DE3486206T2 - Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen. - Google Patents

Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen.

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DE3486206T2
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Steven Rosenberg
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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Für die maximale Expression von Fremdgenen in mikrobiellen Systemen ist es gewöhnlich von Vorteil, homologe Regulationselemente innerhalb des Expressionsvektors zu verwenden. Es wird vermutet, daß die Effizienz der Expression (Produktbildung) eine Funktion von und proportional zu der Stärke des verwendeten Promoters ist. Zusätzlich bietet die Regulation der Genexpression durch Ernährungsfaktoren unter der Kontrolle des Experimentators ein weiteres nützliches, technisches Werkzeug. Die glykolytischen Enzymgene, z. B. diejenigen, die für Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) und Pyruvatkinase (PyK) kodieren, weisen die obigen nützlichen Eigenschaften auf, d. h. hohe Spiegel der Expression (und somit durch Wechselwirkung sehr wirksame Promoter) und die Fähigkeit der Regulation durch Komponenten des Züchtungsmediums. Zum Beispiel kann GAPDH bis zum 5% des Trockengewichts an handelsüblicher Bäckerhefe ausmachen (Krebs, E.G., J.Biol. Chem. (1953) 200 : 471). Weiterhin sind diese Enzyme auch in hohem Ausmaß beeinflußbar. Wenn z. B. Hefekulturen von der Züchtung auf Acetat auf die auf Glucose umgestellt werden, nahm die Aktivität von GAPDH bis auf das 200fache in Verhältnis zu der Konzentration des Zuckers in dem Medium zu (Maitra, P.K. und Lobo, Z., J.Biol. Chem. (1971) 246 : 475). Diese Ergebnisse legen nahe, daß der transkriptionelle Mechanismus dieser Gene in hohem Ausmaß reguliert ist, eventuell durch die Teilnahme von DNA-Sequenzen, die in der 5'-nicht-kodierenden Flankenregion der Gene vorhanden sind.
  • Die Erfindung betrifft die Isolierung, Struktur und die erfolgreiche Verwendung in Hefeexpressionsplasmiden von DNA-Fragmenten, die den 5'-nicht-kodierenden Regionen der regulierbaren Hefegene GAPDH und PyK entsprechen. Diese Fragmente, die DNA-Sequenzen mit starker, die Transkription fördernder Wirkung enthalten, werden "Promoter" genannt. Sie sind ideale Komponenten von DNA-Vektoren für die kommerzielle Herstellung von großen Mengen von von Fremdgenen unter transkriptioneller Kontrolle derselben kodiertem Protein.
  • Zusätzlich betrifft die Erfindung Hefeexpressionsplasmide, die weiterhin einen geeigneten Terminator zur Ausbildung einer "Kassette", gebildet von Promoter/Fremdgen/Terminator, enthalten. Die Anwesenheit des Terminators verstärkt die Expression der Fremd-DNA.
  • Ein früherer Versuch zur Expression von Fremd-DNA in Hefe schlug fehl (Beggs, J.D. et al, Nature (1980) 283 : 285). In diesem Bericht wurde die Hämoglobin-DNA (insertiert mit ihrem eigenen Promoter) transkribiert, die RNA wurde jedoch nicht gespleißt. Eine Anzahl von Erklärungen für dieses Ergebnis ist möglich, z. B. ein falscher Ort für die Initiation der Transkription und/oder die schlechte Fähigkeit der Hefezellen zur Durchführung des Spleißens von Zwischensequenzen (Introns).
  • Es wurden drei GAPDH-Gene der Hefe kloniert (Holland, M.J. et al, Basic Life Science (1981) 19 : 291), ihre Promoter wurden jedoch nicht zur Konstruktion von Expressionssystemen in Hefe mittels rekombinanter Methoden verwendet. Das PyK-Gen wurde ebenfalls kloniert, jedoch lediglich durch genetische Komplementation (es wurden keine strukturellen Studien durchgeführt) (Kawasaki, G. und Fraenel, D.G., Biochem. Biophys. Res. Comm.
  • (1982) 108 : 1107). Andere Hefepromoter, z. B. der von Alkoholdehydrogenase I (Valenzuela, P. et al, Nature (1982) 298 : 347 und Hitzeman, R.A. et al, Nature (1981) 293 : 717) und von Phosphoglyceratkinase (Tuite, M.F. et al, EMBO J. (1982) 1:603 und Hitzeman, R.A. et al, Science (1983) 210 : 620) sind mit Fremdgenen verknüpft worden, um eine Hefeexpression zu ergeben; es wurden jedoch keine Terminatoren verwendet. Die vorliegende Erfindung ist auf neuen Promoter für Hefeexpressionssysteme gerichtet und kombiniert die Vorteile von hochexpressiven Promotern mit der verbesserten Expression, von geeignet ligierten Terminatoren gefunden wird.
  • Eine veröffentlichte europäische Patentanmeldung (072 318) offenbart die Konstruktion eines Hefeexpressionsvektors, der bei der Induktion Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg)-S-protein unter Kontrolle des Hefe-Alkoholdehydrogenase I (ADHI)-Promoters exprimierte.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen Hefeexpressionsvektor mit einem Segment einer Fremd-DNA, d. h. derjenigen, die für das Hepatitis-B-Virus (HBV)-Oberflächenantigen (HBsAg) unter transkriptioneller Kontrolle eines Hefe-Pyk-Promotors kodiert. Es können auch Terminatoren in geeigneter Weise angefügt werden. Der Expressionsvektor weist typischerweise einen Hefe-Replikationsstartpunkt auf und kann in jedem der Zelltypen replizieren. Der Expressionsvektor ergibt bei der Verwendung zur Transformation von Hefezellen erhebliche Mengen des von dem Segment der Fremd-DNA kodierten Proteins.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 Isolation und Zurichtung eines GAPDH-Promoterfragments.
  • Fig. 2 DNA-Sequenz des GAPDH-Promoterfragments.
  • Fig. 3 Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, enthaltend den GAPDH-Promoter.
  • Fig. 4 Nukleotidsequenz des Pyruvatkinase (PyK)-Gens.
  • Fig. 5 Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, enthaltend die PyK-Promoterregion.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Im Prinzip haben Hefeexpressionsplasmide spezielle Vorteile, die die folgenden einschließen. Hefe kann in Kulturen groben Maßstabs für die kommerzielle Herstellung mittels der Fachwelt bekannter Verfahren gezüchtet werden. Im Gegensatz hierzu unterliegen Bakterien in Kulturen groben Maßstabs dem häufigen Problem des Phagenverlusts ("phage-out"). Hefe scheint auch ziemlich die gleiche Fähigkeit wie Säugetierzellen zum Anfügen von Kohlehydratgruppen an neusynthetisierte Proteine zu haben, eine Fähigkeit, die Bakterien nicht aufweisen. Da nun cDNA- Sequenzen leicht zugänglich sind, kann das Problem der Expression von Genen mit Introns leicht umgangen werden.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen Promoter ungewöhnlich hoher Wirksamkeit. Ein Promoter ist im folgenden als DNA-Segment definiert, das zur Initiation der Transkription eines benachbarten DNA-Segmentes funktionieren kann. Die Transkription ist die Synthese von RNA (im folgenden als Messenger-RNA oder mRNA) bezeichnet, welche komplementär zu einem Strang der der Promoterregion benachbarten DNA ist. In Eukaryoten wird die Messenger-RNA-Synthese durch ein RNA-Polymerase 11 genanntes Enzym katalysiert. Die minimalen essentiellen Elemente der Promoterfunktion sind die folgenden: Bereitstellung eines Ausgangspunkts für die Initiation der Transkription und Bereitstellung eines Bindungsortes für RNA-Polymerase 11 in der Nähe des Starts, damit die Selektion des geeigneten DNA-Stranges als ein Templat für die Messenger-RNA-Synthese möglich wird. Zusätzlich wirkt ein eukaryotischer Promoter zur Regulierung der relativen Wirksamkeit der Transkription von Kodierungssegmenten unter seiner Kontrolle. Ein aktiver Promoter ist ein solcher, der die Synthese von relativ groben Mengen von mRNA, komplementär zu einem Strang des benachbarten DNA-Kodierungssegmentes, herbeiführt.
  • Die strukturellen Korrelationen der Promoterfunktion sind nicht eindeutig festgelegt worden. Ein Promotersegment kann gewöhnlich in der Natur als eine Region identifiziert werden, die benachbart zu den 5'-Ende eines gegebenen Strukturgens liegt (die Bezugnahme auf 5'- und 3'-Enden eines Gens ist so zu verstehen, daß damit die entsprechenden jeweiligen Enden der davon transkribierten mRNA angegeben wird, und diese ist ihrerseits so zu verstehen, daß sie mit den NH&sub2;- und -COOH- Termini des kodierten Proteins korreliert).
  • Vergleiche der Nukleotidsequenzen von Promotern verschiedener Gene aus verschiedenen Arten haben lediglich einige kurze Regionen mit einer Ähnlichkeit der Nukleotidsequenzen ergeben, die diesen gemeinsam ist. Die auf fälligste hiervon ist die "TATA-Box", ein Segment von etwa 5 bis 10 Nukleotiden, die allgemein etwa 70 bis 230 Nukleotide stromaufwärts von dem Ort der Initiation der Transkription liegt und eine Sequenz aufweist, die im allgemeinen TATAA ähnelt. Für einen Überblick von Strukturvergleichen siehe Breathnach, R. und Chambon, P., Ann. Rev. of Biochem. (1981) 50 : 349. Die TATA-Box funktioniert vermutlich bei der Initiation der Transkription.
  • Das Fremdgen ist frei oder im wesentlichen frei von Kodons aus dem normalen Strukturgen, das mit dem Promoter assoziiert ist. Gewöhnlich ist das Fremdgen mit einem nicht-kodierenden 3'-Ende der Regulationsregion verknüpft, welche den Promoter umfaßt, so daß sie frei von den Aminosäuren an den N-Terminus von endogenen Genen, die in der Natur mit den Regulationsregionen assoziiert sind, sind. Dies bedeutet, daß weniger als drei Kodons (9 Nukleotide) mit der Regulationsregion behalten werden, wenn sie mit dem Fremdgen verknüpft wird.
  • Die Anwesenheit der Terminatorsequenz an dem 3'-Ende des Kodierungssegmentes verbessert die Expression. Der Effekt ist allgemein ähnlich der Zugabe des rho-Faktors zu prokaryotischen Transkriptionssystemen, bei denen die Geschwindigkeit der Freisetzung der RNA-Polymerase vergrößert wird, um eine Zunahme in der Geschwindigkeit der Initiation der Transkription zu ergeben. Es ist hervorzuheben, daß, während die Terminatorsequenzen für die meßbare Expression von Fremd-DNA-Segmenten nicht erforderlich ist, es vorteilhaft ist, diese in geeigneter Weise zur Verbesserung der Expression anzuhängen. Die Terminatorregion kann natürlich mit dem gleichen oder einem unterschiedlichen Strukturgen als Promoterregion assoziiert sein.
  • Der am besten geeignete DNA-Vektor für die PyK-Konstruktion der vorliegenden Erfindung ist ein Schaukelvektor bzw. Shuttlevektor. Diese Vektoren können zwischen einem Bakterienstamm wie E.coli und Hefe "schaukeln", da sie einen bakteriellen Startpunkt der Replikation und einen Hefestartpunkt der Replikation haben, vgl. z. B. Ammerer G. et al, Recombinant DNA, Proc. Third Cleveland Symposium Macromolecules (Walton, A.G., ed.), p. 185, Elsevier, Amsterdam (1981). Ein typischer bakterieller Startpunkt der Replikation ist von z. B. pBR322 abgeleitet. Der nützlichste Hefestartpunkt der Replikation wird in dem extrachromosomalen genetischen Element gefunden, das als 2-Mikron-Ring bekannt ist. In Laboratoriumsstämmen wird die 2-Mikron-Plasmid-DNA in etwa 50 Kopien pro Zelle gefunden und stabil gehalten. Für eine Übersicht vgl. z. B. Curr. Topics Micro. Imm. (1982) 96 : 119. Dieses Hefeplasmid ist auch sequenziert worden (Hartley, J. L. et al, Nature (1980) 286 : 860).
  • Repräsentative Proben der Plasmide und Wirtszellen, die in den Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt. Das Plasmid pPyK 9.1.1 und die Hefezellen-Transformanten 2150-2-3/pHBS-56 GAP347/33 und 2150-2-3/pHBSs6PyK wurden am 18. Februar 1983 hinterlegt und haben die ATCC-Zugriffsnummern 40061, 20665 und 20666 erhalten.
  • In den folgenden Beispielen sind zahlreiche der Arbeitsweisen, Reaktionen und Trennverfahren in der Fachwelt bereits bekannt. Sämtliche Enzyme, wenn nichts anderes angegeben ist, können aus einer kommerziellen Quelle oder mehreren bezogen werden, z. B. New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Collaborative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Laboratories, Elkhart, Indiana; Beohringer Biochemicals, Inc., Indianapolis, Indiana und Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland. Puffer und Reaktionsbedingungen für den Verdau mit Restriktionsenzymen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller für jedes Enzym eingesetzt, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Standardmethodik für andere Enzymreaktionen, Gelelektrophorese-Trennungen und E.coli-Transformation können in Methods in Enzymology, (1979) 68, gefunden werden. Die Transformation von Hefeprotoplasten kann im wesentlichen wie von Beggs, Nature (1978) 275 : 104 beschrieben durchgeführt werden.
  • E.coli-Stämme, die für die Transformation verwendbar sind, schließen X1776; K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), RR1 und HB101 ein. Hefestämme XV610-8c mit dem Genotyp (a ade2 ade6 leu2 lys1 trp1 can1) und GM-3C-2, Genotyp: (Leu2 Trp1 His4 CYC1-1CYP3-1) (Faye, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1981) 78 : 2258) können in typischer Weise für Hefetransformationen verwendet werden. Die Bakterien können gezüchtet und selektiert werden, entsprechend den von Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) beschriebenen Verfahren. Die Hefe kann auf den folgenden Medien gezüchtet werden: YEPD enthaltend 1% (W/V) Hefeextrakt, 2% (W/V) Pepton und (W/V) Glukose; und im Falle des Plattierungsmediums, 3% (W/V) Agar. YNB plus CAA enthält 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (Difco Laboratories, Minneapolis, Minnesota), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g Casaminosäuren (CAA) (Difco), 20 g Glukose und im Falle von Plattierungsmedien 30 g Agar pro Liter. Die Selektion auf Tryptophanprototrophie kann auf Platten erfolgen, die 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (mit fehlenden Aminosäuren), supplementiert für alle Züchtungserfordernisse des zu transformierenden Stamms, ausgenommen Tryptophan, enthalten.
    • Vergleichsbeispiel 1 Klonierung des Hefe-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Gens
  • Eine die Hefe-GAPDH-Kodierungssequenzen enthaltende komplementäre DNA (cDNA) wurde in der folgenden Weise hergestellt:
  • PolyA+ RNA wurde aus dem Hefestamm A364A isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von AMV-reverser-Transkriptase und E.coli-DNA-Polymerase I synthetisiert. Poly-dC- Schwänze wurden an das doppelsträngige cDNA-Molekül unter Verwendung von Deoxynukleotid-terminaler Transferase angehängt. Die poly-dC-schwänzige cDNA wurde mit poly-dG-schwänzigem pBR322 vereinigt und zur Transformation von E.coli HB101 verwendet. 1.000 Transformanten wurden durch Kolonie-Hybridisierung an markierte PolyA+ RNA gescreened und eine Untergruppe wurde durch Kartierung mit Restriktionsendonuklease und durch DNA-Sequenzierung weiter untersucht. Drei GAPDH-Sequenzen enthaltende Klone wurden aus dem Pool isoliert. Ein Klon (pcGAP-9) enthielt einen Insert von etwa 1.200 Basenpaaren (bp) und wurde für die weiteren Arbeiten verwendet.
  • Eine Hefegenbibliothek wurde durch Insertion von Fragmenten, erhalten nach partiellem Verdau von Gesamthefe-DNA mit der Restriktionsendonuklease Sau3A, in den lambda-Phagen Charon 28, gemäß Blattner, F. R. et al, Science (1977) 196 : 161-169 hergestellt. Verschiedene Fragmente, die Hefe-GAPDH-Kodierungssequenzen erhielten, wurden isoliert, indem man die Phagenbibliothek mit markierter DNA aus pcGAP-9 screente. Das Hefe GAPDH-Gen von einem dieser Klone wurde in pBR322 als 2,1 kb HindIII-Fragment (pGAP-1, vgl. Fig. 1) oder als 3,5 kb BamHI-Fragment (pGAP-2) subkloniert. Die GAPDH-Promoter-aktiven Fragmente wurden von diesen Klonen isoliert. Das HindIII-HhaI-Fragment von etwa 800 bp wurde an das HhaI-HindIII-Fragment von etwa 350 bp ligiert. Das erhaltene 1061 bp HindIII-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in pBR322, (pGAP-347) kloniert sowie die Sequenz bestimmt (vgl. Fig. 2).
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Konstruktion von Hefevektoren, enthaltend den GAPDH-Promoter, wirksam in der Expression von HBsAg.
  • Ein Plasminvektor (pHBS-56GAP347/33) für die Expression von HBV-Oberflächenantigen in Hefe unter Verwendung des GAPDH-Promoterfragmentes wurde wir in Fig. 3 gezeigt konstruiert.
  • Der Gesamtverdau von pGAP-347 mit SphI, gefolgt von dem partiellen Verdau mit HindIII ergab ein ungefähr 1700 bp SphI-HindIII-Fragment mit etwa 1060 bp des GAPDH-Promotors und etwa 53 bp von pBR322. Das 1700 bp SphI-HindIII GAPDH-Promotorfragment wurde mit dem 840 bp HindIII-HindIII-Fragment (enthaltend die HBsAg-Kodierungsregion, 26 Basen der 5'-nicht-kodierenden Region und 128 bp der 3'-nicht-kodierenden Region, erhalten aus pHBS-56) und anschließend mit dem 350 bp HindIII-SphI-Fragment, enthaltend die ADH-I Terminatorregion (isoliert aus pHBS-56), ligiert. Das 2900bp SphI-Fragment (Kassette) wurde isoliert und in pHBS-56, vorher verdaut mit SphI, kloniert. Das Plasmid pHBS-56 (ATCC Zugriffsnummer 40047) ist in einer anhängigen Anmeldung (EPA No. 82.491.473, veröffentlicht als No. 72318 der Regents of the University of California) beschrieben worden und enthält das gesamte 2- Mikronplasmid zusätzlich zu einer Region mit dem Hefe-leu2-Gen und dem amp-Resistenzort von pBR322. Das erhaltende Plasmid (pHBS-56GAP347/33), in dem der Promotor, das Gen und die Terminationsregionen sich in den geeigneten Orientierungen befanden, wurde isoliert und zur Transformation des Hefestamms AB102 (MATa, pep 4-3, leu 2-3 leu2-112, ura 3-52, his 4-580, cirº) oder des Stammes 2150-2-3 (MATa, adel, leu2-04, cirº) verwendet. Der Stamm AB102 wurde von SF657-9c durch Reifung von zwei Mikron-Plasmiden abgeleitet. Der Stamm 2150-2-3 stammt aus der Sammlung von Dr. Leland Hartwell an der Universität von Washington.
    • Beispiel 1 Klonierung des Hefe-Pyruvatkinase-Gens
  • Das Pyruvatkinase-Gen wurde durch Komplementierung kloniert. Ein Hefemutant mit Pyruvatkinase-Minus wurde mit einem Pool von Rekombinanten YEp24-Plasmiden transformiert, die Wild- Typ-Hefegenom-DNA enthielten. Die Hefestämme 5288C (Genotyp: SUC2, mal, gal2, CUP1) und pyk 1-5 (Genotyp: a, ade1, leu1, met14, ura3, pyk1-5) wurden von dem Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics, University of California, Berkeley, erhalten. Die verwendete Hefegenom-Bank bestand aus einem partiellen Sau3A-Verdau von gesamt DNA aus dem Stamm 5288C, kloniert in den BamHI-Ort des "shuttle"-Vektors YEp24. Der Vektor YEp24 enthält pBR322-Sequenzen für die Selektion und Züchtung in Bakterien, das Hefe-URA3-Gen für die Selektion in Hefe und EcoRI-Fragment des Hefe-2u-Rings zur Gewährleistung der Plasmidreplikation und Segretation in Hefe. Der Pool schließt ausreichend unabhängige rekombinante Plasmide ein, um das gesamte Hefegenom zu repräsentieren.
  • Der Stamm pyk1-5 ist nicht in der Lage, auf Glukose enthaltendem und Uracil mangelndem Medium zu wachsen, und zwar infolge Mutationen in diesem Stamm an den Pyk1 und URA3-Orten. Die Transformation dieses Stammes mit der YEp24-Genom Bibliothek und die Selektion auf Transformanten, die auf Uracil-Mangelmedien und Glukose enthaltenden wachsen können, selektiert für solche Zellen, die das Pyruvatkinase-Gen enthaltendes YEp24 erworben haben. Die Transformation von 3,5 · 10&sup8; pyk1-5 Hefezellen mit 10 ug YEp24-rekombinanter Plasmidpool DNA ergab 5 unabhängige Transformanten, die in Abwesenheit von Uracil und in der Anwesenheit von Glukose wuchsen.
  • Die Charakterisierung der Insertions-DNA dieser Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse zeigte, daß diese überlappende DNA-Insertionen enthielten. Wir konzentrierten uns auf einen einzelnen Transformanten, pPyk9.1, der eine 7,0 kb-Insertion enthielt. Das Pyruvatkinase-Gen wurde innerhalb dieser Insertien lokalisiert, indem bestimmt wurde, welche insert-spezifischen Restriktionsfragmente mit einer mRNA von etwa 1,7 kb, erwartet für die Pyruvatkinase-mRNA, hybridisierte. Die Lokalisierung des pPyK-Gens wurde durch Subklonierung geeigneter Regionen der Insert-DNA und Beobachtung der Komplementierung der Funktion in dem pykl-5-Mutanten bestätigt. Ein Subklon pPyK 9.1.1, der das PyK-Gen auf einer 4,4 kb-Insert erhielt, wurde sequenziert und bei der Konstruktion von Expressionsplasmid verwendet.
    • Beispiel 2 Sequenz des Hefe-Pyruvatkinase-Gens
  • Insgesamt 2885 Nukleotide des Pyk-Gens sind sequenziert worden, einschließlich 1497 Nukleotiden in einem einfachen offenen Leseraster, 911 Nukleotiden einer 5'-nicht-translatierten Region und 477 Nukleotiden einer 3'-translatierten Region (vgl. Fig. 4). Das Gen klodiert ein Polypeptid mit 499 Aminosäuren und ergibt ein monomeres Molekulargewicht von 54608 Dalton, was gut mit dem erwarteten Wert für Hefe-Pyk übereinstimmt. Die Aminosäure-Zusammensetzung, abgeleitet von der Nukleotidsequenz, entspricht auch in derjenigen, die an dem isolierten Hefeprotein gemessen wurde. Die Nukleotidsequenz sagt ein carboxy-terminales Valin voraus, das bei Hefe-Pyruvatkinase gefunden wurde.
    • Beispiel 3 Konstruktion von Hefe-Expressionsplasmiden unter Verwendung der Pyruvatkinase-Promoterregion
  • Es wurden zwei verschiedene Konstrukte hergestellt. pHBS16 PyK und pHBSs6 PyK. Die Verfahren sind in Fig. 5 erläutert.
  • Das Plasmid pPyK 9.1.1, das das Hefe-PyK-Gen, kloniert in pBR322, enthält, wurde mit XbaI verdaut und die überstehenden Enden mit Deoxynukleotiden unter Verwendung von DNA Polymerase I aufgefüllt. Das Produkt wurde mit BamHI verdaut, um schließlich ein 912 BamHI-stumpfes Fragment zu isolieren, das den PyK-Promoter und 8 Basen von der PyK-Kodierungsregion enthält. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pHBS-6 ligiert (enthält das HBsAg-Gen, in der die 5'-nicht-kodierende Region deletiert wurde, kloniert in pBR322), welches zuvor mit Nco verdaut, unter Verwendung von DNA-Polymerase aufgefüllt und mit BamHI verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli, wurde pHBS-6PyK isoliert. Dieses Plasmid enthält den PyK-Promoter mit Kodons für 3 extra-Aminosäuren, fusioniert in Phase mit der HBsAg-Kodierungssequenz
  • ATGTCTAG CATG
  • pHBS-6PyK wurde mit BamHI vollständig verdaut und partiell mit EcoRI verdaut, wobei ein 1750 bp BamHI-EcoRI-Fragment isoliert wurde, welches den PyK-Promoter, fusioniert an das HBsAg-Gen, enthielt. Dieses 1750 bp-Fragment wurde an das große Fragment ligiert, welches nach Verdau von pHBS-16 (ATCC Zugangsnummer 40043, Plasmid beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 82 401 473.2 (EP-A-72 318)) mit BamHI und EcoRI erhalten und zur Transformation von E.coli. verwendet wurde. Man erhielt das Hefe-Expressionsplasmid pHBS-16PyK. pHBS-16PyK wurde vollständig mit SphI und XbaI verdaut, und man isolierte ein 1200 bp SphI-XbaI-Fragment (enthaltend 200 bp pBR322, den PyK-Promoter und 100 bp der 5'-Region des HBsAg-Gens). Dieses 1200 bp SphI-XbaI-Fragment wurde an ein 1070 bp XbaI-SphI-Fragment (isoliert aus pHBS-56), das das 3'-Ende des HBsAg-Gens und den ADH-1-Terminator enthielt, ligiert. Nach der Digestion mit SphI wurde ein SphI-SphI-2300 bp-Fragment (Kassette), enthaltend den PyK-Promoter, das HBsAg-Gen und den ADH-1-Terminator, isoliert. Dieses Kassetten-Fragment wurde in pHBS-56 kloniert, welches zuvor mit SphI verdaut wurde. Das Hefe-Espressionsplasmid pHBS-56 PyK wurde erhalten. Dieses Plasmid wurde zur Transformierung des Hefestammes AB102 verwendet (vgl. Vergleichsbeispiel 2) oder des Stammes 2150-2-3 (vgl. Vergleichsbeispiel 2).
    • Beispiel 4 Synthese von HBsAg in Hefe unter PyK-Promoterkontrolle
  • 100 ml Kulturen des Stammes AB102, enthaltend das Plasmid pHBS-56 PyK, wurden auf optische Dichten bei 650 nm von 1-2 gezüchtet. Zellfreie Lysate wurden durch Rühren mit Glasperlen und Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugieren hergestellt. HBsAg wurde mittels des Abbott-Ausriall-Radioimmunoassays bestimmt und die Protein-Konzentration wurde durch die Coomassie-Blau-Bindungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Sie zeigen, daß der PyK-Promoter mindestens zweimal wirksamer als der ADH1-Promoter bei der Expression des Proteinprodukts in Hefe ist. Tabelle 2: Synthese von HBsAg in Hefe (a) aus pHBS-56 (Vergleich, ADH-I Promoter) Beispiel Nr. Protein (mg/ml) Spez. Aktivität (ugsAg/mg Protein) (b) aus pHBS-56 PyK (PyK-Promoter)
  • Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn der Hefestamm 2150-2-3 durch den Hefestamm AB102 ersetzt und das Beispiel 7 wiederholt wurde.

Claims (10)

1. Hefeexpressionsvektor, enthaltend ein Segment einer Fremd-DNA unter Transkriptionskontrolle eines Hefe-Pyrovatkinasepromoters, wobei das genannte Segment sich in korrekter Orientierung zur Transkription befindet und weniger als 3 Kodons der Hefe-Pyruvatkinase am 5'-Ende der genannten Fremd-DNA aufweist und wobei die genannte Fremd-DNA für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder einen Teil desselben kodiert.
2. Hefeexpressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend einen Terminator, welcher an das 3'-Ende des Segmentes der Fremd-DNA angeheftet ist.
3. Hefeexpressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend eine Hefe-2-Mikron-Plasmid-DNA oder einen Teil derselben.
4. Plasmid 2150-2-3-pHBs56Pyk mit der ATCC-Zugriffsnummer 20666.
5. Verfahren zur Expression eines DNA-Kodierungssegmentes in Hefe mit den Schritten
a) Insertion des Kodierungssegmentes in einen Hefeexpressionsvektor, wobei der genannte Vektor ein DNA-Segment umfaßt, das von einem Hefe-Pyruvatkinasepromoter mit weniger als 3 Kodons von 5'-Ende der Pyruvatkinase abgeleitet ist, wobei sich der Promoter benachbart zu dem 5'-Ende des insertierten DNA-Kodierungssegmentes befindet und so ausgerichtet ist, daß die innerhalb des Promoters initiierte Transkription das Kodierungssegment einschließt, wodurch ein Kodierungssegment-Expressionsvektor gebildet wird, in dem die Fremd-DNA für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder einen Teil des selben kodiert, und
b) Transformation von Hefezellen mit dem Kodierungssegment-Expressionsvektor.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der genannte Hefeexpressionsvektor weiterhin einen an das 3'-Ende des insertierten DNA-Kodierungssegmentes angehefteten Terminator umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der genannte Hefeexpressionsvektor weiterhin einen Bakterienzellen-Replikationsorigin aufweist und zur Replikation in einer Bakterienzelle befähigt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Hefe-Alkoholdehydrogenase-Terminator umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Hefe-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Terminator umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Pyruvatkinase-Terminator umfaßt.
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