JPS60248181A - 酵母発現ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、分子生物学の分野に関し、更に詳し、くは異
種遺伝子のｃＤＮＡなとの任意のポリペプチドをコード
する遺伝子を酵母内で、ガラクトースの誘導により発現
させる夕めに好適なプラスミド・−、ククーに関する。

従来の技術 近年、組み換えＤＮＡ技術の発達はめざましく、特に大
腸菌プラスミドによる遺伝子増幅は分子生物学の飛躍的
進歩の原因となっている。しかし、外来ＤＮＡ遺伝子の
発現、つまり蛋白質の生産に関する技術についての実施
例は比較的少ない。やはり、大腸菌の宿主−ベクター系
で発現ベクターの技術は最も進歩しており、大腸菌由来
のアミノ酸配列を含まない外来遺伝子由来の蛋白質の生
産方法が開発されている。

ところが、大腸菌自体は人体に対して充分安全とは言え
ず、実際に外来遺伝子由来の蛋白質を人体に適用するた
めには、リビソドＡなどの大腸菌由来の人体発熱因子を
充分除去しなければならないという欠点をもっている。

このため、人体安全性の高い発現ベクター系の開発が望
まれており、その条件を満たすことができる系が、酵母
発現ベクター系である。つまり、サツカロミセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）に代表される酵母は、高度に発達した遺伝系統
を持っており、実際に外来遺伝子由来の蛋白質の生産に
有利な大量培養技術が古くから蓄積されているという特
徴を有し、しかも、酵母菌自体は、人体に対し特に有害
な物質の生産は行なっておらず、乾燥酵母は日本薬局方
に記載されているほどである。

最近、以上の目的のためにいくつかの酵母発現ベクター
系、例えば、ＴＲＰＩ　（）リプトファン合成系の蛋白
質をコードする遺伝子）、ＧＡＰ−ＤＨ（グリセルアル
デヒド３リン酸　デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
）　、ＰＧＫ　（３−フォスフォグリセレート　キナー
ゼをコードする遺伝子）などのプロモーター領域に外来
遺伝子をつないだものなどが開発されている。しかし、
これら発現ベクター系では、発現が構成的なために酵母
の成育に有害な物質をコードする外来遺伝子の発現はむ
ずかしいという欠点を持っていた。

発明の目的 従って、本発明の目的は、酵母の生育時には、外来遺伝
子由来の蛋白質を全く生産せず、大量培養した後、外来
遺伝子由来の蛋白質を生産することができる酵母発現ベ
クター系を開発することにある。

発明の目的を解決するための手段とその作用及び効果 本発明者らは前記目的を達成すべく鋭意研究を進めた結
果、酵母ＧＡＬ７　（ガラクトース１リン酸ウリジルト
ランスフエラーゼをコードする遺伝子）プロモーター及
びその上流に存在する調節領域を発現ベクターのプロモ
ータ一部分に使用すれば、上記目的を達成し、非常に好
適な発現ベクターが得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。

即ち、本発明に従えば、プロモーター領域上流に、５’
−ＧＣＧＣＴＣＧＧ−３’　（（、：シトシン、Ｇニゲ
アニン、Ｔ：チミン）（上流調節領域）の塩基配列を含
む酵母発現ベクターが提供される。

この酵母発現ベクターは、炭素源として、ガラクトース
を培養液に添加した場合に外来遺伝子由来の蛋白質を生
産することができる。本発明に従えば、また前記発現ベ
クターを持つ酵母、及びそれらを活用した外来遺伝子由
来のポリペプチドの生産方法が提供される。

□、本発明に係る酵母発現ベクターば、酵母の複製＼ 源□、酵母の選択マーカー、およびＧ’ＡＬ？プロモー
ター並びに上流調節領域により構成される。本発明に係
る酵母発現ベクターは、例えば大腸菌などの他生物プラ
スミドの複製源及び選択マーカーを持つのが好ましい。

即ち、大腸菌−酵母のシャトルベクターとすることによ
り、遺伝子増幅を大腸菌などで行らことが可能となる訳
である。

酵母の複製源としては、一般に使用されているＹＥｐ系
プラスミド（２μプラスミドの複製源を持つ）、ＹＲｐ
系プラスミド（酵母染色体ＤＮＡから得られる自己複製
配列−ＡＲ３−を持つ）、ＹＣｐ系プラスミド（ＡＲ３
に加えて、酵母染色体ＤＮＡから得られた動原体−セン
トロメアーのＤＮＡを持つ）のいずれも好適に使用でき
る。外来遺伝子由来の蛋白質を大量に生産する目的のた
めには、細胞あたりのコピー数が数十であるＹＥｐ系プ
ラスミドが好ましい。

また、酵母の選択マーカーとしては、クローニングされ
た遺伝子であれば何でも良（，５例えば汎用されている
ものでは、ＴＲ，ＰＬ、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３
などがあげられる。

本発明の根幹となるＧＡＬ７プロモーター並びに上流調
節領域は、転写開始点（禾ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈｌ　’１巻８５５５〜８５６８頁
、１９８３年参照）より上流少なくとも２４１塩基対を
含むＤＮＡ塩基配列である。第１図にＧＡＬ７遺伝子の
５領域の塩基配列を示した。ＧＡＬ７遺伝子の転写開始
点を１番として下流を正の整数で、上流を負の整数で塩
基配列をナンバー付けした。＋２３からのＡＴＧが翻訳
開始点である。また、塩基配列はノンコーディングスト
ランド（ｍＲＮＡの鋳型とならないＤＮＡ鎖）のみを示
しており、実際のＤＮＡは相補鎖を持つ２本鎮ＤＮＡで
ある。

前記塩基配列のうち、本発明に必須の塩基配列は、プロ
モーターとして一６３位５　’　−ＴＡＴＡＡＡ−３’
　（ＴＡＴＡボックス）（Ｔ：チミン、Ａ：アデニン）
と正の調゛節遺伝ＧＡＬ４蛋白質のの結合部位と考えら
れる一１８０位５　’　−ＧＣＯＣＴＣＧＧ−３’　（
上流調節領域）で示される塩基配列である。この２つの
特徴的なりＮＡ配列が遺伝子上に並ぶとＴＡＴＡボック
スからの転写が調節遺伝子により制御される。つまり、
例えばブドウ糖、ショ糖などのガラクトース以外の物質
を炭素源として、酵母を生育させたときには、この遺伝
子の転写は行なわれず、ガラクトースが存在すると転写
は行なわれる。

上記の根幹となるＤＮＡ塩基配列、つまり、ＴＡＴＡボ
ックスと上流調節領域は、酵母ＧＡＬ７遺伝子を酵母染
色体ＤＮＡからショットガン法によりクローニングして
得ることもできるし、ＤＮＡ合成機などにより化学合成
して得ることもできる。いずれの方法によっても得られ
たＤＮＡ塩基配列は、化学分解法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５巻４９９−５８０頁、
１９８０年）または、ジデオキシヌクレオチド酵素法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１
　’１５２０−７８頁、１９８３年）によって確認する
ことができる。

ＴＡＴＡボックスと上流調節領域の塩基配列以外のＤＮ
Ａ配列は、第１図に示した配列と異なっていでもよいし
、また、両持定配列の間に挿入される塩基数は、５０〜
５００　ｂｐが好ましい。

このようなプロモーター及び上流調節領域を持つ塩基配
列の下流に、発現させたい外来遺伝子を連結すると、上
述のガラクトースによる調節を受け外来遺伝子を発現す
ることができる。

本発明の発現ベクターに連結させることのできる外来遺
伝子は、例えばサツカロミセス・セレビｐｏｍｂｅ　）
などの近縁のカビ類ではイントロンを含んだ遺伝子でも
良いし、ＣＤＮＡでも良い。その他の高等真核生物の遺
伝子ではｃＤＮＡが好ましい。また、原核生物の遺伝子
は、イントロンを含まないので遺伝子のまま使用できる
。また、アミノ酸に対応させて人工的に作ったＤ　Ｎ　
Ａ’は好適に使用できる。蛋白質をコードする遺伝子の
オープンリーディングフレームをすべて発現することが
できる。発現させる蛋白質は種類を問わず、たとえ、酵
母の成１ｑに有害な蛋白質でも、ガラクトース誘導′型
の本発現ヘクターでは、充分発現できる。

例えば、インシュリン、血小板由来の成長因子（ＰＤＧ
Ｆ）　、インターフェロン（α、β、γ）、性腺刺激ホ
ルモン、成長ホルモン、エンケファリン類、エンドルフ
ィン類、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、カルシ
トニン、副甲状％Ｆホルモン、神経成長因子（ＮＧＦ）
　、エリスロポエチン、血液凝固因子、ウロキナーゼ、
血清アルブミン、サイトカイン、Ｌ皮成長因子（ＥＧＦ
）、プロラクチン、レンニン、胎盤ラクトゲン、チモポ
イエチン、胃液分泌抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、コレ
チストキニン（ＣＣＫ−３９）　、ガストリン（ＢＧ）
、カルシトニン、グルカゴン、セクレチン、モチン、ソ
マトスフチン、色素細胞刺激ホルモン、エラスチン、コ
ラーゲン、リパーゼ、ラクターゼ、β−ガラクトテター
ゼ、インへルターゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテ
アーゼなどの蛋白質に関して好適に使用できる。

本発明の発現ベクターに含まれるＧＡＬ７プロモーター
への外来遺伝子の結合は、＋１５位に認識部位５　’　
−ＣＣＴＣ−３’が存在する制限酵素Ｍｎ１ｌを用いる
のが良い。この制限酵素部位は、ＧＡＬ７転写開始点上
流少なくとも２４１塩基対には存在しておらず、容易に
プロモーター及び調節領域を含むＤＮＡ断片を得ること
ができる。しかもＭｎ１Ｉは、認識部位の下流７塩基対
日でプラントエンドでＤＮＡを切断する。つまり、２３
位のＡＴＧ　（翻訳開始点のＧ）の後で切れる。従って
、得られたＡＴＧまでのＤＮＡ断片に外来遺伝子のオー
プンリーディングフレームからＡＴＧを除いたＤＮＡ断
片をつなげば、外来遺伝子のみを発現することになり、
目的とする蛋白質を完全な形で得ることができる。また
、外来遺伝子にＡＴＧを持ったものを使った場合は、＋
２３位のＡＴＧより上流でＧＡＬ７遺伝子につなげば、
外来遺伝子を完全な形で発現できる。また、＋２３位の
ＡＴＣ以後でも、外来遺伝子のコーディングフレーム読
み取りわくさえ合えば、ＧＡＬ７−外来遺伝子融合蛋白
質を発現することができる。

本発明の発現ベクターは、上記、外来遺伝子の発現をガ
ラクトースで制御する能力を持つ酵母発現ベクターであ
る。また、本発明では、この酵母発現ベクターを含む宿
主酵母並びにその酵母を利用した外来遺伝子由来のポリ
ペプチドの生産方法に関する。

２発現べ多クーの宿主となる酵母は、サツカロミセス１
セレビシｓ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）及び、例えばサツカロミセス・カールス
ベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌ
ｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）などの近縁種が好適に使用され
る。ガラクトース誘導機、構を充分発揮するためには、
カラクトース代謝系調整遺伝子ＧＡＬ４、ＧＡＬ８０、
ＧＡＬＩＩが遺伝的に野性型でなければならない。また
、発現ベクターの脱落を防ぐため、発現ベクターの選択
マーカー遺伝子を欠く変異株が用いられる。発現ベクタ
ーによる酵母の形質転換は、）Ｉｉｎｎｅｎらの方法　
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｅｔ、ＬＩＳＡ　
７５巻１９２９〜１９３３頁、１９７８年）及びＩｔｏ
らの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３巻１６３〜
１６８頁、１９８３年）のいずれの方法も好適に使用で
きる。

さらに、外来遺伝子を含む本発明の発現ベクターにより
形質転換された酵母を選択マーカーを欠いた培地で生育
させ、ガラクトースを炭素源として培地中に０．１％〜
１０％、好ましくは１〜３％添加すれば、外来遺伝子よ
りポリペプチドが生産される。このとき、０．１％以下
ではほとんど誘導がかからず、１０％以上では、宿主菌
の生育が悪くなる。また、ガラクトースは、単一炭素源
でも、併用炭素源でも良く、また、添加時期は、細胞の
生育において、最初からでも、対数増殖期でも、静止期
でもいずれでも良い。外来遺伝子産物が酵母の生育に悪
影響を及ぼす場合には、最初ブドウ糖及びショ糖などの
他の炭素源で培養し、対数増殖期後期〜静止期にガラク
トースを添加する方法が良好である。

実施例 以下、本発明を実施例によってざらに詳細に説明するが
、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもの
でないことば言うまでもない。

実施例１〜４ まず、酵母ＧＡＬ７遺伝子を酵母染色体よりクローニン
グした。

酵−母すソカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ　２８８０株（
ＡＴＣＣ２６１０Ｂ）を栄養培地（Ｙ　Ｆ’　Ｄ）で生
育させ、クライヤー法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌ
ｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　１２巻３９−４４頁、アカデミツ
クブレス製、１９７５年）により、染色体ＤＮＡを精製
した。制限酵素田しｌで完全消化し、ＤＮＡ断片を調整
した。一方、酵母クローニングベクターＹ　Ｅ　ｐ２４
　（Ｇｅｎｅ８巻１７−２４頁、１９７９年）をＳａｌ
　１で切断し、このＳａｌ　Ｉ部位に、上記染色体由来
のＤＮＡ断片を挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合
した。得られたハイブリッドプラスミドにより、大腸菌
ＪＡ２２１株を形質転換し、アンピシリン（３０μｇ／
ｍｌ）耐性株を得た。この形質転換株を、栄養培地（Ｌ
　Ｂ）−アンピシリン３０μｇ／ｍｌ添加−で生育させ
、アルカリ法（Ｎｕｃ＋、八ｃｉｄ、　Ｒｅｓ、７巻、
１５１３−１５２３頁）により、ハイブリッドプラスミ
ドを多量に得た。さらに得られた全ハイブリッドプラス
ミドを用いてＩｔｏらの酢酸リチウム−ポリエチレング
リコール法によって、ＧＡＬ７欠失変異酵母−サツカロ
ミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　３４１６Ｂ（Ｂ４）株（Ｙｅａ
ｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒ。

ＤｏｎｎｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　’Ｌｌｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ　９４７２０　ＵＳＡ）遺伝
子型ａ’、　ｇａｌ　７＋ｍｅｔ　Ｌ　ｕｒａ　１＋ａ
ｄｅ　６＋　ａｄｅ　２−を形質転換した。

Ｅ　Ｂ　Ｇａｌ寒天培地（０，００２％臭化エチジウム
、２％ペプトン、１％酵母エキス、２％ガラクトース、
２％寒天）を選択培地として、ＧＡＬ７遺伝子がクロー
ニングされたハイブリッドプラスミドを選択した。つま
り、プラスミド上に３２８８Ｃ株由来のＧＡＬ７遺伝子
が存在すれば、ＧＡＬ７遺伝子を欠失している宿主３４
１６Ｂ（Ｂ４＞株が形質転換により、ガラクトースを資
化できるようになり、Ｅ　Ｂ　Ｇａｌ寒地に生育できる
ようになるわけである。

このようにして得られたバイブリソドプラスミ遺伝子を
持しこんでいた。このＤＮＡ配列にはＧＡＬ７遺伝子の
コーディング配列、及びプロモーター、上流調節領域が
含まれていた。上流のＳａｔ■部位を部分消化法により
展旧部位に置換し、プラスミドを扱いやすくした。

次に、酵母ＧＡＬ７遺伝子の５′領域に基づいた多数の
発現ベクターを作り、ガラクトース代謝系調節遺伝子産
物の関係するＤＮＡ部位を特定しその必須のＤＮＡ配列
を持つ発現ベクターを作製した。発現させる外来遺伝子
としては、大腸菌由来のｌａｃ　Ｚ　’遺伝子（β−ガ
ラクトシダーゼをコードする遺伝子）を用いた。

作成したプラスミドの構造を第２図に示した。

大腸菌プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２に２μプラスミド由
来の酵母複製開始配列及び酵母マーカーとして、ＵＲＡ
３遺伝子をそれぞれＥｃｏＲｌ、、財剪■部位に連結し
た、多コピー酵母ベクター（ＹＥｐ２４）のＢａｍＨＩ
−５ａｌ１部位にＧＡＬ７遺伝子−２７１より下流１４
７２塩基対をクローニングした本発明に係る発現ベクタ
ーｐ　Ｙ　Ｔ　５００３をＢａｍ旧で切断後、切断点を
起点として、エキヌヌクレアーゼｌ１ａｌ　３１により
部分消化し、その断片の末端にｐＢａｍｔｌ　Ｉリンカ
−を連結した。ＢａｍＨＩ−３ａｌ　Ｉで切断し、ＧＡ
ＬＬ虞伝子の５′側がｐ　Ｙ　Ｔ　５００３より短くな
った多種のＤＮＡ断片を得た。

一方、ｙＥｐ　２４をハリニー蝕其Ｉ切断した２μ複製
開始部位、ＵＲＡ３、ｐ　Ｂ　Ｒ３３２のアンピシリン
耐性部位、複製起点を含む断片を用意し、岳ＡＬ７断片
とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、実施例及び比較例
となる多種のバイブ肝ノドプラスミド（Ｉ）を得た。さ
らに、外来遺伝子１ａｃＺ’遺伝子を含む大腸菌プラス
ミドｐＭＣ８７４より１ａｃＺ’を含むハリＩ−とＩＩ
断片を得、これをεＮｋ１遺伝子＋４２１位のガ上」部
位から＋１１９５位のＳａｌ　１部位までを除いたプラ
スミドに７．４ＤＮＡリガーゼにより連結した。ＧＡＬ
７遺伝子の朋■部位の読み取りわくと、１ａｃＺ’遺伝
子の読み取りわくは、それぞれの切断部位で一致してお
り、連結後も同じ読み取りわくとなる。つまり、トラン
スフェラーゼのＮ末端から１３３アミノ酸の配列の後に
β−ガラクトシダーゼのＮ末端から８番目のアミノ酸残
基以後のアミノ酸配列がつらなった融合蛋白質をコード
する遺伝子となるわけである。

このようにして得られた（１）の発現ベクターのＧＡＬ
７　５’領域の賭すＩ　ＩＪンカーの結合位置をジデオ
キシヌクレオチド酵素法による塩基配列決定により決め
、第４図にＢａｍＨ１部位を各プラスミドについて示し
た。実施例１及び２については、第２図に示した作成方
法に準して、転写開始点上流的１．２キロヘースから削
って得た。Ｂａｍ１（１部位の上流はそれぞれｐＢＲ３
２２のＢａｍＨＩ部位（ＥｃｏＲＩを１として３７５位
である）より上流の配列となっている。

これらの実施例及び比較例の発現ベクターに第２図の方
法で１ａｃＺ　’遺伝子をつなぎ、発現について、β−
ガラクトシダーゼ活性により評価した。

本発明に係るＧＡ　Ｌ　７−１ａｃＺ’ハイブリツドプ
ラスミドにより、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＴ
　８−１株（ｕｒａ　３　＊　ａｄｅ、ｔｒｐ１．　Ｉ
ｅｕ　２＋　ｂｉｓ　３）　−ガラクトース代謝調節遺
伝子野性株−、ＹＨ５−２Ａ株（ａ、ｇａｌ　４．　ｕ
ｒａ　３．　ｈｉｓ　、　ｔｒｐ　１．　ａｄｅ　）及
び、ＫＫ４株（α、ｇａｌ　８０．　ｕｒａ　３．　ｈ
ｉｓ　１゜ｔｒｐｌ）の３株を、それぞれ、ＩＬｏらに
よる酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法によって
形質転換した。ウラシルを欠いた寒天培地により、形質
転換株を選択し、本発明に係る酵母ベクターによって形
質転換された酵母を得た。これらの形質転換株について
、β−ガラクトシダーゼ活性発現を評価した。評価法は
、Ｘ−Ｇａ１（５−臭化４−塩化−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシド）を用いた発色法により行なった。

使用した寒天培地の組成は次の通りである。

以下余白 重量％ １、炭素源　２．０ ２、＃母窒素源 （ｆＦミノ酸なし）０．７ ３、　カザミノ酸　０．５ ４、硫酸アゾリン　０．００２ ５、トリプトファン　０．００２ ６、ＫＨ，ＰＯ４１，３６ ７、水酸化カリウム　（ｐＨ７に調整）８、ＸＧａ１　
Ｏ，００４ ９、寒天　２．０ １０、イオン交換水　９３．５ この寒天培地に、発現ヘクターを含む酵母をストリーク
し、３０°Ｃで２日培養する。β−力゛ラクトシダー・
セ活性により培地は青色に変化する。また、青色の濃さ
は、比活性の強さに比例することが知られている。

上記形質転換酵母についてβ−ガラク１−シダーゼ活性
を評価した結果を第１表に示した。なお、実ｊｌｌ１３
のうちす・ノカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＴ　８−１
　（ｐＹ　Ｔ　５０１３）　（微工研菌寄託第７６３３
号）番よ微工研Ｇこ寄託した。

以下余白 実施例１〜４の発現ベクターによって形質転換したＭＴ
８−１株は、ブドウ糖、ショ糖で生育させたときには、
β−ガラクトシダーゼ活性は見られないが、ガラクトー
スまたは、シヨ糖＋ガラクトースで生育させたときには
、β−ガラクトシダーゼを顕著に発現していた。つまり
、発現ベクターの、ＧＡＬ７プロモーター、上流調節領
域がガラクトースによる誘導に充分対応する塩基配列を
持っていることを示していた。このことは、正の調節因
子ＧＡＬ４遺伝子を欠いているＹＨ５−２Ａ株では、β
−ガラクトシダーゼ活性が、炭素源にかかわらず発現さ
れず、また負の調節因子ＧＡＬ８０遺伝子を欠いている
ＫＫ−４株では、炭素源にかかわらず発現することから
も支持される。

これに対して、比較例１では、若干、ガラクトース誘導
傾向が見られなくなり、比較例２では、炭素源にかかわ
らずβ−ガラクトシダーゼ活性は見られなくなる。この
ことからも、−１７６近傍の塩基配列、５　’−ＧＣＯ
ＣＴＣＧＣ，−３　’　（上流調節領域）がＧＡＬ４生
産物と重要なかかわり合いを持っていることが示唆され
る。更に、比較例３では、炭素源にかかわらず若干の酵
素活性が認められるが、比較例４及び５では、いずれの
菌株においても、炭素源を変えても全く酵素活性は見ら
れない。この現象は一６３位に存在するＴＡＴＡボソク
不を欠いてしまったために、転写ができな（なったため
と考えられる。このことはまた、上述の酵素活性の発現
が、あくまで、酵母ＣＡＬＬ遺伝子領域の機能に由来す
るものであり、その上流に位置するｐＢＲ３２２遺伝子
の影響によるものでないことを意味していた。

以上の通り、本発明に係る酵母ベクターは、ガラクトー
ス代謝調節遺伝子が野性型の酵母の中で、外来遺伝子の
発現をガラクトースにより良好に誘導していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母ＧＡＬ７遺伝子の転写開始点周辺のＤ　
Ｎ　Ａ塩基配列を示す図面である。ノンコーデング鎖の
みを示したが、実際のＤＮＡは相補鎖と結合した２本鎖
である。転写開始点を１番とし、上流を−、下流を十の
整数で塩基に番号をつけた。 第２図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの作
成方法並びにＧＡＬ　７−１ａｃ　Ｚ　’融合遺伝子の
作成方法を示す図面である。 第３図は、発現ベクターとｌａｃ　Ｚ　’遺伝子の結合
部分の塩基配列を示す図面である。 第４図は、実施例及び比較例に示した発現ベクターの持
っているＧＡＬ７遺伝子の５′領域の塩基配列を示す図
面である。それぞれ、矢印より下流をもっていて、それ
より上流を欠いている意味である。 以下余白 い 嫁 ５ミ　巳８　ミル　１３　悶−８耀　ｉ起　８よＨ嚇　
ｉ左　目Ｆ　ｉ＜　５占　ビ３ 頂ｄ　市宿Ｉ　Ｉ　粁　トた　り 舶〜　吋　粁　グ占　粁　遡　冒左 呂−滌　ｉ５　Ｉ　葺左　１訃ごぶ　託１占　〆と　１
　理３　旧　嗣　旨ミ １ま　８ミ　３壬　だ靜〜　旨ご　翻と　曜ｙ訃　５計
　已８　し四　翻邸　５汁　１１（＜　（Ｊへ　ｔｖ＜
　ｕ−＜＜　ｏ＞球 トｉ　沓占　ｈ左　匿　唾Ｐ　１甜　１ヨ騒δ　ドｂ　
師！　捉二　騎５　襦弱　旨ミ目層　騎５　番δ−ｘＳ
　蹄ト　ヒト　奢よ≦　暑；　巨」　聴器　６冊　咥３
　５Ｅ手続補正書（方式） 昭和５９年９月、、）２日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０２６８５号 ２、発明の名称 酵母発現ベクター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　（１９５）株式会社　資　生　堂４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付 （１）　明細書の「発明の詳細な説明」の欄（２）明細
書の「図面の簡単な説明」の欄（３）図　面（第４図） ７、補正の内容 （１）明細書第１８頁第８行「第４図」を「第４図−１
及び第４図−２１に補正する。 （２）　明細書第２５頁第７行「第４図」を「第４図−
１及び第４図−２１に補正する。 （３）図面（第４図）の図番を別紙朱書の通り訂正する
。 ８、添付書類の目録 朱書訂正図面（第４図−１及び 第４図−２）１通 絵 ３　謂’　４占１：＋Ｍ、　ｒ？Ｅｉｌｆ５　ｉＥ：、
９ｊ：°　８°　＜８　し占　ｒ３ ３　ｒ　ｂ　、　ｕし　Ｑ １閃５　騎、：Ｅ　ｉ　：３　ＥＣＥ　５　、Ｅ吋　咥
３　グに　写δ　衰と　書左 ■　５母　旧　し！Ｚ−ご茨　ｇ占 〆易　師、ｂｏ　ｕ　Ｈ三　１民　罠ミ８曝　３判　二
乍μ　置〜　昌〜　宥謂咥、ｂｔ＋　９　Ａ　彎１　目
　暑Ｅ　５Ｅψ−３丑　１−　（／ｌ　（Ｄ　＜　＋　
＜　ＣＪ　Ｇ１．　Ｍ’＋　（りイ真　しｄ　邦　尿δ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　５’−ＧＣＯＣＴＣＧＧ−３’　（Ｃ：シトシン
   、Ｇニゲアニン、Ｔ：チミン）の塩基配列を含むことを
   特徴とする酵母発現ベクター。 ２、ＴＡＴＡボックス（５’　−ＴＡＴＡＡＡ−３’）
   （Ｔ：チミン、Ａ；アデニン）を含むプロモーター領域
   の上流に、５　’−ＧＣＯＣＴＣＧＧ−３′の塩基配列
   を含む特許請求の範囲第１項記載の酵母発現ベクター。 ３、酵母ＧＡＬ７遺伝子の転写開始点上流少なくとも２
   ４１塩基対を持つ特許請求の範囲第１項記載の酵母発現
   ベクター。 ４　任意のポリペプチドをコードする遺伝子をプロモー
   ター領域下流に含む特許請求の範囲第１項から第３項の
   いずれか１項に記載の酵母発現ベクター。 ５、プロモーター領域上流に、５　’−ＧＣＧＣＴＣＧ
   Ｇ−３’　（Ｃ：シトシン、Ｇニゲアニン、Ｔ：チミン
   ）の塩基配列を含む酵母発現ベクターによって形質転換
   された酵母。 ６、　プロモーター領域上流に、５　’　−ＧＣＯＣＴ
   ＣＧ（、−３’　（Ｃ：シトシン、Ｇニゲアニン、Ｔ：
   チミン）の塩基配列を含む酵母発現ベクターによって形
   質転換された宿主酵母に、前記発現ベクター由来の任意
   のポリペプチドを発現させることを特徴とするポリペプ
   チドの生産方法。