DE3688831T2

DE3688831T2 - Herstellung von Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen-(HBsAg) mittels Hefe.

Info

Publication number: DE3688831T2
Application number: DE86116302T
Authority: DE
Inventors: Richard Gordon Buckholz; James Michael Cregg; Michael Miller Harpold; Juerg Friedrich Tschopp
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Current assignee: Research Corp Technologies Inc (ndgesd
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-25
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2006-11-26
Also published as: IE863021L; JPS62190085A; PT83819A; AU583683B2; PL262598A1; HUT43112A; YU46031B; FI95929C; AU6538486A; NO176025B; PL152882B1; DK565186A; EP0226846A1; NO864704D0; KR920004050B1; TW215457B; FI864791A; YU201386A; CA1285895C; FI95929B

Description

Die Erfindung betrifft die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen. Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Herstellung von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in Pichia. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft neuartige DNA-Konstrukte, die für Hepatitis B-Oberflächen-Antigen codieren. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft neuartige Organismen, die mit den vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukten transformiert wurden.

Hintergrund

Mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie in den letzten Jahren ist die kontrollierte Herstellung überaus zahlreicher nützlicher Polypeptide durch Mikroorganismen möglich geworden. Viele eukaryontische Polypeptide, wie z. B. menschliche Wachstumshormone, Leukozyteninterferone, menschliches Insulin und menschliches Proinsulin, werden bereits mit Hilfe von Mikroorganismen hergestellt. Man nimmt an, daß die weitere Anwendung bereits bekannter Techniken in der Zukunft die Herstellung einer Vielzahl weiterer nützlicher Polypeptidprodukte durch Mikroorganismen ermöglicht. Ein derartiges nützliches Polypeptidprodukt ist Hepatitis B-Oberflächen-Antigen.
Das Hepatitis B-Virus (Serumhepatitis-Virus) wird unter Menschen übertragen und zeigt sich in chronischen, schwächenden Infektionen, die progressiv zu schweren Leberschädigungen, primären Karzinomen und schließlich zum Tod führen können. In den meisten Fällen ist eine vollständige Genesung von Hepatitis B-Infektionen zu erwarten. Große Teile der Bevölkerung, insbesondere in vielen afrikanischen und asiatischen Staaten, sind jedoch chronische Träger mit dem gefährlichen Potential zur pandemischen Übertragung der Krankheit.
Eine wirksame Prophylaxe des Hepatitis B-Virus besteht in der Verabreichung eines Hepatitis B-Virus-Vakzins, wobei es sich normalerweise um hoch gereinigte Hepatitis B-Oberflächen-Antigene handelt. Derartige Hepatitis B-Virus-Vakzine ermöglichen eine wirksame Verhinderung der Infektion mit dem Virus. Gruppen mit besonders hohem Risiko sind Menschen, die Bluttransfusionen oder eine Dialysebehandlung benötigen, medizinisches Personal, das mit derartigen Gruppen arbeitet, und dergl. Zusätzlich ist ein derartiges Vakzin auch zur Verhinderung der Bildung neuer Träger wirksam, und es erscheint daher möglich, das Hepatitis B-Virus auf der Erde vollständig auszurotten.
Das Hepatitis B-Virus ist in Zellkulturen nicht infektiös, und kann daher nur von infizierten Menschen oder höheren Primaten erhalten werden.
Daher sind keine Einrichtungen verfügbar, um ausreichende Gaben an Hepatitis B-Virus zur Verwendung bei der Herstellung von Antigenen zur Immunisierung gegen Hepatitis B-Virus zu erhalten und aufrechtzuerhalten.
Das Hepatitis B-Virus-Vakzin wird normalerweise durch Isolieren und Reinigen von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen aus dem Blutplasma von Trägern des Hepatitis B-Virus hergestellt. Eine derartige Reinigung muß jedoch extrem wirksam durchgeführt werden, da nur sehr geringe Konzentrationen des gewünschten Antigens im Plasma, das gereinigt wird, vorliegen. Daher ist es bisher sehr schwierig, das gewünschte Hepatitis B-Virus-Vakzin in großtechnischem Maßstab herzustellen.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher in einem Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in hohen Ausbeuten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Herstellung neuartiger DNA-Konstrukte, die zur Expression von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in hohen Konzentrationen fähig sind.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den Ansprüchen.

Darlegung der Erfindung

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in hohen Ausbeuten durch Züchten von Pichia-Zellen hergestellt werden kann, die mit DNA-Konstrukten transformiert wurden, die für Hepatitis B-Oberflächen-Antigen codierende Sequenzen unter Kontrolle regulatorischer Regionen umfassen, die auf Methanol, nicht katabolisch reprimierende Kohlenstoffquellen und einen Mangel an Kohlenstoffquellen ansprechen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine Restriktionskarte der regulatorischen Region des Dihydroxyacetonsynthase-Gens (DAS-Gens) aus Pichia.
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte der regulatorischen Region des primären Alkoholoxidase-Gens (AOX1-Gens) aus Pichia.
Fig. 3 ist die Restriktionskarte der regulatorischen Region des p40- Gens aus Pichia.
Fig. 4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pAOP2.
Fig. 5 stellt ein Schema für die Konstruktion der Plasmide pBSAG5 und pBSAG5I dar.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pHBS-5.
Fig. 7 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pAOT-1.
Fig. 8 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYJ33.
Fig. 9 verdeutlicht die Konstruktion des Plasmids pYM39 aus den Plasmiden pSAOH5 und pTHBS3.
Fig. 10 verdeutlicht die Konstruktion des Plasmids pYMI6 aus den Plasmiden pYM39 und pPG3.2.
Fig. 11 verdeutlicht die Konstruktion des Plasmids pBSAGI5I aus den Plasmiden pYMI6 und pBSAG5I.
Fig. 12 verdeutlicht die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pBSAGI5I in den primären Alkoholoxidase-Locus (AOX1-Locus) des Pichia- Chromosoms.
Fig. 13 stellt ein Schema für die Konstruktion des Plasmids pTHBS3 dar.
Die folgenden Abkürzungen werden in den Figuren verwendet, um die eingesetzten Restriktionsenzyme darzustellen.
Abkürzung Restriktionsenzym
As AsuII
B BamHI
B&sub2; BglII
Bc BclI
C ClaI
H&sub2; HincII
H&sub3; HindIII
K XpnII
Nd&sub1; NdeI
Nr NruI
Ps PstI
Pv&sub1; PvuI
Pv&sub2; PvuII
R&sub1; EcoRI
R&sub5; EcoRV
S SalI
Sp SphI
Ss SstI
St StuI
Xb XbaI
Xh XhoI
In den beigefügten Figuren sind Restriktionsstellen, die zur Manipulation der DNA-Fragmente verwendet wurden, die jedoch bei der Ligation zerstört wurden, dadurch gekennzeichnet, daß die Abkürzung für die zerstörte Stelle in runde Klammern gesetzt ist.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein neuartiges DNA-Fragment bereitgestellt, das eine regulatorische Region und eine für ein Polypeptid codierende Region umfaßt, wobei die für das Polypeptid codierende Region für ein Hepatitis B-Oberflächen-Antigen oder Abschnitte davon codiert und die regulatorische Region zur Kontrolle der Transkription der Messenger-RNA fähig ist, wenn sie am 5'-Ende des für das Polypeptid codierenden Gens angeordnet wird. Die Kombination aus regulatorischer Region, Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Gen (HBsAg-Gen) und einem Transkriptionsterminator-Fragment wird nachstehend als Expressionskassette oder Expressionseinheit bezeichnet. Die bei der Ausführung der Erfindung eingesetzte regulatorische Region spricht mindestens auf eine der aus der folgenden Gruppe ausgewählten Bedingungen an:
die Gegenwart von Methanol im Kulturmedium, mit dem der die Expressionskassette enthaltende Wirtsorganismus in Kontakt steht,
die Gegenwart einer nicht katabolisch reprimierenden Kohlenstoffquelle außer Methanol im Kulturmedium, mit dem der die Expressionskassette enthaltende Wirtsorganismus in Kontakt steht, und
ein Mangel an Kohlenstoffquellen im Kulturmedium, mit dem der die Expressionskassette enthaltende Wirtsorganismus in Kontakt steht, nachdem der Wirtsorganismus auf der katabolisch reprimierenden Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet worden ist.
Erfindungsgemäß werden ferner neuartige lineare und ringförmige Plasmide bereitgestellt, die die vorstehend beschriebene Expressionskassette enthalten.
Weiterhin werden erfindungsgemäß im wesentlichen reine Kulturen von Hefestämmen, die mit den vorstehend beschriebenen linearen oder ringförmigen Plasmiden transformiert wurden, bereitgestellt.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen beschrieben, das das Züchten eines Pichia-Stammes umfaßt, der mit den vorstehend beschriebenen Plasmiden unter Bedingungen, unter denen die Expression des gewünschten Proteinprodukts erzielt wird, transformiert worden ist.
Die regulatorischen Regionen, die bei der Ausführung der Erfindung eingesetzt werden, sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, auf Medien mit folgenden Substanzen anzusprechen:
(1) Methanol,
(2) nicht katabolisch reprimierende Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Galactose, Acetat und dergl.,
(3) katabolisch reprimierende Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Ethanol, Fructose und dergl., gefolgt von einem Mangel an Kohlenstoffquellen.
Beispielhafte regulatorische Regionen, die die vorstehend genannten Kriterien erfüllen, werden durch die in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigten Restriktionskarten verdeutlicht. Die in Fig. 1 gezeigte regulatorische Region ist aus dem Dihydroxyacetonsynthase-Gen (DAS-Gen) von Pichia pastoris abgeleitet. Die in Fig. 2 gezeigte regulatorische Region ist aus dem primären Alkoholoxidase-Gen (AOX1-Gen) von Pichia pastoris abgeleitet (Pichia besitzt zwei Alkoholoxidase-Gene, die hier als AOX1 und AOX2 bezeichnet werden). Die in Fig. 3 gezeigte regulatorische Region ist aus dem p40-Gen von Pichia pastoris abgeleitet. Fachleute erkennen, daß weitere regulatorische Regionen mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften aus methylotrophen Hefen, wie Pichia pastoris, isoliert werden können. Derartige zusätzliche regulatorische Regionen mit regulatorischen Eigenschaften, die den Eigenschaften der vorstehend beschriebenen regulatorischen Regionen ähnlich sind, kommen erfindungsgemäß ebenfalls in Betracht.
Das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Gen (HBsAg-Gen) ist bereits isoliert worden (Valenzuela et al., Nature, Bd. 280 (1979), S. 815) und kann durch die Behandlung verschiedener Vektoren, wie pHBS-5 (vgl. Fig. 6 und Valenzuela et al., Nature, Bd. 298 (1982), S. 347), pHBV-T-1A (Genentech, EPA 73 657), pHBS-56 (ATCC-Hinterlegungsnummer 40 047; vgl. EPA 120 551) und dergl., mit geeigneten Restriktionsenzymen erhalten werden.
Das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Gen wurde durch Behandlung mit der Bal31-Exonuclease modifiziert, um virale, nicht-codierende Sequenzen am 5'-Ende des Hepatitis-Gens zu entfernen. Das 3'-Ende des HBsAg-Gens wurde durch Endonucleaseverdau und Zugabe eines Linkers modifiziert, um virale, nicht-codierende Sequenzen am 3'-Ende des Hepatitis-Gens zu entfernen. Das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Gen wurde weiter modifiziert, um geeignete Restriktionsstellen zur Manipulation des DNA-Fragments einzuführen. Das resultierende DNA-Fragment ist ein EcoRI-StuI-Insert und weist die folgende Nucleotidsequenz auf:
Die erfindungsgemäßen Konstrukte aus regulatorischer Region und Strukturgen können zur Amplifikation, Reproduktion und Expression auf verschiedene Weise in Organismen eingeführt werden. Für die autonome Replikation in Hefe ist ein Sequenzelement für die autonome Replikation (ARS-Element) nützlich. Beispiele umfassen PARS1 und PARS2, die von Pichia pastoris abgeleitet sind (vgl. die entsprechende US-Anmeldung Nr. 666 577, (Erfinder: Cregg, Patentinhaber: Phillips Petroleum Co.). Wird hingegen eine integrative Transformation des Wirts gewünscht, so wird kein ARS-Element eingesetzt. Ein bevorzugtes Verfahren, um eine integrative Transformation zu erzielen, wird in der US-Anmeldung Nr. 791 013, (Erfinder: Cregg, Patentinhaber: Phillips Petroleum Co.) beschrieben, und umfaßt die Integration des Vektors an einer spezifischen Stelle, wobei der Vektor ein
erstes inserierbares DNA-Fragment,
ein selektierbares Markergen und
ein zweites inserierbares DNA-Fragment umfaßt.
Das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment weisen jeweils eine Länge von etwa mindestens 200 Nucleotiden auf. Ihre Nucleotidsequenzen sind homolog zu Abschnitten der genomischen DNA von Spezies der Gattung Pichia. Die verschiedenen Komponenten des integrativen Vektors sind nacheinander unter Bildung eines linearen DNA-Fragments angeordnet, so daß die Expressionskassette und das selektierbare Markergen zwischen dem 3'-Ende des ersten inserierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten inserierbaren DNA-Fragments angeordnet sind. Das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment sind in dem nacheinander angeordneten linearen Fragment so zueinander orientiert, wie sie im Genom von Pichia orientiert sind.
Es ist erforderlich, mindestens ein selektierbares Markergen in die zur Transformation des Wirtsstammes verwendete DNA einzuschließen. Dies erleichtert die Selektion und Isolierung derjenigen Organismen, die die transformierende DNA einverleibt haben. Das Markergen verleiht dem transformierten Organismus phänotypische Merkmale, die der Wirt nicht aufwies, z. B. die Wiederherstellung der Fähigkeit zur Bildung einer spezifischen Aminosäure, wobei der nicht-transformierte Wirtsstamm einen Defekt im Biosyntheseweg für die spezifische Aminosäure aufweist.
Fachleute erkennen, daß zusätzliche DNA-Sequenzen ebenfalls den bei der Ausführung der Erfindung verwendeten Vektoren einverleibt werden können, wie bakterielle Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und dergl. Derartige Sequenzen ermöglichen die Amplifikation und Erhaltung dieser Vektoren in bakteriellen Wirten.

Expression in transformierter Hefe

Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Plasmide sind in Pichia-Stämmen, die transformiert werden können, von Nutzen. Die Regulation der Genexpression in Pichia durch die neuartigen erfindungsgemäßen DNA- Fragmente kann erreicht werden, indem die transformierten Organismen einem Mangel an Kohlenstoffquellen unterworfen werden. Ein Mangel an Kohlenstoffquellen nach Wachstum auf einer Vielzahl von sowohl katabolisch reprimierenden als auch nicht katabolisch reprimierenden Kohlenstoffquellen induziert die Expression des unter Kontrolle der regulatorischen Regionen der Erfindung gehaltenen Genprodukts. Ein weiteres Mittel, um die Expression des gewünschten Genprodukts in geeigneten Spezies von transformierter Pichia zu erhalten, besteht im Züchten transformierter Pichia auf Methanol. Ein weiteres Mittel, um die Expression des gewünschten Genprodukts zu induzieren, besteht im Züchten transformierter Pichia auf einem nicht katabolisch reprimierende Kohlenstoffquellen enthaltenden Medium.
Die regulatorischen Regionen der Erfindung sind für die Expression in allen Pichia-Stämmen nützlich, da gezeigt wurde, daß die regulatorischen Regionen unter einer Vielzahl von Bedingungen induziert werden. Auf diese Weise kann erreicht werden, daß zum Wachstum auf Methanol oder auf nicht katabolisch reprimierenden Kohlenstoffquellen fähige Pichia fremde, d. h. heterologe, Polypeptide direkt herstellt; es kann erreicht werden, daß zum Wachstum auf katabolisch reprimierbaren Kohlenstoffquellen fähige Hefen fremde Polypeptide herstellen, indem die so gezüchteten Hefezellen Mangelbedingungen in Bezug auf Kohlenstoffquellen unterworfen werden.
Pichia wird verwendet, da die Sicherheit ihrer Handhabung, die Wachstumsbedingungen und dergl. etabliert und Fachleuten gut bekannt sind.
Pichia ist zum Wachstum auf Methanol als Kohlenstoff und Energiequelle fähig.
Da die regulatorischen Regionen der Erfindung auch durch Wachstum auf nicht katabolisch reprimierenden Kohlenstoffquellen sowie durch Mangelbedingungen in Bezug auf Kohlenstoffquellen induziert werden, sind Pichia-Stämme, die zum Wachstum auf nicht-methanolischen Substraten, wie Glucose, Acetat, Glycerin, Ethanol, Lactose, Galactose, Fructose, Saccharose und dergl. und Gemischen von zwei oder mehr der vorstehend genannten Verbindungen fähig sind, ebenfalls nützlich bei der Ausführung der Erfindung. Durch Züchten des Wirtsorganismus auf einer geeigneten nicht katabolisch reprimierbaren, nicht-methanolischen Kohlenstoffquelle, wie Glycerin oder Galactose, oder durch Züchten des Wirtsorganismus auf einer geeigneten katabolisch reprimierbaren Kohlenstoffquelle, wie Ethanol, Glucose und Fructose, anschließendes Unterwerfen des Wirtsorganismus den Mangelbedingungen in Bezug auf Kohlenstoffquellen, kann die Expression des Genprodukts unter der Kontrolle der regulatorischen Regionen der Erfindung erreicht werden.
Ein als Wirt besonders bevorzugter Pichia-Stamm ist die Mutante Pichia pastoris GS115, wobei diese Mutante einen Defekt bei der Fähigkeit zur Bildung von Histidin aufweist. Der Genotyp von GS115 wird als his4 bezeichnet, und zwar als Folge eines Defektes im Biosyntheseweg für Histidin, der das für Histidinoldehydrogenase codierende Gen betrifft. GS115 ist von Pichia pastoris NRRL Y-1143O abgeleitet und ist beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt. Die zugeordnete Hinterlegungsnummer ist NRRL Y-15851. Dieser besondere Wirt ist nützlich, da er eine auxotrophe Mutante mit einem Defekt im Histidinbiosyntheseweg ist. Die Transformation dieses Wirts mit einem Vektor, der neben anderen DNA- Sequenzen Sequenzen umfaßt, die für die Funktion des HIS4-Gens codieren, erlaubt die einfache Selektion transformierter Wirte.
Ein weiterer bei der Ausführung der Erfindung bevorzugter Pichia - Stamm ist die Mutante Pichia pastoris GS190, wobei die Mutante einen Defekt im Argininbiosyntheseweg aufweist, der das für Argininsuccinatlyase codierende Gen betrifft. GS190 ist von Pichia pastoris NRRL Y-11430 abgeleitet und beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt. Die zugeordnete Hinterlegungsnummer ist NRRL Y-18014.
Ein weiterer als Wirt bevorzugter Pichia-Stamm ist die doppelt auxotrophe Mutante PPF1, wobei die Mutante sowohl im Histidin- als auch im Argininbiosyntheseweg defekt ist. PPF1 ist sowohl im Histidinbiosyntheseweg defekt, wobei das für Histidinoldehydrogenase codierende Gen betroffen ist, als auch im Argininbiosyntheseweg, wobei das für Argininsuccinatlyase codierende Gen betroffen ist. PPF1 ist beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt. Die zugeordnete Hinterlegungsnummer ist NRRL Y- 18917.
Escherichia coli ist ebenfalls ein geeigneter Wirt für die Plasmide der Erfindung. Fachleute erkennen, daß viele Stämme von E. coli geeignete Wirte sind. Einige in der gegenwärtigen Arbeit verwendete Stämme sind nachstehend aufgeführt:
Bezeichnung des Stamms Hinterlegungsnummer
MC1061 unbekannt
LE392 ATCC Nr. 33572
MM294 ATCC Nr. 33625
Verfahren zur Transformation von Pichia pastoris Das experimentelle Verfahren zur Transformation von Pichia pastoris ist bereits beschrieben worden und wird nachstehend noch ausführlicher dargelegt (Beispiel I).
Pichia pastoris kann durch enzymatischen Verdau der Zellwände transformiert werden, wobei man Sphäroplasten erhält; die Sphäroplasten werden dann mit der transformierenden DNA gemischt und in Gegenwart von Calciumionen und Polyethylenglykol inkubiert und anschließend in einem selektiven Züchtungsmedium ohne Histidin degeneriert. Die transformierende DNA umfaßt das HIS4-Gen, das dem Wirtsstamm fehlt, so daß nur transformierte Zellen das eingesetzte selektive Züchtungsmedium überleben.

Extraktion von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen

Fachleuten ist klar, daß zahlreiche Verfahren zur Extraktion eines heterologen Proteins aus einem einzelligen rekombinanten Wirt verfügbar sind. Beliebige, Fachleuten bekannte Techniken zur Zerstörung der Zellen und zur Proteinkonzentration und/oder Extraktion aus den zerstörten Zellen sind zur Gewinnung des erfindungsgemäß hergestellten HBsAg geeignet.

Hepatitis B-Oberflächen-Antigen-Assay

Transformierte Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, unter geeigneten Bedingungen zur Expression gezüchtet. Anschließend wurden nach dem Aufbrechen der Zellen lösliche und unlösliche Fraktionen auf HBsAg untersucht. Die lösliche Fraktion wurde auf Teilchen von 22 nm mit einem handelsüblichen Reagenzsatz der Bezeichnung "AUSRIA® II" untersucht (Abbott Laboratories). Sowohl die lösliche als auch die unlösliche Fraktion wurden unter Einsatz eines Western-Blot-Verfahrens, bei dem Antiseren gegen die monomere Form von HBsAg und radioaktiv mit ¹²&sup5;I markiertes Protein A verwendet wurden, auf Monomere untersucht.
Die Erfindung wird nun ausführlicher mit Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiele

Die folgenden Abkürzungen werden in allen Beispielen mit der folgenden Bedeutung verwendet:
SDS Natriumdodecylsulfat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylendiamin
DTT Dithiothreit
BSA Rinderserumalbumin
EtBr Ethidiumbromid
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
Ci Curie
Zymolyase 60 000 Quelle: Miles Laboratories
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Puffer und Lösungen haben die nachstehend angegebene Zusammensetzung:
1 m Tris-Puffer 121,1 g Tris-Base in 800 ml H&sub2;O; Einstellung des pH-Wertes auf den gewünschten Wert durch Zugabe von konzentrierter (35%) wäßriger HCl; Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur vor der endgültigen Einstellung des pH-Wertes, Verdünnung auf ein endgültiges Volumen von 1 Liter.
TE-Puffer 1,0 millimolar EDTA in 0,01 m Tris-Puffer (pH- Wert: 7,4)
PBS (phosphatgepufferte 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,0) Kochsalzlösung) 0,15 m NaCl
Puffer für SDS-Gel- 62,5 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 6,8)
Beladung 2% SDS 10% Glycerin 100 millimolar Dithiothreit 0,001 % Bromphenolblau
YPD-Medium 1% Bakto-Hefe-Extrakt 2 % Bakto-Pepton 2 % Dextrose
SD-Medium 6,75 g Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO) 2 % Dextrose in 1 l Wasser
SED 1 m Sorbit 25 millimolar EDTA 50 millimolar DTT
SCE-Puffer 9,1 g Sorbit 1,47 g Natriumcitrat 0,168 g EDTA 50 ml H&sub2;O --Einstellung des pH-Wertes auf 5,8 mit HCl
CaS 1 m Sorbit 10 millimolar CaCl&sub2;
- - Sterilfiltration
PEG-Lösung 20 % Polyethylenglycol-3350 10 millimolar CaCl&sub2; 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4)
- - Sterilfiltration
SOS 1 m Sorbit 0,3x YPD-Medium 10 millimolar CaCl&sub2;

Basissalzzusammensetzung (zur Züchtung transformierter Pichia im Fermenter):

Basissalze pro 1 l
H&sub3;PO&sub4;, 85% 4,2 ml
CaSO&sub4;·2H&sub2;O 0,18 g
K&sub2;SO&sub4; 2,86 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2,34 g
KOH 0,65 g

Nährmedium für Pichia (zum Züchten von GS115/pBsAG5 im Fermenter)

g/l Wasser H&sub3;PO&sub4; (85%) 3,5 ml
CaSO&sub4;·2H&sub2;O 0,15
K&sub2;SO&sub4; 2,38
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1,95
KOH 0,65
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,065
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,006
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,020
MnSO&sub4;·H&sub2;O 0,003
Biotin 0,000041
Kohlenstoffquelle 20-100 g

Lösung von Spurenelementen zum Züchten von GS115(pBSAGI5I) 1

g/l Wasser CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,06
KI 0,08
MnSO&sub4;·H&sub2;O 0,3
Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O 0,2
H&sub3;BO&sub3; 0,02
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 2,0
FeCl&sub3;·6H&sub2;O 4,8
H&sub2;SO&sub4; 3-5 ml/l (um Trübungen zu entfernen)
Ausria-Verdünnungspuffer 4,3 millimolar Na&sub2;HPO&sub4; 1,5 millimolar KH&sub2;PO&sub4; 2,7 millimolar KCl 0,15 m NaCl 1% Rinderserumalbumin 0,02 % Natriumazid --endgültiger pH-Wert: 7,4
Lösungspuffer 10 millimolar Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,5) 0,5 m NaCl 0,1% Triton X-100 2 millimolar PMSF
Sofern nicht anders angegeben, stellen die vorstehend beschriebenen Lösungen die eingesetzte Grundkonzentration (1·) dar. In allen Beispielen, in denen davon verschiedene Konzentrationen eingesetzt werden, wird diese Tatsache durch Angabe der Konzentration der Lösung als ein Vielfaches der Grundkonzentration (1·) angegeben.

Beispiel I

Transformationsverfahren für Pichia pastoris

A. Züchten der Zellen

1. Überimpfen einer Kolonie von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) in etwa -10 ml YPD-Medium und Schütteln der Kultur bei 30ºC für 12 bis 20 Stunden.
2. Nach etwa 12 bis 20 Stunden Verdünnen der Zellen auf einen OD&sub6;&sub0;&sub0;- Wert von etwa 0,01 bis 0,1 und Halten der Zellen in logarithmischer Wachstumsphase in YPD-Medium bei 30ºC für 6 bis 8 Stunden.
3. Nach etwa 6 bis 8 Stunden Animpfen von 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der Vorkultur bei einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von etwa 0,1 (oder mit einer äquivalenten Menge). Schütteln bei 30ºC für etwa 12 bis 20 Stunden.
4. Ernten der Kulturen bei einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von etwa 0,2 bis 0,3 (nach etwa 16 bis 20 Stunden) durch Zentrifugation bei 1500 g für 5 Minuten.

B. Präparation von Sphäroplasten

1. Einmaliges Waschen der Zellen in 10 ml sterilem Wasser. (Alle Zentrifugationsschritte 1 bis 5 werden bei 1500 g für 5 Minuten durchgeführt).
2. Einmaliges Waschen der Zellen in 10 ml frisch bereiteter SED-Lösung.
3. Zweimaliges Waschen der Zellen in 10 ml steriler 1 m Sorbit-Lösung.
4. Resuspendieren der Zellen in 10 ml SCE-Puffer.
5. Zugabe von 5 bis 10 ul von 4 mg/ml Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories). Inkubieren der Zellen bei 30ºC für etwa 30 bis 60 Minuten.
Da die Präparation der Sphäroplasten ein kritischer Schritt des Transformationsverfahrens ist, sollte man die Sphäroplastenbildung wie nachstehend beschrieben, verfolgen: Zugabe von 100 ul Zellsuspension zu 900 ul von 5% SDS-Lösung und 900 ul von 1 m Sorbit-Lösung vor oder unmittelbar nach der Zugabe von Zymolyase und zu verschiedenen Zeiten während der Inkubationsperiode. Abbruch der Inkubation zu dem Zeitpunkt, zu dem die Zellen in SDS, aber nicht in Sorbit-Lösung lysieren (normalerweise zwischen 30 und 60 Minuten Inkubation).
6. Zweifaches Waschen der Sphäroplasten in 10 ml steriler 1 m Sorbit-Lösung durch Zentrifugation bei 1000 g für 5 bis 10 Minuten. (Die Dauer und die Geschwindigkeit der Zentrifugation können variieren; es sollte ausreichend zentrifugiert werden, um die Sphäroplasten zu pelletieren, aber nicht so stark, daß sie durch die Kraft zerreißen).
7. Einfaches Waschen mit 10 ml steriler CaS-Lösung.
8. Resuspendieren der Zellen in insgesamt 0,6 ml CaS-Lösung.

C. Transformation

1. Einfüllen von DNA-Proben (mit einem Volumen bis zu 20 ul) in sterile Polypropylen-Röhrchen von 12·75 mm. (Die DNA sollte sich in Wasser oder in TE-Puffer befinden; für maximale Transformationsfrequenzen mit kleinen Mengen DNA ist es ratsam, jeder Probe etwa 1 ul von 5 mg/ml mit Ultraschall behandelter DNA aus E. coli zuzusetzen).
2. Zugabe von 100 ul Sphäroplasten zu jeder DNA-Probe und Inkubation bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten.
3. Zugabe von 1 ml PEG-Lösung zu jeder Probe und Inkubation bei Raumtemperatur für etwa 15 Minuten.
4. Zentrifugation der Proben bei 1000 g für 5 bis 10 Minuten und Abdekantieren der PEG-Lösung.
5. Resuspendieren der Proben in 150 ul SOS-Lösung und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Zugabe von 850 ul steriler 1 m Sorbit-Lösung und Plattieren von Proben wie nachstehend beschrieben.

D. Regeneration von Sphäroplasten

1. Rezeptur für ein Agar-Medium zur Regeneration:

a. Agar-KCl - 9 g Bakto-Agar, 13,4 g KCl, 240 ml H&sub2;O, Autoklavieren.
b. 10X Glucose - 20 g Dextrose, 100 ml H&sub2;O, Autoklavieren.
c. 10X SC - 6,75 g Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 100 ml H&sub2;O, Autoklavieren. (Zugabe jeder gewünschten Aminosäure oder Nucleinsäure bis zu einer Konzentration von 200 ug pro ml vor oder nach dem Autoklavieren).
d. Zugabe von 30 ml von 10X Glucose und 30 ml von 10X SC zu 300 ml geschmolzener Agar-KCl-Lösung. Zugabe von 0,6 ml von 0,2 mg/ml Biotin und beliebigen anderen gewünschten Aminosäuren oder Nucleinsäuren bis zu einer Konzentration von 20 ug/ml. Belassen des geschmolzenen Regenerations-Agars bei 55 bis 60ºC.

2. Plattieren von Transformationsproben:

Gießen einer Agar-Bodenschicht von 10 ml Regenerationsagar pro Platte mindestens 30 Minuten, bevor die Transformationsproben fertig sind. Verteilen von Proben von 10 ml des Regenerations-Agars in Röhrchen in einem Bad mit 45 bis 50ºC während der Zeitspanne, in der die Transformationsproben sich in der SOS-Lösung befinden. Zugabe einer Menge aus jeder Probe zu den geschmolzenen, bei 45 bis 50ºC gehaltenen Proben des Regenerationsagars. Gießen dieser Proben auf Platten, die eine feste Agar- Bodenschicht aus 10 ml Regenerationsagar enthalten.

3. Bestimmung der Qualität der Sphäroplasten-Präparation:

Entnahme von 10 ul einer Probe und 100-faches Verdünnen durch Zugabe von 990 ul einer 1 m Sorbit-Lösung. Entnahme von 10 ul dieser 100-fach verdünnten Lösung und weitere 100-fache Verdünnung durch Zugabe einer zweiten Probe von 990 ul 1 m Sorbit-Lösung. Ausstreichen von Proben von 100 ul beider Verdünnungen auf YPD-Agarmedium, um die Konzentration ganzer, nicht in Sphäroplasten umgewandelter Zellen zu bestimmen, die in der Präparation verblieben sind. Zugabe von 100 ul jeder Verdünnung zu 10 ml mit 40 ug/ml Histidin angereichertem Regenerationsagar, um die Gesamtmenge an regenerierbaren Sphäroplasten zu bestimmen. Gute Werte für ein Transformationsexperiment sind eine Gesamtmenge von 1-3·10&sup7; regenerierbaren Sphäroplasten/ml und etwa 1·10³ ganze Zellen/ml.

4. Inkubieren der Platten bei 30ºC für 3 bis 5 Tage.

Beispiel II

Konstruktion der pAOP2-Familie von Vektoren

1. Das Plasmid pPG2.5 (ein auf pBR322 basierendes Plasmid, das das ungefähr 2,5-kbp-EcoRI-SalI-Fragment aus dem Plasmid pPG4.0 enthält, wobei dieses Plasmid das primäre Alkoholoxidase-Gen (AOX1) und regulatorische Regionen enthält, und das in E. coli als Wirt vom Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois als NRRL B-15868 erhältlich ist) wurde mit BamHI verdaut.
2. Das linearisierte Plasmid wurde mit BAL31 verdaut.
3. Die resultierende DNA wurde mit Klenow-Fragment behandelt, um die Bildung glatter Enden zu verstärken, und mit EcoRI-Linkern ligiert.
4. Die Ligationsprodukte wurde in den E. coli-Stamm MM294 transformiert.
5. Transformanten wurden durch Koloniehybridisierungs-Techniken unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids mit der folgenden Sequenz:
untersucht. Dieses Oligonucleotid enthält die AOX1-Promotorsequenz bis zum ATG-Initiationskodon, aber ohne dieses einzuschließen, verknüpft mit der Sequenz des EcoRI-Linkers.
6. positive Klone wurden nach der Maxam-Gilbert-Methode sequenziert. Alle drei positiven Klone wiesen die folgende Sequenz auf:
Sie wiesen alle das "A" des ATG auf (in der vorstehenden Sequenz unterstrichen). Es wurde entschieden, daß dieses A wahrscheinlich nicht nachteilig sein würde; alle nachfolgenden Klone sind daher von diesen positiven Klonen abgeleitet. Diesen Klonen wurden die Laborbezeichnungen pAOP1, pAOP2 bzw. pAOP3 gegeben.
7. Zwei weitere Klone wurden durch Untersuchen der BAL31/Linker-ligierten Produkte identifiziert. Sie wiesen die folgende Sequenz auf:
Diese Klone wurden als pAOP5 und pAOP6 bezeichnet.
In Abwandlung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde das Plasmid pPG2.5 mit AsuII anstelle von BamHI geschnitten, das linearisierte Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment behandelt (keine BAL31-Behandlung wie vorstehend) und anschließend an EcoRI-Linker ligiert. Das resultierende Plasmid enthält die AOX1-Promotorsequenzen ohne das ATG- Initiationskodon. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wurde als pAOP4 bezeichnet und weist die folgende Sequenz auf:
Der AOX1-Promotor (pAOX1) spricht auf eine katabolische Kohlenstoffrepression durch eine strikte Unterbrechung der Enzymsynthese an. Zusätzlich spricht der AO-Promotor auf einen Kohlenstoffmangel an. Züchten auf Methanol führt zu einer weiteren Induktion des AOX1-Promotors. Außerdem ist es aus ausführlichen Untersuchungen, wie den von Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold und Gingeras in Molecular and Cellular Biology, Mai 1985, S. 1111-1121, beschriebenen Untersuchungen, bekannt, daß das erfindungsgemäß verwendete AOX1-Promotorfragment in ähnlicher Weise wie der AOX1-Promotor im Chromosom reguliert wird. Jeder der Klone, der wie in diesem Beispiel beschrieben hergestellt und isoliert wurde, spricht auf katabolische Repression, Kohlenstoffmangel und Methanolinduktion an, wie es für den AOX1-Promotor selbst der Fall ist.

Beschreibung des AO-Terminators

Das als AO-Terminator verwendete StuI-HiniIII-Fragment enthält Sequenzen, die eine Matrize für die Polyadenylierung des AOX1-mRNA-Transkripts bereitstellen. Diese Sequenzen umfassen die folgende Sequenz:
TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC - Polyadenylierung
Wenn das StuI-HindIII-Fragment auf dem Plasmid 3' zu einer für ein Polypeptid codierenden Region angeordnet ist, dann begünstigt es die RNA- Termination. Die AOX1-Terminationssequenz ist isoliert worden, und sie kann aus dem Plasmid pPG3.2 gewonnen werden, bei dem es sich um ein Plasmid auf pBR322-Basis handelt, das die AOX1-Terminationssequenz enthält. Das in E. coli als Wirt transformierte Plasmid ist beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15999 erhältlich.

Beispiel III

Die Folge von Schritten, die zur Präparation der Plasmide, die Gegenstand dieses Beispiels sind, angewandt wurde, sind in der beigefügten Fig. 5 zusammengefaßt.

Konstruktion von pBSAG5 und pBSAG5I

1. Konstruktion von pCFL2

Der Vektor pAOP2, der den AOX1-Promotor ohne die Sequenz TG aus ATG an seinem 3'-Ende enthält, wurde mit HincII geschnitten. Das den Promotor enthaltende DNA-Fragment wurde isoliert und in pBR322 ligiert, wobei dieses Plasmid zuvor mit HindIII geschnitten und mit Klenow-Fragment aufgefüllt worden war. Diese Reaktion erzeugte den Vektor pCFL2.

2. Konstruktion von pBSAOP2

pBR322-BglII, bei dem die PvuII-Stelle von pBR322 durch eine BgIII- Stelle ersetzt war, wurde mit EcoRI und ClaI verdaut. Dieses linearisierte Plasmid wurde mit dem 5'-AOX1 enthaltenden ClaI/EcoRI-Fragment aus pCFL2 in einer Ligationsreaktion kombiniert. Der resultierende Vektor wurde als pBSAOP2 bezeichnet.

3. Konstruktion von pBSAG22

Das Plasmid pHBS-5 (beschrieben von Valenzuela et al., Nature, Bd. 298 (1982), S. 347-350; vgl. Fig. 6), das das in die EcoRI-Stelle von pBR322 inserierte HBsAg-Gen enthält, wurde mit ClaI verdaut. Ungefähr 60 Basenpaare wurden in beiden Richtungen mit der Bal31-Exonuclease entfernt. Das verbleibende DNA-Fragment wurde mit BamHI verdaut und mit Klenow-Fragment aufgefüllt. Nach Ligation wurde ein Pool von ungefähr 200 Transformanten mit NcoI geschnitten. Die linearisierten Plasmide wurden isoliert und religiert. Nach Transformation von E. coli wiesen ungefähr 10% aller Plasmide (bezeichnet als pBSAG1) die neu erzeugte NcoI-Stelle auf. pBSAG1 wurde mit NcoI verdaut, mit Klenow-Fragment aufgefüllt und mit BamHI verdaut. Dieses Plasmidfragment wurde an pBSAOP2 ligiert, das zuvor min EcoRI verdaut worden war, mit Klenow-Fragment gefüllt und mit BamHI verdaut. Der resultierende Vektor wurde als pBSAG22 bezeichnet.

4. Konstruktion von pBSAG4, pBSAG5, pBSAG5I

Das Plasmid pAOT-1, ein auf pBR322 basierendes Plasmid, das abgeleitet ist durch Ligation eines 1,6-kbp-SalI-HindIII-Fragments von pPG3.2 (erhältlich in E. coli als Wirt als NRRL B-15999) in ein mit SalI-HindIII geschnittenes pBR322 Delta EcoRI-Plasmid (d. h. pBR322, bei dem die EcoRI- Stelle zerstört ist; vgl. Fig. 7), das ein 3'-AOX1-Transkriptions- Terminationsfragment trägt, wurde mit XbaI und PstI geschnitten. Das den Terminator enthaltende Fragment wurde in pBSAG22 ligiert, das zuvor mit XbaI und PstI geschnitten worden war, um pXP-1 zu erhalten. pBSAG22 wurde mit DraI verdaut, anschließend wurden StuI-Linker zugegeben, und schließlich wurden StuI und EcoRI zum weiteren Verdau verwendet. Das HBsAg- Strukturgen wurde isoliert und in pXP-1 ligiert, das zuvor mit StuI und EcoRI geschnitten worden war, wobei man pBSAG4 erhielt.
Das HBsAg enthaltende ClaI-Fragment aus pBSAG4 wurde in die einzige ClaI-Stelle von pYJ33 (vgl. Fig. 8) ligiert, wobei man pBSAG5 und pBSAG5I erhielt. Eine Restriktionskarte des Plasmids pBSAG5I ist in Fig. 11 dargestellt. Die Plasmide pBSAG5 und pBsAG5I unterscheiden sich nur in der Orientierung des ClaI-Fragments, das die 5'-AOX1/HBsAg/3'-AOX1-Expressionskassette enthält. So ist in pBSAG5 das 5'-AOX1-Fragment zum HIS4-Gen aus Pichia benachbart, während das 3'-AOX1-Fragment zu dem autonomen Element, PARS2, benachbart ist. Das in E. coli als Wirt transformierte Plasmid pBSAG5 ist beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture hinterlegt. Dem E. coli-Stamm MC1061- pBSAG5 ist die Hinterlegungsnummer NRRL B-18028 zugeordnet worden.

Beispiel IV

Konstruktion des Pichia pastoris-HBsAg-Exvressions-Wirtes GS115 (pBSAG151)

Die Präparation des Pichia pastoris-Wirtes, bei dem das primäre Alkoholoxidase-Gen (AOX1) durch das Gen für Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAg) im Pichia-Chromosom ersetzt ist, wird in diesem Beispiel beschrieben.
Um die P. pastoris-HBsAg-Expressions-AOX1&supmin;-Mutante als Wirt zu erzeugen, wurde das Plasmid pBSAGI5I konstruiert, wie in den Fig. 9-11 dargestellt ist. Der erste Schritt der Konstruktion bestand in einem Verdau des AOX1-Promotor-LacZ-Gen-Expressionsvektors pSAOH5 und des AOX1- Promotor-HBsAg-Expressionsvektors pTHBS3, die wie nachstehend beschrieben und in Fig. 13 zusammengefaßt präpariert worden waren, mit der Restriktionsendonuclease HindIII. Um pTHBS3 zu präparieren, wurde das Plasmid pAOT-1 (vgl. Fig. 7) mit StuI geschnitten, mit EcoRI-Linkern ligiert und anschließend mit PstI verdaut. Das EcoRI-PstI-Fragment, das das 3'-AOX1- Fragment enthielt, wurde isoliert. Der Vektor pAOP3, der die 5'-AOX1-Sequenzen enthält, wurde mit EcoRI und SstI geschnitten; das resultierende 5'-AOX1-Fragment wurde in E. coli-S. cerevisiae-Shuttle-Vektor pSEY101 (Douglas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 3983-3987) ligiert, der zuvor mit EcoRI und SstI geschnitten worden war. Das Ergebnis der Ligation dieser pAOP3- und pSEY101-Fragmente war das Plasmid pTAO20. Das Plasmid pTAO20 enthält die URA3- und Ampicillin-Gene zur Selektion in S. cerevisiae bzw. Bakterien, den 2u-Ring zur Replikation in S. cerevisiae und die 5'-AOX1-Sequenzen.
Das Plasmid pTAO20 wurde teilweise mit PstI geschnitten. Der linearisierte Vektor wurde isoliert und mit EcoRI geschnitten. Das größte Fragment (das die Sequenzen des 2u-Rings, das URA3-Gen und das 5'-AOX1- Fragment enthielt) wurde an das 3'-AOX1-Fragment, das aus pAOT-1 erhalten worden war, ligiert, um den Vektor pTHBS1 zu bilden.
Das HBsAg enthaltende EcoRI-Fragment aus pHBS-5 wurde durch Verdau mit EcoRI isoliert und anschließend mit pTHBS1 ligiert, das zuvor mit EcoRI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Bei dem resultierenden Vektor, der als pTHBS2 bezeichnet wurde, ist das HBsAg-Gen zwischen die 3'- und 5'-AOX1-Sequenzen inseriert.
Das Plasmid pYJ30 (erhältlich in E. coli als Wirt als NRRL B-15890) wurde mit EcoRI geschnitten, mit Klenow-Fragment aufgefüllt und anschließend mit PstI geschnitten. Das P. pastoris-HIS4/PARS1 enthaltende Fragment wurde isoliert und mit dem PstI-SstI-Fragment aus dem Vektor pTHBS2 ligiert (der das HBsAg-Gen flankiert von den AOX1-Sequenzen enthält). Diese Ligation ergibt den Vektor pTHBS3.
Das aus pTHBS3 durch Verdau mit HindIII erhaltene 1,4-kbp-Fragment (wobei dieses Fragment das HBsAg-Gen, die AOX1-Terminationssequenz und einen Abschnitt der AOX1-Promotorsequenz enthält) wurde gewonnen und in das 7,7-kbp-Fragment aus pSAOH5 inseriert, das das Pichia-HIS4-Gen, den größten Teil der AOX1-Promotorsequenz und Sequenzen aus pBR322 enthält. Ein rekombinantes 9,1-kbp-Plasmid, pYM39, das die wiederhergestellte AOX1-Promotorsequenz enthält, wurde anschließend isoliert.
Für den zweiten Schritt der Konstruktion wurde das Plasmid pPG3.2 (erhältlich in E. coli als Wirt als NRRL B-15999) mit PvuII verdaut und ein 1,5-kbp-Fragment, das unmittelbar in 3' des AOX1-Gens befindliche Sequenzen enthält, wurde in die einzige NruI-Stelle von pYM39 inseriert. Ein rekombinantes 10,6-kbp-Plasmid, pYMI6, wurde isoliert, wobei dieses Fragment das PvuII-Fragment so orientiert enthielt, daß die zu 3' des AOX1-Gens benachbarten Sequenzen in Richtung auf den HIS4-Gen-Abschnitt des Vektors orientiert waren. Das Plasmid pYMI6 enthielt alle für die Deletion des AOX1-Gens aus einem Pichia-Wirt und für die Expression von HBsAg unter der Kontrolle des AOX1-Promotors erforderlichen Komponenten, aber es enthielt nicht das zurechtgeschnittene HBsAg-Genfragment aus pBSAG5.
Der letzte Schritt der Konstruktion bestand daher in einer Rekombination des gewünschten HBsAg-Gens in einen AOX1-Gen-Deletionsvektor. Dazu wurden pYMI6 und pBSAG5I (ein pBSAG5 entsprechendes Plasmid mit der Ausnahme, daß das Glal-Fragment, das die HBsAg-Expressionskassette enthält, sich in umgekehrter Orientierung befindet) mit den Restriktionsenzymen PstI und SphI verdaut. Das 6,3-kbp-Fragment aus pBSAG5I, das die zurechtgeschnittene HBsAg-Gen-Expressionskassette und das Pichia-HIS4-Gen enthält, wurde in ein 4,6-kbp-Fragment aus pYMI6 inseriert, das die 3'-AOX1 Sequenzen und den größten Teil von pBR322 enthält, wodurch schließlich ein 10,9-kbp-Plasmid, pBSAGI5I, hergestellt wurde. Das Plasmid pBSAGI5I in E. coli als Wirt wurde beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois hinterlegt. Die zugeordnete Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18021.
Zur Transformation des P. pastoris-his4-Mutantenstamms GS115 (NRRL Y-15851) wurde pBSAGI5I zuerst mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut, wobei ein linearer 7,2-kbp-Vektor gebildet wurde, der 0,85 kbp der Sequenz vom 5'-Ende des AOX1-Gens an einem Ende und 1,1 kbp der Sequenz vom 3'-Ende des AOX1-Gens am anderen Ende enthält (Fig. 12). Etwa 2 ug des mit BglII geschnittenen pBSAGI5I wurden in GS115 durch Selektion auf Histidinprototrophie transformiert. Ungefähr 5·10³ His&spplus;-Kolonien resultierten aus der Transformation.
Transformationsereignisse, bei denen pBSAGI5I als lineares Molekül an den chromosomalen Locus von AOX1 inseriert wurde, führten zu einer Deletion des AOX1 Gens. His&spplus;-transformierte Stämme, bei denen die gewünschte lineare Insertion aufgetreten war, wurden daher durch ihre sehr langsame Wachstumsrate auf Methanol identifiziert. (P. pastoris besitzt ein zweites "schwächeres" Alkoholoxidase-Gen, AOX2, das ausreichend Alkoholoxidase für ein Wachstum mit einer langsamen Rate auf Methanol in Stämmen, denen das primäre Alkoholoxidase-Gen fehlt, bildet).
Das Verfahren zur Identifizierung von His&spplus;-Transformanten, die nicht gut auf Methanol wachsen konnten, bestand darin, zuerst die His&spplus;-Zellen zu gewinnen, die in den selektiven Agar eingebettet waren. Der Gewinnungsschritt wurde durch Übertragen des Agars in 50 ml fassende Röhrchen mit 20 ml sterilem Wasser und Pulverisieren des Agars unter Verwendung eines Brinkman-Homogenisators bei niedriger Geschwindigkeit für 30 Sekunden durchgeführt. Agarbruchstücke wurden von den Zellen durch Filtration des Gemisches durch Gaze und Spülen des Agars mit 30 ml sterilem Wasser getrennt. Die Hefezellen wurden dann auf eine optische Dichte von 0,1 bei A&sub6;&sub0;&sub0; verdünnt, 10 Sekunden unter Verwendung eines Branson-Sonofiers in der Einstellung 4 mit Ultraschall behandelt, um die Hefezellklumpen zu zerlegen, und 100fach mit sterilem Wasser verdünnt. Proben von 10 und 100 ul wurden auf Agarplatten mit einem Gehalt an 0,67 % Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (Difco) und 0,1 % Glucose ausgestrichen. Nach 3- tägiger Inkubation bei 30ºC wurden auf den Platten erscheinende Kolonien auf ihre Fähigkeit zum Wachstum auf Methanol untersucht, und zwar durch Replikaplattierung der Kolonien auf eine Reihe von Agarplatten, die einen Gehalt von 0,67 Z Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und die folgenden Kohlenstoffquellen aufwiesen: 1) keine Kohlenstoffquelle; 2) 0,5 % Methanol und 3) 2 % Glucose. Von den Kolonien, die auf 2 % Glucose wuchsen, konnten 32% nicht gut auf Methanol wachsen.
Um zu bestätigen, daß die pBSAGI5I-Sequenzen wie in Fig. 12 gezeigt inseriert wurden, wurde die gesamte DNA aus einem der P. pastoris-Stämme, die einen Defekt bei der Methanolnutzung aufwiesen, extrahiert, mit Restriktionsendonucleasen verdaut und nach der Southern-Blot-Methode mit ³²P-markierten Sonden hybridisiert. In einem Satz von Southern-Blots wurde DNA aus dem AOX1&supmin;-Stamm GS115(pBSAGI5I) und aus dem AOX1&spplus;-Stamm GS115 mit HindIII verdaut und mit markiertem pPG4.0 hybridisiert, wobei dieses Plasmid aus dem AOX1-Gen und Sequenzen aus pBR322 besteht und in E. coli als Wirt vom Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, als NRRL B-15868 erhältlich ist. Ein 2,3-kbp-Fragment, das für AOX1 codiert, wurde in den GS1l5-DNA enthaltenen Bahnen gesehen. In den Gs115(pBSAGI5I)-DNA enthaltenden Bahnen fehlte das 2, 3-kbp-Fragment jedoch, und es traten keine neuen Fragmente auf. Dieses Ergebnis zeigt, daß das AOX1-Gen aus dem GS115(pBSAGI5I)-Stamm deletiert worden war.

Beispiel V

Züchten von Pichia-Hefen, die mit für HBsAg-codierenden Vektoren transformiert sind

1. Züchten von GS115(pBSAG5) in einem Fermenter

Eine 10%-ige Impfkultur wurde über Nacht in Hefestickstoffbasis (YNB) + 2 % Glucose in einem Schüttelkolben bei 30ºC gezüchtet. Die Impfkultur wurde zu einer sterilisierten Mineralsalzlösung (deren pH-Wert auf 4 eingestellt wurde) in einen Fermenter gegeben. Glucose wurde mit einer Verdünnungsrate von 0,05 bis 0,1 pro Stunde zugegeben. Als die Zelldichte einen stationären Zustand erreichte und die Glucosekonzentration im Fermenter Werte von weniger als 100 ppm annahm, wurde die Bildung von HBsAg durch Änderung der Kohlenstoffquelle im Nährmedium in Methanol oder in ein Gemisch aus 50 % Glucose und 50 % Methanol induziert.

2. Züchten von GS115 (pBSAGI5I) (Aox1&supmin;) in einem Fermenter

Eine optimale Expression von löslichem HBsAg (Ausria-Aktivität) (3-4% an löslichem Protein) wurde durch Züchten dieses Aox1&supmin;-Organismus in einer Batch-Kultur auf Glycerin, gefolgt von einem methanolhaltigen Nährmedium, erzielt. Impfkulturen können auf YNB + Glycerin gezüchtet werden. Mineralsalze + Glycerin (1 % und 4 % Glycerin wurden verwendet) und Biotin können im Fermenter autoklaviert werden. Nach Abkühlen sollte der pH- Wert auf einen Wert zwischen 3,5 und 6 eingestellt werden. Spurenelemente (2,5 ml/l) sollten vor dem Animpfen zugegeben werden. Mit 100 % Methanol kann vor oder nach dem Verbrauch des Glycerins begonnen werden. Methanolkonzentrationen von bis zu 2 % stören die HBsAg-Anreicherung nicht, die bis zu 200 Stunden dauern kann. 5% Methanol im Fermenter beenden jedoch die Anreicherung von HBsAg-Teilchen.
Das Züchten zu höheren Zelldichten wurde durch Erhöhung der Nährsalzkonzentrationen erreicht. Erhöhte Zinkkonzentrationen sind besonders wichtig für erhöhte Zelldichten, wenn die Zellen auf Methanol gezüchtet werden. Höhere Konzentrationen an extrahierbarer Ausria-Aktivität konnten erzielt werden, wenn das Wachstum nicht durch Zink begrenzt wurde, aber die Menge an extrahiertem Protein war ebenfalls höher, was zu einer Nettoverringerung der Ausria-Aktivität in %Z löslichem Protein führte.

Schüttelkulturen von GS115(pBSAG5) und GS115(pBSAGI5I)

Eine transformierte Kolonie wurde entnommen und auf einer SD-Platte ausgestrichen. Ein Abstrich der Zellen wurde in 50 ml YNB-Nährlösung (1· YNB, 5 ug/ml Biotin) mit 5 % Glucose in einem 250 ml fassenden Schüttelkolben angezüchtet und bei 30ºC und 250 U/min in einer Schüttelmaschine über Nacht geschüttelt. Am Morgen betrug der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert 2-3. 100 OD&sub6;&sub0;&sub0;- Einheiten an Zellen (ungefähr 10&sup9; Zellen) wurden aus dem Schüttelkolben entnommen und in einer IEC-Zentrifuge 7 Minuten bei 2000 Xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 500 ml YNB-Nährlösung mit 2 % Glycerin in einem 2 Liter fassenden Schüttelkolben resuspendiert (OD&sub6;&sub0;&sub0;= 0,2). Die Kultur wurde bei 30ºC und 250 U/min in einer Schüttelmaschine inkubiert, bis der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert 2-3 erreichte. Im Fall des Aox1&supmin;- Wirts wurden 500 OD&sub6;&sub0;&sub0; aus der Kultur entfernt. Die Zellsuspension wurde in einer IEC-Zentrifuge 7 Minuten bei 2000 Xg zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 500 ml YNB-Nährlösung mit 0,5 % Methanol resuspendiert (1,0 OD&sub6;&sub0;&sub0;). Im Fall des Aox1&spplus;-Wirts wurden 170 OD&sub6;&sub0;&sub0; an Zellen aus der Kultur entnommen, unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und in 500 ml YNB-Nährlösung mit 0,5 % Methanol resuspendiert (0,3 OD&sub6;&sub0;&sub0;). Beide Kulturen wurden in 2 Liter-fassenden Schüttelkolben bei 30ºC und 250 U/min geschüttelt. Wenn ein OD&sub6;&sub0;&sub0;≥2 erreicht wurde, wurden die Kulturen 2- fach mit dem gleichen Nährmedium verdünnt. Proben mit 100 OD&sub6;&sub0;&sub0; wurden periodisch entnommen und 7 Minuten bei 2000 Xg zentrifugiert. Die resultierenden Zellpellets wurden 1 bis 2 Wochen gefroren bei -70ºC aufbewahrt.

Beispiel VI

HBsAg-Assay: Teilchen mit 22 nm und HBsAg-Monomer

1. Präparation von Extrakten und Proteinbestimmung

Alle folgenden Operationen wurden bei 0 bis 4ºC durchgeführt. Die gefrorenen Zellpellets wurden aufgetaut und anschließend 2-fach mit 2 ml eiskaltem Lösungspuffer gewaschen. Die Zellen (100 OD&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten) wurden in Einmalteströhrchen aus Glas (13·100 mm) überführt. 0,35 ml des Lösungspuffers und 0,5 g mit Säure gewaschenen Glaskügelchen (Durchmesser 0,45 mm) wurden zum Zellpellet gegeben. Diese Suspension wurde mit einem Vortex-Mischer bei maximaler Einstellung viermal jeweils 1 Minute geschüttelt und zwischen diesen Schüttelvorgängen jeweils 1 Minute auf Eis gehalten. Die gesamte Zellaufschlämmung wurde entfernt, und die Glaskügelchen wurden mit 0,35 ml Lösungspuffer gewaschen. Der Waschpuffer wurde mit der Zellaufschlämmung vereinigt und in Eppendorf-Röhrchen überführt. Der Extrakt wurde in einer Eppendorf-Zentrifuge 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand (lösliche Fraktion; 0,7 ml) wurde vom Pellet entfernt. Um das HBsAg-Protein aus dem Pellet zu extrahieren, wurden 0,7 ml 2· konzentrierter SDS-Lösungspuffer zu dem Pellet gegeben, und das Gemisch wurde mit einem Mischer gerührt und 15 Minuten gekocht. Das Gemisch wurde 15 Minuten zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand (unlösliche Fraktion) von den Zellbruchstücken entfernt. Proben der löslichen und der unlöslichen Fraktionen wurden auf ihren Proteingehalt mit Hilfe der TCA- Fällung und der Lowry-Methode untersucht. BSA diente als Standard für die Proteinkonzentration. Sowohl die unlöslichen als auch die löslichen Fraktionen wiesen normalerweise Proteinkonzentrationen im Bereich von 3-15 mg/ml auf.

2. Alternatives Verfahren zur Präparation von Extrakten

Dieses Protokoll beschreibt die Bedingungen für die Extraktion des monomeren heterologen Proteins HBsAg oder des Proteinkomplexes (Teilchen mit 22 nm) aus Kulturen von Pichia pastoris, die mit Vektoren transformiert sind, die Sequenzen enthalten, die für das HBsAg-Protein codieren.
Kulturen von P. pastoris wurden bis zu einer Zelldichte von 10-100 OD&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten pro ml gezüchtet. Eine Probe von 100 OD&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurde in ein Kulturröhrchen aus Borsilicat (13·100 mm) überführt und zweimal mit 20 Volumenteilen Lösungspuffer gewaschen.
Die Zellen wurden pelletisiert. Anschließend wurden 0,5 g mit Säure gewaschener Glaskügelchen (0,5 mm), gefolgt von 0,35 ml Lösungspuffer, zu den pelletierten Zellen (klinische IEC-Zentrifuge) gegeben. Der Lösungspuffer enthielt entweder 0,5 in NaCl und 0,1 % Triton X-100 (Gew./Vol.) als Kontrolle oder eine Konzentration von 3 m an Kaliumiodid oder Kaliumthiocyanat in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 % Triton X-100. Alle Lösungen wurden bei einem pH-Wert von 7,5 mit 10 millimolar Natriumphosphat gepuffert. Das Gemisch wurde für 4 l-minütige Intervalle bei maximaler Geschwindigkeit mit einem Rührer gerührt. Zwischen den Intervallen wurde das Gemisch auf Eis für nicht weniger als 1 Minute gekühlt. Nachdem die Lyse vollständig war, wurde die Lösung der gebrochenen Zellen entfernt, die Glaskügelchen wurden mit 0,35 ml Lösungspuffer gewaschen, und die beiden Lösungen wurden vereinigt und einer Zentrifugation für 15 Minuten bei 13 000 xg unterworfen. Die Überstände wurden entfernt und auf immunoreaktive HBsAg-Teilchen (Ausria-Assay) und das gesamte mit Trichloressigsäure gefällte Protein (Lowry) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I als Bereich von 5 Versuchen angegeben. Tabelle I Bedingungen der Lyse Salz A HBsAg, Teilchen B gesamtes Protein C NaCl Triton KI KSCN
Während unter keiner der Bedingungen, bei denen Kaliumiodid oder Kaliumthiocyanat vorliegen, höhere Werte für die HBsAg-Teilchen erhalten werden, als unter Bedingungen, bei denen Natriumchlorid vorliegt (Spalte A), ist es klar, daß Kaliumiodid oder Kaliumthiocyanat die Freisetzung von gesamtem Protein (Spalte B) inhibieren, wobei die spezifische Aktivität des Teilchens auf den 2- bis 5-fachen Wert erhöht wird (Spalte C).

3. Assay auf Teilchen mit 22 nm (Ausria® II-Kit)

Die lösliche Fraktion wurde mit Ausria-Verdünnungspuffer 1000- bis 10 000-fach verdünnt, und Proben zwischen 25 und 100 ul wurden wie folgt untersucht:

Erste Inkubation

1. Um eine Eichkurve aufzustellen, wurde eine Verdünnungsreihe mit einem Gehalt an 0,1 ng bis zu 4 ng als Kontrolle in einem Gesamtvolumen von jeweils 200 ul auf den Boden einzelner Vertiefungen einer Reaktionsplatte pipettiert (zusammen mit 4 negativen Kontrollen).
Für die zu analysierenden Proben wurden jeweils 200 ul jeder verdünnten löslichen Fraktion auf den Boden getrennter Vertiefungen der Reaktionsplatte pipettiert.
2. Ein Kügelchen wurde sorgfältig in die einzelnen, eine Probefraktion oder Kontrolle enthaltende Vertiefung gegeben. Alternativ dazu können die Vertiefungen auch vor der Zugabe der Kontrollen oder Proben verteilt werden.
3. Eine dichte Abdeckung wurde auf die Reaktionsplatte aufgebracht, gegen die dann leicht geklopft wurde, um die Kügelchen abzudecken und zurückgehaltene Luftblasen zu entfernen.
4. Das Reaktionsgemisch wurde dann 2 Stunden bei 45ºC inkubiert.
5. Die dichte Abdeckung wurde entfernt und verworfen. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt, und die einzelnen Kügelchen wurden zweimal mit 4 bis 6 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen.

Zweite Inkubation

6. 200 ul ¹²&sup5;I-Anti-HBs wurden in die einzelnen, ein Kügelchen enthaltenden Vertiefungen pipettiert.
7. Eine neue dichte Abdeckung wurde aufgebracht, und es wurde leicht gegen die Reaktionsplatte geklopft, um die Kügelchen abzudecken und zurückgehaltene Luftblasen zu entfernen.
8. Die Reaktionsplatte wurde 1 Stunde bei 45ºC inkubiert.
9. Die dichte Abdeckung wurde entfernt und verworfen. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt und die einzelnen Kügelchen wurden 4 mal wie in Stufe 5 gewaschen.
10. Die Ränder wurden dann unmittelbar auf geeignet identifizierte Zählrohre übertragen.

Ablesung des Gamma-Scintillationszählers:

11. Die Zählrate wurde für 1 Minute bestimmt.
12. Die Proben wurden innerhalb von 24 Stunden nach dem endgültigen Waschen gezählt.
Die Konzentrationen der Teilchen mit 22 nm wurden unter Verwendung der vorstehend in Stufe 1 aufgestellten Eichkurve berechnet.

4. Monomer-Assay (Western-Assay)

Das 25 ug Protein (lösliche oder unlösliche Fraktion) entsprechende Volumen, normalerweise 2-5 ul, wurde mit H&sub2;O auf 10 ul aufgefüllt. Dazu wurden 10 ul einer 2· konzentrierten Pufferlösung für die SDS-Gel-Beladung (100 millimolar DTT in 1· Puffer) gegeben und die Probe wurde dann 15 Minuten gekocht. Die gekochten Proben wurden auf ein 12 % SDS- Acrylamid-Gel gegeben (Laemmli). Nach der Gelelektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulosepapier übertragen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354). HBsAg wurde mit HBsAg-Antiseren (gegen HBsAg aus dem Plasma) und ¹²&sup5;I-markiertem Protein A nachgewiesen. Das Nitrocellulosepapier wurde einem Kodak-XAR-5-Film über Nacht bei -70ºC exponiert. Eine quantitative Bestimmung des Monomeren wurde durch Zählen der radioaktiven Banden des Nitrocellulosepapiers in einem Gamma-Zähler durchgeführt. Von S. cerevisiae gebildetes rekombinantes HBsAg (100-500 ng/Bahn) wurde als Standard verwendet.

Beispiel VII

Expression von HBsAg in Pichia pastoris

Die Herstellung von HBsAg in mehreren transformierten P. pastoris- Stämmen wurde nach dem in Beispiel VI angegebenen Assay-Protokoll bestimmt, und zwar unter Verwendung des im ersten Teil von Beispiel VI beschriebenen Lösungs-Protokolls. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II transformierter Stamm Phänotyp AoXl&supmin; His&spplus; Aoxl&spplus; Zustand des Vektors integriert autonom HBsAg-Konzentrationa (Schüttelkultur) Zellen/l Monomer Teilchen ZBsAg-Konzentrationa (Fermenter) Zellen Monomer Teilchen
a Protein-Assay; gemessen nach der Bradford-Methode
b HBsAg pro 1 Kulturmedium; OD&sub6;&sub0;&sub0;=5·10&sup7; Zellen/ml = 0,14 mg Trockenmasse/ml = 0,06 mg Protein/ml
Die vorstehend angeführten Ergebnisse zeigen, daß hohe Konzentrationen an HBsAg in Pichia pastoris hergestellt werden können, und zwar unter Kontrolle der regulatorischen Region des primären Alkoholoxidase- Gens (AOX1) aus Pichia pastoris.
Die Beispiele sind lediglich vorgelegt worden, um die Ausführung der Erfindung zu verdeutlichen, und sie sollten in keiner Weise als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung oder der beigefügten Ansprüche verstanden werden. Vernünftige Variationen und Modifikationen, die nicht vom Wesen und Geist der Erfindung abweichen, gehören zum Umfang des angestrebten Patentschutzes.

Claims

1. Ein DNA-Fragment, umfassend:

(a) eine ungefähr 2,9 kbp lange, aus dem Dihydroxyacetonsynthase (DAS)-Gen von Pichia abgeleitete regulatorische Region oder eine ungefähr 2,0 kbp lange, aus dem primären Alkoholoxidase-Gen (AOX1) von Pichia abgeleitete regulatorische Region oder eine ungefähr 3 kbp lange, aus dem p40-Gen von Pichia abgeleitete regulatorische Region, die fähig ist, die Transkription von Messenger-RNA zu kontrollieren, wenn sie am 5'-Ende der für ein Polypeptid codierenden Region angeordnet ist, wobei die regulatorische Region auf mindestens eine der folgenden Bedingungen anspricht:

(i) die Gegenwart von Methanol im Kulturmedium, mit dem ein das DNA- Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt steht,

(ii) die Gegenwart einer nicht katabolisch reprimierenden Kohlenstoffquelle außer Methanol im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt steht, und

(iii) ein Mangel an Kohlenstoffquellen im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt steht, nachdem der Wirtsorganismus auf einer katabolisch reprimierenden Kohlenstoff- und Energiequelle gewachsen ist; und

(b) eine für ein Polypeptid codierende Region, wobei die codierende Region für Hepatitis B-Oberflächen-Antigen codiert.

2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Region für primäre Alkoholoxidase (AOX1) von Pichia durch die in Fig. 2 der Zeichnungen gezeigte Restriktionskarte identifiziert ist.

3. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Region für DAS aus Pichia durch die in Fig. 1 der Zeichnungen gezeigte Restriktionskarte identifiziert ist.

4. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Region für p40 aus Pichia durch die in Fig. 3 der Zeichnungen gezeigte Restriktionskarte identifiziert ist.

5. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Region für AOX1 oder p40 oder DAS aus Pichia pastoris abgeleitet ist.

6. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1-5, ferner umfassend eine 3'-Sequenz von DNA in downstream-Richtung von der für das Polypeptid codierenden Region, wobei die 3'-Sequenz von DNA zur Kontrolle der Polyadenylierung und Termination der Transkription von Messenger-RNA, für die die für das Polypeptid codierende Region codiert, fähig ist.

7. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment ferner eine oder mehrere zusätzliche DNA Sequenzen umfaßt, die aus

bakterieller Plasmid-DNA,

Bakteriophagen- DNA,

Hefeplasmid-DNA und

chromosomaler Hefe-DNA abgeleitet sind.

8. DNA-Fragment nach Anspruch 7, wobei die chromosomale Hefe-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markergen umfaßt.

9. DNA-Fragment nach Anspruch 1, ferner umfassend nacheinander angeordnete DNA, die

ein erstes inserierbares DNA-Fragment,

ein selektierbares Markergen und

ein zweites inserierbares DNA-Fragment umfaßt,

wobei das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment jeweils eine Länge von mindestens 200 Nucleotiden aufweisen und wobei sie Nucleotidsequenzen besitzen, die homolog zu Abschnitten der genomischen DNA von Spezies der Gattung Pichia sind, wobei das DNA-Fragment und das Markergen zwischen dem 3'-Ende des ersten inserierbaren DNA-Fragments und dem 5'- Ende des zweiten inserierbaren DNA-Fragments angeordnet sind und wobei das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment so zueinander angeordnet sind, wie sie im Genom von Pichia angeordnet sind.

10. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Polypeptid codierende Region im wesentlichen aus dem ungefähr 700 Basenpaare langen EcoRI-StuI-Fragment besteht, das nachstehend gezeigt ist:

11. Plasmid, umfassend:

das DNA-Fragment nach Anspruch 1,

bakterielle Plasmid-DNA,

ein selektierbares Hefe-Markergen und

eine autonom replizierende Hefe-Sequenz.

12. Plasmid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid ausgewählt ist aus

pBSAG5 (NRRL B-18028),

pBSAG5I, wie in Fig. 11 gezeigt, und

pBSAGI5I (NRRL B-18021), wie in Fig. 11 gezeigt, wobei C in Fig. 11

der Restriktionsstelle ClaI entspricht und wobei pBSAG5 und pBSAG5I sich in der Orientierung des ClaI-Fragments unterscheiden.

13. Eine im wesentlichen reine Kultur eines Stammes der Gattung Pichia, transformiert mit einem Plasmid, ausgewählt aus pBSAG5 (NRRL B- 18028), pBSAG5I und pBSAGI5I (NRRL B-18021), wie sie in Anspruch 12 definiert sind.

14. Im wesentlichen reine Kultur nach Anspruch 13, wobei der Stamm zur Gattung Pichia pastoris gehört.

15. Eine im wesentlichen reine Kultur eines Stammes der Gattung Pichia, transformiert mit einem Expressionsvektor, der das DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt.

16. Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis B-Oberflächen-Antigens, gekennzeichnet durch Züchten eines Pichia-Stamms, der mit einem Plasmid nach Anspruch 11 transformiert worden ist, in einem Nährmedium, das mindestens eine Kohlenstoff- und Energiequelle, ausgewählt aus Methanol und katabolisch nicht reprimierenden Kohlenstoffquellen, umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem transformierten Pichia-Stamm, der zum Wachstum auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle fähig ist, um Pichia pastoris GS115 handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Pichia-Stamm, der zum Wachstum auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle fähig ist, um Pichia pastoris GS190 handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem transformierten Pichia-Stamm um Pichia pastoris PPF1 handelt.

20. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch

(a) Züchten eines Hefestamms, der mit dem Plasmid nach Anspruch 11 transformiert wurde, in einem Nährmedium, das mindestens eine katabolisch reprimierende Kohlenstoff- und Energiequelle umfaßt, und

(b) Unterwerfen des Produkts aus Stufe (a) unter Bedingungen eines Mangels an Kohlenstoffquellen.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, ferner umfassend das Isolieren und Reinigen des Hepatitis B-Oberflächen-Antigens.

22. Ein Plasmid, geeignet für die Konstruktion von Expressionsvektoren für die Herstellung heterologer Proteine unter der Kontrolle der regulatorischen Region von primärer Alkoholoxidase (AOX1) aus Pichia, erhältlich aus dem Klon pPG4.0 (NRRL B-15868) von der 5'-EcoRI-Restriktionsstelle bis zur 3'-SalI-Restriktionsstelle, wobei das Ausgangsplasmid pPG2.5, das die regulatorische Region enthält, gemäß den Angaben in Beispiel II behandelt wird, um das in Fig. 4 dargestellte Plasmid pAOP2 zu erhalten.