HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Saccharomyces cerevisiae hat sich als vielseitiger Wirtsorganismus für die Expression
fremder Polypeptide erwiesen. Viele verschiedene Proteine einer Auswahl voll Arten
sind in S. cerevisiae exprimiert worden, einige bis zu Mengen von > 10% des gesamten
Zellproteins. Typischerweise wurde die Expression von einem Plasmid, das
regulatorische Hefe-Sequenzen enthält, vermittelt (Transcriptions-Promotor und -Terminator) und
welches das Strukturgen für das exprimierte Polypeptid wie auch für andere Sequenzen,
die für die Selektion und Vervielfältigung von Plasmiden sowohl in S. cerevisiae wie in
Escherichia coli erforderlich sind, trailscribiert. Zusätzlich war es möglich, die
Heferegulatorischen Sequenzen, die das Strukturgen für die exprimierten Polypeptide
transcribieren, in ein Hefe-Chromosom zu integrieren und eine Expression mit hoher
Ausbeute zu erzielen. S. cerevisiae hat 4 Gene, die die Enzyme kodieren, die für die
Verwertung von Galaktose als Kohlenstoffquelle verantwortlich sind. Die GAL1-,
GAL2-, GAL2-, bzw. GAL10-Gene kodieren Galaktokinase, Galaktose-5-Permease, α-
D-Galaktose-1-phosphat-Uridyltransferase bzw. Uridin-Diphosphogalaktose-4-
Epimerase. In Abwesenheit von Galaktose wird nur eine sehr geringfügige Expression
dieser Enzyme detektiert. Wenn Zellen anfangs in einem Glucose-haltigen Medium
wachsen und Galaktose der Kultur zugesetzt wird, werden diese vier Enzyme in einem
kontinuierlichen Ablauf mindestens um das 100fache nach Abnahme der Glucose im
Medium induziert. Diese Induktion tritt, wie gezeigt wurde, auf der Ebene der RNA-
Transcription auf. Die GAL1-, GAL2-, GAL7- und GAL10-Gene sind als Moleküle
kloniert und sequenziert worden. Die regulatorischen und Promotor-Sequenzen an den
5'-Enden einiger der entsprechenden Kodierungsregionen wurden anschließend
benachbart zu den Kodierungsregionen des lacZ-Gens angeordnet. Diese Experimente haben
diejenigen Promotor- und Regulator-Sequenzen festgelegt, die für eine Galaktose-
Induktion notwendig und hinreichend sind und die verwendbar sind, um die Expression
von heterologen Genen voranzutreiben.
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Die GAL4- bzw. GAL80 Genprodukte sind positive bzw. negative Regulatoren
der Expression der GAL1, GAL2, GAL7, und GAL10 Gene ebenso wie der MEL1
Gene, die die α-Galactosidase kodieren, ein Enzym das für den Melibiose- Stoffwechsel
erforderlich ist. Das GAL4-Produkt wirkt als positiver Regulator auf
Transcriptionsebene, indem es an spezifische DNA Sequenzen am 5'-Ende der
Strukturinformation dieser Gene bindet. In Abwesenheit von Galaktose, tritt das
GAL80 Genprodukt (Protein) mit dem GAL4-Genprodukt oder mit einer DNA
Sequenz, um diesen Aktivierungs-Vorgang der Transcriptions zu verhindern, in
Wechselwirkung. In Gegenwart von Galaktose kann das GAL80 Protein anscheinend
nicht das GAL4-Protein antagonisieren, und das GAL4-Protein kann als
Transcriptionsaktivator wirken. Das GAL4-Gen wird nur in sehr geringen Mengen exprimiert, und
sein Produkt ist für die optimale Induktion des GAL-Genpromotors
geschwindigkeitsbestimmend. Dies gilt besonders, wenn eine Zelle multiple Kopien eines Plasmids mit
Galaktose-induzierbaren Promotoren enthält, die die Expression heterologer Gene
vorantreibt. Wenn es jedoch Ziel ist, eine minimale oder keine Expression eines
heterologen Gens vor der Zugabe von Galaktose aufrecht zu erhalten, ist es wichtig, daß das
GAL4-Gen in Abwesenheit von Galaktose in sehr niedrigen Mengen exprimiert wird.
Bei einer Auswahl von rekombinanten mikrobiellen Expressionssystemen, ist gezeigt
worden, daß die Synthese vieler verschiedener heterologer Polypeptide für die Gastzelle
nachteilig ist. Als Folge davon, tritt ein Selektionsdruck gegenüber der Expression
solcher heterologer Polypeptide, in der Form auf, daß die einzigen Zellen, die sich in
einer in vergrößertem Maßstab angelegten rekombinanten Kultur anreichern, solche
sind, die die heterologen Polypeptide nicht exprimieren oder so wenig davon, daß die
Kultur zu einer unökonomischen Quelle für dieses Polypeptid wird. Ein optimaler Plan
für eine solche rekombinante Kultur im vergrößerten Maßstab wäre es, eine minimale
oder keine Expression der heterologen Gene während der Wachstumsphase der Kultur
auf großes Volumen und hohe Zelldichte aufrecht zu halten und darauf die maximale
Expression des heterologen Gens erst in der Endphase der Kultur vor der Isolierung des
Produkts zu induzieren.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Hefestämme bereitzustellen,
in denen das GAL4-Protein in einer regulierbaren Weise derart überproduziert werden
kann, daß die Expression der heterologen Gene, angeregt durch Galaktose-induzierbare
Promotoren, während der Wachstumsphase der Kultur zu einer hohen Zelldichte auf
das kleinste Maß reduziert und in der Endphase der Kultur vor der Produktisolierung
maximiert werden kann. Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung gehen
aus der folgenden Beschreibung hervor.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Das GAL4-Protein ist, was seine Menge angeht, als positiver Regulator für
Galaktose-induzierbare Promotoren in Hefestämmen geschwindigkeitsbegrenzend. Neue
Stämme werden beschrieben, bei denen das GAL4-Protein in regulierbarer Weise
überproduziert werden kann. Diese Stämme sind in Hefe für die regulierbare
Expression heterologer Gene, deren Expression von einem Galalltose-induzierbaren
Promotor angeregt wird, verwendbar.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1 stellt die Herstellung von pKHint-A dar
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Fig. 2 stellt die Herstellung von pKHint-B und pKHint-C dar.
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Fig. 3 stellt die Herstellung von Sc252 (pGAL10/GAL4) und Sc294
(pGAL10/GAL4) dar.
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Fig. 4 stellt die Herstellung von pRJ178 dar.
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Fig. 5 stellt die Herstellung von pJC197 dar.
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Fig. 6 stellt die Herstellung von pKH207-1.
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Fig. 7 stellt die Herstellung von pKH4 dar.
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Fig. 8 stellt die Herstellung von pKH4-EBMA dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung neuer Hefestämme, in
denen das GAL4-Genprodukt in regulierbarer Weise überexprimiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung solcher neuen Stämme als
Wirtsorganismus für die Expression heterologer Gene, angeregt durch einen
Galalltoseinduzierbaren Promotor. Insbesondere betrifft sie die Bedingungen für den
großtechnischen Maßstab rekombinanter Kulturen in der Art, daß die heterologe Genexpression
während der Wachstumsphase der Kultur auf ein großes Volumen und hohe Zelldichte
gering gehalten werden kann und dann in der stationären Phase des Kulturwachstums
vor der Produktisolierung maximiert werden kann. Eine Expressionskassette, die den
GAL10-Promotor in Verknüpfung mit dem GAL4-Strukturgen enthält, wird in der Art
und Weise erstellt, daß Zellen, die diese Kassette am HIS3-Locus integrieren, selektiert
werden können. Der E. coli-S. cerevisiae "shuttle"-Vektor YEp51 enthält die GAL10-
Promotor-Sequenzen der Hefe. Dieses Plasmid wird mit Sau3A und SalI geschnitten,
und das 0,5 kbp GAL10-Promotor-Fragment wird mittels präparativer Agarose-
Gelelektrophorese isoliert. Zwei Oligonukleotid-Linker werden synthetisiert und mit
dem 0,5 kbp Fragment verbunden und somit werden die 5'-, Sau3A- und die 3'-, SalI-
Enden zu EcoRI bzw. BglII Enden umgewandelt. Nach anschließendem Schneiden mit
EcoRI und BglII wird das EcoRI-BglII-GAL10-Promotor-Fragment durch präparative
Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Der Plasmid-Vektor pJJ42 enthält das Hefe-Gen
HIS3. Das Hefe-Strukturgen GAL4 (einschließend der translationalen Start-Region)
wird aus pSJ3 isoliert und unter Bildung von pIA subkloniert. Dieses Plasmid wird mit
mit BamHI und HindIII geschnitten, und das 2,9 kbp-GAL4-Fragment wird durch
präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Der Plasmidvektor PJI42 enthält das HIS3-
Hefe-Gen. Dieses Plasmid wird mit EcoRI und HindIII geschnitten, um ein Segment
des HIS3-Gens zu entfernen, das sich von der Mitte der Kodierungsregion bis
unmittelbar stromaufwärts des HIS3-Promotors erstreckt. Das 12 kbp-Vektorfragment wird
durch präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert und gleichzeitig mit den 0,5 kbp
und 2,9 kbp Fragmenten, wie oben beschrieben, verknüpft um das Plasmid pKHint-A
zu erhalten. Die pGAL10/GAL4-Expressionsluissette wird vom pKHint-A durch
Schneiden mit BamHI entfernt, und das 5,6 kbp-Fragment wird mittels präparativer
Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Der Plasmidvektor pJJ98, ein modifizierter pBR322
mit fehlender HindIII-Region, wird mit BamHI geschnitten und mit der 5,6 kbp
Kassette verknüpft. Das erhaltene Plasmid pKHint-B enthält eine einmal vorliegende
HindIII-Region, die über dem Carboxy-terminalen Ende der GAL4-Kodierungssequenz
hinaus lokalisiert ist. Das voll funktionsfähige URA3-Hefe-Gen wird aus dem E. coli-
S. cerevisiae shuttle-Vektor YEp24 durch Schneiden mit HindIII und Abtrennung des
1,2 kbp Fragments mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Nach dem
Schneiden mit HindIII wird das Plasmid pKHint-B mit dem 1,2 kbp HindIII-Fragment,
das das URA3-Gen trägt, verknüpft um das pKHint-C zu erhalten, das nun die
vollständige Expressionskassette für die Integration in das Hefechromosom enthält. Die
entscheidenden Eigenschaften dieser Kassette sind: 1) der regulierbare GAL10-Hefe-
Promotor, 2) die GAL4-Translationsstartregion und das -Hefe-Strukturgen, 3) der
URA3-Hefe-Promotor und das Strukturgen für die positive Selektion in der ura3&supmin;-
Wirtszelle der Hefe, und
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4) zwei BamHI-Regionen, die innerhalb der 5'-, und 3'- nicht-translatierten Sequenzen
des HIS3-Gens zur integrativen Ersatz-Transformation an dem HIS3-Hefe-Locus eine
Spaltung durchführen.
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Im Falle des Schneidens mit BamHI, ergibt das Plasmid pKHint-C eine 6,8
kbp Expressionskassette, die an beiden Enden von nichttranslationsfähigen HIS3-DNA-
Sequenzen flankiert ist. Die behandelte DNA wird dazu verwendet, um S. cerevisiae-
Wirtsstämme Sc252 (MATa ura3-52 leu2-2-112, ade1, MEL1) und Sc294 (MATa,
ura3-52, leu2-2-112, delta-gal1-10-7, MEL1) zu transformieren. In der Funktion einer
Targeting-Vorrichtung, dirigieren die BamHI-Enden die Expressionskassette an den
chromosomalen HIS3-Locus, wo die Kassette sich via homologer Rekombination
integriert. Transformanten werden für URA3&spplus; selektiert und für his3&supmin; einem Screening
unterzogen. Eine Southern Blot-Analyse der klonalen Isolate, als Sc252
(pGAL10/GAL14) und Sc294 (pGAL10/GAL4) bezeichnet, bestätigt, daß die Kassette
am HIS3-Locus integriert worden ist. Transformanten und ihre jeweiligen
Elternstamme läßt man in Glycerol Milchsaure Medium entweder mit oder ohne 2%
(w/v) Galaktose wachsen. Nach der Ernte bei A&sup6;&sup0;&sup0; - 1,5, werden DNA-Extrakte
hergestellt und durch Northern Blot Techniken analysiert. In Gegenwart von Galaktose
wird beobachtet, daß die Transcription der GAL4-mRNA mindestens 20fach
in den Sc252 (pGAL10/GAL4) und Sc294 (pGAL10/GAL4) Stanimen im Vergleich zu
den jeweiligen Elternstammen erhöht ist. Die Stamme zeigen in Abwesenheit von
Galaktose eine Expression der GAL4-mRNA auf Basisniveau. Somit weisen die neuen
Hefestamme den erwünschten Phanotyp der GAL4-Expression auf Basisniveau in
Abwesenheit der Galaktose und die Expression von GAL4 auf höherem Niveau (als
Wildtyp-Stämme) in Gegenwart von Galaktose auf.
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Um zu testen, ob die neuen Hefestämme eine Verbesserung des Niveaus der
Expression heterologer Gene gegenüber Wildtypstämmen aufweisen, wird ein
Expressions-Vektor hergestellt, der einen Galaktose-induzierbaren Promotor zur
Transformation der Stämme enthält.
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Die entscheidenden Eigenschaften dieses Plasmids sind: 1) die Escherichia. coli-
Herkunft der Sequenzen für die Selektion und Amplifikation des Plasmids in E. coli, 2)
die S. cerevisiae-Herkunft der Sequenzen für die Selektion und Amplifikation des
Plasmids in Hefe, 3) der GAL10-Hefe-Promotor, 4) der Pre-Leader des
Hefe-alphamating-Faktors, um das Translationsprodukt in das rauhe endoplasmatische Retikulum
zu leiten, 5) der Pro-Leader des Hefe-alpha-mating-Faktors, der N-Glykosyliervngs-
Signalsequenzen kodiert und der durch die KEX2- und STE13-Proteasen (Genprodukte)
gespalten wird, 6) die Kodierungsequenz für die Epstein-Barr-Virvs-Antigen-Membran-
(EBMA)-Proteine, die Glykoproteine von 350000 und 220000 Dalton sind, kodiert
durch den EB-Virus (EBV) und auf der Oberfläche der EBV-infizierten Zellen und EB-
Virionen resident, 7) eine Translations-Terminations-Sequenz, und 8) eine Hefe-
Transcriptions-Terminations-Sequenz.
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Dieses rekombinante Plasmid wird in S. cerevisiae-Stämme, die für GAL4
vom Wildtyp-Charakter sind, und in isogene S. cerevisiae-Stämme, die den
pGAL10/GAL4-Integranten beherbergen, eingeführt, und transformierte Klone werden
selektiert. Die Zellen wachsen in synthetischem, selektivem Glycerol-Milchsäure-
Medium; Galaktose wird den Kulturen zugesetzt, um die Expression des EBMA-Gens
zu induzieren. RNA wird von beiden Stämmen hergestellt und einer Northern-Blot-
Analyse unterzogen. Die mRNA, die EBMA kodiert, wird gegenüber dem Wildtyp-
Stamm mindestens 4-5fach in dem pGAL10/GAL4-Integranten vervielfältigt. Lysate
werden hergestellt, einer Elektrophorese in Polyacrylamid-Gelen unterzogen, und
einem Western-Blot-Verfahren auf Nitrocellulose unterworfen. EBMA-Proteine,die
spezifisch mit humanen konvalescenten EBV-Seren reagieren, werden in dem
pGAL10/GAL4-Integranten gegenüber dem Wildtyp-Stamm ungefähr 10fach
vervielfältigt. Vor der Zugabe von Galaktose zur Kultur können keine EBMA-mRNA oder
EBMA-Protein in dem GAL10/GAL4-Integranten-Stamm nachgewiesen werden.
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Das GAL4 Protein wird in Funktion eines Transcriptions Aktivators des
Galaktose induzierbaren Promotors wirksam und beeinflusst a priori nicht die Art und
Weise, in der heterologe Genprodukte, deren Expression von Galaktose induzierbaren
Promotoren stimuliert wird, nach der Translation translatiert oder weiterverarbeitet
werden. Deshalb ist es Fachleuten klar, daß das Konzept, einen Hefestamm, in dem das
GAL4-Protein in einer regulierbaren Weise als Wirtszelle für heterologe Genexpression
überproduziert werden kann, zu verwenden, sich auf irgendein heterologes Gen
erstreckt, dessen Expression von einem Galaktose-induzierbaren Promotor angeregt wird.
Darüberhinaus ist es Fachleuten klar, daß irgendeiner der Galaktose-induzierbaren
Promotoren, GAL1, GAL2, GAL7, GAL10, oder MEL1, die alle der
GAL4-vermittelten Transcriptionsaktivierung unterliegen, verwendet werden kann, um die
Expression heterologer Gene in einer Hefe-Wirtszelle, in der das GAL4-Protein in
einer regulierbaren Weise überproduziert werden kann, anzuregen. Ein anderes
Schlüsselkonzept besteht darin, daß die GAL4-Protein-Überproduktion regulierbar sein
sollte, was bedeutet, daß die GAL4-Genexpression von einem Promotor, dessen
Aktivität durch irgendein physiologisches Mittel, das die Zugabe von Galaktose zu
einer Kultur einschließt, aber nicht auf sie begrenzt ist, regulierbar ist, angeregt werden
sollte. Deshalb ist es Fachleuten klar, daß ein neuer Stamm, in dem das GAL4-Protein
in einer regulierbaren Weise überproduziert werden kann, ein GAL4-Gen enthalten
würde, dessen Expression von einem Promotor, einschließlich aber nicht begrenzt auf
die Promotoren der Alkoholdehydrogenase 2, sauren Phosphatase,
Phosphoglyceratkinase, Invertase, Hefe-Hitze-Schock- und Kupferthionein-Gene, der
anders als Galaktose-induzierbar ist,angeregt werden könnte. Darüberhinaus ist es
Fachleuten klar, daß die Sequenzen, die einen regulierbaren Promotor und die GAL4-
Kodierungssequenz enthalten, sich in der Hefewirtszelle entweder in einer integrierten
Form oder auf einem Plasinid befinden können und dennoch die regulierbare
Überproduktion des GAL4-Proteins zulassen können.
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Die Gattung Saccharomyces setzt sich aus einer Vielzahl von Spezies
zusammen. Am häufigsten wird S. cerevisiae, oder Bäckerhefe, als Wirtsorganismus
für die durch rekombinante-DNA vermittelte Expression unterschiedlicher fremder
Polypeptide verwendet. Jedoch sind die Unterschiede unter den anderen Spezies der
Gattung Saccharomyces nicht immer klar definiert. Viele dieser Arten sind in der Lage,
sich untereinander mit S. cerevisiae zu kreuzen, und es wurde bei ihnen gezeigt, daß
sie Galaktose-induzierbare Gene und positive regulatorische Proteine für die
Transeriptionsaktivierung solcher Gene besitzen. Der positive Regulator, der in S.
cerevisiae als GAL4 bekannt ist, kann von unterschiedlicher Struktur oder anderen
Namens als GAL4 sein und dennoch als Transcriptionsaktivator des
Galaktose-induzierbaren Promotors wirksam sein. Deshalb ist es Fachleuten klar, daß das Konzept
einen Stamm, bei dem das GAL4-Protein, oder andere positive Regulatoren für die
Transcriptionsaktivierung des Galaktose-induzierbaren Promotors in einer regulierbaren
Weise überproduziert werden können, zu verwenden, auf andere Arten der Gattung
Saccharomyces, einschließlich aber nicht begrenzt auf, carlsbergensis, norbensis,
diastaticus, oviformis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, und elongisporus
ausgedehnt werden kann.
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Mehrere Hefe-Gattungen, wie z. B. Hansenula, Candida, Torulopsis und
Pichia, weisen wie gezeigt ähnliche Stoffwechselwege für die Verwendung von
Methanol als alleiniger Kohlenstoffquelle zum Wachstum auf. Das Gen für die
Alkoholoxidase, ein Enzym das Teil dieses Stoffwechselwegs ist, ist aus Pichia pastoris
isoliert worden. Der S. cerevisiae Alkoholoxidase-Promotor ist isoliert worden, und es
ist gezeigt worden, daß er bezüglich der Methanol-Induktion der Expression
empfindlich ist. Der Promotor ist auf einen Expressionsvektor aufgebracht worden,
wobei es sich erwies, daß er die Expression von Fremdgenen, die benachbart davon
kloniert worden sind, anregt. Auf diese Weise ist das Prinzip, einen induzierbaren
Promotor zu benutzen, um die Expression von Fremdgenen in Arten anderer Hefe-
Gattungen zu steuern, wohlbekannt. Darüberhinaus können Arten anderer Hefe-
Gattungen eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen, einschließlich Galaktose, zum
Wachstum nutzen. Deshalb ist es Fachleuten klar, daß das Konzept der gesteigerten und
regulierbaren Expression eines positiven regulatorischen Elements als
einen Transcriptionsaktivator von Galaktose induzierbaren Promotoren, um die
Expression eines heterologen Gens, dessen Expression von einem
Galaktoseinduzierbaren Promotor angeregt wird, zu steigern die Reihe geeigneter
Hefewirtsorganismen aus Arten von Hefen der folgenden Familien erweitert:
Saceharomycetaceae und Cryptoeoccaceae, einschließlich aber nicht begrenzt auf Arten
der Gattungen Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kluyveromyces, und
Saccharomycopsis.
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Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung ohne jedoch
dieselbe hierauf zu begrenzen. Die Offenbarung jeder erwähnten Referenz in den
folgenden Beispielen wird hiermit als Referenz mit berücksichtigt.
BEISPIEL 1
Herstellung einer pGAL10/GAE4 Expressionskassette zur integrativen Transformation
Der E. coli - S. cerevisiae-shuttle-Vektor
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YEp51 (Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, S. 83,
Academic Press, 1983) enthält die Hefe-GAL10-Promotor-Sequenzen. Dieses Plasmid
wurde mit Sau3A und SalI geschnitten, und das 0,5 kbp GAL10-Promotorfragment
wurde durch präpararive Agarose-Gelelektrophorese isoliert (Fig. 1, oben). Zwei
Oligonukleotid-Linker wurden synthesisiert und an das 0,5 kbp Fragment gebunden und
somit 5'-Sau3A und die 3'-SalI-Enden zu EcoRI- bzw. BglII-Enden umgewandelt. Die
betreffenden Strukturen dieser Oligonukleotide sind
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CTGAATTC
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GACTTAAGCTAG
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und
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TCGAGATCTTAG
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CTAGAATC
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Nach anschließendem Schneiden mit EcoRI und BglII, wurde das 0.5 kbp EcoRI-BalII
GAL10-Promotor-Fragment mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert.
(Fig. 1, oben).
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Um das GAL4-Strukturgen frei von seinen eigenen Transcriptionskontroll-
Sequenzen zu isolieren, wurde pIA (Fig. 1, Mitte) gemäß des folgenden Verfahrens
hergestellt. pYe(CEN3)41 [Clark und Carbon, Nature 287: 504(1980)] wurde mit
PstI behandelt und das große Fragment mit sich selbst ligasiert, um das LEU2-Gen zu
entfernen und das bla-Gen wiederherzustellen. Das resultierende Plasmid pYC wurde
mit BamHI und SalI geschnitten und das große BamHI-SalI-Fragment wurde mit einem
2,4 kbp BglI-SalI-Fragment, welches das Hefe-LEU2-Gen trägt, das durch Behandlung
von YEp13 mit BglII und SalI isoliert worden war, ligasiert [Broach et al Gene., 8:121
(1979)]. Als Ergebnis dieser Ligation wird die BamHI Region in dem resultierenden
Plasmid pYCL-1 zerstört. Das Plasmid pAAR6 (Ammerer, Methods in Enzymology
101:192(1983)] wurde mit BamHI und HindIII geschnitten, und das 1,5 kbp BamHI-
HindIII-Fragment, das den Hefe-Alkoholdeliydrogenase I (ADHI)-Gen-Promotor
enthält, wurde isoliert. Das Plasmid pYCL-1 wurde daraufhin mit BglII und HindIII
behandelt und das resultierende große Vektor-Fragment wurde mit dem 1,5 kbp
BamHI-HindIII-ADHI-Promotor-Fragment ligasiert, um pYCLF, welches nicht die
BamHI-Region enthält, zu ergeben. Das GAL4-Gen wurde dann von pSJ3 [Johnston
und Hopper, Proc. Natl.Acad.Sci., U.S.A. 79: 6971(1982)] durch Schneiden mit
HindIII isoliert. Das resultierende 3,3 kbp HindIII-Fragment, das das GAL4-Gen
enthält, wurde dann in die nur einmal vorhandene HindIII-Region von pYCLF in der
richtigen Orientierung in der Weise, daß sich der ADHI-Promotor stromaufwärts des
GAL4-Strukturgens befand, eingefügt. Das resultierende Plasmid YCpLF+4 enthält
eine nur einmal vorhandene BamHI-Region, die von dem 3'-Ende des ADHI-Promotors
und dem Translationsstart des GAL4-Gens äquidistant (etwa 0,45 kbp) ist. YCpLF+4
wurde an der BamHI-Region geschnitten und dann mit der Exonuklease Bal-
31 behandelt, um Deletionen verschiedener Länge zu erzeugen. Die erhaltenen Enden
wurden mittels des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I mit glatten Enden
versehen, der BamHI-Linker wurde dann hinzugefügt und die Enden religasiert, wobei eine
Plasmid-Familie mit verschiedenen Fusionen des ADHI-Promotors an das GAL4-Gen
erzeugt wurde. Die anschließende Charakterisierung der erhaltenen Plasmide führte zur
Isolierung eines bestimmten Plasmids pIA, bei dem die BamHI-Region am 3'-Ende des
ADHI-Promotor fünf Basenpaare stromaufwärts des ATG-Translations-
Initiationskodons für das GAL4-Strukturgen lokalisiert war. Das -GAL4-Hefe-
Strukturgen (das die Translations-Start-Region einschließt) wurde aus dem Plasmid
pIA isoliert. Dieses Plasmid wurde mit BamHI und HindIII geschnitten, und ein 2,9
kbp GAL4-Fragment wurde mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert.
(Bild 1, Mitte). Der Plasmid-Vektor pJJ42 [Struhl et al., Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 47: 901(1982)] enthält das HIS3-Hefe-Gen. Dieses Plasmid wurde mit
EcoRI und HindIII, die innerhalb des HIS3-Promotors bzw. innerhalb des HIS3-Gens
spalten, geschnitten. Ein 12 kbp Vektor-Fragment wurde durch präparative Agarose-
Gelelektrophorese isoliert und gleichzeitig mit den 0,5 kbp und 2,9 kbp Fragmenten
wie oben beschrieben ligasiert, um das Plasmid pKHint-A zu ergeben (Fig. 1, unten).
Die GAL10/GAL4-Expressionskassette wurde aus dem pKHint-A durch Schneiden mit
BamHI und Isolierung des 5,6 kbp Fragments mittels präparativer Agarose-
Gelelektrophorese (Fig. 2, oben) entfernt. Der Plasmidvektor pJJ98, ein modifizierter
pBR322 ohne HindIII-Region, wurde mit BamHI behandelt und mit dem 5,6 kbp
Fragment ligasiert (Fig. 2, Mitte). Das resultierende Plasmid pKHint-B enthält eine nur
einmal vorhandene HindIII-Region, die am Carboxy-terminalen Ende der GAL4-
kodierenden Sequenz lokalisiert ist. Das voll funktionale URA3-Hefe-Gen wurde aus
dem E. coli-S. cerevisiae-shuttle-Vektor YEp24 [Botstein et al. Cell 8: 17(1979)]
durch Schneiden mit HindIII und Abtrennen des 1,2 kbp Fragments durch präparative
Agarose-Gelelektrophorese isoliert (Fig. 2, Mitte). Nach Schneiden mit HindIII wurde
das Plasmid pKHint-B mit dem 1,2 kbp HindIII-Fragment, das das URA3-Gen trägt,
ligasiert, um pKHint-C zu erhalten, welches nun die komplette Expressionskassette für
die Integration in das Hefechromosom enthält. Die entscheidenden Eigenschaften dieser
Kassette sind: 1) der regulierbare GAL10-Hefe-Promotor, 2) die GAL4-Translations-
Start-Region der Hefe und das Strukturgen, 3) der URA3-Hefe-Promotor der und das
Strukturgen für die positive Selektion in ura3-Hefewirtszelle, 4) zwei BamHI-
Regionen, die innerhalb der 5-, und 3'-translatierten Sequenz des HIS3-Gens für die
integrative Transformation an dem HIS3-Hefe-Chrososomen-Locuseine Spaltung
durchführen.
BEISPIEL 2
Herstellung neuer Hefe-Stämme
die eine integrierte pGAL10/GAL4-Expressionskassette enthalten
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Bei Schneiden mit BamHI, ergab das Plasmid pKHint-C eine 6,8 kbp
Expressionskassette, flankiert an jedem Ende durch nichttranslatierte HIS3-DNA-
Sequenzen (Fig. 3, oben). Die geschnittene DNA wurde benutzt, um die S. cerevisiae-
Wirts-Stämme Sc252 (MATa ura3-52, leu2-2-112, ade1, MEL1) [Johnston, et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79. 697(1982)] uiid Sc294 (MATa) ura3-52 ,leu2-2-
112, gal1-10-7, MEL1) zu transformieren. Als Targeting-Vorrichtungen wirkend,
lenken die BamHI-Enden die Expressionskassette zu dem chromosomalen HIS3-Locus, wo
die Kassette sich via homologer Rekombination integrierte (Fig. 3, Mitte).
Transformanten wurden für URA3&spplus; selektiert und einem Screening auf his3&supmin;
unterzogen. Die Southern-Blot-Analyse der klonierten Isolate, bestätigte, daß die Kassette am
HIS3-Locus integriert war. Transformanten und ihre betreffenden Elternstämme
wurden in synthetischem, selektivem (leu&supmin;) Glycerol-Milchsäure-Medium [Sherman et al.,
Methods in Yeast Genetics. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1979) ,
entweder mit oder ohne 2% (w/v) Galaktose wachsen gelassen. Nach der Ernte bei
A&sup6;&sup0;&sup0;= 1,5 wurden die RNA-Extrakte hergestellt [Zitomer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 76: 627(1979)] und mittels Northern-Blot-Techniken analysiert.
[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5201(1980)]. In Gegenwart von
Galaktose, wird beobachtet, daß die Transcription von GAL4-mRNA in den Sc252-
(pGAL10/GAL4) und Sc294- (pGAL10/GAL4) Stämmen gegenüber den betreffenden
Elternstämmen mindestens um das 20fache erhöht ist. Die Stämme zeigen in
Abwesenheit von Galaktose eine Expression der GAL4-mRNA auf Grundnivau. Auf
diese Weise erzeugen die neuen Hefestämme in Abwesenheit von Galaktose den
erwünschten Phänotyp einer GAL4-Expression auf Grundniveau und in Anwesenheit von
Galaktose eine Expression der GAL4 auf viel höherem Niveau (als die Wildtyp-
Stämme).
BEISPIEL 3
Herstellung eines Expressionsvektors mit
einem GAL10-Promotor, der die Expression von EMBA steuert
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Das Gen des alpha-mating-Factors-(α-Faktor)-MF(alpha) wurde auf einen
Plasmid-Vektor aus S. cerevisiae-Genom-DNA [Kurjan et al. Cell 30: 933(1982);
Singh et al., Nucleic Acids Res. 11: 4049(1983)] kloniert. Das erhaltene Plasmid
pKH2 wurde mit EcoRI geschnitten und das 1,7 kbp Fragment, das das Gen des
alphamating-Faktors trug, wurde mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese gereinigt
(Fig. 4, oben). Das Plasmid pRI148 (ein modifiziertes pBR322 mit fehlender HindIII-
Region) wurde mit EcoRI geschnitten und mit dem 1,7 kbp Fragment ligasiert und
ergab das Plasmid pRJ159 (Fig. 4, Mitte). Diese DNA wurde mit HindIII geschnitten
und mit sich selbst ligasiert, um das Plasmid pRJ67, welches nun eine nur einmal
vorhandene HindIII-Region hatte (Fig. 4, Mitte), zu bilden. Das Plasmid pRJ167 wurde
mit HindIII geschnitten und durch Insertion eines synthetischen Oligonukleotid-DNA-
Adaptors modifiziert und ergab ein neues Plasmid (pR3178), welches eine nur einmal
vorkommende HindIII-Region, die sich an der 3'-Seite des Promotors und des Prä-Pro-
Leaders und an der 5'-Seite des Translations-Terminationssignals in allen drei
Leserastern befindet (Fig. 4, unten) enthielt. Die HindIII-Region wurde durch
Schneiden mit HindIII in eine BamHI-Region umgewandelt, durch das Klenow-
Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, durch Zugeben von
BamHI-Linker und Ligasieren mit sich selbst umgewandelt, so daß sich das Plasmid
pJC193 bildete (Fig. 5, oben). Dieses Plasmid wurde mit EcoRI geschnitten, durch das
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, durch Zugabe
von BclI-Linkern modifiziert, mit BclI behandelt und das 1,5 kbp Fragment, das das
Gen des alpha-mating-Faktors trägt, durch präparative Agarose-Gelelektrophorese
isoliert (Fig. 5, Mitte). Dieses erhaltene BclI-Fragment wurde dann mit intestinaler
alkalischer Kalb-Phosphatase geschnitten und in die nur einmal vorkommende BAMHI-
Region des pC1/1 eingefügt, wobei bei diesem Verfahren die ursprüngliche BamHI-
Region zerstört wird (Plasmid pJC194, Fig. 5, unten). Diese DNA wurde mit BamHI
geschnitten und mit sich selbst ligasiert, um überschüssigen BamHI-Linker zu entfernen
(Plasmid pJC197, Fig. 5, unten).
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pJC197 wurde mit EcoRI und PstI geschnitten. Ein 0,7 kbp Fragment, das
einen Teil des Prä-Pro-Leaders des alpha-mating-Faktors, einen
Tianscriptionsterminator in drei Leserastern und den Transcriptionsterminator für den
alpha-mating-Faktor enthält, wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese
isoliert (Fig. 6, Mitte links). Der E coli-S. cerevisiae shuttle-Vektor YEp51 enthält die
GAL10-Sequenzen des Hefe-Gen-Promotors. Diese DNA wurde mit SAU3A
geschnitten, durch das Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen,
und mit synthetischen BamHI-Linkern der Struktur:
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CGGATCCG
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GCCTAGGC
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ligasiert. Die Linker-DNA wurde mit SalI geschnitten und ein 0,5 kbp GAL10-
Promotor-Fragment wurde mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert (Fig.
6, oben links). Ein 35 bp SalI - PstI synthetischer Oligonukleotid-
DNA-Adaptor mit der Struktur:
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TCGACCAAAAGAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA
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GGTTTTCTTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG
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wurde synthetisiert. Dieser Adaptor enthält 11 Basenpaare des nicht-translatierenden
Leaders des alpha-mating-Faktors und das ATG und die ersten 8 Aminosäuren des Prä-
Pro-Leaders des alpha-mating-Faktors. Das 0,5 kbp GAL10-Promotor- und das 35 bp
Adaptor-Fragment wurden miteinander ligasiert und mit BamHI geschnitten, um ein 5'-
BamHI-Ende zu erzeugen. Das erhaltene 0,5 kbp BamHI-PstI-GAL10-Promotor-
Fragment des alpha-mating-Faktors wurde durch präparative Agarose-
Gelelektrophorese isoliert (Fig. 6, Mitte). Der Plasmidvektor pBR322 wurde mit EcoRI
und BamHI geschnitten, und ein 4,0 kbp Vektor-Fragment wurde mittels präparativer
Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Die 4,0 kbp, 0,7 kbp und 0,5 kbp Fragmente
wurden miteinander ligasiert, um das Plasmid pKH2O7-1 (Fig. 6, unten links) zu erzeugen.
pKH2O7-1 wurde vollständig mit EcoRI und partiell mit BamHI geschnitten. Die 1,2
kbp BamHI-EcoRI-GAL10-Promotor-Expressionskassette des alpha-mating-Faktors
wurde mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert und durch das Klenow-
Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen (Fig. 7, Mitte). Der E.
coli - S. cerevisiae-shuttle-Vektor pCl/1 [Beggs, Nature 275:104 (1978); Rosenberg et
al., Nature 312: 77(1984)] wurde mit BAMHI und SalI behandelt, durch das Klenow-
Fraqment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen und mit der 1,2 kbp
Kassette ligasiert, um ein neues Expressionsplasmid zu erzeugen, pKH4 (Fig. 7, unten
rechts).
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Das B68' Plasmid [Hummel et al., J. Virol. 49: 413(1984)], welches das
BamHI-L DNA-Fragment, das das EBMA-Gen enthält, trägt, wurde mit XhoII und
ScaI geschnitten, und das 2,5 kbp Fragment, das das EBMA-Strukturgen enthält, wurde
durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen (Fig.
8, oben). Der Expression s-Vektor pKH4 wurde mit BamHI geschnitten und durch das
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen. Das 2,5 kbp
EBMA-Fragment wurde mit dem Vektor ligasiert. Dieses rekombinante Plasmid pkH4-
EBMA (Fig. 8, unten) hat die folgenden entscheidenden Eigenschaften: (1) die von E.
coli stammenden Sequenzen für die Selektion und Vervielfältigung des Plasmids in E.
coli, (2) die von S. cerevisiae stammenden Sequenzen für die Selektion und
Vervielfältigung des Plasmids in Hefe, (3) den GAL10-Hefe-Promotor, (4) den Prä-
Leader des Hefe-alpha-mating-Faktors, um das Translationsprodukt in das rauhe
endoplasmitische Retikulum zu lenken, (5) den Pro-Leader des Hefe-alpha-mating-
Faktors, der die N-Glykosylierungssignal-Sequenzen kodiert und der durch die KEX2
und STE13 Proteasen (Genprodukte) gespalten wird [Julius et al Cell 32: 839 (1983);
Julius et al., Cell 37:1075 (1984)], (6) die Kodierungs-Sequenz für EBMA, (7)
eine Terminationssequenz
auf Translationsebene und (8) eine Terminationssequenz auf
Transscriptionsebene.
BEISPIEL 4
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Expression der EMBA-Gene in neuen Hefe-Stämmen, die eine integrierte
pGAL10/GAL4 Expressionskassette enthalten
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Der Expressionsvektor pKH4-EMBA (Fig. 8, unten) wurde in die S.
cerevisiae-Stämme Sc252, Sc252 (pGAL10/GAL4) und Sc294 (pGAL10/GAL4) eingeführt.
Die Transformanten (mit pKH4-EBMA) wurde in synthetischen, selektivem
Glycerol-Milchsäure-Medium bis zu A&sup6;&sup0;&sup0; = 0,5-1,0 wachsen gelassen; zu diesem
Zeitpunkt wurde Galaktose bis zur Endkonzentration von 2% (w/v) hinzugefügt. Lysate
wurden hergestellt, einer Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen unterzogen und einem
Western-Blot auf Nitrocellulose unterworfen. Die Proteine von 375000 und 225000
und 175000 Dalton erwiesen sich für EBMA, kraft ihrer alleinigen Anwesenheit in
Transformanten, ihrer Reaktivität mit humanen, konvaleszenten EBV-Seren und eines
EBMA-spezifischen monoklonalen Antikörpers [Qualtiere et al., Proc Natl. Acad. Sci.
79: 616(1982)], und ihrem Fehlen an Reaktivität mit in einem Pool vereinigten
negativen Humanseren als spezifisch. Es wurde keine EBMA-spezifischen Proteine in
Kulturen, die in Abwesenheit von Galaktose angezogen worden waren, nachgewiesen.
24 Stunden nach der Zugabe von Galaktose, enthalten die 2 Stämme Sc252
(pGAL10/GAL4) und Sc294 (pGAL10/GAL4) jeweils das 10fache mehr an EBMA-
spezifischen Proteinen als der Stamm Sc252.