221A (en) | Transformant producing substance PF1022, and method for transforming microorganism belonging to the class hyphomycetes | |
| JPH09507742A (ja) | Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａから得られるグルコアミラーゼプロモーターおよび異種ポリペプチドの生産におけるその使用 | |
| ES2649555T3 (es) | Polipéptidos con actividad glucoamilasa y polinucleótidos que los codifican | |
| CN108611339A (zh) | 葡萄糖淀粉酶TlGa15及其基因和应用 | |
| CN112695022B (zh) | 一种降解植物多糖的酶系及其应用 | |
| WO2020057476A1 (zh) | 海藻糖酶在发酵生产中的应用 | |
| CN112048487B (zh) | 淀粉酶合成的调控蛋白及其编码基因与应用 | |
| JPH09505989A (ja) | 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現 | |
| US4870014A (en) | Cloning of thermolabile glucoamylase gene into saccharomyces cerevisiae | |
| JP2607509B2 (ja) | グルコアミラーゼ生産形質転換酵母によるアルコールの生産方法 | |
| BR112021000059A2 (pt) | Glucoamilases e métodos para uso das mesmas | |
| Barker et al. | A yeast-based biosensor for environmental monitoring | |
| NZ219435A (en) | Production of glucoamylase by recombinant techniques |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |