JPS60248181A - 酵母発現ベクタ− - Google Patents
酵母発現ベクタ−Info
- Publication number
- JPS60248181A JPS60248181A JP59102685A JP10268584A JPS60248181A JP S60248181 A JPS60248181 A JP S60248181A JP 59102685 A JP59102685 A JP 59102685A JP 10268584 A JP10268584 A JP 10268584A JP S60248181 A JPS60248181 A JP S60248181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- gene
- expression vector
- upstream
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、分子生物学の分野に関し、更に詳し、くは異
種遺伝子のcDNAなとの任意のポリペプチドをコード
する遺伝子を酵母内で、ガラクトースの誘導により発現
させる夕めに好適なプラスミド・−、ククーに関する。
種遺伝子のcDNAなとの任意のポリペプチドをコード
する遺伝子を酵母内で、ガラクトースの誘導により発現
させる夕めに好適なプラスミド・−、ククーに関する。
従来の技術
近年、組み換えDNA技術の発達はめざましく、特に大
腸菌プラスミドによる遺伝子増幅は分子生物学の飛躍的
進歩の原因となっている。しかし、外来DNA遺伝子の
発現、つまり蛋白質の生産に関する技術についての実施
例は比較的少ない。やはり、大腸菌の宿主−ベクター系
で発現ベクターの技術は最も進歩しており、大腸菌由来
のアミノ酸配列を含まない外来遺伝子由来の蛋白質の生
産方法が開発されている。
腸菌プラスミドによる遺伝子増幅は分子生物学の飛躍的
進歩の原因となっている。しかし、外来DNA遺伝子の
発現、つまり蛋白質の生産に関する技術についての実施
例は比較的少ない。やはり、大腸菌の宿主−ベクター系
で発現ベクターの技術は最も進歩しており、大腸菌由来
のアミノ酸配列を含まない外来遺伝子由来の蛋白質の生
産方法が開発されている。
ところが、大腸菌自体は人体に対して充分安全とは言え
ず、実際に外来遺伝子由来の蛋白質を人体に適用するた
めには、リビソドAなどの大腸菌由来の人体発熱因子を
充分除去しなければならないという欠点をもっている。
ず、実際に外来遺伝子由来の蛋白質を人体に適用するた
めには、リビソドAなどの大腸菌由来の人体発熱因子を
充分除去しなければならないという欠点をもっている。
このため、人体安全性の高い発現ベクター系の開発が望
まれており、その条件を満たすことができる系が、酵母
発現ベクター系である。つまり、サツカロミセス・セレ
ビシェ(Saccharoo+ycescerevis
iae)に代表される酵母は、高度に発達した遺伝系統
を持っており、実際に外来遺伝子由来の蛋白質の生産に
有利な大量培養技術が古くから蓄積されているという特
徴を有し、しかも、酵母菌自体は、人体に対し特に有害
な物質の生産は行なっておらず、乾燥酵母は日本薬局方
に記載されているほどである。
まれており、その条件を満たすことができる系が、酵母
発現ベクター系である。つまり、サツカロミセス・セレ
ビシェ(Saccharoo+ycescerevis
iae)に代表される酵母は、高度に発達した遺伝系統
を持っており、実際に外来遺伝子由来の蛋白質の生産に
有利な大量培養技術が古くから蓄積されているという特
徴を有し、しかも、酵母菌自体は、人体に対し特に有害
な物質の生産は行なっておらず、乾燥酵母は日本薬局方
に記載されているほどである。
最近、以上の目的のためにいくつかの酵母発現ベクター
系、例えば、TRPI ()リプトファン合成系の蛋白
質をコードする遺伝子)、GAP−DH(グリセルアル
デヒド3リン酸 デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
) 、PGK (3−フォスフォグリセレート キナー
ゼをコードする遺伝子)などのプロモーター領域に外来
遺伝子をつないだものなどが開発されている。しかし、
これら発現ベクター系では、発現が構成的なために酵母
の成育に有害な物質をコードする外来遺伝子の発現はむ
ずかしいという欠点を持っていた。
系、例えば、TRPI ()リプトファン合成系の蛋白
質をコードする遺伝子)、GAP−DH(グリセルアル
デヒド3リン酸 デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
) 、PGK (3−フォスフォグリセレート キナー
ゼをコードする遺伝子)などのプロモーター領域に外来
遺伝子をつないだものなどが開発されている。しかし、
これら発現ベクター系では、発現が構成的なために酵母
の成育に有害な物質をコードする外来遺伝子の発現はむ
ずかしいという欠点を持っていた。
発明の目的
従って、本発明の目的は、酵母の生育時には、外来遺伝
子由来の蛋白質を全く生産せず、大量培養した後、外来
遺伝子由来の蛋白質を生産することができる酵母発現ベ
クター系を開発することにある。
子由来の蛋白質を全く生産せず、大量培養した後、外来
遺伝子由来の蛋白質を生産することができる酵母発現ベ
クター系を開発することにある。
発明の目的を解決するための手段とその作用及び効果
本発明者らは前記目的を達成すべく鋭意研究を進めた結
果、酵母GAL7 (ガラクトース1リン酸ウリジルト
ランスフエラーゼをコードする遺伝子)プロモーター及
びその上流に存在する調節領域を発現ベクターのプロモ
ータ一部分に使用すれば、上記目的を達成し、非常に好
適な発現ベクターが得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
果、酵母GAL7 (ガラクトース1リン酸ウリジルト
ランスフエラーゼをコードする遺伝子)プロモーター及
びその上流に存在する調節領域を発現ベクターのプロモ
ータ一部分に使用すれば、上記目的を達成し、非常に好
適な発現ベクターが得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
即ち、本発明に従えば、プロモーター領域上流に、5’
−GCGCTCGG−3’ ((、:シトシン、Gニゲ
アニン、T:チミン)(上流調節領域)の塩基配列を含
む酵母発現ベクターが提供される。
−GCGCTCGG−3’ ((、:シトシン、Gニゲ
アニン、T:チミン)(上流調節領域)の塩基配列を含
む酵母発現ベクターが提供される。
この酵母発現ベクターは、炭素源として、ガラクトース
を培養液に添加した場合に外来遺伝子由来の蛋白質を生
産することができる。本発明に従えば、また前記発現ベ
クターを持つ酵母、及びそれらを活用した外来遺伝子由
来のポリペプチドの生産方法が提供される。
を培養液に添加した場合に外来遺伝子由来の蛋白質を生
産することができる。本発明に従えば、また前記発現ベ
クターを持つ酵母、及びそれらを活用した外来遺伝子由
来のポリペプチドの生産方法が提供される。
□、本発明に係る酵母発現ベクターば、酵母の複製\
源□、酵母の選択マーカー、およびG’AL?プロモー
ター並びに上流調節領域により構成される。本発明に係
る酵母発現ベクターは、例えば大腸菌などの他生物プラ
スミドの複製源及び選択マーカーを持つのが好ましい。
ター並びに上流調節領域により構成される。本発明に係
る酵母発現ベクターは、例えば大腸菌などの他生物プラ
スミドの複製源及び選択マーカーを持つのが好ましい。
即ち、大腸菌−酵母のシャトルベクターとすることによ
り、遺伝子増幅を大腸菌などで行らことが可能となる訳
である。
り、遺伝子増幅を大腸菌などで行らことが可能となる訳
である。
酵母の複製源としては、一般に使用されているYEp系
プラスミド(2μプラスミドの複製源を持つ)、YRp
系プラスミド(酵母染色体DNAから得られる自己複製
配列−AR3−を持つ)、YCp系プラスミド(AR3
に加えて、酵母染色体DNAから得られた動原体−セン
トロメアーのDNAを持つ)のいずれも好適に使用でき
る。外来遺伝子由来の蛋白質を大量に生産する目的のた
めには、細胞あたりのコピー数が数十であるYEp系プ
ラスミドが好ましい。
プラスミド(2μプラスミドの複製源を持つ)、YRp
系プラスミド(酵母染色体DNAから得られる自己複製
配列−AR3−を持つ)、YCp系プラスミド(AR3
に加えて、酵母染色体DNAから得られた動原体−セン
トロメアーのDNAを持つ)のいずれも好適に使用でき
る。外来遺伝子由来の蛋白質を大量に生産する目的のた
めには、細胞あたりのコピー数が数十であるYEp系プ
ラスミドが好ましい。
また、酵母の選択マーカーとしては、クローニングされ
た遺伝子であれば何でも良(,5例えば汎用されている
ものでは、TR,PL、LEU2、URA3、HIS3
などがあげられる。
た遺伝子であれば何でも良(,5例えば汎用されている
ものでは、TR,PL、LEU2、URA3、HIS3
などがあげられる。
本発明の根幹となるGAL7プロモーター並びに上流調
節領域は、転写開始点(禾ら、Nucleic^cid
s Re5earchl ’1巻8555〜8568頁
、1983年参照)より上流少なくとも241塩基対を
含むDNA塩基配列である。第1図にGAL7遺伝子の
5領域の塩基配列を示した。GAL7遺伝子の転写開始
点を1番として下流を正の整数で、上流を負の整数で塩
基配列をナンバー付けした。+23からのATGが翻訳
開始点である。また、塩基配列はノンコーディングスト
ランド(mRNAの鋳型とならないDNA鎖)のみを示
しており、実際のDNAは相補鎖を持つ2本鎮DNAで
ある。
節領域は、転写開始点(禾ら、Nucleic^cid
s Re5earchl ’1巻8555〜8568頁
、1983年参照)より上流少なくとも241塩基対を
含むDNA塩基配列である。第1図にGAL7遺伝子の
5領域の塩基配列を示した。GAL7遺伝子の転写開始
点を1番として下流を正の整数で、上流を負の整数で塩
基配列をナンバー付けした。+23からのATGが翻訳
開始点である。また、塩基配列はノンコーディングスト
ランド(mRNAの鋳型とならないDNA鎖)のみを示
しており、実際のDNAは相補鎖を持つ2本鎮DNAで
ある。
前記塩基配列のうち、本発明に必須の塩基配列は、プロ
モーターとして一63位5 ’ −TATAAA−3’
(TATAボックス)(T:チミン、A:アデニン)
と正の調゛節遺伝GAL4蛋白質のの結合部位と考えら
れる一180位5 ’ −GCOCTCGG−3’ (
上流調節領域)で示される塩基配列である。この2つの
特徴的なりNA配列が遺伝子上に並ぶとTATAボック
スからの転写が調節遺伝子により制御される。つまり、
例えばブドウ糖、ショ糖などのガラクトース以外の物質
を炭素源として、酵母を生育させたときには、この遺伝
子の転写は行なわれず、ガラクトースが存在すると転写
は行なわれる。
モーターとして一63位5 ’ −TATAAA−3’
(TATAボックス)(T:チミン、A:アデニン)
と正の調゛節遺伝GAL4蛋白質のの結合部位と考えら
れる一180位5 ’ −GCOCTCGG−3’ (
上流調節領域)で示される塩基配列である。この2つの
特徴的なりNA配列が遺伝子上に並ぶとTATAボック
スからの転写が調節遺伝子により制御される。つまり、
例えばブドウ糖、ショ糖などのガラクトース以外の物質
を炭素源として、酵母を生育させたときには、この遺伝
子の転写は行なわれず、ガラクトースが存在すると転写
は行なわれる。
上記の根幹となるDNA塩基配列、つまり、TATAボ
ックスと上流調節領域は、酵母GAL7遺伝子を酵母染
色体DNAからショットガン法によりクローニングして
得ることもできるし、DNA合成機などにより化学合成
して得ることもできる。いずれの方法によっても得られ
たDNA塩基配列は、化学分解法(Methods i
n Enzymology 65巻499−580頁、
1980年)または、ジデオキシヌクレオチド酵素法(
Methods in Enzymology 101
’1520−78頁、1983年)によって確認する
ことができる。
ックスと上流調節領域は、酵母GAL7遺伝子を酵母染
色体DNAからショットガン法によりクローニングして
得ることもできるし、DNA合成機などにより化学合成
して得ることもできる。いずれの方法によっても得られ
たDNA塩基配列は、化学分解法(Methods i
n Enzymology 65巻499−580頁、
1980年)または、ジデオキシヌクレオチド酵素法(
Methods in Enzymology 101
’1520−78頁、1983年)によって確認する
ことができる。
TATAボックスと上流調節領域の塩基配列以外のDN
A配列は、第1図に示した配列と異なっていでもよいし
、また、両持定配列の間に挿入される塩基数は、50〜
500 bpが好ましい。
A配列は、第1図に示した配列と異なっていでもよいし
、また、両持定配列の間に挿入される塩基数は、50〜
500 bpが好ましい。
このようなプロモーター及び上流調節領域を持つ塩基配
列の下流に、発現させたい外来遺伝子を連結すると、上
述のガラクトースによる調節を受け外来遺伝子を発現す
ることができる。
列の下流に、発現させたい外来遺伝子を連結すると、上
述のガラクトースによる調節を受け外来遺伝子を発現す
ることができる。
本発明の発現ベクターに連結させることのできる外来遺
伝子は、例えばサツカロミセス・セレビpombe )
などの近縁のカビ類ではイントロンを含んだ遺伝子でも
良いし、CDNAでも良い。その他の高等真核生物の遺
伝子ではcDNAが好ましい。また、原核生物の遺伝子
は、イントロンを含まないので遺伝子のまま使用できる
。また、アミノ酸に対応させて人工的に作ったD N
A’は好適に使用できる。蛋白質をコードする遺伝子の
オープンリーディングフレームをすべて発現することが
できる。発現させる蛋白質は種類を問わず、たとえ、酵
母の成1qに有害な蛋白質でも、ガラクトース誘導′型
の本発現ヘクターでは、充分発現できる。
伝子は、例えばサツカロミセス・セレビpombe )
などの近縁のカビ類ではイントロンを含んだ遺伝子でも
良いし、CDNAでも良い。その他の高等真核生物の遺
伝子ではcDNAが好ましい。また、原核生物の遺伝子
は、イントロンを含まないので遺伝子のまま使用できる
。また、アミノ酸に対応させて人工的に作ったD N
A’は好適に使用できる。蛋白質をコードする遺伝子の
オープンリーディングフレームをすべて発現することが
できる。発現させる蛋白質は種類を問わず、たとえ、酵
母の成1qに有害な蛋白質でも、ガラクトース誘導′型
の本発現ヘクターでは、充分発現できる。
例えば、インシュリン、血小板由来の成長因子(PDG
F) 、インターフェロン(α、β、γ)、性腺刺激ホ
ルモン、成長ホルモン、エンケファリン類、エンドルフ
ィン類、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH) 、カルシ
トニン、副甲状%Fホルモン、神経成長因子(NGF)
、エリスロポエチン、血液凝固因子、ウロキナーゼ、
血清アルブミン、サイトカイン、L皮成長因子(EGF
)、プロラクチン、レンニン、胎盤ラクトゲン、チモポ
イエチン、胃液分泌抑制ポリペプチド(GIP)、コレ
チストキニン(CCK−39) 、ガストリン(BG)
、カルシトニン、グルカゴン、セクレチン、モチン、ソ
マトスフチン、色素細胞刺激ホルモン、エラスチン、コ
ラーゲン、リパーゼ、ラクターゼ、β−ガラクトテター
ゼ、インへルターゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテ
アーゼなどの蛋白質に関して好適に使用できる。
F) 、インターフェロン(α、β、γ)、性腺刺激ホ
ルモン、成長ホルモン、エンケファリン類、エンドルフ
ィン類、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH) 、カルシ
トニン、副甲状%Fホルモン、神経成長因子(NGF)
、エリスロポエチン、血液凝固因子、ウロキナーゼ、
血清アルブミン、サイトカイン、L皮成長因子(EGF
)、プロラクチン、レンニン、胎盤ラクトゲン、チモポ
イエチン、胃液分泌抑制ポリペプチド(GIP)、コレ
チストキニン(CCK−39) 、ガストリン(BG)
、カルシトニン、グルカゴン、セクレチン、モチン、ソ
マトスフチン、色素細胞刺激ホルモン、エラスチン、コ
ラーゲン、リパーゼ、ラクターゼ、β−ガラクトテター
ゼ、インへルターゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテ
アーゼなどの蛋白質に関して好適に使用できる。
本発明の発現ベクターに含まれるGAL7プロモーター
への外来遺伝子の結合は、+15位に認識部位5 ’
−CCTC−3’が存在する制限酵素Mn1lを用いる
のが良い。この制限酵素部位は、GAL7転写開始点上
流少なくとも241塩基対には存在しておらず、容易に
プロモーター及び調節領域を含むDNA断片を得ること
ができる。しかもMn1Iは、認識部位の下流7塩基対
日でプラントエンドでDNAを切断する。つまり、23
位のATG (翻訳開始点のG)の後で切れる。従って
、得られたATGまでのDNA断片に外来遺伝子のオー
プンリーディングフレームからATGを除いたDNA断
片をつなげば、外来遺伝子のみを発現することになり、
目的とする蛋白質を完全な形で得ることができる。また
、外来遺伝子にATGを持ったものを使った場合は、+
23位のATGより上流でGAL7遺伝子につなげば、
外来遺伝子を完全な形で発現できる。また、+23位の
ATC以後でも、外来遺伝子のコーディングフレーム読
み取りわくさえ合えば、GAL7−外来遺伝子融合蛋白
質を発現することができる。
への外来遺伝子の結合は、+15位に認識部位5 ’
−CCTC−3’が存在する制限酵素Mn1lを用いる
のが良い。この制限酵素部位は、GAL7転写開始点上
流少なくとも241塩基対には存在しておらず、容易に
プロモーター及び調節領域を含むDNA断片を得ること
ができる。しかもMn1Iは、認識部位の下流7塩基対
日でプラントエンドでDNAを切断する。つまり、23
位のATG (翻訳開始点のG)の後で切れる。従って
、得られたATGまでのDNA断片に外来遺伝子のオー
プンリーディングフレームからATGを除いたDNA断
片をつなげば、外来遺伝子のみを発現することになり、
目的とする蛋白質を完全な形で得ることができる。また
、外来遺伝子にATGを持ったものを使った場合は、+
23位のATGより上流でGAL7遺伝子につなげば、
外来遺伝子を完全な形で発現できる。また、+23位の
ATC以後でも、外来遺伝子のコーディングフレーム読
み取りわくさえ合えば、GAL7−外来遺伝子融合蛋白
質を発現することができる。
本発明の発現ベクターは、上記、外来遺伝子の発現をガ
ラクトースで制御する能力を持つ酵母発現ベクターであ
る。また、本発明では、この酵母発現ベクターを含む宿
主酵母並びにその酵母を利用した外来遺伝子由来のポリ
ペプチドの生産方法に関する。
ラクトースで制御する能力を持つ酵母発現ベクターであ
る。また、本発明では、この酵母発現ベクターを含む宿
主酵母並びにその酵母を利用した外来遺伝子由来のポリ
ペプチドの生産方法に関する。
2発現べ多クーの宿主となる酵母は、サツカロミセス1
セレビシs (Saccharomyces cere
visiae)及び、例えばサツカロミセス・カールス
ベルゲンシス(Saccharomyces carl
sbergensis)などの近縁種が好適に使用され
る。ガラクトース誘導機、構を充分発揮するためには、
カラクトース代謝系調整遺伝子GAL4、GAL80、
GALIIが遺伝的に野性型でなければならない。また
、発現ベクターの脱落を防ぐため、発現ベクターの選択
マーカー遺伝子を欠く変異株が用いられる。発現ベクタ
ーによる酵母の形質転換は、)Iinnenらの方法
(Proc、Natl、^cad、Set、LISA
75巻1929〜1933頁、1978年)及びIto
らの方法(J、Bacteriol、153巻163〜
168頁、1983年)のいずれの方法も好適に使用で
きる。
セレビシs (Saccharomyces cere
visiae)及び、例えばサツカロミセス・カールス
ベルゲンシス(Saccharomyces carl
sbergensis)などの近縁種が好適に使用され
る。ガラクトース誘導機、構を充分発揮するためには、
カラクトース代謝系調整遺伝子GAL4、GAL80、
GALIIが遺伝的に野性型でなければならない。また
、発現ベクターの脱落を防ぐため、発現ベクターの選択
マーカー遺伝子を欠く変異株が用いられる。発現ベクタ
ーによる酵母の形質転換は、)Iinnenらの方法
(Proc、Natl、^cad、Set、LISA
75巻1929〜1933頁、1978年)及びIto
らの方法(J、Bacteriol、153巻163〜
168頁、1983年)のいずれの方法も好適に使用で
きる。
さらに、外来遺伝子を含む本発明の発現ベクターにより
形質転換された酵母を選択マーカーを欠いた培地で生育
させ、ガラクトースを炭素源として培地中に0.1%〜
10%、好ましくは1〜3%添加すれば、外来遺伝子よ
りポリペプチドが生産される。このとき、0.1%以下
ではほとんど誘導がかからず、10%以上では、宿主菌
の生育が悪くなる。また、ガラクトースは、単一炭素源
でも、併用炭素源でも良く、また、添加時期は、細胞の
生育において、最初からでも、対数増殖期でも、静止期
でもいずれでも良い。外来遺伝子産物が酵母の生育に悪
影響を及ぼす場合には、最初ブドウ糖及びショ糖などの
他の炭素源で培養し、対数増殖期後期〜静止期にガラク
トースを添加する方法が良好である。
形質転換された酵母を選択マーカーを欠いた培地で生育
させ、ガラクトースを炭素源として培地中に0.1%〜
10%、好ましくは1〜3%添加すれば、外来遺伝子よ
りポリペプチドが生産される。このとき、0.1%以下
ではほとんど誘導がかからず、10%以上では、宿主菌
の生育が悪くなる。また、ガラクトースは、単一炭素源
でも、併用炭素源でも良く、また、添加時期は、細胞の
生育において、最初からでも、対数増殖期でも、静止期
でもいずれでも良い。外来遺伝子産物が酵母の生育に悪
影響を及ぼす場合には、最初ブドウ糖及びショ糖などの
他の炭素源で培養し、対数増殖期後期〜静止期にガラク
トースを添加する方法が良好である。
実施例
以下、本発明を実施例によってざらに詳細に説明するが
、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもの
でないことば言うまでもない。
、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもの
でないことば言うまでもない。
実施例1〜4
まず、酵母GAL7遺伝子を酵母染色体よりクローニン
グした。
グした。
酵−母すソカロミセス・セレビシェ(Saccharo
mycescerevisiae) S 2880株(
ATCC2610B)を栄養培地(Y F’ D)で生
育させ、クライヤー法(Methods in cel
l biology 12巻39−44頁、アカデミツ
クブレス製、1975年)により、染色体DNAを精製
した。制限酵素田しlで完全消化し、DNA断片を調整
した。一方、酵母クローニングベクターY E p24
(Gene8巻17−24頁、1979年)をSal
1で切断し、このSal I部位に、上記染色体由来
のDNA断片を挿入し、T4DNAリガーゼにより結合
した。得られたハイブリッドプラスミドにより、大腸菌
JA221株を形質転換し、アンピシリン(30μg/
ml)耐性株を得た。この形質転換株を、栄養培地(L
B)−アンピシリン30μg/ml添加−で生育させ
、アルカリ法(Nuc+、八cid、 Res、7巻、
1513−1523頁)により、ハイブリッドプラスミ
ドを多量に得た。さらに得られた全ハイブリッドプラス
ミドを用いてItoらの酢酸リチウム−ポリエチレング
リコール法によって、GAL7欠失変異酵母−サツカロ
ミセス・セレビシェ(Saccharomyces c
erevisiae) 3416B(B4)株(Yea
st genetic 5tock center。
mycescerevisiae) S 2880株(
ATCC2610B)を栄養培地(Y F’ D)で生
育させ、クライヤー法(Methods in cel
l biology 12巻39−44頁、アカデミツ
クブレス製、1975年)により、染色体DNAを精製
した。制限酵素田しlで完全消化し、DNA断片を調整
した。一方、酵母クローニングベクターY E p24
(Gene8巻17−24頁、1979年)をSal
1で切断し、このSal I部位に、上記染色体由来
のDNA断片を挿入し、T4DNAリガーゼにより結合
した。得られたハイブリッドプラスミドにより、大腸菌
JA221株を形質転換し、アンピシリン(30μg/
ml)耐性株を得た。この形質転換株を、栄養培地(L
B)−アンピシリン30μg/ml添加−で生育させ
、アルカリ法(Nuc+、八cid、 Res、7巻、
1513−1523頁)により、ハイブリッドプラスミ
ドを多量に得た。さらに得られた全ハイブリッドプラス
ミドを用いてItoらの酢酸リチウム−ポリエチレング
リコール法によって、GAL7欠失変異酵母−サツカロ
ミセス・セレビシェ(Saccharomyces c
erevisiae) 3416B(B4)株(Yea
st genetic 5tock center。
DonnerLaboratory、 ’Llnive
rsity of Ca1ifornia。
rsity of Ca1ifornia。
Berkeley、 CA 94720 USA)遺伝
子型a’、 gal 7+met L ura 1+a
de 6+ ade 2−を形質転換した。
子型a’、 gal 7+met L ura 1+a
de 6+ ade 2−を形質転換した。
E B Gal寒天培地(0,002%臭化エチジウム
、2%ペプトン、1%酵母エキス、2%ガラクトース、
2%寒天)を選択培地として、GAL7遺伝子がクロー
ニングされたハイブリッドプラスミドを選択した。つま
り、プラスミド上に3288C株由来のGAL7遺伝子
が存在すれば、GAL7遺伝子を欠失している宿主34
16B(B4>株が形質転換により、ガラクトースを資
化できるようになり、E B Gal寒地に生育できる
ようになるわけである。
、2%ペプトン、1%酵母エキス、2%ガラクトース、
2%寒天)を選択培地として、GAL7遺伝子がクロー
ニングされたハイブリッドプラスミドを選択した。つま
り、プラスミド上に3288C株由来のGAL7遺伝子
が存在すれば、GAL7遺伝子を欠失している宿主34
16B(B4>株が形質転換により、ガラクトースを資
化できるようになり、E B Gal寒地に生育できる
ようになるわけである。
このようにして得られたバイブリソドプラスミ遺伝子を
持しこんでいた。このDNA配列にはGAL7遺伝子の
コーディング配列、及びプロモーター、上流調節領域が
含まれていた。上流のSat■部位を部分消化法により
展旧部位に置換し、プラスミドを扱いやすくした。
持しこんでいた。このDNA配列にはGAL7遺伝子の
コーディング配列、及びプロモーター、上流調節領域が
含まれていた。上流のSat■部位を部分消化法により
展旧部位に置換し、プラスミドを扱いやすくした。
次に、酵母GAL7遺伝子の5′領域に基づいた多数の
発現ベクターを作り、ガラクトース代謝系調節遺伝子産
物の関係するDNA部位を特定しその必須のDNA配列
を持つ発現ベクターを作製した。発現させる外来遺伝子
としては、大腸菌由来のlac Z ’遺伝子(β−ガ
ラクトシダーゼをコードする遺伝子)を用いた。
発現ベクターを作り、ガラクトース代謝系調節遺伝子産
物の関係するDNA部位を特定しその必須のDNA配列
を持つ発現ベクターを作製した。発現させる外来遺伝子
としては、大腸菌由来のlac Z ’遺伝子(β−ガ
ラクトシダーゼをコードする遺伝子)を用いた。
作成したプラスミドの構造を第2図に示した。
大腸菌プラスミドp B R322に2μプラスミド由
来の酵母複製開始配列及び酵母マーカーとして、URA
3遺伝子をそれぞれEcoRl、、財剪■部位に連結し
た、多コピー酵母ベクター(YEp24)のBamHI
−5al1部位にGAL7遺伝子−271より下流14
72塩基対をクローニングした本発明に係る発現ベクタ
ーp Y T 5003をBam旧で切断後、切断点を
起点として、エキヌヌクレアーゼl1al 31により
部分消化し、その断片の末端にpBamtl Iリンカ
−を連結した。BamHI−3al Iで切断し、GA
LL虞伝子の5′側がp Y T 5003より短くな
った多種のDNA断片を得た。
来の酵母複製開始配列及び酵母マーカーとして、URA
3遺伝子をそれぞれEcoRl、、財剪■部位に連結し
た、多コピー酵母ベクター(YEp24)のBamHI
−5al1部位にGAL7遺伝子−271より下流14
72塩基対をクローニングした本発明に係る発現ベクタ
ーp Y T 5003をBam旧で切断後、切断点を
起点として、エキヌヌクレアーゼl1al 31により
部分消化し、その断片の末端にpBamtl Iリンカ
−を連結した。BamHI−3al Iで切断し、GA
LL虞伝子の5′側がp Y T 5003より短くな
った多種のDNA断片を得た。
一方、yEp 24をハリニー蝕其I切断した2μ複製
開始部位、URA3、p B R332のアンピシリン
耐性部位、複製起点を含む断片を用意し、岳AL7断片
とT4DNAリガーゼにより連結し、実施例及び比較例
となる多種のバイブ肝ノドプラスミド(I)を得た。さ
らに、外来遺伝子1acZ’遺伝子を含む大腸菌プラス
ミドpMC874より1acZ’を含むハリI−とII
断片を得、これをεNk1遺伝子+421位のガ上」部
位から+1195位のSal 1部位までを除いたプラ
スミドに7.4DNAリガーゼにより連結した。GAL
7遺伝子の朋■部位の読み取りわくと、1acZ’遺伝
子の読み取りわくは、それぞれの切断部位で一致してお
り、連結後も同じ読み取りわくとなる。つまり、トラン
スフェラーゼのN末端から133アミノ酸の配列の後に
β−ガラクトシダーゼのN末端から8番目のアミノ酸残
基以後のアミノ酸配列がつらなった融合蛋白質をコード
する遺伝子となるわけである。
開始部位、URA3、p B R332のアンピシリン
耐性部位、複製起点を含む断片を用意し、岳AL7断片
とT4DNAリガーゼにより連結し、実施例及び比較例
となる多種のバイブ肝ノドプラスミド(I)を得た。さ
らに、外来遺伝子1acZ’遺伝子を含む大腸菌プラス
ミドpMC874より1acZ’を含むハリI−とII
断片を得、これをεNk1遺伝子+421位のガ上」部
位から+1195位のSal 1部位までを除いたプラ
スミドに7.4DNAリガーゼにより連結した。GAL
7遺伝子の朋■部位の読み取りわくと、1acZ’遺伝
子の読み取りわくは、それぞれの切断部位で一致してお
り、連結後も同じ読み取りわくとなる。つまり、トラン
スフェラーゼのN末端から133アミノ酸の配列の後に
β−ガラクトシダーゼのN末端から8番目のアミノ酸残
基以後のアミノ酸配列がつらなった融合蛋白質をコード
する遺伝子となるわけである。
このようにして得られた(1)の発現ベクターのGAL
7 5’領域の賭すI IJンカーの結合位置をジデオ
キシヌクレオチド酵素法による塩基配列決定により決め
、第4図にBamH1部位を各プラスミドについて示し
た。実施例1及び2については、第2図に示した作成方
法に準して、転写開始点上流的1.2キロヘースから削
って得た。Bam1(1部位の上流はそれぞれpBR3
22のBamHI部位(EcoRIを1として375位
である)より上流の配列となっている。
7 5’領域の賭すI IJンカーの結合位置をジデオ
キシヌクレオチド酵素法による塩基配列決定により決め
、第4図にBamH1部位を各プラスミドについて示し
た。実施例1及び2については、第2図に示した作成方
法に準して、転写開始点上流的1.2キロヘースから削
って得た。Bam1(1部位の上流はそれぞれpBR3
22のBamHI部位(EcoRIを1として375位
である)より上流の配列となっている。
これらの実施例及び比較例の発現ベクターに第2図の方
法で1acZ ’遺伝子をつなぎ、発現について、β−
ガラクトシダーゼ活性により評価した。
法で1acZ ’遺伝子をつなぎ、発現について、β−
ガラクトシダーゼ活性により評価した。
本発明に係るGA L 7−1acZ’ハイブリツドプ
ラスミドにより、サツカロミセス・セレビシェ(Sac
charomyces cerevisiae) MT
8−1株(ura 3 * ade、trp1. I
eu 2+ bis 3) −ガラクトース代謝調節遺
伝子野性株−、YH5−2A株(a、gal 4. u
ra 3. his 、 trp 1. ade )及
び、KK4株(α、gal 80. ura 3. h
is 1゜trpl)の3株を、それぞれ、ILoらに
よる酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法によって
形質転換した。ウラシルを欠いた寒天培地により、形質
転換株を選択し、本発明に係る酵母ベクターによって形
質転換された酵母を得た。これらの形質転換株について
、β−ガラクトシダーゼ活性発現を評価した。評価法は
、X−Ga1(5−臭化4−塩化−3−インドリル−β
−D−ガラクトシド)を用いた発色法により行なった。
ラスミドにより、サツカロミセス・セレビシェ(Sac
charomyces cerevisiae) MT
8−1株(ura 3 * ade、trp1. I
eu 2+ bis 3) −ガラクトース代謝調節遺
伝子野性株−、YH5−2A株(a、gal 4. u
ra 3. his 、 trp 1. ade )及
び、KK4株(α、gal 80. ura 3. h
is 1゜trpl)の3株を、それぞれ、ILoらに
よる酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法によって
形質転換した。ウラシルを欠いた寒天培地により、形質
転換株を選択し、本発明に係る酵母ベクターによって形
質転換された酵母を得た。これらの形質転換株について
、β−ガラクトシダーゼ活性発現を評価した。評価法は
、X−Ga1(5−臭化4−塩化−3−インドリル−β
−D−ガラクトシド)を用いた発色法により行なった。
使用した寒天培地の組成は次の通りである。
以下余白
重量%
1、炭素源 2.0
2、#母窒素源
(fFミノ酸なし)0.7
3、 カザミノ酸 0.5
4、硫酸アゾリン 0.002
5、トリプトファン 0.002
6、KH,PO41,36
7、水酸化カリウム (pH7に調整)8、XGa1
O,004 9、寒天 2.0 10、イオン交換水 93.5 この寒天培地に、発現ヘクターを含む酵母をストリーク
し、30°Cで2日培養する。β−力゛ラクトシダー・
セ活性により培地は青色に変化する。また、青色の濃さ
は、比活性の強さに比例することが知られている。
O,004 9、寒天 2.0 10、イオン交換水 93.5 この寒天培地に、発現ヘクターを含む酵母をストリーク
し、30°Cで2日培養する。β−力゛ラクトシダー・
セ活性により培地は青色に変化する。また、青色の濃さ
は、比活性の強さに比例することが知られている。
上記形質転換酵母についてβ−ガラク1−シダーゼ活性
を評価した結果を第1表に示した。なお、実jll13
のうちす・ノカロミセス・セレビシェ(Sacchar
omyces cerevisiae) MT 8−1
(pY T 5013) (微工研菌寄託第7633
号)番よ微工研Gこ寄託した。
を評価した結果を第1表に示した。なお、実jll13
のうちす・ノカロミセス・セレビシェ(Sacchar
omyces cerevisiae) MT 8−1
(pY T 5013) (微工研菌寄託第7633
号)番よ微工研Gこ寄託した。
以下余白
実施例1〜4の発現ベクターによって形質転換したMT
8−1株は、ブドウ糖、ショ糖で生育させたときには、
β−ガラクトシダーゼ活性は見られないが、ガラクトー
スまたは、シヨ糖+ガラクトースで生育させたときには
、β−ガラクトシダーゼを顕著に発現していた。つまり
、発現ベクターの、GAL7プロモーター、上流調節領
域がガラクトースによる誘導に充分対応する塩基配列を
持っていることを示していた。このことは、正の調節因
子GAL4遺伝子を欠いているYH5−2A株では、β
−ガラクトシダーゼ活性が、炭素源にかかわらず発現さ
れず、また負の調節因子GAL80遺伝子を欠いている
KK−4株では、炭素源にかかわらず発現することから
も支持される。
8−1株は、ブドウ糖、ショ糖で生育させたときには、
β−ガラクトシダーゼ活性は見られないが、ガラクトー
スまたは、シヨ糖+ガラクトースで生育させたときには
、β−ガラクトシダーゼを顕著に発現していた。つまり
、発現ベクターの、GAL7プロモーター、上流調節領
域がガラクトースによる誘導に充分対応する塩基配列を
持っていることを示していた。このことは、正の調節因
子GAL4遺伝子を欠いているYH5−2A株では、β
−ガラクトシダーゼ活性が、炭素源にかかわらず発現さ
れず、また負の調節因子GAL80遺伝子を欠いている
KK−4株では、炭素源にかかわらず発現することから
も支持される。
これに対して、比較例1では、若干、ガラクトース誘導
傾向が見られなくなり、比較例2では、炭素源にかかわ
らずβ−ガラクトシダーゼ活性は見られなくなる。この
ことからも、−176近傍の塩基配列、5 ’−GCO
CTCGC,−3 ’ (上流調節領域)がGAL4生
産物と重要なかかわり合いを持っていることが示唆され
る。更に、比較例3では、炭素源にかかわらず若干の酵
素活性が認められるが、比較例4及び5では、いずれの
菌株においても、炭素源を変えても全く酵素活性は見ら
れない。この現象は一63位に存在するTATAボソク
不を欠いてしまったために、転写ができな(なったため
と考えられる。このことはまた、上述の酵素活性の発現
が、あくまで、酵母CALL遺伝子領域の機能に由来す
るものであり、その上流に位置するpBR322遺伝子
の影響によるものでないことを意味していた。
傾向が見られなくなり、比較例2では、炭素源にかかわ
らずβ−ガラクトシダーゼ活性は見られなくなる。この
ことからも、−176近傍の塩基配列、5 ’−GCO
CTCGC,−3 ’ (上流調節領域)がGAL4生
産物と重要なかかわり合いを持っていることが示唆され
る。更に、比較例3では、炭素源にかかわらず若干の酵
素活性が認められるが、比較例4及び5では、いずれの
菌株においても、炭素源を変えても全く酵素活性は見ら
れない。この現象は一63位に存在するTATAボソク
不を欠いてしまったために、転写ができな(なったため
と考えられる。このことはまた、上述の酵素活性の発現
が、あくまで、酵母CALL遺伝子領域の機能に由来す
るものであり、その上流に位置するpBR322遺伝子
の影響によるものでないことを意味していた。
以上の通り、本発明に係る酵母ベクターは、ガラクトー
ス代謝調節遺伝子が野性型の酵母の中で、外来遺伝子の
発現をガラクトースにより良好に誘導していた。
ス代謝調節遺伝子が野性型の酵母の中で、外来遺伝子の
発現をガラクトースにより良好に誘導していた。
第1図は、酵母GAL7遺伝子の転写開始点周辺のD
N A塩基配列を示す図面である。ノンコーデング鎖の
みを示したが、実際のDNAは相補鎖と結合した2本鎖
である。転写開始点を1番とし、上流を−、下流を十の
整数で塩基に番号をつけた。 第2図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの作
成方法並びにGAL 7−1ac Z ’融合遺伝子の
作成方法を示す図面である。 第3図は、発現ベクターとlac Z ’遺伝子の結合
部分の塩基配列を示す図面である。 第4図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの持
っているGAL7遺伝子の5′領域の塩基配列を示す図
面である。それぞれ、矢印より下流をもっていて、それ
より上流を欠いている意味である。 以下余白 い 嫁 5ミ 巳8 ミル 13 悶−8耀 i起 8よH嚇
i左 目F i< 5占 ビ3 頂d 市宿I I 粁 トた り 舶〜 吋 粁 グ占 粁 遡 冒左 呂−滌 i5 I 葺左 1訃ごぶ 託1占 〆と 1
理3 旧 嗣 旨ミ 1ま 8ミ 3壬 だ靜〜 旨ご 翻と 曜y訃 5計
已8 し四 翻邸 5汁 11(< (Jへ tv<
u−<< o>球 トi 沓占 h左 匿 唾P 1甜 1ヨ騒δ ドb
師! 捉二 騎5 襦弱 旨ミ目層 騎5 番δ−xS
蹄ト ヒト 奢よ≦ 暑; 巨」 聴器 6冊 咥3
5E手続補正書(方式) 昭和59年9月、、)2日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 昭和59年特許願第102685号 2、発明の名称 酵母発現ベクター 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 (195)株式会社 資 生 堂4、代理人 住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番10号5、
補正命令の日付 (1) 明細書の「発明の詳細な説明」の欄(2)明細
書の「図面の簡単な説明」の欄(3)図 面(第4図) 7、補正の内容 (1)明細書第18頁第8行「第4図」を「第4図−1
及び第4図−21に補正する。 (2) 明細書第25頁第7行「第4図」を「第4図−
1及び第4図−21に補正する。 (3)図面(第4図)の図番を別紙朱書の通り訂正する
。 8、添付書類の目録 朱書訂正図面(第4図−1及び 第4図−2)1通 絵 3 謂’ 4占1:+M、 r?Eilf5 iE:、
9j:° 8° <8 し占 r3 3 r b 、 uし Q 1閃5 騎、:E i :3 ECE 5 、E吋 咥
3 グに 写δ 衰と 書左 ■ 5母 旧 し!Z−ご茨 g占 〆易 師、bo u H三 1民 罠ミ8曝 3判 二
乍μ 置〜 昌〜 宥謂咥、bt+ 9 A 彎1 目
暑E 5Eψ−3丑 1− (/l (D < +
< CJ G1. M’+ (りイ真 しd 邦 尿δ
h 8冒 I 臼 評引咥δ 已に F易 曙屓“ 臼 計 韮 イ5 臆ミ ド−。Φα )−%l−%’)−菖 トCは鍔 小−i
:!占 8’; 3 * ’jfa赳 ≦芝トi 8謂
に5 ご3 層面 8よ
N A塩基配列を示す図面である。ノンコーデング鎖の
みを示したが、実際のDNAは相補鎖と結合した2本鎖
である。転写開始点を1番とし、上流を−、下流を十の
整数で塩基に番号をつけた。 第2図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの作
成方法並びにGAL 7−1ac Z ’融合遺伝子の
作成方法を示す図面である。 第3図は、発現ベクターとlac Z ’遺伝子の結合
部分の塩基配列を示す図面である。 第4図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの持
っているGAL7遺伝子の5′領域の塩基配列を示す図
面である。それぞれ、矢印より下流をもっていて、それ
より上流を欠いている意味である。 以下余白 い 嫁 5ミ 巳8 ミル 13 悶−8耀 i起 8よH嚇
i左 目F i< 5占 ビ3 頂d 市宿I I 粁 トた り 舶〜 吋 粁 グ占 粁 遡 冒左 呂−滌 i5 I 葺左 1訃ごぶ 託1占 〆と 1
理3 旧 嗣 旨ミ 1ま 8ミ 3壬 だ靜〜 旨ご 翻と 曜y訃 5計
已8 し四 翻邸 5汁 11(< (Jへ tv<
u−<< o>球 トi 沓占 h左 匿 唾P 1甜 1ヨ騒δ ドb
師! 捉二 騎5 襦弱 旨ミ目層 騎5 番δ−xS
蹄ト ヒト 奢よ≦ 暑; 巨」 聴器 6冊 咥3
5E手続補正書(方式) 昭和59年9月、、)2日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 昭和59年特許願第102685号 2、発明の名称 酵母発現ベクター 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 (195)株式会社 資 生 堂4、代理人 住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番10号5、
補正命令の日付 (1) 明細書の「発明の詳細な説明」の欄(2)明細
書の「図面の簡単な説明」の欄(3)図 面(第4図) 7、補正の内容 (1)明細書第18頁第8行「第4図」を「第4図−1
及び第4図−21に補正する。 (2) 明細書第25頁第7行「第4図」を「第4図−
1及び第4図−21に補正する。 (3)図面(第4図)の図番を別紙朱書の通り訂正する
。 8、添付書類の目録 朱書訂正図面(第4図−1及び 第4図−2)1通 絵 3 謂’ 4占1:+M、 r?Eilf5 iE:、
9j:° 8° <8 し占 r3 3 r b 、 uし Q 1閃5 騎、:E i :3 ECE 5 、E吋 咥
3 グに 写δ 衰と 書左 ■ 5母 旧 し!Z−ご茨 g占 〆易 師、bo u H三 1民 罠ミ8曝 3判 二
乍μ 置〜 昌〜 宥謂咥、bt+ 9 A 彎1 目
暑E 5Eψ−3丑 1− (/l (D < +
< CJ G1. M’+ (りイ真 しd 邦 尿δ
h 8冒 I 臼 評引咥δ 已に F易 曙屓“ 臼 計 韮 イ5 臆ミ ド−。Φα )−%l−%’)−菖 トCは鍔 小−i
:!占 8’; 3 * ’jfa赳 ≦芝トi 8謂
に5 ご3 層面 8よ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 5’−GCOCTCGG−3’ (C:シトシン
、Gニゲアニン、T:チミン)の塩基配列を含むことを
特徴とする酵母発現ベクター。 2、TATAボックス(5’ −TATAAA−3’)
(T:チミン、A;アデニン)を含むプロモーター領域
の上流に、5 ’−GCOCTCGG−3′の塩基配列
を含む特許請求の範囲第1項記載の酵母発現ベクター。 3、酵母GAL7遺伝子の転写開始点上流少なくとも2
41塩基対を持つ特許請求の範囲第1項記載の酵母発現
ベクター。 4 任意のポリペプチドをコードする遺伝子をプロモー
ター領域下流に含む特許請求の範囲第1項から第3項の
いずれか1項に記載の酵母発現ベクター。 5、プロモーター領域上流に、5 ’−GCGCTCG
G−3’ (C:シトシン、Gニゲアニン、T:チミン
)の塩基配列を含む酵母発現ベクターによって形質転換
された酵母。 6、 プロモーター領域上流に、5 ’ −GCOCT
CG(、−3’ (C:シトシン、Gニゲアニン、T:
チミン)の塩基配列を含む酵母発現ベクターによって形
質転換された宿主酵母に、前記発現ベクター由来の任意
のポリペプチドを発現させることを特徴とするポリペプ
チドの生産方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59102685A JPS60248181A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 酵母発現ベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59102685A JPS60248181A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 酵母発現ベクタ− |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60248181A true JPS60248181A (ja) | 1985-12-07 |
JPH0249715B2 JPH0249715B2 (ja) | 1990-10-31 |
Family
ID=14334090
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59102685A Granted JPS60248181A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 酵母発現ベクタ− |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60248181A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63296689A (ja) * | 1987-04-15 | 1988-12-02 | ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト | ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造方法 |
US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
JPS5974987A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 |
JPS5974986A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
-
1984
- 1984-05-23 JP JP59102685A patent/JPS60248181A/ja active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5948082A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-03-19 | チバ−ガイギ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 酵母発現ベクター系 |
JPS5974987A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 |
JPS5974986A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
JPS63296689A (ja) * | 1987-04-15 | 1988-12-02 | ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト | ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0249715B2 (ja) | 1990-10-31 |
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