DE3486206T2 - Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen. - Google Patents

Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen.

Info

Publication number
DE3486206T2
DE3486206T2 DE89106868T DE3486206T DE3486206T2 DE 3486206 T2 DE3486206 T2 DE 3486206T2 DE 89106868 T DE89106868 T DE 89106868T DE 3486206 T DE3486206 T DE 3486206T DE 3486206 T2 DE3486206 T2 DE 3486206T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
yeast
dna
terminator
expression vector
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE89106868T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3486206D1 (de
Inventor
Rae Lyn Burke
Steven Rosenberg
Olson Patricia Tekamp
Pablo D T Valenzuela
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23860419&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE3486206(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of DE3486206D1 publication Critical patent/DE3486206D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3486206T2 publication Critical patent/DE3486206T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Toys (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Für die maximale Expression von Fremdgenen in mikrobiellen Systemen ist es gewöhnlich von Vorteil, homologe Regulationselemente innerhalb des Expressionsvektors zu verwenden. Es wird vermutet, daß die Effizienz der Expression (Produktbildung) eine Funktion von und proportional zu der Stärke des verwendeten Promoters ist. Zusätzlich bietet die Regulation der Genexpression durch Ernährungsfaktoren unter der Kontrolle des Experimentators ein weiteres nützliches, technisches Werkzeug. Die glykolytischen Enzymgene, z. B. diejenigen, die für Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) und Pyruvatkinase (PyK) kodieren, weisen die obigen nützlichen Eigenschaften auf, d. h. hohe Spiegel der Expression (und somit durch Wechselwirkung sehr wirksame Promoter) und die Fähigkeit der Regulation durch Komponenten des Züchtungsmediums. Zum Beispiel kann GAPDH bis zum 5% des Trockengewichts an handelsüblicher Bäckerhefe ausmachen (Krebs, E.G., J.Biol. Chem. (1953) 200 : 471). Weiterhin sind diese Enzyme auch in hohem Ausmaß beeinflußbar. Wenn z. B. Hefekulturen von der Züchtung auf Acetat auf die auf Glucose umgestellt werden, nahm die Aktivität von GAPDH bis auf das 200fache in Verhältnis zu der Konzentration des Zuckers in dem Medium zu (Maitra, P.K. und Lobo, Z., J.Biol. Chem. (1971) 246 : 475). Diese Ergebnisse legen nahe, daß der transkriptionelle Mechanismus dieser Gene in hohem Ausmaß reguliert ist, eventuell durch die Teilnahme von DNA-Sequenzen, die in der 5'-nicht-kodierenden Flankenregion der Gene vorhanden sind.
  • Die Erfindung betrifft die Isolierung, Struktur und die erfolgreiche Verwendung in Hefeexpressionsplasmiden von DNA-Fragmenten, die den 5'-nicht-kodierenden Regionen der regulierbaren Hefegene GAPDH und PyK entsprechen. Diese Fragmente, die DNA-Sequenzen mit starker, die Transkription fördernder Wirkung enthalten, werden "Promoter" genannt. Sie sind ideale Komponenten von DNA-Vektoren für die kommerzielle Herstellung von großen Mengen von von Fremdgenen unter transkriptioneller Kontrolle derselben kodiertem Protein.
  • Zusätzlich betrifft die Erfindung Hefeexpressionsplasmide, die weiterhin einen geeigneten Terminator zur Ausbildung einer "Kassette", gebildet von Promoter/Fremdgen/Terminator, enthalten. Die Anwesenheit des Terminators verstärkt die Expression der Fremd-DNA.
  • Ein früherer Versuch zur Expression von Fremd-DNA in Hefe schlug fehl (Beggs, J.D. et al, Nature (1980) 283 : 285). In diesem Bericht wurde die Hämoglobin-DNA (insertiert mit ihrem eigenen Promoter) transkribiert, die RNA wurde jedoch nicht gespleißt. Eine Anzahl von Erklärungen für dieses Ergebnis ist möglich, z. B. ein falscher Ort für die Initiation der Transkription und/oder die schlechte Fähigkeit der Hefezellen zur Durchführung des Spleißens von Zwischensequenzen (Introns).
  • Es wurden drei GAPDH-Gene der Hefe kloniert (Holland, M.J. et al, Basic Life Science (1981) 19 : 291), ihre Promoter wurden jedoch nicht zur Konstruktion von Expressionssystemen in Hefe mittels rekombinanter Methoden verwendet. Das PyK-Gen wurde ebenfalls kloniert, jedoch lediglich durch genetische Komplementation (es wurden keine strukturellen Studien durchgeführt) (Kawasaki, G. und Fraenel, D.G., Biochem. Biophys. Res. Comm.
  • (1982) 108 : 1107). Andere Hefepromoter, z. B. der von Alkoholdehydrogenase I (Valenzuela, P. et al, Nature (1982) 298 : 347 und Hitzeman, R.A. et al, Nature (1981) 293 : 717) und von Phosphoglyceratkinase (Tuite, M.F. et al, EMBO J. (1982) 1:603 und Hitzeman, R.A. et al, Science (1983) 210 : 620) sind mit Fremdgenen verknüpft worden, um eine Hefeexpression zu ergeben; es wurden jedoch keine Terminatoren verwendet. Die vorliegende Erfindung ist auf neuen Promoter für Hefeexpressionssysteme gerichtet und kombiniert die Vorteile von hochexpressiven Promotern mit der verbesserten Expression, von geeignet ligierten Terminatoren gefunden wird.
  • Eine veröffentlichte europäische Patentanmeldung (072 318) offenbart die Konstruktion eines Hefeexpressionsvektors, der bei der Induktion Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg)-S-protein unter Kontrolle des Hefe-Alkoholdehydrogenase I (ADHI)-Promoters exprimierte.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen Hefeexpressionsvektor mit einem Segment einer Fremd-DNA, d. h. derjenigen, die für das Hepatitis-B-Virus (HBV)-Oberflächenantigen (HBsAg) unter transkriptioneller Kontrolle eines Hefe-Pyk-Promotors kodiert. Es können auch Terminatoren in geeigneter Weise angefügt werden. Der Expressionsvektor weist typischerweise einen Hefe-Replikationsstartpunkt auf und kann in jedem der Zelltypen replizieren. Der Expressionsvektor ergibt bei der Verwendung zur Transformation von Hefezellen erhebliche Mengen des von dem Segment der Fremd-DNA kodierten Proteins.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 Isolation und Zurichtung eines GAPDH-Promoterfragments.
  • Fig. 2 DNA-Sequenz des GAPDH-Promoterfragments.
  • Fig. 3 Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, enthaltend den GAPDH-Promoter.
  • Fig. 4 Nukleotidsequenz des Pyruvatkinase (PyK)-Gens.
  • Fig. 5 Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, enthaltend die PyK-Promoterregion.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Im Prinzip haben Hefeexpressionsplasmide spezielle Vorteile, die die folgenden einschließen. Hefe kann in Kulturen groben Maßstabs für die kommerzielle Herstellung mittels der Fachwelt bekannter Verfahren gezüchtet werden. Im Gegensatz hierzu unterliegen Bakterien in Kulturen groben Maßstabs dem häufigen Problem des Phagenverlusts ("phage-out"). Hefe scheint auch ziemlich die gleiche Fähigkeit wie Säugetierzellen zum Anfügen von Kohlehydratgruppen an neusynthetisierte Proteine zu haben, eine Fähigkeit, die Bakterien nicht aufweisen. Da nun cDNA- Sequenzen leicht zugänglich sind, kann das Problem der Expression von Genen mit Introns leicht umgangen werden.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen Promoter ungewöhnlich hoher Wirksamkeit. Ein Promoter ist im folgenden als DNA-Segment definiert, das zur Initiation der Transkription eines benachbarten DNA-Segmentes funktionieren kann. Die Transkription ist die Synthese von RNA (im folgenden als Messenger-RNA oder mRNA) bezeichnet, welche komplementär zu einem Strang der der Promoterregion benachbarten DNA ist. In Eukaryoten wird die Messenger-RNA-Synthese durch ein RNA-Polymerase 11 genanntes Enzym katalysiert. Die minimalen essentiellen Elemente der Promoterfunktion sind die folgenden: Bereitstellung eines Ausgangspunkts für die Initiation der Transkription und Bereitstellung eines Bindungsortes für RNA-Polymerase 11 in der Nähe des Starts, damit die Selektion des geeigneten DNA-Stranges als ein Templat für die Messenger-RNA-Synthese möglich wird. Zusätzlich wirkt ein eukaryotischer Promoter zur Regulierung der relativen Wirksamkeit der Transkription von Kodierungssegmenten unter seiner Kontrolle. Ein aktiver Promoter ist ein solcher, der die Synthese von relativ groben Mengen von mRNA, komplementär zu einem Strang des benachbarten DNA-Kodierungssegmentes, herbeiführt.
  • Die strukturellen Korrelationen der Promoterfunktion sind nicht eindeutig festgelegt worden. Ein Promotersegment kann gewöhnlich in der Natur als eine Region identifiziert werden, die benachbart zu den 5'-Ende eines gegebenen Strukturgens liegt (die Bezugnahme auf 5'- und 3'-Enden eines Gens ist so zu verstehen, daß damit die entsprechenden jeweiligen Enden der davon transkribierten mRNA angegeben wird, und diese ist ihrerseits so zu verstehen, daß sie mit den NH&sub2;- und -COOH- Termini des kodierten Proteins korreliert).
  • Vergleiche der Nukleotidsequenzen von Promotern verschiedener Gene aus verschiedenen Arten haben lediglich einige kurze Regionen mit einer Ähnlichkeit der Nukleotidsequenzen ergeben, die diesen gemeinsam ist. Die auf fälligste hiervon ist die "TATA-Box", ein Segment von etwa 5 bis 10 Nukleotiden, die allgemein etwa 70 bis 230 Nukleotide stromaufwärts von dem Ort der Initiation der Transkription liegt und eine Sequenz aufweist, die im allgemeinen TATAA ähnelt. Für einen Überblick von Strukturvergleichen siehe Breathnach, R. und Chambon, P., Ann. Rev. of Biochem. (1981) 50 : 349. Die TATA-Box funktioniert vermutlich bei der Initiation der Transkription.
  • Das Fremdgen ist frei oder im wesentlichen frei von Kodons aus dem normalen Strukturgen, das mit dem Promoter assoziiert ist. Gewöhnlich ist das Fremdgen mit einem nicht-kodierenden 3'-Ende der Regulationsregion verknüpft, welche den Promoter umfaßt, so daß sie frei von den Aminosäuren an den N-Terminus von endogenen Genen, die in der Natur mit den Regulationsregionen assoziiert sind, sind. Dies bedeutet, daß weniger als drei Kodons (9 Nukleotide) mit der Regulationsregion behalten werden, wenn sie mit dem Fremdgen verknüpft wird.
  • Die Anwesenheit der Terminatorsequenz an dem 3'-Ende des Kodierungssegmentes verbessert die Expression. Der Effekt ist allgemein ähnlich der Zugabe des rho-Faktors zu prokaryotischen Transkriptionssystemen, bei denen die Geschwindigkeit der Freisetzung der RNA-Polymerase vergrößert wird, um eine Zunahme in der Geschwindigkeit der Initiation der Transkription zu ergeben. Es ist hervorzuheben, daß, während die Terminatorsequenzen für die meßbare Expression von Fremd-DNA-Segmenten nicht erforderlich ist, es vorteilhaft ist, diese in geeigneter Weise zur Verbesserung der Expression anzuhängen. Die Terminatorregion kann natürlich mit dem gleichen oder einem unterschiedlichen Strukturgen als Promoterregion assoziiert sein.
  • Der am besten geeignete DNA-Vektor für die PyK-Konstruktion der vorliegenden Erfindung ist ein Schaukelvektor bzw. Shuttlevektor. Diese Vektoren können zwischen einem Bakterienstamm wie E.coli und Hefe "schaukeln", da sie einen bakteriellen Startpunkt der Replikation und einen Hefestartpunkt der Replikation haben, vgl. z. B. Ammerer G. et al, Recombinant DNA, Proc. Third Cleveland Symposium Macromolecules (Walton, A.G., ed.), p. 185, Elsevier, Amsterdam (1981). Ein typischer bakterieller Startpunkt der Replikation ist von z. B. pBR322 abgeleitet. Der nützlichste Hefestartpunkt der Replikation wird in dem extrachromosomalen genetischen Element gefunden, das als 2-Mikron-Ring bekannt ist. In Laboratoriumsstämmen wird die 2-Mikron-Plasmid-DNA in etwa 50 Kopien pro Zelle gefunden und stabil gehalten. Für eine Übersicht vgl. z. B. Curr. Topics Micro. Imm. (1982) 96 : 119. Dieses Hefeplasmid ist auch sequenziert worden (Hartley, J. L. et al, Nature (1980) 286 : 860).
  • Repräsentative Proben der Plasmide und Wirtszellen, die in den Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt. Das Plasmid pPyK 9.1.1 und die Hefezellen-Transformanten 2150-2-3/pHBS-56 GAP347/33 und 2150-2-3/pHBSs6PyK wurden am 18. Februar 1983 hinterlegt und haben die ATCC-Zugriffsnummern 40061, 20665 und 20666 erhalten.
  • In den folgenden Beispielen sind zahlreiche der Arbeitsweisen, Reaktionen und Trennverfahren in der Fachwelt bereits bekannt. Sämtliche Enzyme, wenn nichts anderes angegeben ist, können aus einer kommerziellen Quelle oder mehreren bezogen werden, z. B. New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Collaborative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Laboratories, Elkhart, Indiana; Beohringer Biochemicals, Inc., Indianapolis, Indiana und Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland. Puffer und Reaktionsbedingungen für den Verdau mit Restriktionsenzymen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller für jedes Enzym eingesetzt, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Standardmethodik für andere Enzymreaktionen, Gelelektrophorese-Trennungen und E.coli-Transformation können in Methods in Enzymology, (1979) 68, gefunden werden. Die Transformation von Hefeprotoplasten kann im wesentlichen wie von Beggs, Nature (1978) 275 : 104 beschrieben durchgeführt werden.
  • E.coli-Stämme, die für die Transformation verwendbar sind, schließen X1776; K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), RR1 und HB101 ein. Hefestämme XV610-8c mit dem Genotyp (a ade2 ade6 leu2 lys1 trp1 can1) und GM-3C-2, Genotyp: (Leu2 Trp1 His4 CYC1-1CYP3-1) (Faye, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1981) 78 : 2258) können in typischer Weise für Hefetransformationen verwendet werden. Die Bakterien können gezüchtet und selektiert werden, entsprechend den von Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) beschriebenen Verfahren. Die Hefe kann auf den folgenden Medien gezüchtet werden: YEPD enthaltend 1% (W/V) Hefeextrakt, 2% (W/V) Pepton und (W/V) Glukose; und im Falle des Plattierungsmediums, 3% (W/V) Agar. YNB plus CAA enthält 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (Difco Laboratories, Minneapolis, Minnesota), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g Casaminosäuren (CAA) (Difco), 20 g Glukose und im Falle von Plattierungsmedien 30 g Agar pro Liter. Die Selektion auf Tryptophanprototrophie kann auf Platten erfolgen, die 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (mit fehlenden Aminosäuren), supplementiert für alle Züchtungserfordernisse des zu transformierenden Stamms, ausgenommen Tryptophan, enthalten.
    • Vergleichsbeispiel 1 Klonierung des Hefe-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Gens
  • Eine die Hefe-GAPDH-Kodierungssequenzen enthaltende komplementäre DNA (cDNA) wurde in der folgenden Weise hergestellt:
  • PolyA+ RNA wurde aus dem Hefestamm A364A isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von AMV-reverser-Transkriptase und E.coli-DNA-Polymerase I synthetisiert. Poly-dC- Schwänze wurden an das doppelsträngige cDNA-Molekül unter Verwendung von Deoxynukleotid-terminaler Transferase angehängt. Die poly-dC-schwänzige cDNA wurde mit poly-dG-schwänzigem pBR322 vereinigt und zur Transformation von E.coli HB101 verwendet. 1.000 Transformanten wurden durch Kolonie-Hybridisierung an markierte PolyA+ RNA gescreened und eine Untergruppe wurde durch Kartierung mit Restriktionsendonuklease und durch DNA-Sequenzierung weiter untersucht. Drei GAPDH-Sequenzen enthaltende Klone wurden aus dem Pool isoliert. Ein Klon (pcGAP-9) enthielt einen Insert von etwa 1.200 Basenpaaren (bp) und wurde für die weiteren Arbeiten verwendet.
  • Eine Hefegenbibliothek wurde durch Insertion von Fragmenten, erhalten nach partiellem Verdau von Gesamthefe-DNA mit der Restriktionsendonuklease Sau3A, in den lambda-Phagen Charon 28, gemäß Blattner, F. R. et al, Science (1977) 196 : 161-169 hergestellt. Verschiedene Fragmente, die Hefe-GAPDH-Kodierungssequenzen erhielten, wurden isoliert, indem man die Phagenbibliothek mit markierter DNA aus pcGAP-9 screente. Das Hefe GAPDH-Gen von einem dieser Klone wurde in pBR322 als 2,1 kb HindIII-Fragment (pGAP-1, vgl. Fig. 1) oder als 3,5 kb BamHI-Fragment (pGAP-2) subkloniert. Die GAPDH-Promoter-aktiven Fragmente wurden von diesen Klonen isoliert. Das HindIII-HhaI-Fragment von etwa 800 bp wurde an das HhaI-HindIII-Fragment von etwa 350 bp ligiert. Das erhaltene 1061 bp HindIII-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in pBR322, (pGAP-347) kloniert sowie die Sequenz bestimmt (vgl. Fig. 2).
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Konstruktion von Hefevektoren, enthaltend den GAPDH-Promoter, wirksam in der Expression von HBsAg.
  • Ein Plasminvektor (pHBS-56GAP347/33) für die Expression von HBV-Oberflächenantigen in Hefe unter Verwendung des GAPDH-Promoterfragmentes wurde wir in Fig. 3 gezeigt konstruiert.
  • Der Gesamtverdau von pGAP-347 mit SphI, gefolgt von dem partiellen Verdau mit HindIII ergab ein ungefähr 1700 bp SphI-HindIII-Fragment mit etwa 1060 bp des GAPDH-Promotors und etwa 53 bp von pBR322. Das 1700 bp SphI-HindIII GAPDH-Promotorfragment wurde mit dem 840 bp HindIII-HindIII-Fragment (enthaltend die HBsAg-Kodierungsregion, 26 Basen der 5'-nicht-kodierenden Region und 128 bp der 3'-nicht-kodierenden Region, erhalten aus pHBS-56) und anschließend mit dem 350 bp HindIII-SphI-Fragment, enthaltend die ADH-I Terminatorregion (isoliert aus pHBS-56), ligiert. Das 2900bp SphI-Fragment (Kassette) wurde isoliert und in pHBS-56, vorher verdaut mit SphI, kloniert. Das Plasmid pHBS-56 (ATCC Zugriffsnummer 40047) ist in einer anhängigen Anmeldung (EPA No. 82.491.473, veröffentlicht als No. 72318 der Regents of the University of California) beschrieben worden und enthält das gesamte 2- Mikronplasmid zusätzlich zu einer Region mit dem Hefe-leu2-Gen und dem amp-Resistenzort von pBR322. Das erhaltende Plasmid (pHBS-56GAP347/33), in dem der Promotor, das Gen und die Terminationsregionen sich in den geeigneten Orientierungen befanden, wurde isoliert und zur Transformation des Hefestamms AB102 (MATa, pep 4-3, leu 2-3 leu2-112, ura 3-52, his 4-580, cirº) oder des Stammes 2150-2-3 (MATa, adel, leu2-04, cirº) verwendet. Der Stamm AB102 wurde von SF657-9c durch Reifung von zwei Mikron-Plasmiden abgeleitet. Der Stamm 2150-2-3 stammt aus der Sammlung von Dr. Leland Hartwell an der Universität von Washington.
    • Beispiel 1 Klonierung des Hefe-Pyruvatkinase-Gens
  • Das Pyruvatkinase-Gen wurde durch Komplementierung kloniert. Ein Hefemutant mit Pyruvatkinase-Minus wurde mit einem Pool von Rekombinanten YEp24-Plasmiden transformiert, die Wild- Typ-Hefegenom-DNA enthielten. Die Hefestämme 5288C (Genotyp: SUC2, mal, gal2, CUP1) und pyk 1-5 (Genotyp: a, ade1, leu1, met14, ura3, pyk1-5) wurden von dem Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics, University of California, Berkeley, erhalten. Die verwendete Hefegenom-Bank bestand aus einem partiellen Sau3A-Verdau von gesamt DNA aus dem Stamm 5288C, kloniert in den BamHI-Ort des "shuttle"-Vektors YEp24. Der Vektor YEp24 enthält pBR322-Sequenzen für die Selektion und Züchtung in Bakterien, das Hefe-URA3-Gen für die Selektion in Hefe und EcoRI-Fragment des Hefe-2u-Rings zur Gewährleistung der Plasmidreplikation und Segretation in Hefe. Der Pool schließt ausreichend unabhängige rekombinante Plasmide ein, um das gesamte Hefegenom zu repräsentieren.
  • Der Stamm pyk1-5 ist nicht in der Lage, auf Glukose enthaltendem und Uracil mangelndem Medium zu wachsen, und zwar infolge Mutationen in diesem Stamm an den Pyk1 und URA3-Orten. Die Transformation dieses Stammes mit der YEp24-Genom Bibliothek und die Selektion auf Transformanten, die auf Uracil-Mangelmedien und Glukose enthaltenden wachsen können, selektiert für solche Zellen, die das Pyruvatkinase-Gen enthaltendes YEp24 erworben haben. Die Transformation von 3,5 · 10&sup8; pyk1-5 Hefezellen mit 10 ug YEp24-rekombinanter Plasmidpool DNA ergab 5 unabhängige Transformanten, die in Abwesenheit von Uracil und in der Anwesenheit von Glukose wuchsen.
  • Die Charakterisierung der Insertions-DNA dieser Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse zeigte, daß diese überlappende DNA-Insertionen enthielten. Wir konzentrierten uns auf einen einzelnen Transformanten, pPyk9.1, der eine 7,0 kb-Insertion enthielt. Das Pyruvatkinase-Gen wurde innerhalb dieser Insertien lokalisiert, indem bestimmt wurde, welche insert-spezifischen Restriktionsfragmente mit einer mRNA von etwa 1,7 kb, erwartet für die Pyruvatkinase-mRNA, hybridisierte. Die Lokalisierung des pPyK-Gens wurde durch Subklonierung geeigneter Regionen der Insert-DNA und Beobachtung der Komplementierung der Funktion in dem pykl-5-Mutanten bestätigt. Ein Subklon pPyK 9.1.1, der das PyK-Gen auf einer 4,4 kb-Insert erhielt, wurde sequenziert und bei der Konstruktion von Expressionsplasmid verwendet.
    • Beispiel 2 Sequenz des Hefe-Pyruvatkinase-Gens
  • Insgesamt 2885 Nukleotide des Pyk-Gens sind sequenziert worden, einschließlich 1497 Nukleotiden in einem einfachen offenen Leseraster, 911 Nukleotiden einer 5'-nicht-translatierten Region und 477 Nukleotiden einer 3'-translatierten Region (vgl. Fig. 4). Das Gen klodiert ein Polypeptid mit 499 Aminosäuren und ergibt ein monomeres Molekulargewicht von 54608 Dalton, was gut mit dem erwarteten Wert für Hefe-Pyk übereinstimmt. Die Aminosäure-Zusammensetzung, abgeleitet von der Nukleotidsequenz, entspricht auch in derjenigen, die an dem isolierten Hefeprotein gemessen wurde. Die Nukleotidsequenz sagt ein carboxy-terminales Valin voraus, das bei Hefe-Pyruvatkinase gefunden wurde.
    • Beispiel 3 Konstruktion von Hefe-Expressionsplasmiden unter Verwendung der Pyruvatkinase-Promoterregion
  • Es wurden zwei verschiedene Konstrukte hergestellt. pHBS16 PyK und pHBSs6 PyK. Die Verfahren sind in Fig. 5 erläutert.
  • Das Plasmid pPyK 9.1.1, das das Hefe-PyK-Gen, kloniert in pBR322, enthält, wurde mit XbaI verdaut und die überstehenden Enden mit Deoxynukleotiden unter Verwendung von DNA Polymerase I aufgefüllt. Das Produkt wurde mit BamHI verdaut, um schließlich ein 912 BamHI-stumpfes Fragment zu isolieren, das den PyK-Promoter und 8 Basen von der PyK-Kodierungsregion enthält. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pHBS-6 ligiert (enthält das HBsAg-Gen, in der die 5'-nicht-kodierende Region deletiert wurde, kloniert in pBR322), welches zuvor mit Nco verdaut, unter Verwendung von DNA-Polymerase aufgefüllt und mit BamHI verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli, wurde pHBS-6PyK isoliert. Dieses Plasmid enthält den PyK-Promoter mit Kodons für 3 extra-Aminosäuren, fusioniert in Phase mit der HBsAg-Kodierungssequenz
  • ATGTCTAG CATG
  • pHBS-6PyK wurde mit BamHI vollständig verdaut und partiell mit EcoRI verdaut, wobei ein 1750 bp BamHI-EcoRI-Fragment isoliert wurde, welches den PyK-Promoter, fusioniert an das HBsAg-Gen, enthielt. Dieses 1750 bp-Fragment wurde an das große Fragment ligiert, welches nach Verdau von pHBS-16 (ATCC Zugangsnummer 40043, Plasmid beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 82 401 473.2 (EP-A-72 318)) mit BamHI und EcoRI erhalten und zur Transformation von E.coli. verwendet wurde. Man erhielt das Hefe-Expressionsplasmid pHBS-16PyK. pHBS-16PyK wurde vollständig mit SphI und XbaI verdaut, und man isolierte ein 1200 bp SphI-XbaI-Fragment (enthaltend 200 bp pBR322, den PyK-Promoter und 100 bp der 5'-Region des HBsAg-Gens). Dieses 1200 bp SphI-XbaI-Fragment wurde an ein 1070 bp XbaI-SphI-Fragment (isoliert aus pHBS-56), das das 3'-Ende des HBsAg-Gens und den ADH-1-Terminator enthielt, ligiert. Nach der Digestion mit SphI wurde ein SphI-SphI-2300 bp-Fragment (Kassette), enthaltend den PyK-Promoter, das HBsAg-Gen und den ADH-1-Terminator, isoliert. Dieses Kassetten-Fragment wurde in pHBS-56 kloniert, welches zuvor mit SphI verdaut wurde. Das Hefe-Espressionsplasmid pHBS-56 PyK wurde erhalten. Dieses Plasmid wurde zur Transformierung des Hefestammes AB102 verwendet (vgl. Vergleichsbeispiel 2) oder des Stammes 2150-2-3 (vgl. Vergleichsbeispiel 2).
    • Beispiel 4 Synthese von HBsAg in Hefe unter PyK-Promoterkontrolle
  • 100 ml Kulturen des Stammes AB102, enthaltend das Plasmid pHBS-56 PyK, wurden auf optische Dichten bei 650 nm von 1-2 gezüchtet. Zellfreie Lysate wurden durch Rühren mit Glasperlen und Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugieren hergestellt. HBsAg wurde mittels des Abbott-Ausriall-Radioimmunoassays bestimmt und die Protein-Konzentration wurde durch die Coomassie-Blau-Bindungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Sie zeigen, daß der PyK-Promoter mindestens zweimal wirksamer als der ADH1-Promoter bei der Expression des Proteinprodukts in Hefe ist. Tabelle 2: Synthese von HBsAg in Hefe (a) aus pHBS-56 (Vergleich, ADH-I Promoter) Beispiel Nr. Protein (mg/ml) Spez. Aktivität (ugsAg/mg Protein) (b) aus pHBS-56 PyK (PyK-Promoter)
  • Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn der Hefestamm 2150-2-3 durch den Hefestamm AB102 ersetzt und das Beispiel 7 wiederholt wurde.

Claims (10)

1. Hefeexpressionsvektor, enthaltend ein Segment einer Fremd-DNA unter Transkriptionskontrolle eines Hefe-Pyrovatkinasepromoters, wobei das genannte Segment sich in korrekter Orientierung zur Transkription befindet und weniger als 3 Kodons der Hefe-Pyruvatkinase am 5'-Ende der genannten Fremd-DNA aufweist und wobei die genannte Fremd-DNA für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder einen Teil desselben kodiert.
2. Hefeexpressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend einen Terminator, welcher an das 3'-Ende des Segmentes der Fremd-DNA angeheftet ist.
3. Hefeexpressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend eine Hefe-2-Mikron-Plasmid-DNA oder einen Teil derselben.
4. Plasmid 2150-2-3-pHBs56Pyk mit der ATCC-Zugriffsnummer 20666.
5. Verfahren zur Expression eines DNA-Kodierungssegmentes in Hefe mit den Schritten
a) Insertion des Kodierungssegmentes in einen Hefeexpressionsvektor, wobei der genannte Vektor ein DNA-Segment umfaßt, das von einem Hefe-Pyruvatkinasepromoter mit weniger als 3 Kodons von 5'-Ende der Pyruvatkinase abgeleitet ist, wobei sich der Promoter benachbart zu dem 5'-Ende des insertierten DNA-Kodierungssegmentes befindet und so ausgerichtet ist, daß die innerhalb des Promoters initiierte Transkription das Kodierungssegment einschließt, wodurch ein Kodierungssegment-Expressionsvektor gebildet wird, in dem die Fremd-DNA für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder einen Teil des selben kodiert, und
b) Transformation von Hefezellen mit dem Kodierungssegment-Expressionsvektor.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der genannte Hefeexpressionsvektor weiterhin einen an das 3'-Ende des insertierten DNA-Kodierungssegmentes angehefteten Terminator umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der genannte Hefeexpressionsvektor weiterhin einen Bakterienzellen-Replikationsorigin aufweist und zur Replikation in einer Bakterienzelle befähigt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Hefe-Alkoholdehydrogenase-Terminator umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Hefe-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Terminator umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Terminator den Pyruvatkinase-Terminator umfaßt.
DE89106868T 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen. Expired - Lifetime DE3486206T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46858983A 1983-02-22 1983-02-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3486206D1 DE3486206D1 (de) 1993-10-07
DE3486206T2 true DE3486206T2 (de) 1994-02-03

Family

ID=23860419

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8484300091T Expired - Lifetime DE3482844D1 (de) 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme fuer hefe mit einen gapdh promotor enthaltenden vektoren und synthese von fremdproteinen.
DE3486431T Expired - Lifetime DE3486431T3 (de) 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme für Hefe mit Vektoren, die einen GAPDH-Promotor enthalten und Oberflächenantigensynthese von Hepatitis B
DE89106868T Expired - Lifetime DE3486206T2 (de) 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen.

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8484300091T Expired - Lifetime DE3482844D1 (de) 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme fuer hefe mit einen gapdh promotor enthaltenden vektoren und synthese von fremdproteinen.
DE3486431T Expired - Lifetime DE3486431T3 (de) 1983-02-22 1984-01-06 Expressionssysteme für Hefe mit Vektoren, die einen GAPDH-Promotor enthalten und Oberflächenantigensynthese von Hepatitis B

Country Status (7)

Country Link
EP (4) EP0460716B2 (de)
JP (2) JPS59210888A (de)
AT (3) ATE93894T1 (de)
CA (2) CA1341116C (de)
DE (3) DE3482844D1 (de)
DK (1) DK173604B1 (de)
SG (1) SG48422A1 (de)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド
JPS5936699A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Chemo Sero Therapeut Res Inst シヤトルベクタ−
US5422267A (en) * 1984-05-22 1995-06-06 Robert R. Yocum Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene
EP0173997A1 (de) * 1984-09-06 1986-03-12 Chiron Corporation Katzenleukämievirusproteinimpfstoffe und ihre Herstellung
EP0184575B1 (de) * 1984-12-06 1993-04-28 Fina Research S.A. Transformierte Hefen die Lysozym produzieren, für diese Transformation zu verwendende Plasmide und deren Verwendung
EP0211767B1 (de) * 1985-08-05 1991-03-06 Merck & Co. Inc. Verfahren zur Steigerung der Produktion von rekombinantem Protein in Hefearten der Gattung Saccharomyces
ES2028779T3 (es) * 1985-10-03 1992-07-16 Green Cross Corporation Promotor de levadura y procedimiento para preparar proteina heterologa.
JPH0655155B2 (ja) * 1985-10-03 1994-07-27 株式会社ミドリ十字 蛋白質の製造方法
DK162900C (da) * 1985-10-24 1992-05-11 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i gaer samt dna-fragment, rekombineret dna-segment og plasmider, hvor disse indgaar til brug ved udoevelse af fremgangsmaaden
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
JPS62236496A (ja) * 1986-04-07 1987-10-16 Green Cross Corp:The ＨＢｓＡｇの製造方法
US4839283A (en) * 1986-12-30 1989-06-13 Zymogenetics, Inc. Method of expressing alpha-1-antitrypsin in yeast
DE10299017I2 (de) 1987-06-22 2005-05-25 Medeva Holdings Bv Hepatitis-B-Oberfl{chenantigen enthaltendes Peptid.
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
AU644619B2 (en) 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
FI103206B1 (fi) * 1990-01-29 1999-05-14 Novartis Ag Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten
US6194140B1 (en) 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
ES2109336T3 (es) 1990-11-26 1998-01-16 Genetics Inst Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma.
EP0491077A1 (de) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches Mittel gegen chronische virale Leberkrankheiten
JPH08510240A (ja) 1993-05-12 1996-10-29 カイロン コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルスｅ２／ｎｓ１領域の保存モチーフ
US5629167A (en) 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
JPH08173170A (ja) * 1994-05-25 1996-07-09 Kirin Brewery Co Ltd キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現
US5712249A (en) * 1994-09-08 1998-01-27 Ciba-Geigy Corporation Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response
JP2000507087A (ja) 1995-12-22 2000-06-13 ギスト ブロカデス ベスローテン ファンノートシャップ ファフィア株を形質転換する改良法、そのようにして得られた形質転換したファフィア株及び前記方法における組換えｄｎａ
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
US6087128A (en) * 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
RU2245366C2 (ru) 1999-04-30 2005-01-27 Чирон С.Р.Л. Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
EP2275552B1 (de) 1999-10-29 2015-09-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Antigenpeptide aius Neisseria
US6709863B2 (en) 1999-12-08 2004-03-23 Iowa State University Research Foundation Nucleic acid molecules encoding multiple start codons and histidine tags
PT2289545T (pt) 2000-01-17 2016-09-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacina de omv suplementada contra meningococos
MXPA03003690A (es) 2000-10-27 2004-05-05 Chiron Spa Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
US7838287B2 (en) 2001-01-25 2010-11-23 Evolva Sa Library of a collection of cells
US8008459B2 (en) 2001-01-25 2011-08-30 Evolva Sa Concatemers of differentially expressed multiple genes
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
EP1572720A4 (de) 2002-05-24 2008-12-24 Nps Allelix Corp Verfahren zur enzymatischen herstellung von glp-2-(1-33)- und glp-2-(1-34)-peptiden
EP2279746B1 (de) 2002-11-15 2013-10-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
PL1704234T3 (pl) 2003-11-21 2012-06-29 Nps Pharma Inc Wytwarzanie glukagonopodobnego peptydu 2 i analogów
DE10356218A1 (de) * 2003-12-03 2005-06-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Pyruvatkinasen aus Pilzen
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
EP1836298B1 (de) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. Zusammensetzungen von aminoacyl-trna-synthetase und verwendungen davon
DK1828224T3 (en) 2004-12-22 2016-07-18 Ambrx Inc Compositions containing, methods including, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES
WO2006113528A2 (en) 2005-04-18 2006-10-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
BRPI0615420A2 (pt) 2005-09-01 2011-05-17 Novartis Vaccines & Diagnostic vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c
PT2339014E (pt) 2005-11-16 2015-10-13 Ambrx Inc Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais
EP1968635B1 (de) 2005-12-14 2014-09-17 Ambrx, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren mit und Verwendung von nicht-natürlichen Aminosäuren und Polypeptiden
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
WO2008030613A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Hybrid suppressor trna for vertebrate cells
DK2615108T3 (en) 2006-09-08 2017-01-30 Ambrx Inc Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their applications
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
WO2008139591A1 (ja) * 2007-05-11 2008-11-20 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute 組換えアプロチニンの生産方法
AU2008326324B9 (en) 2007-11-20 2012-11-15 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
EP3103880A1 (de) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modifizierte leptinpolypeptide und deren verwendungen
UA118536C2 (uk) 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
EP3216800A1 (de) 2008-09-26 2017-09-13 Ambrx, Inc. Modifizierte tierische erythropoietin-polypeptide und deren verwendungen
MX348657B (es) 2008-09-26 2017-06-21 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
CN102753573A (zh) 2009-12-21 2012-10-24 Ambrx公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
EP2571991A1 (de) 2010-05-20 2013-03-27 Evolva SA Verfahren zur herstellung von isoprenoidverbindungen in hefe
BR112013003522B1 (pt) 2010-08-17 2021-05-25 Ambrx, Inc. polipeptídeos relaxina modificados compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente, seu método de preparação e seu uso, bem como ácido nucleico e célula hospedeira
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
CN110637027A (zh) 2017-02-08 2019-12-31 百时美施贵宝公司 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
GR76274B (de) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
NZ201705A (en) * 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
JPS58146281A (ja) * 1981-10-19 1983-08-31 Suntory Ltd 酵母細胞の形質転換法
US4446235A (en) * 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
EP0096910B1 (de) * 1982-05-19 1989-04-19 Unilever N.V. Hefe des Genus Kluyveromyces, modifiziert zur Expression von Preprothaumatin oder seinen verschiedenen allelischen und modifizierten Formen oder Maturationsformen
AU577259B2 (en) * 1982-08-13 1988-09-22 Zymogenetics Inc. Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor
JPH0716432B2 (ja) * 1982-10-20 1995-03-01 サントリー株式会社 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0732403A1 (de) 1996-09-18
DE3486206D1 (de) 1993-10-07
JPS59210888A (ja) 1984-11-29
EP0460716B1 (de) 1996-06-05
JPH0724594B2 (ja) 1995-03-22
DK577783D0 (da) 1983-12-15
SG48422A1 (en) 1998-04-17
EP0329203B1 (de) 1993-09-01
ATE55151T1 (de) 1990-08-15
DE3486431T2 (de) 1996-10-10
EP0120551A2 (de) 1984-10-03
CA1341116C (en) 2000-10-17
EP0460716B2 (de) 1999-12-15
EP0460716A1 (de) 1991-12-11
EP0120551B1 (de) 1990-08-01
EP0120551A3 (en) 1986-05-14
DE3482844D1 (de) 1990-09-06
ATE93894T1 (de) 1993-09-15
ATE138975T1 (de) 1996-06-15
DE3486431D1 (de) 1996-07-11
JPH05268984A (ja) 1993-10-19
JPH0515431B2 (de) 1993-03-01
DK577783A (da) 1984-08-23
DK173604B1 (da) 2001-04-23
EP0329203A1 (de) 1989-08-23
DE3486431T3 (de) 2000-05-04
CA1341302C (en) 2001-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3486206T2 (de) Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen.
DE3689411T2 (de) Methode zur erhöten Expression von Polypeptiden in Hefe des Gattung Pichia.
DE3486216T2 (de) Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren.
DE69532603T2 (de) Hefestämme und modifizierte albumine
DE69126632T2 (de) DNS Sequenz, bestehend aus einem kodierenden, strukturellen Gen für Xylose-Reduktase oder Xylose -Reduktase und Xylitol-Dehydrogenase
DE3689846T2 (de) Erhöhte ausscheidung von heterologen proteinen durch wirtszellen durch verwendung von substituierten promotoren.
DE3885728T2 (de) Verbesserung der Expression und Sekretion heterologener Proteine in Hefe mittels trunkierter Sequenzen des Alpha-Faktor-Leaders.
DE3280468T2 (de) Synthese von menschlichen Virusantigenen durch Hefe.
DE3588234T3 (de) Hefevektor
DE69535704T2 (de) EXPRESSIONSPLASMIDE, DURCH EINEN osmB PROMOTER REGULIERT
DD254211A5 (de) Verfahren zur herstellung von plypeptiden
DD212982A5 (de) Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden
DE3854256T2 (de) Expressionsvektor für hefe.
DE69027948T2 (de) Reinigung von rekombinantem, menschlichem Interleukin-3
DE3689899T2 (de) Verfahren und hybridpromotor zur steuerung der exogenen gentranskription.
DE3782560T2 (de) Hefestaemme zur expression fremder gene.
EP0385391B1 (de) Expressionsvektoren zur Synthese von Proteinen in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe
EP0536192B1 (de) Neue promotorregion
DD283836A5 (de) Verfahren zur bildung von antigenen hbv-teilchen
DE3887425T2 (de) BAR1-Sekretions-Signal-Sequenz.
US5786212A (en) Multiple integrative vectors and Yarrowia lipolytica transformants
DE69433222T2 (de) Mutanter AOX2-Promotor
EP0245479B1 (de) Verkürzter phosphoglycerat-kinase-promotor
EP0725822B1 (de) Verfahren zur rekombinanten herstellung von proteinen in hefe
DE4329969A1 (de) Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in Hefe

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition