DE3588234T3

DE3588234T3 - Hefevektor

Info

Publication number: DE3588234T3
Application number: DE3588234T
Authority: DE
Inventors: Robert Rogers Yocum
Original assignee: ROBERT ROGERS YOCUM LEXINGTON
Current assignee: ROBERT ROGERS YOCUM LEXINGTON
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-05-22
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2005-05-23
Also published as: EP0707068A1; EP0163491A1; AU4270985A; FI852024A0; EP0707068B1; DK224185D0; EP0707068B2; FI852024L; BR8502400A; DE3588096T2; IL75210A0; JPS6140793A; DE3588234D1; ATE207961T1; DE3588096D1; ATE136059T1; DK224185A; EP0163491B1; CA1338857C; DE3588234T2

Description

Diese Erfindung betrifft Gentechnik bei Hefe.
Gegenwärtig ist die Technologie zum Einführen heterologer (d.h. modifizierter oder fremder) Gene in Laborstämmen der Hefe der Gattung Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae vorhanden. Zwei Arten von Plasmidvektoren sind zu diesem Zweck verwendet worden, Replikations- und Integrationsvektoren. Replikationsvektoren enthalten einen Startpunkt (Origin) der DNA-Replikation, der in Hefe funktioniert, so dass das Plasmid extrachromosomal als ein zirkuläres Episom erhalten wird. Integrationsvektoren enthalten nicht notwendigerweise einen derartigen Startpunkt und können durch Insertion in ein Hefechromosom stabil erhalten werden.
Beide Arten von Plasmiden können durch Standardtransformationsverfahren in Hefezellen eingeführt werden. Weil die erfolgreiche Aufnahme und Etablierung von Plasmid-DNA durch kompetente Hefezellen ein relativ seltenes Ereignis (<10^–3) ist, ist ein Selektionsmechanismus erforderlich, um die Identifikation der Transformanten zu erlauben.
Am häufigsten wird Selektion durch Einführung auxotropher Mutationen in den aufnehmenden Hefestamm erreicht. Die gewöhnlich verwendeten Mutationen sind ura3, leu2, trp1 und his3. Das Plasmid von Interesse trägt eine Wildtyp-Kopie eines dieser Gene. Weil die Wildtyp-Kopie auf dem Plasmid dominant gegenüber dem chromosomalen Wirtsallel ist, wird Selektion für Zellen, die das Plasmid aufnehmen, auf einem Minimalmedium, dem der Nährstoff fehlt, der von der auxotrophen Wirtszelle benötigt wird, leicht erreicht.
Es gibt auch Berichte der Verwendung von Antibiotikumsresistenz, um transformierte Zellen zu selektieren. Es ist beschrieben worden, dass Replikationsvektoren auf der Sensitivität der meisten Saccharomyces-Stämme gegen das im Handel erhältliche Neomycin-Analogon, Antibiotikum G418 (auch bekannt als „Geneticin"^TM) beruhen; Jimenez et al. (1980) Nature 287, 869; Hollenberg (1982) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Hofschneider et al., Hrsg. (Springer-Verlag, NY); Webster et al. (1983) Gene 26, 243. Webster et al. beschreiben auch einen Integrationsplasmidvektor, welcher durch Resistenz gegen G418 nicht direkt selektiert worden war. Die in den vorstehenden Bezügen beschriebenen Vektoren enthalten ein Gen, das kan^r, neo^r oder G418^r genannt wird, aus dem Bakterientransposon Tn903, und die Beispiele der Replikationsvektoren enthalten einen Replikationsstartpunkt der Hefe; in allen diesen Beispielen, sowohl in dem Replikations- als auch in dem Integrationsvektoren, geht dem Bakteriengen sein nativer Bakterienpromotor voraus.
Ein anderer Replikationsvektor ist beschrieben worden, welcher das Gen für die Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin B unter der Kontrolle eines Hefepromotors enthält; Gritz et al. (1983) Gene 25, 178.
EP-A-0068740 betrifft einen Klonierungsvektor rekombinanter DNA, umfassend (a) einen Eukaryontenpromotor, (b) ein oder zwei verschiedene Strukturgene und eine verbundene Kontrollsequenz, die die Resistenz gegen eines oder beide Antibiotika Hygromycin und G 418 überträgt, wenn sie in eine Wirtszelle transformiert wird, die sensitiv gegen eines oder beide Antibiotika ist, für welches Resistenz übertragen wird, wobei die Wirtszelle für die Transformation, Zellteilung und Kultur empfänglich ist, und (c) ein Prokaryontenreplikon, wobei das Replikon funktionell ist, wenn die Wirtszelle ein Prokaryont ist, den Beschränkungen unterworfen, dass sich das eine oder die beiden Strukturgene und die verbundene Kontrollsequenz neben dem Eukaryontenpromotor befinden und in einer eukaryontischen Wirtszelle vom Eukaryontenpromotor transkribiert werden, dass ein Signalgen und eine verbundene Kontrollsequenz Resistenz gegen eines, aber nicht gegen beide Hydromycin B und G418 überträgt, und dass die genübertragende Resistenz gegen G418 nicht das Enzym Phosphotransferase kodiert. Jedoch ermöglicht diese Druckschrift einem Fachmann nicht, eine DNA-Sequenz zu konstruieren, in welcher die G418-Resistenz funktionell an eine Hefepromotorsequenz gekuppelt ist.
Erfindungsgemäß wird ein Vektor bereitgestellt, der eine DNA-Sequenz enthält, die zur Integration in ein Hefechromosom in der Lage ist, umfassend eine Hefepromotorsequenz, die funktionell an ein Gen gekuppelt ist, das die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 kodiert, so dass die DNA-Sequenz in der Lage ist, direkt im integrierten Zustand in einer mit der DNA transformierten Hefezelle selektiert zu werden.
Der Vektor kann zum Beispiel sein, wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 beschrieben. Der Vektor kann in einer Wirtshefezelle vorliegen. Er kann ein Gen einschließen, das heterolog zur Wirtshefezelle ist (d.h. ein Nichthefegen, ein modifiziertes Gen, ein Gen aus einem anderen Hefestamm oder ein homologes Gen aus einer anderen chromosomalen Lokation). Der Vektor kann verwendet werden, um die Wirtszellen zu transformieren; Transformanten werden auf der Grundlage von Antibiotikumsresistenz selektiert.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt der Vektor auch eine Sequenz ein, welche mit einer Sequenz (einer „Ziel"-Sequenz (Target)) eines Wirtschromosoms homolog ist, um die Integration zu erleichtern. Vorzugsweise ist die homologe Sequenz von der Kontrollsequenz, welche das Antibiotikumsresistenzgen kontrolliert, getrennt, und vorzugsweise ist das Ziel eine Region, wo der Metabolismus der Wirtszelle nicht gestört wird.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kodiert das heterologe Gen ein Enzym, z.B. Glukoamylase (welches die Erzeugung von Glukose aus Stärke durch die Hefezelle ermöglicht), und die Wirtszelle nimmt an einem Prozeß teil, z.B. der Produktion von Teig, welcher ein Produkt des Metabolismus der Zelle, z.B. Kohlendioxid, verwendet.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen stehen das Antibiotikumsresistenzgen und das heterologe Gen unter der Kontrolle verschiedener Promotoren, wobei der Promotor, der das heterologe Gen kontrolliert, vorzugsweise der höher exprimierte der beiden ist. Das bevorzugte Integrationsverfahren ist eines, welches das Einbringen des heterologen Gens im Wirtshefezellchromosom zur Folge hat, zum Ausschluss des größten Teils des Restes der Vektor-DNA, wobei außerordentlich erhöhte Stabilität bereitgestellt wird. Ausschluss dieser DNA beseitigt auch eine mögliche Störungsquelle bei einer Eigenschaft, z.B. Geschmack, des Endprodukts.
Der Vektor kann ein Gen umfassen, das Glukoamylase kodiert, wobei der Vektor die Expression der Glukoamylase in einer Wirtshefezelle ermöglicht.
Der Vektor kann ein Gen umfassen, das Malonmilchsäureenzym (Malolacticenzym) oder Malatpermease kodiert, wobei der Vektor die Expression des Malolacticenzyms oder der Malatpermease in einer Wirtshefezelle ermöglicht.
Der Vektor kann eine Sequenz einschließen, die homolog mit einer Sequenz eines Chromosoms einer Wirtshefezelle ist, wobei die Integration des Vektors in der Sequenz des Chromosoms den Metabolismus der Wirtshefezelle nicht stört.
Erfindungsgemäße Integrationsvektoren stellen Stabilität über Generationen von Wirtsteilungen in Abwesenheit von Selektion bereit, ein wichtiger Vorteil in industriellen Fermentationsverfahren; Replikationsvektoren können von den Hefezellen mit Raten bis zu 1% bis 5% pro Generation verloren gehen. Stabile Erhaltung integrierter Sequenzen über Generationen verhindert das Hinzufügen toxischer Antibiotika zum Fermentationsmedium, um Selektionsdruck auszuüben, um die Sequenzen zu erhalten. Die erfindungsgemäßen Vektoren wirken gemäß der Hefepromotorsequenz, die das Gen für die Antibiotikumsresistenz kontrolliert, auch in Hefe gut. Außerdem ist, weil industrielle Hefestämme gewöhnlich diploid oder polyploid sind (im Gegensatz zu haploiden Laborstämmen), die Einführung auxotropher Mutationen (verwendet für die Selektion von Transformanten in haploide Stämme) in sie schwierig. Die Verwendung von Antibiotikumsresistenz in einem Integrationsvektor erlaubt Selektion stabiler Transformanten in jedem Hefestamm, ungeachtet der Anzahl der Chromosomen oder der Gegenwart oder Abwesenheit spezifischer Mutationen.
Die Einführung von Genen, die heterologe Enzyme kodieren, in industrielle Hefestämme unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren erleichtern die Produktion solcher Produkte, wie Alkohol, welches sich gewöhnlich auf Zuckern stützt, die der Hefe zugeführt werden. Ein Enzym, wie Glukoamylase, ermöglicht der Hefe, Stärke aus preiswerten Quellen, wie Tapioka und Kartoffeln, zu zerlegen, um Glukose zu liefern, von welcher die Hefe ernährt werden kann. Ähnlich kann das Brotbacken billiger gemacht werden, wenn eher Stärke (Mehl) als Zucker als primäre Energiequelle verwendet wird.
Heterologe Enzyme können auch die Produktion von Leichtbier erleichtern, welches einen geringeren Stärkegehalt aufweist als normales Bier. Ein Verfahren, das gegenwärtig beim Brauen von Leichtbier verwendet wird, um die Reststärke zu zerlegen, welche nach Abschluss des Mälzerei-Verfahrens übrigbleibt, ist, Glukoamylase zur Bierwürze hinzuzufügen, die aus Brotschimmel gewonnen wird, ein Schritt, welcher eliminiert werden kann, wenn die beim Brauen verwendete Hefe auch ein Glukoamylase-kodierendes Gen trägt und exprimiert.
Andere Enzyme können kommerzielle Fermentationsverfahren in anderen Hinsichten erleichtern. Zum Beispiel erlaubt bei der Weinherstellung die Insertion des Gens für das Malolacticenzym oder die Malatpermease Wirtshefezellen, aus Trauben metabolisierte Maleinsäure umzuwandeln, wobei folglich der Verderb des Weins durch Entfernen der Maleinsäure verhindert wird, von welcher sich ansonsten Verderben hervorrufende Bakterien ernähren.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich.
Wir beschreiben zuerst kurz die Zeichnungen.
1 ist eine schematische Darstellung eines Replikationsvektors.
Die 2, 3a und 3b sind schematische Darstellungen von erfindungsgemäßen Integrationsvektoren.
4 ist eine schematische Darstellung eines Mechanismus, mit welchem ein Integrationsvektor in ein Wirtshefechromosom integriert wird.
Plasmidstruktur
In den 1-3 werden die folgenden Abkürzungen für Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen verwendet: A, XbaI; B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; K, KpnI; M, SmaI; PI, PvuI; PII, PvuII; S, SalI; TII, SsII; U, StuI; X, XhoI. (A) bezeichnet die Position einer früheren XbaI-Stelle, die etwa 3 Kilobasen vom 5'-Ende des HO-Gens entfernt liegt. Diese Stelle wurde zerstört und durch eine SalI-Stelle bei der Konstruktion von pRY253 ersetzt. (PII) bezeichnet eine frühere PvuII-Stelle, die während der Plasmidkonstruktion ähnlich zerstört wurde. Vollständige Gene oder Fusionsgene sind durch Kästchen gezeigt. Die Abkürzungen für die Gene sind wie folgt: amp^r, Ampicillinresistenz; G418^r, Resistenz gegen das Antibiotikum G418; HO, Homothallismus; CYC1, iso-1-Cytochrom c; URA3, orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase; GAL1, Galactokinase; lacZ, beta-Galactosidase. Die konzentrischen Pfeile innerhalb der Ringe zeigen DNA-Abschnitte an, deren Startpunkt ein anderer als pBR322 ist. Die Ausdehnung dieser Sequenzen wird durch die Pfeilspitzen angezeigt, und die Quelle wird durch die Markierungen angezeigt. pBR322-Sequenzen weisen keine konzentrischen Pfeile auf. Andere Abkürzungen sind: kb, Kilobasenpaare; ori, E. coli-Replikationsstartpunkt.
In 4 werden die folgenden Abkürzungen verwendet: X, jede Gen- oder jede DNA-Sequenz, die in ein Hefechromosom zu integrieren und zu exprimieren ist; S, eine Klonierungsstelle (zum Beispiel: eine Stelle für eine Restriktionsendonuklease), in welche Gen X insertiert wird; L, eine Stelle (zum Beispiel eine Stelle für eine Restriktionsendonuklease) zum Linearisieren des Vektors innerhalb der Zielsequenz, „T" oder „Ziel"; R, eine Stelle, nicht notwendigerweise spezifisch, wo Rekombination zwischen homologen vektorabgeleiteten und chromosomabgeleiteten Zielsequenzen stattfindet. Ein Apostroph bezeichnet eine halbe Stelle (wie S oder L), die von ihrer anderen Hälfte durch Spaltung, durch Insertion einer dazwischenliegenden DNA-Sequenz oder durch Integration in ein Chromosom getrennt ist. Ein tiefstehender Buchstabe von V oder C bezeichnet Stellen oder Teile von Stellen, die aus dem Vektor bzw. Chromosom abgeleitet sind. Andere Abkürzungen sind wie in den 1-3.
Mit Bezug auf 1 besteht ein Replikationsplasmidvektor pRY252, beginnend bei der 12 Uhr-Position der Zeichnung und im Uhrzeigersinn bewegend, aus der Sequenz E-H, einem kleinen Stück DNA aus dem E.coli-Plasmid pBR322; Sequenz H-H, welche das Hefegen URA3 (eines der Gene, die für die Fähigkeit erforderlich sind, auf Uracil-armen Medien zu wachsen; dieses Gen ist ein unnötiges Artefakt im Plasmid, welches ursprünglich insertiert wurde, um ein Vergleichsselektionsmittel bereitzustellen) einschließt; Sequenz H-S, ein anderes Stück pBR322; Sequenz S-(PII), welches den Hefe-CYC1-(Cytochrom c)-Promotor und den größten Teil des Gens für Resistenz gegen G418 aus dem Bakterientransposon Tn903 (die nichtessentielle N-terminale Region ist nicht eingeschlossen) einschließt; Sequenz (PII)-E, einschließlich dem E. coli-Replikationsstartpunkt von pBR322 und dem amp^r-Gen zum Selektieren von Transformanten in E. coli; und Sequenz E-E, dem Replikationsstartpunkt der Hefe eines Hefe-2-Mikronrings.
Mit Bezug auf 2 ist der Integrationsplasmidvektor pRY253 von pRY252 dadurch abgeleitet, dass der Replikationsstartpunkt der Hefesequenz durch ein 7,0 kb EcoRI-Fragment von S. cerevisiae, das das HO-(Homothallismus)-Gen, einschließlich der Stelle K zur Insertion eines gewünschten heterologen Gens, enthält, ersetzt ist.
Mit Bezug auf 3a ist der Integrationsplasmidvektor pRY255 von pRY253 dadurch abgeleitet, dass ein 3,3 Kilobasen langes SalI- bis XhoI-Fragment, das sich von einem Endes des HO-Inserts zum Anfang der CYC1-Promotorsequenz erstreckt und das das URA3-Gen enthält, durch ein 6,0 Kilobasen langes XhoI- bis SalI-Fragment ersetzt ist, das ein Fusionsgen aus dem Hefe-GAL1-Gen und dem E. coli-lacZ-Gen enthält. Mit Bezug auf 3b ist pRY255A dem pRY255 dadurch ähnlich, dass es auch vom pRY253 dadurch abgeleitet ist, dass das 2,5 Kilobasen lange SalI-Fragment von pRY253 durch das 6,0 Kilobasen lange XhoI- bis SalI-Fragment, das das GAL1-IacZ-Fusionsgen enthält, ersetzt ist.
Mit Bezug auch auf 3b wurde pDY3 von pRY255A durch Deletion der 1,8 Kilobasenregion zwischen einer StuI-Stelle und der SmaI-Stelle stromabwärts vom CYC1-Promotor abgeleitet.
pRY255A und pDY3 können im Wesentlichen auf dieselbe Art und Weise wie pRY255, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden. Zusätzlich ist in pDY3 eine SstII-Stelle nahe des 3'-Endes des HO einzigartig auf dem Vektor, was sie eine geeignetere Stelle zur Linearisierung des Vektors macht.
Die Plasmide pRY252, pRY253, pRY255 und pRY255A wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt, und haben jeweils die Hinterlegungsnummern ATCC 39687, 39688, 39689 und 39822.
Mit Bezug auf 4 enthält das Plasmid pRY257 ein Gen X für ein gewünschtes heterologes Protein, z.B. Glukoamylase oder Interferon, das an der Stelle S in das Plasmid pRY255 insertiert wurde.
Plasmidkonstruktion
Die in den 1-3 veranschaulichten Plasmide wurden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren für rekombinante DNA und öffentlich zugängliche Materialien hergestellt.
Die Plasmide pRY253, pRY255, pRY255A und pDY3 wurden vom Replikationsplasmid pRY252 abgeleitet, welches, kurz gesagt, wie folgt konstruiert wurde.
Das URA3-Gen wurde in das Plasmid pBR322, wie veranschaulicht, insertiert, und dann wurde der Startpunkt der Replikation vom endogenen Hefe-2-Mikronring ohne die ihn normalerweise begleitenden drei Gene insertiert. Der Vektor ist in der Lage, sich in Wirtshefezellen zu replizieren, ohne diese drei Gene zu enthalten, von denen zwei Proteine kodieren, die für die Replikation essentiell sind, weil Wirtshefezellen schon den endogenen Hefe-2-Mikronring enthalten, der diese Proteine kodiert (Botstein et al. (1979) Gene 8, 17).
Der CYC1-G418^r-Fusionsteil des Plasmids wurde durch Fusion der XhoI-Stelle nahe dem 5'-Ende des G418^r-Gens des Transposons Tn903 (beschrieben in Oka et al. (1981) J. Mol. Biol., 147, 217) bis zur BamHI-Stelle, die dem CYC1-Promotor und dem 5'-Ende der CYC1-kodierenden Sequenzen des Plasmids pLG669 (beschrieben in Guarente et al. (1981) PNAS USA 78, 2199) folgen, konstruiert, nachdem beide Enden mit Mungbohnennuklease glatt gemacht wurden. Die DNA-Sequenz dieser Fusionszusammenführung ist (CYC1)...TAAATTAATAATGACCGGGCCG...(G418^r).
Die Plasmide pRY253, pRY255, pRY255A und pDY3 wurden aus pRY252 durch Durchführen der in den Figuren gezeigten Genfragmentsubstitutionen und -deletionen konstruiert. Das Plasmid pRY257 kann durch Insertion eines Gens X für ein gewünschtes Protein an der Stelle S von pRY255 innerhalb des HO-Gens konstruiert werden, so dass es Teile des HO-Gens auf jeder Seite von Gen X gibt, wie in 4 gezeigt.
Plasmidverwendung
Die erfindungsgemäßen Vektoren können bei jedem brauchbaren Verfahren verwendet werden, bei welchem Wirtshefezellen ein gewünschtes heterologes Gen exprimieren. Das gewünschte heterologe Gen kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren für rekombinante DNA insertiert werden, z.B. wie in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. pRY253, pRY255, pRY255A und pDY3 können auch verwendet werden, um Gene aus Wildtyp-Hefestämmen zu entfernen. Für die Deletion von Genen wird der HO-Teil der Vektoren irrelevant. Deletion eines Gens oder eines Teils eines Gens kann wie folgt erreicht werden:

1. Klonieren des zu entfernenden Gens mit einer benachbarten Sequenz auf beiden Seiten des Gens.
2. Erzeugen einer Deletion des geklonten Gens in vitro und Hinterlassen eines Teils von jedem der 3'- und 5'-Enden des Gens, das ausreichend ist für homologe Rekombination, aber nicht ausreichend ist, um das Protein zu kodieren, das normalerweise von dem Gen kodiert wird.
3. Einbringen der Deletions-enthaltenden DNA an einer geeigneten Lokation in einen der hier beschriebenen Integrationsvektoren.
4. Linearisieren des Vektors an einem Punkt in einer der Sequenzen neben der Deletion und Durchführen der Integrationstransformation und Selektieren auf G418-Resistenz.
5. Nichtselektives Wachsenlassen eines stabilen Transformanten über 20 bis 40 Generationen und Screenen auf Vektorabwurfereignisse entweder durch Verlust der Kolonieblaufärbung auf XgaI-Indikatorplatten oder durch Replikaplattierung auf G418-enthaltende Platten.
6. Screenen durch Durchführen eines Southern-Blots von Kolonien, die den Vektor abgeworfen haben, auf solche, die die deletierte Version des Gens behalten haben.

Die Vektoren sind besonders brauchbar in industriellen Hefestämmen, die bei der Produktion von Endprodukten, wie Wein, Brot und Bier, welche Kohlehydrat-Fermentation einschließen, verwendet werden.
Transformation
Hefezellen wurden mit Vektoren wie folgt transformiert.
Der Laborhefestamm DBY 745 (beschrieben in Guarente et al. (1981) PNAS USA 78, 2199); ein Carlsberg^®-Braustamm (isoliert aus nicht-pasteurisiertem Bier); Fleischmann's^®-Backhefe (erworben in einem Supermarkt) und eine Bordeauxweinhefe (ATCC 42928) wurden in einem reichen Standardmedium, YEP-D, mit Glusulase zu Sphaeroplasten gemacht, wachsengelassen und durch Standardverfahren der Hefetransformation Plasmid-DNA ausgesetzt, wie in Sherman et al. (1981) Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben. Vor der Transformation wurde das Integrationsplasmid pRY253 durch Verdau mit Restriktionsendonuklease an einer einzigartigen SstII-Stelle nahe dem 3'-Ende des HO-Gens linearisiert, und pRY255 wurde an einer einzigartigen KpnI-Stelle nahe dem 5'-Ende des HO-Gens linearisiert, um die Integration an der HO-Lokation zu dirigieren. Das Replikationsplasmid pRY252 wurde nicht linearisiert.
Nach Einwirken der Plasmide wurden 10⁸ Sphaeroplasten in YEP-D plus 1,0 M Sorbitol 30 Minuten lang bei 30°C wachsengelassen, und dann in 6 ml warmem 3% Agarose-enthaltendem YEP-D auf 20 ml 2% Agar, YEP-D, 1,0 M Sorbitol und 70 mM Kaliumphosphat, pH 7,0 plattiert. Nach 10 Minuten langem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden weitere 4 ml warmer 1% Agar, YEP-D, 1,0 M Sorbitol auf den oberen Agar geschichtet. Die Zellen wurden dann bei 30°C über 6 Generationen wachsengelassen, was 8 Stunden für DBY 745, 9 Stunden für Carlsberg, 7 Stunden für die Weinhefe und 6 Stunden für Fleischmann's entspricht. Nach diesem Zeitraum des „Auswachsens" wurde 0,6 ml einer sterilen Lösung des Antibiotikums G418 mit 25 mg/ml auf der Agaroberfläche verteilt und in einem sterilen Abzug trocknen gelassen. Die Platten wurden dann 2-5 Tage bei 30°C inkubiert, wonach Kolonien vor einem Hintergrund nichttransformierter Zellen erschienen. Mehrere dieser Kolonien wurden mit einem Zahnstocher auf frische YEP-D-Platten, die 500 μg/ml G418 enthalten, gepickt. Zellen, die erfolgreich transformiert wurden, ließen innerhalb von 24 Stunden sichtbare Kolonien entstehen, während nichttransformierte Zellen dies nicht taten. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist nachstehend in Tabelle 1 gegeben. Tabelle 1

^a vor der Transformation mit SstII linearisiert
^b vor der Transformation mit KpnI linearisiert

Durch Wachsen isolierter Transformanten über 10 bis 20 Generationen nichtselektiv in YEP-D und durch Zeigen, dass Umkehr zu G418-Sensitivität bei einer Rate von weniger als 10^–3 stattfand, wurde gezeigt, dass die Transformanten, die aus den Integrationsplasmiden pRY253 und pRY255 erhalten wurden, stabil integrierte Plasmide enthielten. Transformanten, die pRY255 enthielten, ergaben blaue Kolonien auf Platten, die Galaktose als alleinige Kohlenstoffquelle, 70 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0 und XgaI-Indikatorfarbstoff (5'-Brom-4'-chlor-3'-indoyl-β-D-galaktosid) enthielten.
Abwerfen von Vektorsequenzen
Der Plasmidvektor pRY257 kann linearisiert werden und zum Transformieren von Wirtshefezellen verwendet werden, wie vorstehend für die Plasmide pRY253 und pRY255 beschrieben. Wie vorstehend beschrieben, werden Transformanten auf der Grundlage von Antibiotikumsresistenz selektiert (4).
Im Anschluss an diese Selektion, wie in 4 gezeigt, kann ein weiterer Schritt unternommen werden, um unnötige Teile des Vektors abzuwerfen, welche die Stabilität des Transformanten nachteilig beeinflussen, den Geschmack oder eine andere wichtige Eigenschaft des Endprodukts nachteilig beeinflussen oder die metabolische Energie verschwenden könnten. Tatsächlich „einbringt" dieser Screenschritt das gewünschte Gen im Wirtschromosom, während er Fremd-DNA ausschließt. Der Ausschluss dieser Fremd-DNA erhöht die Stabilität des Transformanten durch Beseitigen von Tandemwiederholungssequenzen (Tandem-Repeat-Sequenzen), welche unerwünschte Rekombinationsereignisse bewirken könnten, die zum Beispiel den Verlust des gewünschten heterologen Gens zur Folge haben. Auch kann die Beseitigung des Gens für die Antibiotikumsresistenz ein Vorteil sein, wenn aus irgendeinem Grund vorhersehbar ist, dass die Verwendung des Antibiotikums, um die Hefe zu töten, notwendig werden kann. Schließlich kann die Beseitigung aller Escherichia coli-abgeleiteten Sequenzen aus der transformierten Hefe die Regierungsdurchführungserlaubnis für die Verwendung des Organismus vereinfachen.
Das Screenen hängt von der Gegenwart eines Gens im Vektor ab, das ein screenbares Merkmal kodiert; in pRY257 ist dies das E. coli-lacZ-Gen, welches β-Galaktosidase kodiert. Hefekolonien, die dieses Gen exprimieren, werden auf einer geeigneten Indikator-Petrischale, die einen Farbindikatorfarbstoff, wie XgaI enthalten, blau. Um folglich Transformanten zu selektieren, in welchen ein Teil der Vektor-DNA einschließlich dem lacZ-Gen abgeworfen worden ist, werden die Transformanten auf eine Indikatorplatte plattiert, und solche Kolonien, die auf den Platten weiß bleiben, wurden als Transformanten oder Nachkommen von Transformanten, die das lacZ-Gen nicht behalten, selektiert.
4 veranschaulicht den Abwurf-Mechanismus. In einigen Transformanten wird es ein Cross-Over-Ereignis zwischen den Vektorsequenzen geben, die homolog mit Chromosomensequenzen sind (siehe 4d). Dieses Cross-Over-Ereignis bewirkt das Ausstülpen einer Schleife (Loop) und Deletion der Region des Vektors zwischen den homologen Sequenzen (siehe 4e). Wenn sich das gewünschte heterologe Gen X (das, sagen wir, Glukoamylase kodiert) außerhalb dieser Region befindet, bleibt es im Chromosom eingebracht. Die Häufigkeit dieser Art von Ereignis kann relativ zu der anderer ungewollter Ereignisse (wie Ausstülpen einer Schleife des gesamten Plasmids, einschließlich des eingebrachten Gens) durch Einbringen des eingebrachten Gens näher am Ende der Zielsequenzen, die die Linearisierungsstelle enthalten, als am Ende der Zielsequenzen, die die Stelle des „Ausstülpens der Schleife" enthalten, erhöht werden.
Das gewünschte Ereignis des Ausstülpens der Schleife kann von den unerwünschten Ereignissen durch Screenen von den weißen Kolonien auf solche, die das Gen X halten, unterschieden werden. Dies kann entweder durch einen funktionellen Assay für das Produkt von Gen X (z.B. im Fall von Glukoamylase Kreise auf stärkehaltigen Platten) oder durch einen direkten Assay für die Gegenwart von Gen X durch Southern-Blot-Verfahren getan werden. Die beiden Screenings können gleichzeitig durchgeführt werden, z.B. durch Verwendung eines Mediums, das sowohl XgaI als auch Stärke enthält.
Andere Ausführungsformen befinden sich innerhalb der Lehre der Erfindung.
Obwohl zum Beispiel die Häufigkeit, mit welcher sich die Integrationsvektoren in das Wirtschromosom integrieren, durch Linearisierung des Vektors vor der Transformation erhöht wird, kann die Integration mit einer geringeren Häufigkeit durch Transformation mit den Vektoren in Kreisform erreicht werden. Obwohl das HO-Gen das am meisten bevorzugte Zielgen ist, kann jede andere Region des Wirtschromosoms, die nicht am Metabolismus beteiligt ist, verwendet werden. Zum Beispiel kann das mutante Homothallismus-Gen der meisten Laborhefestämme (das ho-Gen), welches sich leicht vom Wildtyp-HO-Gen unterscheidet, als Ziel verwendet werden; das ho-Gen, wie das HO-Gen hat die Vorteile einer großen Größe (etwa 2.000 Basenpaare) und der Nichtbeteiligung am Metabolismus in diploiden oder polyploiden Zellen.
Zusäztlich zu Enzymen, die an der Produktion von Brot und alkoholischen Getränken beteiligt sind, können die Vektoren der Erfindung in Verfahren verwendet werden, bei welchen das gewünschte Endprodukt ein Protein ist, z.B. therapeutische Proteine, wie Interferon, das durch das insertierte heterologe Gen kodiert wird. Das heterologe Gen kann auch ein Gen sein, das schon auf einem anderen Teil des Wirtschromosoms getragen wird; zum Beispiel könnte es vorteilhaft sein, eine zusätzliche Kopie eines nativen Gens, das bei der Alkoholproduktion beteiligt ist, hinzuzufügen, um die Produktionsmengen zu erhöhen.
Die Hefepromotorsequenz, die das Gen für die Antibiotikumsresistenz kontrolliert, kann auch weit variieren, wobei der einzige kritische Faktor der ist, dass die Sequenz bereitstellt, dass eine ausreichende Expressionsmenge in Hefezellen aufrechterhalten wird.
Wenn ein Gen im Wirtschromosom durch Verwenden eines Vektors, der eine homologe Sequenz enthält, die Zielsequenz ist, kann Linearisierung des Vektors vor der Transformation irgendwo innerhalb der homologen Sequenz stattfinden; allgemein wird die Integrationseffizienz jedoch verbessert, wenn die Linearisierung nahe dem Zentrum der Sequenz stattfindet, und verringert sich, wenn sich der Linearisierungspunkt einem der beiden Enden der Sequenz nähert.
Das screenbare Merkmal zusätzlich zur Fähigkeit, β-Galaktosidase zu produzieren, kann irgendein Merkmal sein, dessen Abwesenheit nachgewiesen werden kann. Außerdem muss, wenn die β-Galaktosidase-Produktion verwendet wird, das Gen nicht das E. coli-lacZ-Gen sein; zum Beispiel kann auch das LAC4-Gen aus der Kluyeromyces-Species, z.B. K. lactis, welches auch eine β-Galaktosidase kodiert, verwendet werden.

Claims

Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die zur Integration in ein Hefechromosom in der Lage ist, umfassend eine Hefepromotorsequenz, die funktionell mit einem Gen gekoppelt ist, das die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 kodiert, so dass die DNA-Sequenz in der Lage ist, direkt im integrierten Zustand in einer mit der DNA transformierten Hefezelle selektiert zu werden.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der Hefepromotor ein Saccharomyces cerevisiae-Promotor ist.
Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Promotor ein Saccharomyces cerevisiae-Iso-1-Cytochrom C-(CYC1)-Promotor ist.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei sich das Gen, das die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 kodiert, vom Transposon Tn903 ableitet.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der ferner ein Gen umfasst, das ein gewünschtes heterologes Protein kodiert.
Hefezelle, die mit einem Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche transformiert ist, oder ein Deszendent einer solchen Hefezelle.
Verfahren zum Transformieren von Hefezellen, umfassend das Aussetzen einer Population von Hefezellen einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Transformierbedingungen, Aussetzen der Zellen einer Dosis des Antibiotikums G418, die ausreicht, das Wachstum von nichttransformierten Zellen der Population zu verhindern, und Selektieren der Zellen, die in der Lage sind, in Gegenwart des Antibiotikums zu wachsen.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten heterologen Proteins, umfassend die Verwendung einer Hefezelle, die durch ein Verfahren nach Anspruch 7 produziert wurde, wenn von Anspruch 5 abhängig, um das Protein zu produzieren.