JPH0716432B2 - 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 - Google Patents
酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法Info
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- JPH0716432B2 JPH0716432B2 JP57184291A JP18429182A JPH0716432B2 JP H0716432 B2 JPH0716432 B2 JP H0716432B2 JP 57184291 A JP57184291 A JP 57184291A JP 18429182 A JP18429182 A JP 18429182A JP H0716432 B2 JPH0716432 B2 JP H0716432B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は酵母サツカロマイセスの解糖系酵素の１つであ
るグリセロアルデヒド−３−ホスフエイトデヒドロゲナ
ーゼ（以下GAP−DHと略称する）を支配している遺伝子
（オペロン）のプロモーターと有用な目的ペプチド遺伝
子とを結合した酵母菌のベクターに関する。更に、本発
明は上記GAP−DHを支配しているオペロンのプロモータ
ーを利用して、有用な目的ペプチドを高収率で酵母から
生産する方法に関する これまで遺伝子操作技術を用いて医薬上有用なペプチド
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモ
ン、各種インターフエロン、インフルエンザウイルス並
びに肝炎Ｂウイルス蛋白、サイモシンα１、β−エンド
ルフイン、α−ネオエンドルフイン、セクレチン、ウロ
キナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など多くの物質
が微生物又は動物細胞で作られるようになつている。
るグリセロアルデヒド−３−ホスフエイトデヒドロゲナ
ーゼ（以下GAP−DHと略称する）を支配している遺伝子
（オペロン）のプロモーターと有用な目的ペプチド遺伝
子とを結合した酵母菌のベクターに関する。更に、本発
明は上記GAP−DHを支配しているオペロンのプロモータ
ーを利用して、有用な目的ペプチドを高収率で酵母から
生産する方法に関する これまで遺伝子操作技術を用いて医薬上有用なペプチド
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモ
ン、各種インターフエロン、インフルエンザウイルス並
びに肝炎Ｂウイルス蛋白、サイモシンα１、β−エンド
ルフイン、α−ネオエンドルフイン、セクレチン、ウロ
キナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など多くの物質
が微生物又は動物細胞で作られるようになつている。
これらの多くは宿主として原核細胞（prokaryote）であ
る大腸菌を用いているが、近年有核細胞（eukaryote）
である酵母を宿主として利用することが注目されてい
る。これは、酵母の培養条件が簡単であり、分裂速度が
速いこと、安全性が高いこと、特にサツカロマイセス酵
母では遺伝生化学的解析がより多くなされていることな
どの理由による。しかし、酵母における外来異種ペプチ
ド産生に関する例は少く、α−インタ−フエロン、HB肝
炎表面抗原蛋白、α−ネオエンドルフインにみられる程
度である。
る大腸菌を用いているが、近年有核細胞（eukaryote）
である酵母を宿主として利用することが注目されてい
る。これは、酵母の培養条件が簡単であり、分裂速度が
速いこと、安全性が高いこと、特にサツカロマイセス酵
母では遺伝生化学的解析がより多くなされていることな
どの理由による。しかし、酵母における外来異種ペプチ
ド産生に関する例は少く、α−インタ−フエロン、HB肝
炎表面抗原蛋白、α−ネオエンドルフインにみられる程
度である。
一方、外来異種遺伝子、例えば化学的に合成した遺伝
子、mRNAから逆転写酵素によつて得られる相補的DNA（c
DNA）遺伝子、あるいは染色体から適当な処理によつて
得られる遺伝子などを発現させようとするには、用いる
宿主に適したプロモーター領域の存在が必須である。プ
ロモーターの良し悪しが目的とするペプチド遺伝子発現
に大きく影響するため、これまで種々のプロモーターを
用いた発現プラスミドベクターの開発が行われてきた。
子、mRNAから逆転写酵素によつて得られる相補的DNA（c
DNA）遺伝子、あるいは染色体から適当な処理によつて
得られる遺伝子などを発現させようとするには、用いる
宿主に適したプロモーター領域の存在が必須である。プ
ロモーターの良し悪しが目的とするペプチド遺伝子発現
に大きく影響するため、これまで種々のプロモーターを
用いた発現プラスミドベクターの開発が行われてきた。
しかしながら、報告されている酵母を宿主とする外来遺
伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクターに比
べ、目的とする外来遺伝子の発現効率は十分とは言えな
い。発明者らは、酵母サツカロマイセスの解糖系を支配
している酵素であるグリセロアルデヒド−３−ホスフエ
イトデヒドロゲナーゼ（GAP−DH）が酵母菌体で多量に
生産されているのに着目し、この酵素をコードしている
オペロンのプロモーター遺伝子の利用を考え、研究を進
めた。この結果、このプロモーター、更に詳細にはGAP
−DH遺伝子の転写開始コドンの５′側上流の少なくとも
90塩基対から成る非翻訳領域が酵母での異種または同種
のペプチドの生産に非常に有用であることを見出し、こ
のプロモーター領域の下流に異種または同種ペプチド遺
伝子とを結合した酵母菌のベクターを作成し、これを用
いて酵母の形質転換を行い、形質転換の行われた酵母を
分離解析することにより本発明を完成した。
伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクターに比
べ、目的とする外来遺伝子の発現効率は十分とは言えな
い。発明者らは、酵母サツカロマイセスの解糖系を支配
している酵素であるグリセロアルデヒド−３−ホスフエ
イトデヒドロゲナーゼ（GAP−DH）が酵母菌体で多量に
生産されているのに着目し、この酵素をコードしている
オペロンのプロモーター遺伝子の利用を考え、研究を進
めた。この結果、このプロモーター、更に詳細にはGAP
−DH遺伝子の転写開始コドンの５′側上流の少なくとも
90塩基対から成る非翻訳領域が酵母での異種または同種
のペプチドの生産に非常に有用であることを見出し、こ
のプロモーター領域の下流に異種または同種ペプチド遺
伝子とを結合した酵母菌のベクターを作成し、これを用
いて酵母の形質転換を行い、形質転換の行われた酵母を
分離解析することにより本発明を完成した。
本発明の酵母ベクターは次のようにして作成される。
サツカロマイセス酵母XS 16−5C株〔cir0〕の核DNAを
制限酵素Hind IIIで切断して得た1.9kbから2.2kbに相当
するDNA断片を適当なプラスミドベクター、例えばプラ
スミドPBR322のHind IIIサイトにクローニングして、酵
母の遺伝子ライブラリーを得た。その遺伝子ライブラリ
ーから2.1kbの長さの酵母DNA断片を持ち、かつそのDNA
断片が制限酵素Sal Iで１ケ所、制限酵素Hpa Iで１ケ所
切断される断片を持つクローンを分離した。このプラス
ミドは、挿入されたDNA断片についてMaxam−Gilbert法
（PNAS74、560−564（1977））により塩基配列を決定
し、この結果をホランド（Holland）ら「J.Biol.Chem.2
54、9839（1979）」の報告と比較検討することにより、
目的とするGAP−DH遺伝子が挿入されていることを確認
できる。
制限酵素Hind IIIで切断して得た1.9kbから2.2kbに相当
するDNA断片を適当なプラスミドベクター、例えばプラ
スミドPBR322のHind IIIサイトにクローニングして、酵
母の遺伝子ライブラリーを得た。その遺伝子ライブラリ
ーから2.1kbの長さの酵母DNA断片を持ち、かつそのDNA
断片が制限酵素Sal Iで１ケ所、制限酵素Hpa Iで１ケ所
切断される断片を持つクローンを分離した。このプラス
ミドは、挿入されたDNA断片についてMaxam−Gilbert法
（PNAS74、560−564（1977））により塩基配列を決定
し、この結果をホランド（Holland）ら「J.Biol.Chem.2
54、9839（1979）」の報告と比較検討することにより、
目的とするGAP−DH遺伝子が挿入されていることを確認
できる。
尚、上記2.1kbのHind III切断断片に相当し、ホランド
らの文献第9840頁に記載されているDNA断片の制限酵素
地図を第４図に示した。このようにしてGAP−DH遺伝子
が挿入されたプラスミドを特定の制限酵素で切断し、上
記遺伝子を含むDNA断片を選択マーカーを持つ酵母菌ベ
クター、好しくは操作の便宜上大腸菌−酵母シヤトルベ
クターに挿入する。
らの文献第9840頁に記載されているDNA断片の制限酵素
地図を第４図に示した。このようにしてGAP−DH遺伝子
が挿入されたプラスミドを特定の制限酵素で切断し、上
記遺伝子を含むDNA断片を選択マーカーを持つ酵母菌ベ
クター、好しくは操作の便宜上大腸菌−酵母シヤトルベ
クターに挿入する。
次に、このベクター中のGAP−DH遺伝子のＣ末端近くに
ある制限酵素Sal I切断部位に、読みわく（reading fra
me）が合うように、予じめ得ている目的ペプチド遺伝子
を含む断片を挿入する。このようにして得たGAP−DH遺
伝子および目的ペプチド遺伝子を含むプラスミドにより
酵母を形質転換する。
ある制限酵素Sal I切断部位に、読みわく（reading fra
me）が合うように、予じめ得ている目的ペプチド遺伝子
を含む断片を挿入する。このようにして得たGAP−DH遺
伝子および目的ペプチド遺伝子を含むプラスミドにより
酵母を形質転換する。
目的ペプチド遺伝子としては外来性異種ペプチド遺伝子
および酵母内のGAP−DH遺伝子以外のペプチド遺伝子
（同種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする。
および酵母内のGAP−DH遺伝子以外のペプチド遺伝子
（同種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする。
このように形質転換された酵母において、GAP−DH遺伝
子プロモーターが目的ペプチド遺伝子の発現に非常に優
れていることが認められた。
子プロモーターが目的ペプチド遺伝子の発現に非常に優
れていることが認められた。
又、目的ペプチドの酵母における生産性は、GAP−DH遺
伝子の３′末端非翻訳領域をプラスミド中の目的ペプチ
ド遺伝子の下流に付加することによつて著しく上昇する
ことが認められている。この３′末端非翻訳領域の付加
による効果については特許昭56−167615号に詳細に説明
されている。
伝子の３′末端非翻訳領域をプラスミド中の目的ペプチ
ド遺伝子の下流に付加することによつて著しく上昇する
ことが認められている。この３′末端非翻訳領域の付加
による効果については特許昭56−167615号に詳細に説明
されている。
上記のような３′末端非翻訳領域を利用する方法および
この領域も挿入されているプラスミドおよびその利用も
本発明の範囲に含むものとする。
この領域も挿入されているプラスミドおよびその利用も
本発明の範囲に含むものとする。
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。
具体的実施例では、目的ペプチド遺伝子としてアルフア
ネオエンドルフイン（αNE）遺伝子を用い、GAP−DHプ
ロモーター−GAP−DH構造遺伝子−αNE遺伝子（PGAP−G
AP−αNEと略）およびPGAP−GAP−αNE−３′GAP（GAP
−DH遺伝子の３′未非翻訳領域を附加したもの）のよう
な配列から、GAP−αNE雑種蛋白質として目的物質（αN
E）を生産する方法を記しているが、GAP−DHプロモータ
ーの位置から適当な塩基配列をおいて目的遺伝子、例え
ばインターフエロンのようなペプチドをコードする遺伝
子を附加し目的ペプチドを直接生産させることもでき
る。このようにGAP−DHプロモーターは広く外来遺伝子
の発現並びにアルフアネオエンドルフイン以外の異種お
よび同種ペプチドの生産に活用されうるものである。
ネオエンドルフイン（αNE）遺伝子を用い、GAP−DHプ
ロモーター−GAP−DH構造遺伝子−αNE遺伝子（PGAP−G
AP−αNEと略）およびPGAP−GAP−αNE−３′GAP（GAP
−DH遺伝子の３′未非翻訳領域を附加したもの）のよう
な配列から、GAP−αNE雑種蛋白質として目的物質（αN
E）を生産する方法を記しているが、GAP−DHプロモータ
ーの位置から適当な塩基配列をおいて目的遺伝子、例え
ばインターフエロンのようなペプチドをコードする遺伝
子を附加し目的ペプチドを直接生産させることもでき
る。このようにGAP−DHプロモーターは広く外来遺伝子
の発現並びにアルフアネオエンドルフイン以外の異種お
よび同種ペプチドの生産に活用されうるものである。
実施例 1.GAP−DH遺伝子のクローニング（第１図参照） サツカロマイセス酵母XS16−5C〔cir0〕（Saccharomyce
s cerevisiae XS16−5CMATa leu2 his3 tryp1〔sir0〕
を１のYPD培地（１％酵母エキス、２％ポリペプト
ン、２％グルコース）で30℃、24時間培養し、得られた
菌体をクライヤー（Cryer）らの方法（Cryer etal,Isol
ation of yeast DNA,Methods in Cell Biology,vol.12,
Academic Press,NewYork,1975,pp 39−44）に従つて総
DNAを分離した。
s cerevisiae XS16−5CMATa leu2 his3 tryp1〔sir0〕
を１のYPD培地（１％酵母エキス、２％ポリペプト
ン、２％グルコース）で30℃、24時間培養し、得られた
菌体をクライヤー（Cryer）らの方法（Cryer etal,Isol
ation of yeast DNA,Methods in Cell Biology,vol.12,
Academic Press,NewYork,1975,pp 39−44）に従つて総
DNAを分離した。
50μｇの酵母DNAを100単位のHind IIIを用いて37℃で２
時間加温することにより切断した。反応液を0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、1.9kb〜2.2kbに相当
するHind IIIによるDNA断片を分離精製した。一方、0.5
μｇのPBR322をHind III 1単位を用いてTA緩衝液（33mM
トリス酢酸、pH7.9、66mM酢酸カリ、10mM酢酸マグネシ
ウム、0.5mMDTT）中で37℃で１時間反応させることによ
り切断した。次にこれら両DNAをT4DNAリガーゼ用緩衝液
（20mMトリス塩酸、pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、
0.5mM ATP）に溶解し、２単位のT4DNAリガーゼを加
え、15℃で18時間反応させた。この反応液10μを0.3m
lのCaCl2で処理したE.coli JA221に加えて形質転換
し、アンピシリン耐性クローンを得た。このうちテトラ
サイクリンに対して感受性のあるクローンを400個選
び、そのプラスミドDNAの解析をアルカリ変性法により
行つた。
時間加温することにより切断した。反応液を0.8％アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、1.9kb〜2.2kbに相当
するHind IIIによるDNA断片を分離精製した。一方、0.5
μｇのPBR322をHind III 1単位を用いてTA緩衝液（33mM
トリス酢酸、pH7.9、66mM酢酸カリ、10mM酢酸マグネシ
ウム、0.5mMDTT）中で37℃で１時間反応させることによ
り切断した。次にこれら両DNAをT4DNAリガーゼ用緩衝液
（20mMトリス塩酸、pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、
0.5mM ATP）に溶解し、２単位のT4DNAリガーゼを加
え、15℃で18時間反応させた。この反応液10μを0.3m
lのCaCl2で処理したE.coli JA221に加えて形質転換
し、アンピシリン耐性クローンを得た。このうちテトラ
サイクリンに対して感受性のあるクローンを400個選
び、そのプラスミドDNAの解析をアルカリ変性法により
行つた。
既に報告されているホランド等の解析結果によると、GA
P−DH遺伝子を含む2.1kbの断片にはHpa IおよびSal Iの
切断部位がそれぞれ１ケ所ある。2.1kbのHind III断片
はSal Iにより0.14kbと1.96kbとの２つの断片に切断さ
れ、またHpa Iにより1.39kbと0.71kbとの２つの断片に
それぞれ切断されている。
P−DH遺伝子を含む2.1kbの断片にはHpa IおよびSal Iの
切断部位がそれぞれ１ケ所ある。2.1kbのHind III断片
はSal Iにより0.14kbと1.96kbとの２つの断片に切断さ
れ、またHpa Iにより1.39kbと0.71kbとの２つの断片に
それぞれ切断されている。
発明者らは上記の400個のクローンについて検討した結
果、上記GAP−DH遺伝子を含む断片におけるのと同じ制
限酵素切断部位を有するプラスミドを持つクローンが１
つ得られたことが判つた。このクローンのプラスミドを
PYgap87とした。
果、上記GAP−DH遺伝子を含む断片におけるのと同じ制
限酵素切断部位を有するプラスミドを持つクローンが１
つ得られたことが判つた。このクローンのプラスミドを
PYgap87とした。
このPYgap87のSal I切断部位に近い方のHind III切断に
よつて得られる粘着末端にγ−〔32P〕−ATPおよびポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、Maxam−Gilbert
法に従いDNAの塩基配列を決定した。この結果を前記ホ
スランドらの報告と比較検討し、PYgap87はGAP−DH遺伝
子を持つことを確認した。このPYgap87によつて形質転
換された大腸菌Ｋ−12株はE.coli SBM151と命名し、工
業技術院微生物工業研究所（微工研）に寄託し、寄託番
号FERMP−6762（ブタペスト条約に基く国際寄託の受託
番号 FERM BP−382）を得ている。
よつて得られる粘着末端にγ−〔32P〕−ATPおよびポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、Maxam−Gilbert
法に従いDNAの塩基配列を決定した。この結果を前記ホ
スランドらの報告と比較検討し、PYgap87はGAP−DH遺伝
子を持つことを確認した。このPYgap87によつて形質転
換された大腸菌Ｋ−12株はE.coli SBM151と命名し、工
業技術院微生物工業研究所（微工研）に寄託し、寄託番
号FERMP−6762（ブタペスト条約に基く国際寄託の受託
番号 FERM BP−382）を得ている。
2.PYE237プラスミドベクターの作製P YE237ベクターは特願昭56−167615号に開示されたPYE2
27ベクターからそのSal I切断点を消失させたプラスミ
ドであり、次のように作製された。
27ベクターからそのSal I切断点を消失させたプラスミ
ドであり、次のように作製された。
５μｇのPYE227を10単位のSal Iを用いTA緩衝液中で37
℃1.5時間反応させ切断した。
℃1.5時間反応させ切断した。
続いて65℃で加熱することによりSal Iを失活させた
後、４種のdNTPを0.3mM;2−メルカプトエタノールを8mM
となる様に加え１単位のT4DNAポリメラーゼを用いて37
℃30分間反応させ、Sal I切断で生じた粘着末端を消失
させた。反応終了後フエノール抽出を１回行つた後、２
容のエタノールでDNAを沈殿させた。DNA沈殿物を20μ
のT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解後、５単位のT4DNAリガー
ゼを用い15℃18時間反応させることにより結合させた。
後、４種のdNTPを0.3mM;2−メルカプトエタノールを8mM
となる様に加え１単位のT4DNAポリメラーゼを用いて37
℃30分間反応させ、Sal I切断で生じた粘着末端を消失
させた。反応終了後フエノール抽出を１回行つた後、２
容のエタノールでDNAを沈殿させた。DNA沈殿物を20μ
のT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解後、５単位のT4DNAリガー
ゼを用い15℃18時間反応させることにより結合させた。
反応液を供与DNAとして常法に従いE.coli JA221に形質
転換し、アンピミリン耐性クローンを得た。これらのク
ローンよりDNAを分離し解析し、PYE227よりSal Iの切断
部位の消失したPYE237を得た。
転換し、アンピミリン耐性クローンを得た。これらのク
ローンよりDNAを分離し解析し、PYE227よりSal Iの切断
部位の消失したPYE237を得た。
3.PYE1201酵母−大腸菌シヤトルベターの作製（第２図
参照） ５μｇのPYE237を20単位のHind IIIを用い、TA緩衝液中
で37℃１時間反応させた。以後制限酵素の反応はTA緩衝
液中で37℃１時間反応させた。一方既に得られていたプ
ラスミドPYgap87 ５μｇを20単位のHind IIIを用い切
断後、寒天電気泳動法により2.1kbのDNAフラグメント
（GAP−DH遺伝子）を分離し寒天片よりDNAを溶出、精製
した。この2.1kb DNA断片とPYE237のHind III切断DNAを
20μDNAリガーゼ用緩衝液に溶解し、１単位のT4DNAリ
ガーゼを加え15℃16時間反応させた。この反応液10μ
を0.3mlのCaCl2処理した。E.coli JA221に加え形質転換
を行つた。
参照） ５μｇのPYE237を20単位のHind IIIを用い、TA緩衝液中
で37℃１時間反応させた。以後制限酵素の反応はTA緩衝
液中で37℃１時間反応させた。一方既に得られていたプ
ラスミドPYgap87 ５μｇを20単位のHind IIIを用い切
断後、寒天電気泳動法により2.1kbのDNAフラグメント
（GAP−DH遺伝子）を分離し寒天片よりDNAを溶出、精製
した。この2.1kb DNA断片とPYE237のHind III切断DNAを
20μDNAリガーゼ用緩衝液に溶解し、１単位のT4DNAリ
ガーゼを加え15℃16時間反応させた。この反応液10μ
を0.3mlのCaCl2処理した。E.coli JA221に加え形質転換
を行つた。
アンピシリン耐性トランスホーマントから、常法に従い
プラスミドDNAを分離解析し、PYE1201を得たことを確認
した。
プラスミドDNAを分離解析し、PYE1201を得たことを確認
した。
このプラスミドによつて形質転換された酵母（XS16−5
C）株はSaccharomyces cerevisiae SBM321と命名し、微
工研に寄託番号FERM P−6766（ブタペスト条約に基く国
際寄託の受託番号 FERM BP−381）として寄託した。
C）株はSaccharomyces cerevisiae SBM321と命名し、微
工研に寄託番号FERM P−6766（ブタペスト条約に基く国
際寄託の受託番号 FERM BP−381）として寄託した。
4.αNE遺伝子を含むプラスミドDNA（ＰαNE5′−Sal I
−ｃ）の作製 Neucleic Acid Research 101741〜1754（1982）の方法
に従いαNE遺伝子（Eco RI−Bam HI DNA断片）を作製し
た。
−ｃ）の作製 Neucleic Acid Research 101741〜1754（1982）の方法
に従いαNE遺伝子（Eco RI−Bam HI DNA断片）を作製し
た。
この様にして得られた46塩基対より成るαNE遺伝子をPB
R322のEco RI・Bam HI両制限酵素で切断した大きい方の
断片（4kb）に挿入しPYαNE5′を得た。次にGAP−DH遺
伝子中にあるSal I部位に読み枠を合せ、挿入する為
に、５′−GGGTCGACCC−３′よりなるSal Iリンカーを
挿入したプラスミドPYαNE5′（Sal I）−ｃを得た。５
μｇのPYαNE5′を10単位のEcoRIを用いTA緩衝液中で37
℃１時間加温することにより切断した。65℃で加熱後、
0.3mMのdATP,dTTP及び8mMの２−メルカプトエタノール
となる様にそれぞれ加え、37℃30min反応させEcoRIの粘
着末端を満した。反応終了後フエノール抽出を１回行つ
てからエタノール沈殿によりDNAを回収した。一方、Sal
Iリンカー１μｇを50mMトリス塩酸、pH7.5、10mM Mg C
l2中で25nmolのATP,10単位のポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて37℃,45分間反応させ、５′末端をリン酸化し
た。これらのDNAを混合し、T4DNAリガーゼ緩衝液とし５
単位のT4DNAリガーゼを加え15℃で18時間反応させた。
この反応液10μを0.3mlのCaCl2処理したE.coli JA221
に加え形質転換を行つた。アンピシリン耐性形質転換体
から常法に従いプラスミドDNAを分離解析し、PYαNE5′
−Sal I−ｃを得た。
R322のEco RI・Bam HI両制限酵素で切断した大きい方の
断片（4kb）に挿入しPYαNE5′を得た。次にGAP−DH遺
伝子中にあるSal I部位に読み枠を合せ、挿入する為
に、５′−GGGTCGACCC−３′よりなるSal Iリンカーを
挿入したプラスミドPYαNE5′（Sal I）−ｃを得た。５
μｇのPYαNE5′を10単位のEcoRIを用いTA緩衝液中で37
℃１時間加温することにより切断した。65℃で加熱後、
0.3mMのdATP,dTTP及び8mMの２−メルカプトエタノール
となる様にそれぞれ加え、37℃30min反応させEcoRIの粘
着末端を満した。反応終了後フエノール抽出を１回行つ
てからエタノール沈殿によりDNAを回収した。一方、Sal
Iリンカー１μｇを50mMトリス塩酸、pH7.5、10mM Mg C
l2中で25nmolのATP,10単位のポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて37℃,45分間反応させ、５′末端をリン酸化し
た。これらのDNAを混合し、T4DNAリガーゼ緩衝液とし５
単位のT4DNAリガーゼを加え15℃で18時間反応させた。
この反応液10μを0.3mlのCaCl2処理したE.coli JA221
に加え形質転換を行つた。アンピシリン耐性形質転換体
から常法に従いプラスミドDNAを分離解析し、PYαNE5′
−Sal I−ｃを得た。
5.アルフアネオエンドルフイン（αNE）遺伝子の挿入
（第２図参照） ５μｇのPYE1201を20単位のBamHI,20単位のSal Iで２つ
の断片に切断し寒天電気泳動にて分離後、大きい断片を
寒天より溶出させ精製した。一方αNE遺伝子を含む断片
はＰαNE5′−Sal I−c50μｇを100単位のBam HI,100単
位のSal Iを用いて切断後、５％ポリアクリルアミドゲ
ルによる電気泳動法により分離し50塩基対に相当するDN
A断片を溶出・精製して得た。以上の２つのDNA断片を20
μのDNAリガーゼ緩衝液に溶解し２単位のT4DNAリガー
ゼを加え、15℃16時間反応させた。この反応液10μを
0.3mlのCaCl2処理したE.coli JA221に加え形質転換を行
い、アンピシリン耐性形質転換体から常法に従いプラス
ミドDNAを分離解析しPYαNE53を得た。
（第２図参照） ５μｇのPYE1201を20単位のBamHI,20単位のSal Iで２つ
の断片に切断し寒天電気泳動にて分離後、大きい断片を
寒天より溶出させ精製した。一方αNE遺伝子を含む断片
はＰαNE5′−Sal I−c50μｇを100単位のBam HI,100単
位のSal Iを用いて切断後、５％ポリアクリルアミドゲ
ルによる電気泳動法により分離し50塩基対に相当するDN
A断片を溶出・精製して得た。以上の２つのDNA断片を20
μのDNAリガーゼ緩衝液に溶解し２単位のT4DNAリガー
ゼを加え、15℃16時間反応させた。この反応液10μを
0.3mlのCaCl2処理したE.coli JA221に加え形質転換を行
い、アンピシリン耐性形質転換体から常法に従いプラス
ミドDNAを分離解析しPYαNE53を得た。
6.GAP−DH遺伝子３′末端領域のPYαNE53への付加（第
３図参照）P YαNE53にGAP−DH遺伝子の３′末端領域を組込まれた
αNE遺伝子の下流に付加する具体例を以下に示す。
３図参照）P YαNE53にGAP−DH遺伝子の３′末端領域を組込まれた
αNE遺伝子の下流に付加する具体例を以下に示す。
10μｇのPYαNE53を30単位のBam HIで切断後、１単位の
T4DNAポリメラーゼを用い、67mMトリス塩酸（pH8.8）、
6.7mM MgCl2、10mM2−ルカプトエタノール16.6mM硫酸ア
ンモン、6.7μM EDTA、0.3mMの４種のdNTPを含む緩衝液
（T4DNAポリメラーゼ緩衝液）中37℃30分間反応させ、B
am HI切断で生じた粘着末端をうめた。一方GAP−DH遺伝
子の３′末端領域をPYE1201より得た10μｇのPYE1201を
30単位のSal Iで切断後、１単位のT4DNAポリメラーゼを
用い同緩衝液中で37℃30分間反応させ、Sal I切断で生
じた粘着末端をうめた。次にそれぞれ30単位のPst Iで
切断し、PYαNE53からはαNE遺伝子を含む断片、PYE120
1からはGAP−DH遺伝子の３′末端領域を含む断片をアガ
ロース電気泳動で分離し精製した。次に両断片を20μ
のT4DNAリガーゼ緩衝液中５単位のT4DNAリガーゼを用い
て15℃17時間反応させ結合させた。この反応液10μを
用い上記の方法で形質転換体を得、それよりプラスミド
DNAを分離・解析しPYαNE155を得たことを確認した。
T4DNAポリメラーゼを用い、67mMトリス塩酸（pH8.8）、
6.7mM MgCl2、10mM2−ルカプトエタノール16.6mM硫酸ア
ンモン、6.7μM EDTA、0.3mMの４種のdNTPを含む緩衝液
（T4DNAポリメラーゼ緩衝液）中37℃30分間反応させ、B
am HI切断で生じた粘着末端をうめた。一方GAP−DH遺伝
子の３′末端領域をPYE1201より得た10μｇのPYE1201を
30単位のSal Iで切断後、１単位のT4DNAポリメラーゼを
用い同緩衝液中で37℃30分間反応させ、Sal I切断で生
じた粘着末端をうめた。次にそれぞれ30単位のPst Iで
切断し、PYαNE53からはαNE遺伝子を含む断片、PYE120
1からはGAP−DH遺伝子の３′末端領域を含む断片をアガ
ロース電気泳動で分離し精製した。次に両断片を20μ
のT4DNAリガーゼ緩衝液中５単位のT4DNAリガーゼを用い
て15℃17時間反応させ結合させた。この反応液10μを
用い上記の方法で形質転換体を得、それよりプラスミド
DNAを分離・解析しPYαNE155を得たことを確認した。
7.酵母の形質転換および培養 上記のようにして得られたプラスミドPYE1201PYαNE5
3、PYαNE155をBeggs J.D.,Nature,vol.275104（1978）
に記載の方法に従つて酵母（サツカロマイセス セレビ
ジエXS16−5C）に形質転換した。得られた形質に転換体
をYPD（１％イーストエキス,2％ポリペプトン,2％グル
コース）培地で30℃、24時間振とう培養後、遠心分離に
より菌体を回収した。1mlの培養液から得られた菌体に
0.5mlの冷アセトンを加え、−20℃で１〜24時間放置し
た後、凍結乾燥した。この乾燥菌体に5mg/mlの臭化シア
ンを含む70％ギ酸溶液に懸濁し24時間暗所で反応させ
た。この試料を凍結乾燥後0.1mlの0.1N酢酸でαNEを溶
出させ0.1mlの1.3Mトリス塩酸（pH8.0）で中和後RIAの
試料とした。RIAはN.Minamino et al,BBRC Vol.102 226
（1981）に記さいの方法に準じて行つた。その結果を表
１に示した。GAP−DHプロモーターを利用しそのＮ末端
（323アミノ酸残基）の直後にαNEを結合した雑種蛋白
質として、PYαNE53の場合（GAP−DH遺伝子の３′末端
領域が無い）では１細胞当り200万分子発現していた。
3、PYαNE155をBeggs J.D.,Nature,vol.275104（1978）
に記載の方法に従つて酵母（サツカロマイセス セレビ
ジエXS16−5C）に形質転換した。得られた形質に転換体
をYPD（１％イーストエキス,2％ポリペプトン,2％グル
コース）培地で30℃、24時間振とう培養後、遠心分離に
より菌体を回収した。1mlの培養液から得られた菌体に
0.5mlの冷アセトンを加え、−20℃で１〜24時間放置し
た後、凍結乾燥した。この乾燥菌体に5mg/mlの臭化シア
ンを含む70％ギ酸溶液に懸濁し24時間暗所で反応させ
た。この試料を凍結乾燥後0.1mlの0.1N酢酸でαNEを溶
出させ0.1mlの1.3Mトリス塩酸（pH8.0）で中和後RIAの
試料とした。RIAはN.Minamino et al,BBRC Vol.102 226
（1981）に記さいの方法に準じて行つた。その結果を表
１に示した。GAP−DHプロモーターを利用しそのＮ末端
（323アミノ酸残基）の直後にαNEを結合した雑種蛋白
質として、PYαNE53の場合（GAP−DH遺伝子の３′末端
領域が無い）では１細胞当り200万分子発現していた。
さらに、本発明者らは、本発明におけるプロモーター領
域の改変実験において、GAP−DH構造遺伝子の開始コド
ンの５′側上流約300塩基対および480縁基対をプロモー
ター領域として用いた場合のα−ネオエンドルフィンの
生産量は、いずれもGAP−DH構造遺伝子の開始コドンの
５′側上流約900塩基対をプロモーター領域として用い
た場合の生産量より、約10分の１に低下していることを
確認した。
域の改変実験において、GAP−DH構造遺伝子の開始コド
ンの５′側上流約300塩基対および480縁基対をプロモー
ター領域として用いた場合のα−ネオエンドルフィンの
生産量は、いずれもGAP−DH構造遺伝子の開始コドンの
５′側上流約900塩基対をプロモーター領域として用い
た場合の生産量より、約10分の１に低下していることを
確認した。
また、前記のPYαNE53にGAP−DH遺伝子の３′末端領域
を付加したもの（PYαNE155）ついては−PYαNE53の約1
0倍に相当する１細胞当り2000万分子発現していた。培
養液当りでは約２μg/mlの生産が認められた。プラスミ
ドの安定性について検討したところ10世代非選択条件
（YPD培地で培養）で培養したところ、完全なGAP−DHを
持つプラスミドPYE1201の場合は10〜20％とかなり不安
定であつた。しかしαNE遺伝子をＣ末端付近に結合させ
たプラスミド（PYαNE53,PYαNE155）の場合は多少安定
性は良くなつていた。
を付加したもの（PYαNE155）ついては−PYαNE53の約1
0倍に相当する１細胞当り2000万分子発現していた。培
養液当りでは約２μg/mlの生産が認められた。プラスミ
ドの安定性について検討したところ10世代非選択条件
（YPD培地で培養）で培養したところ、完全なGAP−DHを
持つプラスミドPYE1201の場合は10〜20％とかなり不安
定であつた。しかしαNE遺伝子をＣ末端付近に結合させ
たプラスミド（PYαNE53,PYαNE155）の場合は多少安定
性は良くなつていた。
【図面の簡単な説明】 第１図〜第３図はGAP−DH遺伝子を含みαNE遺伝子を組
込んだプラスミドの構成法を示す。 第１図はGAP−DH遺伝子のクローニングを示す。 第２図はGAP−DH遺伝子を含みαNE遺伝子を組込んだプ
ラスミドの構成法を示す。 第３図は第２図で得られたプラスミドPYαNE53上のαNE
遺伝子の下流にGAP−DH遺伝子の３′末端非翻訳部位が
付加されたプラスミドの構成法を示す。 第４図は第１図において遺伝子ライブラリーからHind I
IIで切出したDNA断片の制限酵素切断地図を示す図であ
る。
込んだプラスミドの構成法を示す。 第１図はGAP−DH遺伝子のクローニングを示す。 第２図はGAP−DH遺伝子を含みαNE遺伝子を組込んだプ
ラスミドの構成法を示す。 第３図は第２図で得られたプラスミドPYαNE53上のαNE
遺伝子の下流にGAP−DH遺伝子の３′末端非翻訳部位が
付加されたプラスミドの構成法を示す。 第４図は第１図において遺伝子ライブラリーからHind I
IIで切出したDNA断片の制限酵素切断地図を示す図であ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】FERM BP−382として寄託されている大腸菌
に挿入されているプラスミドに組み込まれているグリセ
ロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ構造
遺伝子の開始コドンから５′側上流の少くとも900塩基
対からなる非翻訳領域をプロモーター領域として用い
て、異種の目的ペプチドを生産する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184291A JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
| EP83110471A EP0109559A1 (en) | 1982-10-20 | 1983-10-20 | High-efficiency yeast vector plasmid and method of its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184291A JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6092062A Division JP2625379B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 酵母の高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974986A JPS5974986A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0716432B2 true JPH0716432B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=16150753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57184291A Expired - Lifetime JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0109559A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0716432B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
| JPS60248181A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Shiseido Co Ltd | 酵母発現ベクタ− |
| JPS6156078A (ja) * | 1984-07-27 | 1986-03-20 | Suntory Ltd | 酵母を宿主とする分泌発現ベクタ− |
| JPS61141890A (ja) * | 1984-12-15 | 1986-06-28 | Suntory Ltd | アルコ−ルの製造法 |
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| JP2608540B2 (ja) * | 1982-05-19 | 1997-05-07 | ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ | クルイベロミセス種のためのクローニング系 |
-
1982
- 1982-10-20 JP JP57184291A patent/JPH0716432B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-10-20 EP EP83110471A patent/EP0109559A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5974986A (ja) | 1984-04-27 |
| EP0109559A1 (en) | 1984-05-30 |
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