FI95929B - Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa - Google Patents

Description

95929

Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa

Keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöön hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin tuottamiseksi hiivassa. Keksinnön eräs piirre kohdistuu hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin tuottamiseen hiivassa. Keksinnön toinen piirre kohdistuu uusiin DNA-muodosteisiin, joihin hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni on koodautunut. Edelleen, keksinnön eräs muu piirre kohdistuu uusiin organismeihin, jotka on transformoitu edellä kuvatuilla DNA-muodosteilla.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan kehityttyä viime vuosina erittäin monien hyödyllisten polypeptidien hallittu tuotanto mikro-organismeissa on tullut mahdolliseksi. Mikro-organismeilla on jo saatu tuotetuksi monia eukarioottisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyyttien interferonei-ta, ihmisen insuliinia sekä ihmisen proinsuliinia. On odotettavaa, että tulevaisuudessa, jo käytettävissä olevia tekniikoita jatkuvasti soveltamalla, myös monia muita käyttökelpoisia poly-peptidituotteita on mahdollista tuottaa mikro-organismien avulla. Eräs tällainen hyödyllinen polypeptidituote on hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni.

, Hepatitis B-virus (seerumin hepatitis) siirtyy ihmisen keskuudes sa yksilöstä toiseen ja aiheuttaa kroonisesti heikentäviä infektioita, jotka saattavat johtaa vähitellen maksan vakavaan vaurioitumiseen, primääriin karsinoomaan ja lopulta kuolemaan. Useimmissa tapauksissa täydellinen paraneminen hepatitis B-viruksen aiheuttamasta infektiosta on odotettavaa. Kuitenkin ; suuret väestöryhmät, erityisesti useissa Afrikan ja Aasian maissa, ovat tämän viruksen kroonisia kantajia, jolloin vaarana on taudin mahdollinen leviäminen yleiseksi epidemiaksi.

Hepatitis B-viruksen tehokas ennaltaehkäisy toteutetaan antamalla hepatitis B-viruksesta saatua rokotetta, joka on tavalli- ... sesti hepatitis B-viruksen erittäin tarkoin puhdistettua pinnan

____ ... I

95929 2 antigeeniä. Tällainen hepatitis B-viruksesta saatu rokote estää tehokkaasti viruksen aiheuttamat infektiot. Erityisen suuressa vaarassa ovat ihmiset, jotka tarvitsevat verensiirtoja tai dialyysikäsittelyä, tällaisten henkilöiden parissa työskentelevä hoitohenkilökunta, ja muut vastaavat. Lisäksi tällainen rokote estää myös tehokkaasti uusien viruskantajien ilmaantumisen, joten hepatitis B-viruksen täydellinen eliminoiminen maailmasta saattaa olla mahdollista.

Hepatitis B-virus ei kykene siirtymään soluviljelmien soluihin, mistä syystä sitä voidaan eristää ainoastaan viruksella infektoituneista ihmisistä tai korkeammista kädellisistä eläimistä. Näin ollen, toistaiseksi käytettävissä ei ole ollut keinoja hepatitis B-viruksen sellaisten määrien saamiseksi ja ylläpitämiseksi, jotka määrät riittäisivät hepatitis B-virusta vastaan immunoivan antigeenin tuottamiseen.

Hepatitis B-viruksesta saatu rokote valmistetaan tavallisesti eristämällä ja puhdistamalla hepatitis B pinta-antigeenia hepatitis B-virusta kantavien yksilöiden veriplasmasta. Tällainen puhdistaminen on kuitenkin toteutettava erittäin tehokkaasti, sillä toivotun antigeenin pitoisuus puhdistettavassa plasmassa on erittäin alhainen. Tästä syystä toivottavan, hepatitis B-viruksesta saatavan rokotteen teollinen valmistaminen on ollut toistaiseksi erittäin vaikeata.

Näin ollen oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin valmistamiseksi siten, että saannot ovat suuria.

Keksinnön toisena tavoitteena on uusien DNA-rakenteiden valmistaminen, jotka DNA-rakenteet kykenevät ilmentämään hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä suurina määrinä.

Keksinnön nämä ja muut tavoitteet ovat ilmeisiä seuraavan kuvauksen ja patenttivaatimusten perusteella.

95929 3

Oheisen keksinnön puitteissa todettiin, että hepatitis B-viruk-sen pinnan antigeeniä voidaan tuottaa suurina saantoina viljelemällä hiivasoluja, joiden transformointiin käytetyt DNA-muo-dosteet käsittävät hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä koo-daavat ketjut sellaisten säätelevien alueiden säätelyn alaisuudessa, jotka säätelevät alueet reagoivat metanoliin, hiilen lähteisiin, jotka eivät aiheuta kataboliittista tukahtumista, sekä hiilen lähteen ehtymiseen.

Piirustuksissa kuva 1 esittää Pichia-hiivan dihydroksiasetonisyntetaasin geeniin (DAS) liittyvän säätelevän alueen restriktiokarttaa.

Kuva 2 esittää Pichia-hiivan primääriin alkoholioksidaasin geeniin (A0X1) liittyvän säätelevän alueen restriktiokarttaa.

Kuva 3 esittää Pichia-hiivan p40-geeniin liittyvän säätelevän alueen restriktiokarttaa.

Kuva 4 esittää plasmidin pA0P2 restriktiokarttaa.

Kuva 5 esittää plasmidien pBSAG5 ja pBSAG5I muodostamiseen käytettyä menetelmää.

Kuva 6 esittää plasmidin pHBS-5 restriktiokarttaa.

Kuva 7 esittää plasmidin pAOT-1 restriktiokarttaa.

Kuva 8 esittää plasmidin pYJ33 restriktiokarttaa.

Kuva 9 esittää plasmidin pYM39 muodostamista plasmideista PSAOH5 ja pTHBS3.

Kuva 10 esittää plasmidin pYMI6 muodostamista plasmideista pYM39 ja pPG3.2.

Kuva 11 esittää plasmidin pBSAGl5I muodostamista plasmideista pYMI6 ja pBSAG5I.

Kuva 12 esittää plasmidista pBSAGI5I saadun osan istuttamista primääriin alkoholioksidaasin (A0X1) geenikohtaan Pichia-hiivan kromosomissa.

Kuva 13 esittää plasmidin pTHBS3 muodostamiseen käytettyä . menetelmää.

- 95929 4

Tarvittavista restriktioentsyymeistä käytetään kuvissa seuraa-via lyhenteitä:

Lyhenne Restriktioentsyymi

As AsuII

B BamHI

B2 Bglll

Bc Bell C Clal H2 Hindi H3 Hindlll K Kpnll

Nd^ Ndel

Nr NruI

Ps PstI

Ρν^^ PvuI

Pv2 PvuII

R^ EcoRI

R5 EcoRV

S Sali

Sp Sphl

Ss SstI

St Stul

Xb Xbal

Xh XhoI

• ·

Liitteenä olevissa kuvissa DNA-kappaleiden manipulointiin käytetyt restriktiokohdat, jotka tuhoutuvat ligaatiossa, merkitään esittämällä tuhoutuneen kohdan lyhenne suluissa.

Keksinnössä saadaan aikaan säätelevän alueen ja polypeptidiä koo-| daavan alueen käsittävä uusi DNA-kappale, jossa polypeptidiä koo- daavaan alueeseen on koodautunut hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni tai sen osia, ja jossa säätelevä alue kykenee säätämään lähetti-RNA:n kopioitumista polypeptidiä koodaavan geenin 5'-päähän sijoitettuna. Säätelevästä alueesta, hepatitis B-viruksen pinnan antigeeniä (HBsAg) koodaavasta geenistä sekä kopioitumisen päättävästä kappaleesta muodostuvaa yhdis- 5 95929 telmsä nimitetään tämän jälkeen ilmentämiskasetiksi tai ilmen-tämisyksiköksi. Oheisen keksinnön toteuttamiseen käytetty säätelevä alue reagoi vähintään yhdelle seuraavista olosuhteista: - viljelyalustassa, jonka kanssa ilmentämiskasetin sisältävä isäntäorganismi on kosketuksissa, läsnäolevalle metanolille; - viljelyalustassa, jonka kanssa ilmentämiskasetin sisältävä isäntäorganismi on kosketuksissa, läsnäolevalle hiilen lähteelle, joka ei aiheuta kataboliittista tukahduttamista, ja joka on muu kuin metanoli; ja - hiilen lähteen ehtymiselle siinä viljelyalustassa, jonka kanssa ilmentämiskasetin sisältävä isäntäorganismi on kosketuksissa, sen jälkeen, kun isäntäorganismia on ensin kasvatettu kataboliittisen tukahtumisen aiheuttavaa hiilen ja energian lähdettä käyttäen.

Edelleen, keksinnössä saadaan aikaan uudet lineaariset ja rengasmaiset plasmidit, jotka sisältävät edellä kuvatut ilmentämis-kasetit.

Tämän lisäksi keksinnössä saadaan aikaan edellä kuvatuilla lineaarisilla tai rengasmaisilla plasmideilla transformoitujen hii-vakantojen olennaisesti puhtaat viljelmät.

Keksinnön eräässä suoritusmuodossa kuvataan menetelmä hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää edellä kuvatuilla plasmideilla transformoidun hiiva-kannan viljelemisen sellaisissa olosuhteissa, joissa toivotun proteiinituotteen ilmentyminen on mahdollista.

•

Keksinnön toteuttamiseen käytettyjen säätelevien alueiden tunnusomaisena piirteenä on niiden kyky reagoida kasvatusalustaan, joka sisältää: (1) metanolia (2) hiilen lähteitä, jotka eivät aiheuta kataboliittista tukah- • tumista, kuten esimerkiksi glyserolia, galaktoosia, asetaattia ja muita vastaavia, . 95929 6 (3) kataboliittiseen tukahtumiseen johtavia hiilen lähteitä, kuten esimerkiksi glukoosia, etanolia, fruktoosia ja muita vastaavia, joita seuraa hiilen lähteen ehtyminen.

Esimerkkejä edellä mainitut kriteerit tyydyttävistä säätelevistä alueista esitetään kuvien 1, 2 ja 3 restriktiokartoissa. Kuvassa 1 nähtävä säätelevä alue on saatu Pichia pastoris-hiivan di-hydroksiasetonisyntetaasin (DAS) geenistä. Kuvassa 2 nähtävä säätelevä alue on saatu Pichia pastoris-hiivan primääristä alko-holioksidaasin (AOXl) geenistä (Pichia-hiivassa on kaksi alkoho-lioksidaasin geeniä, joista ohessa käytetään lyhenteitä AOXl ja AOX2). Kuvassa 3 nähtävä säätelevä alue on saatu Pichia pastoris,hiivan p40-geenistä. Alan asiantuntijoille on selvää, että muita sääteleviä alueita, joilla on edellä kuvatut ominaisuudet, voidaan eristää metylotroofisistä hiivoista, kuten Pichia pastoris-hiivasta. Oheinen keksintö kattaa myös nämä muut säätelevät alueet, joiden säätelevät ominaisuudet ovat samankaltaisia kuin edellä kuvattujen säätelevien alueiden ominaisuudet .

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin (HBsAg) geeni on eristetty jo aikaisemmin (Valenzuela et ai. (1979) Nature 280, 815), ja se voidaan saada sopivilla restriktioentsyymeillä käsittelemällä monista erilaisista vektoreista, kuten pHBS-5 (katso kuva 6, sekä Valenzuela et ai. (1982), Nature 298, 347), pHBV-T-1A (Genentech, EPÄ 73,657), pHBS-56 (ATCC-talletusnumero 40,047; katso EPÄ 120,551) jne.

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin geeni muokattiin käsittelemällä eksonukleaasilla Bal31 virusperäisten koodaamattomien ketjujen poistamiseksi hepatitis-geenin 5'-päästä. HBsAg-geenin 3'-päätä muokattiin endonukleaasilla pilkkomalla, ja liittämällä kytkijä, virusperäisten koodaamattomien ketjujen poistamiseksi hepatitis-geenin 3'-päästä. Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin geeniä muokattiin edelleen sopivien restriktio-kohtien sijoittamiseksi siihen tämän DNA-kappaleen manipulointia . varten. Tuloksena oleva DNA-kappale on EcoRI-StuI-istute, « ja sen nukleotidiketju on seuraava:

II

7 95929

5'-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC

TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT

CCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT

CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA

ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC . CAACCTCCTG

TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG

CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA

TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC

CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG

GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT

CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG

AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC

GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT

GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG

GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG

TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT

TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC. TCTGGGTATA

CATTTAAGGC CT-31

Keksinnön mukaiset, säätelevästä alueesta ja rakenteellisesta geenistä muodostetut muodosteet voidaan viedä organismeihin monistamista, lisääntymistä ja ilmentämistä varten monella eri tavalla. Autonomisesta replikaatioketjusta (ARS) muodostuva elementti on käyttökelpoinen hiivassa tapahtuvaa autonomista replikaatiota varten. Esimerkkeinä mainittakoon Pichia pastoris-hiivasta saatu PARSI ja PARS2 (katso US-patenttihakemus SN 666 577). Mikäli sen sijaan isäntään yhtenäistyvä transformaatio on toivottavaa, niin tällöin ei käytetä ARS-element-tiä. Edullinen menetelmä yhtenäistävän transformaation toteut-: tamiseksi kuvataan US-patenttihahakemuksessa 791 013 ja tässä menetelmässä käytetään kohtaohjautuvaa yhtenäistyvää vektoria, joka käsittää ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen, valikoitavan merkitsimen geenin sekä toisen istutettavan DNA-kappaleen.

* · 95929 ____ 1 8

Sekä ensimmäisen että toisen istutettavan DNA-kappaleen pituus on vähintään 200 nukleotidiä, ja niiden nukleotidiketjut ja Pichia-suvun lajien genomisen DNA:n osat ovat keskenään homologisia. Yhtenäistyvän vektorin eri komponentit sijaitsevat peräkkäin ja ne muodostavat lineaarisen DNA-kappäleen siten, että ilmentämiskasetti ja valikoitavan merkitsimen geeni sijoittuvat ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen 3'-pään ja toisen istutettavan DNA-kappaleen 5'-pään väliin. Ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat suuntautuneet toisiinsa nähden peräkkäin järjestäytyneessä lineaarisessa kappaleessa niin kuin ne ovat suuntautuneet Pichia-hiivan genomissa.

Isäntäkannan transformointiin käytettävään DNA:han on sisällytettävä vähintään yksi valikoitavan merkitsimen geeni. Tämä helpottaa transformoivan DNA:n sisältävien organismien valikointia ja eristämistä. Merkitsimen geenillä transformoituun organismiin saadaan aikaan fenotyypin ominaisuus, jota isännällä ei muussa tapauksessa olisi. Tällä tavalla voidaan esimerkiksi palauttaa isännän kyky tuottaa spesifistä aminohappoa, mikäli transformoitumattomassa isäntäkannassa tämän spesifisen aminohapon biosynteesireitti on puutteellinen.

Alan asiantuntijalle on selvää, että keksinnön toteuttamiseen käytettäviin vektoreihin voidaan myös sisällyttää muita DNA-ketjuja, esimerkiksi bakteereista saatua plasmidi-DNA:ta, bakteriofaagin DNA:ta ja muita vastaavia. Tällaiset ketjut tekevät näiden vektoreiden monistamisen ja ylläpitämisen bakteeri-isännissä mahdolliseksi.

Ilmentäminen transformoidussa isännässä

Edellä kuvattuja keksinnön mukaisia plasmideja voidaan käyttää hiivakannoissa, jotka voidaan transformoida. Keksinnön mukaisten uusien DNA-kappaleiden avulla hiivassa toteutettavaa geeni-ilmentymistä voidaan säädellä saattamalla transformoidut organismit olosuhteisiin, joissa hiilen lähde ehtyy. Hiililähteen ehtyminen sen jälkeen, kun organismia on kasvatettu käyttäen . erilaisia, kataboliittista tukahtumista aiheuttavia ja aiheut tamattomia hiilen lähteitä, indusoi keksinnön mukaisten saatele- 9 - 95929 vien alueiden säätelyn alaisuudessa pidettyjen geeni tuotteiden ilmentymistä. Toinen tapa toivotun geenituotteen ilmentämiseksi transformoidun hiivan sopivassa kannassa on kasvattaa transformoituja hiivoja metanolissa. Edelleen eräs muu tapa toivotun geenituotteen ilmentymisen indusoimiseksi on kasvattaa transformoitua hiivaa alustassa, jonka sisältämät hiilen lähteet eivät aiheuta kataboliittista tukahtumista.

Keksinnön mukaiset säätelevät alueet ovat käyttökelpoisia kaikissa hiivakannoissa toteutettavaa ilmentämistä varten, koska näiden säätelevien alueiden on osoitettu indusoituvan erilaisissa olosuhteissa. Täten hiivat, jotka kykenevät kasvamaan metanolissa tai hiilen lähteissä, jotka eivät aiheuta kataboliittista tukahtumista, voidaan saada tuottamaan vieraita, eli heterolo-gisia polypeptidejä suoraan; kun taas hiivat, jotka kykenevät kasvamaan kataboliittista tukahtumista aiheuttavissa hiilen lähteissä, voidaan saada tuottamaan vieraita polypeptidejä kasvattamalla hiivasoluja olosuhteissa, joissa hiilen lähde estyy.

Esimerkkeinä transformoiduista hiivakannoista, joita käytetään mielellään keksinnön mukaisessa menetelmässä, mainittakoon seu-raavien sukujen edustajat:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Schizosaccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis,

Pichia, ja Kluyveromyces.

Menetelmässä käytetään mielellään näiden sukujen hiivoja, koska niiden käsittely on turvallista, ja koska niiden kasvuolosuhteet ja muut vastaavat tiedot on selvitetty ja tunnetut alan asiantuntijalle.

- 95929 10

Keksinnön mukaisen menetelmän eri suoritusmuodoissa erityisen mielellään käytettyjä hiivakantoja ovat ne, jotka kykenevät kasvamaan käyttäen metanolia hiilen ja energian lähteenään. Esimerkkeinä hiivoista, joiden tiedetään voivan kasvaa metanolissa, mainittakoon seuraavien sukujen edustajat:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis, ja Pichia.

Koska keksinnön mukaiset säätelevät alueet saadaan myös indusoitumaan kasvattamalla organismia hiilen lähteissä, jotka eivät aiheuta kataboliittista tukahtumista, sekä olosuhteissa, joissa hiilen lähde ehtyy, niin keksinnön toteuttamiseen voidaan myös käyttää hiivakantoja, jotka kykenevät kasvamaan tällaisissa, muuta kuin metanolia olevissa substraateissa, kuten: glukoosi, asetaatti, glyseroli, etanoli, laktoosi, galaktoosi, fruktoosi, sakkaroosi, ja muissa vastaavissa substraateissa tai seoksissa, jotka • sisältävät kahta tai useampaa tällaista substraattia. Geeni- tuote saadaan ilmentymään keksinnön mukaisten säätelevien alueiden säätelyn alaisuudessa kasvattamalla isäntäorganismia sopivassa hiilen lähteessä, joka ei aiheuta kataboliittista tukahtumista, ja joka on muuta kuin metanolia, kuten glyserolissa tai galaktoosissa, tai kasvattamalla isäntäorganismia sopi-. vassa, kataboliittisen tukahtumisen aiheuttavassa hiilen li n - 95929 lähteessä, kuten esimerkiksi etanolissa, glukoosissa ja fruktoosissa, minkä jälkeen isäntäorganismia kasvatetaan edelleen olosuhteissa, joissa hiilen lähde ehtyy.

Erityisen edullinen isäntänä toimiva hiivakanta on mutantti Pichia pastoris GS115, jonka mutantin kyky tuottaa histidiiniä on puutteellinen. GS115-mutantin genotyypiksi esitetään his4, koska sen histidiinireitti on puutteellinen histidinoli-dehydrogenaasia koodaavaan geeniin vaikuttaen. GS115 on saatu Pichia pastoris-kannasta NRRL Y-11430, ja se on talletettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois,talletus-numerolla NRRL Y-15851. Tämä erityinen isäntä on käyttökelpoinen, koska se on auksotroofinen mutantti, jonka histidiinireitti on puutteellinen. Tämän isännän transformointi vektorilla, joka sisältää muiden DNA-ketjujen lisäksi HIS4-geenin toimintaa koodaavat ketjut, mahdollistaa transformoitujen isäntien helpon valikoinnin.

Toinen, oheisen keksinnön toteuttamiseen mielellään käytetty hiivakanta on mutantti Pichia pastoris GS190, jonka mutantin arginiinireitti on puutteellinen ja vaikuttaa argininosukki-naattilyaasia koodaavaan geeniin. GS190 on saatu Pichia pastoris-kannasta NRRL Y-11430, ja se on talletettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL Y-18014.

Edelleen, eräs muu isäntänä edullinen hiivakanta on kaksinkertainen auksotroofinen mutantti PPFl, jossa mutantissa sekä histidiini- että arginiinireitit ovat puutteelliset. PPFl-mutan-tissa sekä histidiinireitti on puutteellinen, mikä vaikuttaa histidinoli-dehydrogenaasia koodaavaan geeniin, että myöskin arginiinireitti on puutteellinen, vaikuttaen argininosukkinaat-tilyaasia koodaavaan geeniin. PPFl on talletettu kantakokoelmaan Norhern Regional Research Center of the United States . Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL Y-18017.

- '95929 12

Escherichia coli sopii myös keksinnön mukaisten plasmidien isännäksi. Alan asiantuntijalle on selvää, että monet E. coli-kannat ovat sopivia isäntiä. Keksinnön puitteissa käytettiin seuraavia kantoja:

Kannan nimitys Tailetusnumero MC1061 Ei tiedossa LE392 ATCC #33572 MM294 ATCC #33625

Pichia pastoris-hiivan transformointiin käytetyt toimenpiteet Kokeelliset menetelmät Pichia pastoris-hiivan transformoimiseksi on kuvattu aikaisemmin, ja ne esitetään seuraavassa yksityiskohtaisesti (esimerkki I).

Pichia pastoris voidaan transformoida hajottamalla soluseinämät entsymaattisesti, jolloin saadaan sferoplasteja; sferoplastit sekoitetaan sitten transformoivaan DNA:han ja seosta inkuboi-daan kalsiumionien ja polyetyleeniglykolin läsnäollessa, ja regeneroidaan selektiivisellä kasvualustalla, josta puuttuu histidiini. Transformoiva DNA sisältää HIS4-geenin, joka puuttuu isännästä, ja näin ollen ainoastaan transformoituneet solut jäävät eloon käytetyssä kasvatusalustassa.

. Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin eristäminen • J- - . - L — . I J- J - '«- ·> · - Γ - - -r-.-T_._-..

Alan asiantuntija tuntee lukuisia käytössä olevia menetelmiä he-terologisen proteiinin eristämiseksi yhdistämällä saadusta yksisoluisesta isännästä. Keksinnön mukaisesti tuotetun HBsAg-proteiinin talteenottoon voidaan käyttää mitä tahansa alalla tunnettuja tekniikoita solujen hajottamiseksi ja proteiinin väkevöimiseksi ja/tai eristämiseksi hajotetuista soluista.

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenillä suoritetut kokeet Transformoituja soluja kasvatettiin ilmentymistä ajatellen sopivissa olosuhteissa, kuten edellä esitetään. Tämän jälkeen solut rikotaan ja liukoisista sekä liukenemattomista fraktioista analysoitiin HBsAg. Liukoisesta fraktiosta analysoitiin 22 nanometrin suuruisen hiukkasen läsnäolo kaupallisesti saatavalla analyysikitillä "Ausrii^II" (Abbott Laboratories).

Il 95929 13

Sekä liukoisesta että liukenemattomasta fraktiosta määritettiin monomeerin läsnäolo käyttäen Western'in täpliin perustuvia toimenpiteitä, joissa käytetyt antiseerumit olivat muodos- 125 tuneet HBsAg:n monomeerista muotoa ja radioaktiivista I-merkittyä proteiinia A vastaan.

Keksintöä kuvataan tämän jälkeen yksityiskohtaisemmin seuraa-vien esimerkkien avulla.

Esimerkit

Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä, joilla on seuraava merkitys: SDS natriumdodekyylisulfaatti EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo TEMED N,N,N',N'-tetrametyleenidiamiini DTT ditiotreitoli BSA naudan seerumin albumiini

EtBr etidiumbromidi PMSF fenyylimetyylisulfonyylifluoridi

Ci Curie

Zymolyaasi 60 000 saatu yhtiöstä Miles Laboratories

Seuraavissa esimerkeissä käytettyjen puskureiden ja liuosten koostumus on seuraava: 1 M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 millilitrassa vettä; pH asetetaan toivottuun arvoon lisäämällä HCl:n väkevää (35 %) vesi-liuosta; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen pH-arvon lopullista asettamista, liuos laimennetaan lopulliseen tilavuuteen, joka on 1 litra.

TE-puskuri. 1,0 mM EDTA 0,01 M (pH 7,4) Tris- puskurissa.

PBS (fosfaatilla pus- lo mM natriumfosfaattia (pH 7,0); *. kuroitu suolaliuos) 0,15 M NaCl.

• 95929 Γ- 14

SDS-geelin kuormitus- 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8) puskuri 2 % SDS

10 % glyserolia 100 mM ditiotreitolia 0,001 % bromifenolisinistä YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia 2 % dekstroosia SD-alusta 6,75 g hiivan typpialustaa, ilman amino happoja (DIFCO) 2 % dekstroosia 1 litrassa vettä SED 1 M sorbitolia

25 mM EDTA 50 mM DTT

SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 50 ml H20 --pH asetetaan arvoon 5,8 HCl-liuoksella

CaS 1 M sorbitolia 10 mM CaCl 2 --steriloidaan suodattamalla PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykolia 3350 10 mM CaCl2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) --steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitolia 0,3 x YPD-alustaa 10 mM CaCl2

Perussuolaseos (transformoidun Pichia-hiivan kasvattamiseksi fermentorissa) 95929 15

Perussuojat litraa kohden H3P04, 85 % 4,2 ml

CaS04-2H20 0,18 g K-SO, 2,86 o

MgS04-7H20 2,34 g KOH 0,65 g

Pichia-hiivan syöttöalusta (yhdistelmän GSll5/pBSAG5 kasvattamiseksi fermentorissa) g/1 vettä H3P04 (85 %) 3,5 ml

CaS04-2H20 0,15 K2S04 2,38

MgS04-7H20 1,95 KOH 0,65

FeSO .·7H o0 0,065

CuS04*5H20 0,006

ZnS04-7H20 0,020

MnS04-H30 0,003

Biotiini 0,000041

Hiilen lähde 20-100 g

Hivensuolaliuos (yhdistelmän GS115/pBSAGI5I kasvattamiseksi) g/1 vettä

CuSO· ·5H O 0,06 4 2 ' KI 0,08

MnS04-H20 0,3

Na2Mo04-2H20 0,2 H3B03 0,02

ZnS04-7H20 2,0

FeCl3-6H20 4,8 H2S04 3-5 ml/1 (sameuden poistamiseksi) - 95929 16

Ausria-laimennospuskuri 4,3 mM Na^HPO^ 1,5 mM KH2P04 2,7 mM KC1 0,15 M NaCl 1 % naudan seerumin albumiinia 0,02 % natriumatsidia --lopullinen pH 7,4

Liukoiseksi tekevä puskuri 10 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,5) 0,5 M NaCl 0,1 % Triton X-100 2 mM PMSF.

Mikäli toisin ei mainita, edellä esitetyt liuokset ovat käytettyjä peruspitoisuuksia (lx). Mikäli näitä liuoksia käytetään esimerkeissä erilaisina pitoisuuksina, niin se esitetään viittaamalla liuokseen peruspitoisuuden (lx) monikertana.

Esimerkki I

Pichia pastoris-hiivan transformointiin käytetyt toimenpiteet A. Solujen kasvatus 1. Pichia pastoris-kannan GS115 (NRRL Y-15851) pesäke siirros-tetaan noin 10 millilitraan YPD-alustaa ja tätä viljelmää ravistellaan 30°C:n lämpötilassa 12-20 tuntia.

2. Noin 12-20 tunnin kuluttua solususpensio laimennetaan siten, että optiseksi tiheydeksi aallonpituudella 600 nm (OD^qq) saadaan noin 0,01-0,1, ja soluja pidetään logaritmisen kasvun vaiheessa YPD-alustassa 30°C:n lämpötilassa 6-8 tuntia.

3. Noin 6-8 tunnin kuluttua 100 millilitraan YPD-alustaa siirrostetaan 0,5 ml siirrosteviljelmää, jonka ODg0o on no^n (tai vastaava määrä). Viljelmää ravistellaan 30°C:n lämpötilassa noin 12-20 tuntia.

4. Solut otetaan talteen, kun 0D60Q on noin 0,2-0,3 (suurin piirtein 16-20 tunnin kuluttua), sentrifugoimalla nopeudella 1500 x g 5 minuuttia.

95929 17 B. Sferoplastien valmistus 1. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä vettä. (Kaikki vaiheiden 1-5 sentrifugoinnit toteutetaan nopeudella 1500 x g 5 minuutin ajan.) 2. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla juuri valmistettua SED-liuosta.

3. Solut pestään kahdesti 10 millilitralla steriiliä 1 M sorbitoiiliuosta.

4. Solut suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan SCE-puskuria.

5. Soluihin lisätään 5-10 ^ul entsyymiä Zymolyaasi 60 000, jonka pitoisuus on 4 mg/ml (Miles Laboratories). Soluja inku-boidaan 30°C:n lämpötilassa noin 30-60 minuuttia.

Koska sferoplastien valmistus on kriittinen vaihe transformoin-tiin tähtäävässä toimenpiteessä, niin sferoplastien muodostumista tulisi seurata seuraavalla tavalla: 100 ^,ul suuruinen solunäyte lisätään 900 mikrolitraan 5 % SDS-liuosta sekä 900 mikro-litraan 1 M sorbitoliliuosta ennen zymolyaasin lisäämistä ja heti zymolyaasin lisäämisen jälkeen, sekä eri hetkillä inkuboin-tijakson kuluessa. Inkubointi keskeytetään sillä hetkellä, jolloin solut hajoavat SDS-liuoksessa, mutta eivät vielä hajoa sorbitoliliuoksessa (tavallisesti silloin, kun inkubointi on kestänyt 30-60 minuuttia).

6. Sferoplastit pestään kahdesti 10 millilitralla steriiliä 1 M sorbitoliliuosta sentrifugoimalla nopeudella 1000 x g 5-10 minuuttia. (Sentrifugoinnin kesto ja nopeus voivat vaihdella; sentrifugoinnin tulee riittää sferoplastien kasauttamiseen, niiden kuitenkaan hajoamatta voimavaikutuksen seurauksena.) 7. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä CaS-liuosta.

8. Solut suspendoidaan uudestaan yhteensä 0,6 millilitraan CaS-liuosta.

18 95929 C. Transformaatio 1. DNA-näytteet (tilavuus korkeintaan 20 ^ul) laitetaan sterii-leihin polypropyleeniputkiin, joiden suuruus on 12 x 75 mm.

(DNA:n tulisi olla vedessä tai TE-puskurissa; jotta pienillä DNA-määrillä päästäisiin transformaation mahdollisimman suuriin esiintymistodennäköisyyksiin, niin on suositeltavaa, että kuhunkin näytteeseen lisätään noin 1 ^ul sonikoitua E. coli DNA:ta, jonka pitoisuus on 5 mg/ml.) 2. Kuhunkin DNA-näytteeseen lisätään 100 ^ul sferoplasteja, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia.

3. Kuhunkin näytteeseen lisätään 1 ml PEG-liuosta, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 15 minuuttia.

4. Näytteet sentrifugoidaan nopeudella 1000 x g 5-10 minuuttia, ja PEG-liuos dekantoidaan pois.

5. Näytteet suspendoidaan uudestaan 150 mikrolitraan SOS-liuosta, ja niitä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

6. Näytteisiin lisätään 850 ^ul steriiliä 1 M sorbitoliliuos-ta, ja pieni osa näytteistä maljataan jäljempänä kuvatulla tavalla.

D. Sferoplastien regenerointi 1. Regenerointiin käytetyn agaralustan valmistusohje: a. Agar-KCl - 9 g Bacto-agaria, 13,4 g KC1, 240 ml vettä, autoklavointi.

b. lOX Glukoosi - 20 g dekstroosia, 100 ml vettä, autoklavointi.

c. 10X SC - 6,75 g hiivan typpialustaa ilman aminohappoja, 100 ml vettä, autoklavointi. (Ennen autoklavointia tai sen jälkeen tähän komponenttiin lisätään mitä tahansa toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa korkeintaan pitoisuudeksi 200 ^,ug/ml. ) d. 300 millilitraan sulaa Agar-KCl-liuosta lisätään 30 ml 10X glukoosia-komponenttia ja 30 ml 10X SC-komponenttia. Alustaan lisätään 0,6 ml biotiinia, jonka pitoisuus on 0,2 mg/ml, sekä *. mitä tahansa muuta toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa

II

95929 19 pitoisuudeksi 20 ^ug/ml. Sulaa regenerointiagaria pidetään 55-60°C:n lämpötilassa.

2. Transformoitujen näytteiden maljaaminen:

Maljaa kohden kaadetaan 10 ml regenerointiagaria alimmaksi agarkerrokseksi vähintään 30 ennen transformoitujen näytteiden valmistusta. Putkiin, joita pidetään 45-50°C:n lämpöisessä hauteessa, kaadetaan 10 ml suuruinen määrä regenerointiagaria siinä vaiheessa, kun transformoidut näytteet ovat SOS-liuokses-sa. Tietty määrä kutakin näytettä lisätään 10 millilitraan sulaa regenerointiagaria, joita pidetään putkissa 45-50°C:n lämpötilassa, ja kunkin putken sisältö kaadetaan maljaan, joka sisältää alimmaisena agarkerroksena 10 ml kiinteätä regenerointiagaria.

3. Sferoplastipreparaatin laadun määrittäminen:

Yhdestä näytteestä otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan 100-kertaisesti lisäämällä se 990 mikrolitraan 1 M sorbitoliliuosta. Tästä 100-kertaisesta laimennoksesta otetaan 10 ^,ul, joka laimennetaan jälleen 100-kertaisesti lisäämällä se toiseen 990 mikrolitran suuruiseen erään 1 M sorbitoliliuosta. Molemmista laimennoksista otetaan 100 ^ul, jotka levitetään YPD-agaralustaa sisältäville maljoille preparaatissa läsnäolevien kokonaisten, sferoplasteiksi muuttumattomien solujen pitoisuuden määrittämiseksi. Kummastakin laimennoksesta otetaan 100 ^ul, joka lisätään 10 millilitraan regenerointiagaria, johon oli lisätty täydennökseksi 40 ^.ug/ml histidiiniä, regeneroituvien sferoplas- tien kokonaismäärän määrittämiseksi. Transformointikokeessa . .. 7 hyvinä arvoina voidaan pitää yhteensä 1-3 x 10 regeneroituvaa 3 sferoplastia/ml ja noin 1 x 10 kokonaista solua/ml.

4. Maljoja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 3-5 vuorokautta.

Esimerkki II

pAOP2-vektoriperheen muodostaminen 1. Plasmidi pPG2.5 katkottiin entsyymillä BamHI (tämä plasmidi perustuu plasmidiin pBR322, ja se sisältää noin 2,5 kiloemäsparin 20 - 95929 suuruisen EcoRI-Sall-kappaleen plasmidista pPG4.0, joka plas-midi sisältää puolestaan primäärin alkoholioksidaasin geenin {AOXl) sekä säätelevät alueet, ja jota on saatavana E. coli-isännässä kantakokoelmasta Northern Regional Research Center of the United States Department of Agrigulture, Peoria,

Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15868).

2. Lineaariseksi tehty plasmidi katkottiin entsyymillä BAL31; 3. Tuloksena oleva DNA käsiteltiin Klenow-kappaleella tylppien päiden muokkaamiseksi, ja ligatoitiin EcoRI-kytkijoihin; 4. Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli-kantaan MM294; 5. Transformantit seulottiin pesäkehybridisaatioon perustuvalla tekniikalla käyttäen synteettistä oiigonukleotidiä, jonka ketju on seuraava: 5'TTATTCGAAACGGGAATTCC.

Tämä oligonukleotidi sisältää AOXl-geenin promoottoriketjun ATG-aloituskodoniin saakka, sitä kuitenkaan sisältämättä, yhteen-sulautuneena EcoRI-kytkijän ketjuun; 6. Positiivisten kloonien järjestys määritettiin Maxam-Gilbert-tekniikalla. Järjestys kaikissa kolmessa positiivisessa kloonissa oli seuraava: « • · 51___TTATTCGAAACGAGGAATTCC...3’ .

Niihin jokaiseen sisältyy "A" ATG-kodonista (alleviivattu esitetyssä ketjussa). Todettiin, ettei tämä A todennäköisesti ole haitallinen; täten kaikki myöhemmät kloonit ovat näiden positiivisten kloonien johdannaisia. Näistä klooneista käytetään laboratoriossa lyhenteitä pAOPl, pA0P2 ja pA0P3, vastaavasti.

7. Kaksi muuta kloonia tunnistettiin seulomalla BAL31-entsyy-millä käsitellyt ja kytkijään ligatoidut tuotteet. Niiden ketju on seuraava:

5'...T AATTATTCGGAATTC C...3' pAOXl EcoRI

li 21 95929 Näistä klooneista käytetään lyhenteitä pAOP5 ja pAOPö.

Edellä kuvatun menetelmän muunnoksessa plasmidi pPG2.5 katkottiin entsyymillä AsuII eikä BamHI, lineaariseksi muuttunut kappale käsiteltiin Klenow-kappaleella (edellä kuvattu BAL31-käsittely jää pois), ja ligatoitiin sitten EcoRI-kytkijoihin. Tuloksena oleva plasmidi sisältää AOXl-promoottoriketjut, josta puuttuu ATG-aloituskodoni. Täten valmistetusta plasmidista käytetään lyhennettä pA0P4, ja sen ketju on seuraava:

51 ...T A A T T A T G G A A T T C...3' pAOXl EcoRI

AOXl-promoottori (pAOXl) reagoi hiililähteestä johtuvaan kata-boliittiseen tukahtumiseen siten, että entsyymisynteesi pysähtyy erittäin haitallisesti. Tämän lisäksi AO-promoottori reagoi hiililähteen ehtymiseen. Edelleen, kasvattaminen metanolissa johtaa AOXl-promoottorin indusoitumiseen. Lisäksi laajojen tutkimusten, kuten esimerkiksi julkaisun Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold ja Gingeras, Molecular and Cellular Biology, Toukokuu, 1985, sivut 1111-1121 perusteella tiedetään, että tässä keksinnössä käytettävän AOXl-promoottorikappaleen säätely tapahtuu samankaltaisesta kuin AOXl-promoottorin säätely kromosomissa. Jokainen tässä esimerkissä kuvatulla tavalla valmistettu ja eristetty klooni reagoi kataboliseen tukahtumiseen, hiili- • · lähteen ehtymiseen ja metanoli-induktioon samalla tavalla kuin itse AOXl-promoottori.

AO-päättäjän kuvaus AO-päättäjänä käytetty StuI-Hindlll-kappale sisältää ketjuja, ' jotka toimivat mallitteena AOXl mRNA-kopion polyadenyloimi- seksi. Näihin ketjuihin kuuluu seuraava: TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-polyadenylaatio.

Kun StuI-Hindlll-kappale sijoitetaan plasmidissa 3'-asemaan polypeptidiä koodaavaan alueeseen nähden, niin se edistää RNA:n

• · I

. 95929 T~ 22 päättymistä. AOXl:n päättämisketjut on eristetty ja ne on saatavissa plasmidista pPG3.2, joka on pBR322:een perustuva, AOXl:n päättämisketjut sisältävä plasmidi. Tämä plasmidi on yleisön saatavana E. coli-isäntään transformoituna kantakokoel-masta Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15999 sen jälkeen, kun oheiselle hakemukselle on myönnetty patenttioikeudet.

Esimerkki III

Tämän esimerkin kohteena olevien plasmidien valmistamiseksi käytetyt peräkkäiset vaiheet esitetään yhteenvedon tavoin liitteenä olevassa kuvassa 5.

Vektoreiden pBSAG5 ja pBSAG5I muodostaminen 1. Vektorin pCFL2 muodostaminen

Vektori pAOP2, joka sisältää 3'-päässään AOXl-promoottorin, josta puuttuu ATG:n TG, katkottiin entsyymillä Hindi. Promoottorin sisältämä DNA-kappale eristettiin ja ligatoitiin plasmi-diin pBR322, joka oli tätä ennen katkottu entsyymillä Hindlll ja täytetty Klenow-kappaleella. Tässä reaktiossa saatiin vektori pCFL2.

2. Vektorin pBSA0P2 muodostaminen

Plasmidi pBR322-BglII,joka on pBR322, missä PvuII-kohta on kor- * · vautunut Bglll-kohdalla, pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Clal. Tämä lineaariseksi tehty plasmidi yhdistettiin ligaatioreaktiolla vektorista pCFL2-saatuun, AOXlrn sisältävään Clal/EcoRI-rajoitteiseen 5'-kappaleeseen. Tuloksena olevasta vektorista käytetään lyhennettä pBSA0P2.

* 3. Vektorin pBSAG22 muodostaminen

Plasmidi pHBS-5,joka kuvataan julkaisussa (Valenzuela et ai., Nature 298, 347-350 (1982); katso kuva 6), ja joka sisältää HBsAg-geenin istutettuna EcoRI-kohtaan plasmidissa pBR322, katkottiin entsyymillä Clal. Suurin piirtein 60 emäsparia poistettiin kumpaankin suuntaan eksonukleaasilla Bal31. Jäljelle jäävä 95929 23 DNA-kappale pilkottiin entsyymillä BamHI ja täytettiin Klenow-kappaleella. Arviolta yhteensä 200 transformanttia pilkottiin entsyymillä Ncol ligaation jälkeen. Lineaariseksi tehdyt plasmi-dit eristettiin ja ligatoitiin uudestaan. E. coli-bakteerin transformaation jälkeen arviolta 10 % plasmideista (joista käytetään lyhennettä pBSAGl) käsitti uudestaan muodostuneen Ncol-kohdan. pBSAGl katkottiin entsyymillä Ncol, täytettiin Klenow-kappaleella ja katkottiin entsyymillä BamHI. Tämä plasmidikappale ligatoitiin vektoriin pBSA0P2, joka oli tätä ennen katkottu entsyymillä EcoRI, täytetty Klenow-kappaleella ja katkottu entsyymillä BamHI. Tuloksena olevasta vektorista käytetään lyhennettä pBSAG22.

4. Vektoreiden pBSAG4, pBSAG5 ja pBSAG5I muodostaminen Plasmidi pAOT-1 /plasmidiin pBR322 perustuva plasmidi, joka saadaan ligatoimalla muodosteen pPG3.2 (saatavana E. coli-isännässä talletusnumerolla NRRL B-15999) 1,6 kiloemäsparin suuruinen Sall-Hindlll-kappale entsyymeillä Sali ja Hindlll pilkottuun plasmidiin pBR322^EcoRI (eli plasmidiin pBR322, josta EcoRI-kohta on tuhottu; katso kuva 7/, joka sisältää kopioinnin päättävän 3'-AOXl-kappaleen, katkottiin entsyymeillä Xbal ja Pstl. Päättäjän sisältävä kappale ligatoitiin vektoriin pBSAG22, joka oli tätä ennen pilkottu entsyymeillä Xbal ja Pstl, jolloin saadaan pXP-1. pBSAG22 pilkottiin entsyymillä Dral, siihen lisättiin Stul-kytkijät, ja lopuksi toteutettiin vielä • · pilkkominen entsyymeillä Stul ja EcoRI. Rakenteellinen HBsAg-geeni eristettiin ja ligatoitiin muodosteeseen pXP-1, joka oli tätä ennen pilkottu entsyymeillä Stul ja EcoRI, jolloin saatiin vektori pBSAG4.

; HBsAg-geenin sisältävä Clal-kappale muodosteesta pBSAG4 ligatoi tiin muodosteen pYJ33 (katso kuva 8) ainoaan Clal-kohtaan, jolloin saatiin vektorit pBSAG5 ja pBSAG5I. Plasmidin pBSAG5I restriktiokartta esitetään kuvassa 11. Plasmidit pBSAG5 ja pBSAG5l eroavat toisistaan ainoastaan Clal-kappaleen, joka sisältää 5'-AOXl/HBsAg/3'-AOXl-ilmentämiskasetin, suuntautumisen suhteen. Täten, plasmidissa 5'-AOXl-kappale sijaitsee Pichia- 24 95929 hiivan HIS4-geenin vieressä, kun taas 3’-AOXl-kappale sijaitsee autonomisen elementin PARS2 vieressä. E. coli-isäntään transformoitu plasmidi pBSAG5 on talletettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, jotta se olisi yleisön saatavilla, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. E. coli-kannalle MCl061-pBSAG5 on annettu talletusnumeroksi NRRL B-18028.

Esimerkki IV

HBsAg-proteiinia ilmentävän Pichia pastoris-isännän GS115 (pBSAG!5I) muodostaminen______ Tässä esimerkissä kuvataan Pichia pastoris-isännän, jossa primääri alkoholioksidaasin geeni (A0X1) on korvautunut Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin (HBsAg) geenillä Pichia-hiivan kromosomissa, valmistaminen.

Tällaisen HBsAgrtä ilmentävän, Aoxl--mutatoituneen Pichia pastoris-isännän muodostamista varten valmistettiin plasmidi pBSAGI5l kuvissa 9-11 esitetyllä tavalla. Muodostamisen ensimmäisenä vaiheena oli AOXl-promoottorin ja LacZ-geenin käsittävän ilmen-tämisvektorin pSA0H5 sekä AOXl-promoottorin ja HBsAg-geenin käsittävän ilmentämisvektorin pTHBS3, jotka on valmistettu jäljempänä sekä kuvassa 13 esitetyllä tavalla, katkaiseminen restriktioendonukleaasilla Hindlll. pTHBS3:n muodostamiseksi plasmidi pAOT-1 (katso kuva 7) katkottiin entsyymillä Stul, ligatoitiin EcoRI-kytkijoiden kanssa, ja pilkottiin sitten entsyymillä Pstl. 3’-AOXl-kappaleen sisältävä EcoRI-Pstl-kappale eristettiin. 5'-AOXl-ketjut sisältävä vektori pA0P3 katkottiin entsyymeillä EcoRI ja SstI; tuloksena oleva 51-AOXl-kappale ligatoitiin E. coli - S. cerevisiae-sukkulavektoriin pSEYlOl ‘ (Douglas et ai. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 3983-3987), joka oli tätä ennen katkottu entsyymeillä EcoRI ja SstI. Näiden pAOP3- ja pSEYlOl-kappaleiden ligaation tuloksena saatiin plasmidi pTA020. Plasmidi pTA020 sisältää URA3-geenin ja ampisilliinin geenin S. cerevisiae-hiivassa ja bakteereissa valikointia varten, vastaavasti, 2 renkaan S.

;· cerevisiae-hiivassa replikoitumista varten sekä 5 1-AOXl-ket jut.

li 25 95929

Plasmidi pTA020 katkottiin osittain entsyymillä Pstl. Lineaariseksi tehty vektori eristettiin ja katkottiin entsyymillä EcoRI. Suurin kappale (joka sisältää 2 ^u rengasketjut, URA3-geenin sekä 5'-AOXl-kappaleen) ligatoitiin muodosteesta pAOT-1 saatuun 3'-AOXl-kappaleeseen vektorin pTHBSl muodostamiseksi.

HBsAg-geenin sisältävä EcoRI-kappale muodosteesta pHBs-5 eristettiin pilkkomalla entsyymillä EcoRI, jonka jälkeen se ligatoitiin muodosteeseen pTHBSl, joka oli tätä ennen pilkottu entsyymillä EcoRI ja käsitelty bakteeriperäisellä alkalisella fos-fataasilla. Tuloksena olevan vektorin, josta käytetään lyhennettä pTHBS2, sisältämä HBsAg-geeni on sijoittunut 3'- ja 5’-AOXl-ketjujen väliin.

Plasmidi pYJ30 (saatavana E. coli-isännässä talletusnumerolla NRRL B-15890) katkottiin entsyymillä EcoRI, täytettiin Klenow-kappaleella, ja katkottiin sitten Pstl-entsyymillä. P. pastoris-hiivan HIS4/PARSl-elementin sisältävä kappale eristettiin ja ligatoitiin Pstl-Sstl-rajoitteiseen kappaleeseen vektorista pTHBS2 (joka sisältää HBsAg-geenin AOXl-ketjujen reunustamana). Ligaation tuloksena saadaan vektori pTHBS3.

Vektori pTHBS3 pilkottiin entsyymillä Hindlll, jolloin saatu 1,4 kiloemäsparin kappale (joka sisältää HBsAg-geenin, AOXl- . päättämisketjun sekä osan AOXl-promoottoriketjusta) otettiin • · talteen ja istutettiin muodosteesta pSAOH5 saatuun 7,7 kiloemäsparin kappaleeseen, joka sisältää Pichia-hiivan HIS4-geenin, suurimman osan AOXl-promoottoriketjusta sekä ketjuja plasmidista pBR322. Tämän jälkeen saatiin eristetyksi 9,1 kiloemäsparin suuruinen yhdistelmäplasmidi pYM39, joka sisältää uudestaan muodostuneet AOXl-promoottoriketjut.

Muodostuksen toista vaihetta varten plasmidi pPG3.2 (saatavana E. coli-isännässä talletusnumerolla NRRL B-15999) pilkottiin entsyymillä PvuII, ja 1,5 kiloemäsparin kappale, joka sisältää ketjuja välittömästi 3'-puolella AOXl-geenistä, istutettiin muodosteen pYM39 ainoaan Nrul-kohtaan. Tämän jälkeen eristettiin 26 95929 10,6 kiloemäsparin suuruinen yhdistelmäplasmidi pYM16, jonka sisältämä PvuII-kappale on suuntautunut siten, että 3'-AOXl-geeniä lähellä olevat ketjut olivat sijoittuneet vektorin HIS4-geeni-osaa kohden- Plasmidi pYMl6 sisälsi kaikki ne komponentit, jotka tarvitaan hävittämään AOXl-geeni Pichia-isännästä ja HBsAg:n ilmentymiseen AOXl-promoottorin säätelyn alaisuudessa, mutta se ei sisällä muodosteen pBSAG5 trimmattua HBsAg-geeni-kappaletta.

Tästä syystä muodostuksen viimeisenä vaiheena oli yhdistää toivottu HBsAg-geeni AOXl-geenin häviämävektoriin. Tätä tarkoitusta varten plasmidit pYMl6 ja pBSAG5I (muuten sama plasmidi kuin pBSAG5 paitsi, että HBsAg-ilmentämiskasetin sisältävän Clal-kappaleen suuntautuminen on päinvastainen) pilkottiin restriktio-entsyymeillä PstI ja SphI. Plasmidista pBSAG5I saatu 6,3 kiloemäsparin suuruinen kappale, joka sisältää trimmatun HBsAg-geenin käsittävän ilmentämiskasetin sekä Pichia-hiivan HIS4-geenin, istutettiin plasmidista pYM16 saatuun 4,6 kiloemäsparin suuruiseen kappaleeseen, joka sisältää 31-AOXl-ketjut sekä suurimman osan plasmidista pBR322, jolloin saadaan lopullinen, 10,9 kiloemäsparin suuruinen plasmidi pBSAGl5I. E. coli-isäntään istutettu plasmidi pBSAGI5I on talletettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, jotta plasmidi olisi yleisön saatavilla sen jälkeen, kun oheiselle hakemukselle on myönnetty patenttioikeudet, plasmidin talletusnumeron ollessa NRRL B-18021.

• · P. pastoris his4-mutanttikannan GS115 (NRRL Y-15851) transfor-moimiseksi plasmidi pBSAGI5I pilkottiin ensin restriktioentsyy-millä Bglll 7,2 kiloemäsparin suuruisen lineaarisen vektorin tuottamiseksi, joka vektori sisältää yhdessä päätteessään 0,85 ; kiloemäsparia AOXl-geenin 5'-päästä sekä toisessa päätteessään 1,1 kiloemäsparia AOXl-geenin 3'-päästä (kuva 12). Noin 2 ^ug entsyymillä Bglll katkottua plasmidia pBSAGI5I transformoitiin kantaan GS115 käyttäen histidiini-prototrofiaan perustuvaa valikointia. Transformaatiossa saatiin noin 5 x 103 His+-pesäkettä.

Il 95929 27

Transformoinnit, joissa pBSAGI5I istutettiin lineaarisena molekyylinä kromosomeissa AOXl-geenin sijaintikohtaan, johtavat AOXl-geenin häviämiseen. Tästä syystä His+-transformoituneet kannat, joissa oli toteutunut toivottu lineaarinen istutus, tunnistettiin hyvin hitaasta kasvunopeudestaan metanolissa kasvatettaessa. (P. pastoris-hiiva käsittää toisen, "heikomman" alkoholioksidaasin geenin A0X2, jonka tuottama alkoholioksi-daasi riittää kantojen, joilta puuttuu primääri alkoholioksidaasin geeni, hitaaseen kasvuun metanolissa.)

Menetelmä His+-transformanttien, jotka eivät kyenneet kasvamaan hyvin metanolissa, tunnistamiseksi käsitti ensin selektiiviseen agariin laitettujen His+-solujen ottamisen talteen.

Tämä talteenottovaihe toteutettiin siirtämällä agar 50 milli-litran putkeen, joka sisältää 20 ml steriiliä vettä, ja jauhamalla agaria Brinkman-homogenisaattorilla alhaisella nopeudella 30 minuutin ajan. Agarjäte erotettiin soluista suodattamalla seos siivilän läpi ja huuhtomalla agar 30 millilitralla steriiliä vettä. Tämän jälkeen hiivasolut laimennettiin siten, että optiseksi tiheydeksi aallonpituudella 600 nm (Ag0Q) saatiin 0,1, niitä sonikoitiin 10 sekuntia käyttäen Branson-sonikaat-toria asetusarvolla 4 hiivasoluista muodostuneiden kokkareiden hajottamiseksi, minkä jälkeen solut laimennettiin 100-kertai-sesti steriilillä vedellä. Laimennoksesta otettiin 10 ^ul ja . 100 ,ul, jotka levitettiin agarmaljoille, jotka maljat sisältä- •« / vät 0,67 % hiivan typpialustaa ilman aminohappoja (Difco) sekä 0,1 % glukoosia. Maljoja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 3 vuorokautta, minä aikana maljoille ilmaantuneet pesäkkeet seulottiin sen perusteella, miten ne kykenivät kasvamaan metanolissa. Pesäkkeiden seulomiseksi ne replikamaljättiin joukkoon agarmal joja, jotka sisältävät 0,67 % hiivan typpialustaa ilman aminohappoja sekä seuraavat hiilen lähteet: 1) hiilen lähde puuttuu; 2) 0,5 % metanolia; sekä 3)2% glukoosia. Niistä pesäkkeistä, jotka kasvoivat 2 % glukoosilla, 32 % ei kyennyt kasvamaan hyvin metanolilla.

28 95929

Jotta voitaisiin varmistua siitä, että pBSAGI5I-ketjut on saatu istutetuiksi kuvassa 12 esitetyllä tavalla, koko DNA eristettiin yhdestä Pichia pastoris-kannasta, joka ei kykene käyttämään hyväkseen metanolia, pilkottiin restriktio-endonukleaaseilla ja hybridisoitiin Southern1 n täpliin perustuvalla menetelmällä 32 P-merkittyihin koettimiin. Yhdessä Southern'in täpliin perustuvassa kokeessa Aoxl -kannasta, GS115(pBSAGI5I), sekä Aoxl+-kannasta GS115 saadut DNA:t pilkottiin entsyymillä Hindlll ja hybridisoitiin merkittyyn plasmidiin pPG4.0, joka on muodostettu AOXl-geenistä sekä plasmidista pBR322 saaduista ketjuista, ja joka plasmidi on saatavana E. coli-isännässä kantakokoelmasta Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15868. AOXl-proteiinia koodaava, 2,3 kiloemäsparin suuruinen kappale todettiin urissa, jotka sisältävät GS115 DNA:ta.

2,3 kiloemäsparin kappale puuttui kuitenkin urista, jotka sisälsivät kannasta GS115(pBSAGI5I) saatua DNA:ta, ja näissä urissa ei todettu mitään uusia kappaleita. Nämä tulokset osoittavat, että AOXl-geeni oli hävinnyt kannasta GS115(pBSAGl5I).

Esimerkki V

HBsAg-proteiinia koodaavilla vektoreilla transformoitujen Pichia-hiivojen kasvatus_ 1. Kannan GS115(pBSAG5) kasvatus fermentorissa

10 % siirroste kasvatettiin yön aikana hiivan typpialustassa (YNB), joka sisältää 2 % glukoosia, ravistelupullossa 30°C:n v lämpötilassa. Siirroste lisättiin perussuolaliuosta (pH

asetettu arvoon 4) sisältävään fermentoriin. Glukoosisyöttö aloitettiin laimennosnopeudella 0,05-0,1/tunti. Kun soluti-heys saavutti muuttumattoman tilan ja kun fermentorin glukoosi-pitoisuus putosi arvoon, joka on alle 100 ppm, niin HBsAg:n tuotanto indusoitiin muuttamalla syötettävä hiilen lähde metano-liksi tai seokseksi, joka sisältää 50 % metanolia ja 50 % glukoosia.

2. Kannan GS115(pBSAG!5I) (Aoxl~) kasvatus fermentorissa Liukoisen HBsAg-proteiinin, joka on Ausria-aktiivista, optimaaliseen ilmentymiseen (3-4 % liukoista proteiinia) päästään

II

. 95929 29 kasvattamalla tätä Aoxl“-organismia panoskasvatuksena käyttäen glyserolia, jota seuraa metanolia sisältävä syöttö. Siirroste voidaan kasvattaa glyserolia sisältävällä YNB-alustalla. Perussuolat ja glyseroli (käytetty glyserolipitoisuus on ollut 1 % ja 4 %) sekä biotiini voidaan autoklavoida fermentorissa. Jäähtymisen jälkeen pH tulisi asettaa alueelle 3,5-6, ja alustaan tulisi lisätä hivensuolat (2,5 mg/1) ennen siirrosteen lisäämistä. Sataprosenttinen metanolisyöttö voidaan aloittaa ennen glyserolin kulumista loppuun tai sen jälkeen. Jopa niinkin korkea kuin 2 prosentin metanolitaso ei häiritse HBsAg:n keräytymistä, jota voi jatkua jopa 200 tuntia. HBsAg-hiukkas-ten keräytyminen lakkaa kuitenkin, kun metanolipitoisuus fermen-torissa on 5 %.

Kasvattaminen suurempiin solutiheyksiin on onnistunut nostamalla syötettävien suolojen pitoisuutta. Suuremmat sinkkipi-toisuudet ovat erityisen tärkeitä suuremmille solutiheyksille, kun kasvatus tapahtuu metanolissa. Suurempiin talteensaata-viin Ausria-aktiivisuuksiin on päästy, kun sinkki ei rajoita kasvua, mutta tällöin myös koko talteensaatava proteiinimäärä oli suurempi, mikä johtaa pienempään Ausria-aktiivisuuteen liukoisen proteiinin prosenttisena osuutena laskettaessa.

3. Kannoista GS115(pBSAG5) ja GS115(pBSAGI5I) saatujen soluvil-jelmien kasvatus ravistelupulloissa_ • ·

Transformoitu pesäke poimittiin ja levitettiin SD-maljalle.

Solujuova siirrostettiin 50 millilitraan YNB-elatusalustaa (1 x YNB, 5 ^ug/ml biotiinia), joka sisältää 5 % glukoosia, 250 millilitran ravistelupullossa, ja pulloa ravisteltiin 30°C:n lämpötilassa ilmaravistelijassa yön yli nopeudella 250 kierros- ·. ta minuutissa. Aamulla saatu 0D,.^-lukema oli 2-3. Ravistelu-

oUU

pullosta poistettiin 100 OD60Q-yksikköä vastaava määrä soluja (noin 109 solua), ja niitä sentrifugoitiin IEC-sentrifugilla 7 minuuttia nopeudella 2000 x g huoneen lämpötilasa. Solukasau-ma suspendoitiin uudestaan 500 millilitraan YNB-elatusalustaa, joka sisältää 2 % glyserolia, 2 litran ravistelupullossa (ODgQQ = 0,2). Viljelmää inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 95929 30 α nopeudella 250 rpm ilmaravistelijassa niin kauan, kunnes ODgoo saavutti arvon 2-3. Aoxl--isännän tapauksessa viljelmästä poistettiin 500 OD6oo-yksikköä. Solususpensiota sentrifugoitiin IEC-sentrifugilla 7 minuuttia nopeudella 2000 x g. Solukasauma suspendoitiin uudestaan 500 millilitraan YNB-alustaa, joka sisältää 0,5 % metanolia (1,0 0ϋ6οο). Aoxl+-isännän tapauksessa viljelmästä poistettiin 170 ODgOQ-yksikköä, jota sentrifugoitiin edellä mainituissa olosuhteissa, ja solut suspendoitiin uudestaan 500 millilitraan YNB-alustaa, joka sisältää 0,5 % metanolia (0,3 0ϋίηΛ). Molempia viljelmiä ravisteltiin 2 litran

bOO

ravistelupulloissa 30°C:n lämpötilassa nopeudella 250 rpm.

Heti, kun 0Dg0Q-arvoksi saatiin ^ 2, viljelmät laimennettiin 2-kertaisesti samalla kasvatusalustalla. Viljelmistä otettiin säännöllisin väliajoin 100 OD,.^ -yksikön näyte, jota sentri-

bOO

fugoitiin 7 minuuttia nopeudella 2000 x g. Tuloksena olevia solukasaumia voidaan säilyttää pakastettuna -70°C:n lämpötilassa 1-2 viikkoa.

Esimerkki VI

HBsAg-kokeet: 22 nanometrin hiukkanen ja HBsAg-monomeeri 1. Uutteiden valmistus ja proteiinin määrittäminen Kaikki seuraavat toimenpiteet suoritettiin 0-4°C:n lämpötilassa. Pakastettu solukasauma sulatettiin, pestiin kahdesti 2 milli-litralla jääkylmää, liukoiseksi tekevää puskuria. Solut (100 0D600_yks*kk°^ siirrettiin kertakäyttöiseen lasiputkeen (13 x 100 mm). Solukasaumaan lisättiin 0,35 ml liukoiseksi tekevää puskuria ja 0,5 g hapolla pestyjä lasihelmiä (halkaisija 0,45 mm). Tätä suspensiota sekoitettiin koeputkisekoittajalla kulloinkin 1 minuutin ajan käyttäen suurinta asetusarvoa 4, pitäen putkia 1 minuutin pituinen ajanjakso jäissä kunkin se-• koituskerran välissä. Koko soluliete poistettiin ja lasihelmet pestiin 0,35 millilitralla liukoiseksi tekevää puskuria. Pesuun käytetty puskuri lisättiin solulietteeseen ja siirrettiin Eppendorf-putkeen. Uutosta sentrifugoitiin Eppendorf-sentrifu-gilla 15 minuuttia. Supernatantti (liukoinen fraktio; 0,7 ml) poistettiin kasaumasta. Kasaumaan lisättiin 0,7 ml 2-kertai-... sesti väkevöityä SDS-liukoistavaa puskuria HBsAg-proteiinin 95929 31 uuttamiseksi kasaumasta, ja seosta sekoitettiin koeputkisekoit-tajalla ja sitä keitettiin 15 minuuttia. Seosta sentrifugoi-tiin 15 minuuttia, minkä jälkeen supernatantti (liukenematon fraktio) poistettiin solujätteestä. Liukoisesta ja liukenemattomasta fraktiosta otettiin näytteitä, joista määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen TCA-saostusta sekä Lowry'n menetelmää. Proteiinipitoisuuden standardina käytettiin BSA:ta. Proteiinipitoisuus oli tavallisesti alueella 3-15 mg/ml sekä liukenemattomassa että liukoisessa fraktiossa.

2. Vaihtoehtoinen menetelmä uutteiden valmistamiseksi Seuraavassa kuvataan olosuhteet monomeerisen heterologisen HBsAg-proteiinin, tai proteiinikompleksin, 22 nanometrin hiukkasen, uuttamiseksi Pichia pastoris-hiivan viljelmistä, joka hiiva on transformoitu HBsAg-proteiinia koodaavat ketjut sisältävillä vektoreilla.

P. pastoris-hiivan viljelmiä kasvatettiin siten, että soluti-heys oli 10-100 ODgOQ-yksikköä millilitrassa. 100 ODgOQ-yksikköä vastaava määrä siirrettiin boorisilikaatista valmistettuun vil-jelyputkeen, jonka koko oli 13 x 100 mm, ja pestiin 20 tilavuudella liukoiseksi tekevää puskuria.

Solut sentrifugoitiin (kliinisellä IEC-sentrifugilla), ja kasau- . tettuihin soluihin lisättiin 0,5 g hapolla pestyjä lasihelmiä > » (0,5 mm), ja sitten 0,35 ml liukoiseksi tekevää puskuria. Liukoiseksi tekevä puskuri sisältää vertailuna joko 0,5 M NaCl ja 0,1 % Triton X-100 (paino/tilavuus), tai pitoisuutena 3 M kaliumjodidia tai kaliumtiosyanaattia tuotteen Triton X-100 0,1 prosentin läsnäollessa tai sen puuttuessa. Kaikki liuok-; set puskuroitiin pH-arvoon 7,5 10 mM natriumfosfaatilla.

Seosta sekoitettiin neljästi yhden minuutin ajan käyttäen koe-putkisekoittajaa suurimmalla nopeudella. Sekoituskertojen välissä seosta jäähdytettiin jäissä vähintään minuutin ajan.

Kun hajoittaminen oli viety loppuun, niin rikottujen solujen liuos poistettiin, ja lasihelmet pestiin 0,35 millilitralla 32 95929 liukoiseksi tekevää puskuria, ja nämä kaksi liuosta yhdistettiin ja saatua liuosta sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 13 000 xg. Supernatantit poistettiin, ja niistä määritettiin immunoreaktiiviset HBsAg-hiukkaset (Ausria-koe) sekä trikloo-rietikkahapolla (TCA) saostuva kokonaisproteiini (Lowry).

Tulokset esitetään taulukossa I viidestä kokeesta saatuna arvo-alueena .

Taulukko I

A B C

Olosuhteet hajotet- HBsAg Kokonais- HBsAg taessa 22 nm hiukka- proteiini 22 nm hiukka nen (,ug/ml) (,ul/ml) nen/proteii-_ ' J__ ni (paino-%)

Suolapitoisuus

NaCl (0,5 M) + Triton 203-249 8,6-11,2 2,1-3,2 ΚΙ (3M) + Triton 5,1-150 0,85-3,4 0,5-8,1 ΚΙ (3Μ) - Triton 71-136 2,5-4,3 2,3-7,2 KSCN (3M) + Triton 2,4-50 0,6-1,9 0,8-9,6 KSCN (3M) - Triton 80-125 1,6-4,3 3,8-16,7

Missään kaliumjodidia tai kaliumtiosyanaattia sisältävissä olosuhteissa ei päästä HBsAg-hiukkasen arvoihin,jotka olisivat suuremmat kuin natriumkloridia sisältävissä olosuhteissa saadut arvot (sarake A), mutta kuitenkin on selvää, että kaliumjodidi . tai kaliumtiosyanaatti inhiboi kokonaisproteiinien vapautumista • » (sarake B), nostaen täten hiukkasen ominaisaktiivisuuden 2-5-kertaiseksi (sarake C).

3. 22 nanometrin suuruisen hiukkasen kokeet (Ausriatm II- reagenssipakkaus )________________ : Liukoinen fraktio laimennettiin 1000-10 000-kertaisesti Ausria- pakkauksen sisältämällä laimennospuskurilla, ja 25-100 mikro-litran suuruiset näytteet analysoidaan seuraavasti:

Ensimmäinen inkubointi: 1. Standardikäyrän muodostamiseksi reaktiolevyn eri kolojen pohjalle pipetoitiin laimennossarja, joka sisältää 0,1-4 nanogram-maa vertailua yhteensä 200 mikrolitran tilavuudessa (levylle laitettiin myös 4 negatiivista vertailua).

Il 95929 33

Analysoitavien näytteiden tapauksessa reaktiolevyn eri kolojen pohjalle pipetoitiin 200 ^ul kustakin näytteestä saatua, laimennettua liukoista fraktiota.

2. Kuhunkin koloon, joka sisältää joko analysoitavaa näytettä tai vertailua, laitetaan varoen yksi helmi. Vaihtoehtoisesti helmet voidaan laittaa koloihin ennen vertailujen ja näytteiden lisäämistä.

3. Reaktiolevy peitettiin tiiviillä kannella, minkä jälkeen levyä liikuteltiin varovaisesti helmien päällystämiseksi ja koloissa mahdollisesti läsnäolevien ilmakuplien poistamiseksi.

4. Reaktiota inkuboitiin tämän jälkeen 45°C:n lämpötilassa 2 tuntia.

5. Tiivis kansi poistettiin ja heitettiin pois. Neste imettiin pois ja kukin helmi pestiin kahdesti 4-6 millilitralla tislattua tai ionivaihdettua vettä.

Toinen inkubointi 6. Jokaiseen helmen sisältävään koloon pipetoitiin 200 ^ul ^^I-anti-HBs-liuos ta.

. 7. Levy suljettiin uudella tiiviillä kannella, ja reaktiolevyä liikuteltiin jälleen varovaisesti helmien kastelemiseksi ja koloissa läsnäolevien ilmakuplien poistamiseksi.

8. Tämän jälkeen reaktiolevyä inkuboitiin 45°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan.

« 9. Tiivis kansi poistettiin ja heitettiin pois. Neste imettiin pois, ja kukin helmi pestiin vaiheessa 5 kuvatulla tavalla.

10. Helmet siirrettiin sitten välittömästi asianmukaisesti merkittyihin laskuriputkiin.

- 95929 34

Gamma-tuikelaskurin lukeminen 11. Laskurin lukema-arvo määritettiin yhdessä minuutissa.

12. Näytteet laskettiin 24 tunnin kuluessa lopullisesta pesusta.

22 nm hiukkasten pitoisuus määritettiin vaiheessa 1 esitetyllä tavalla valmistetun standardikäyrän avulla.

4. Monomeerin koe (Western'in analyysi)

Liukoisesta tai liukenemattomasta fraktiosta otettiin tilavuus, joka sisältää 25 ^ug proteiinia, tavallisesti 2-5 ^ul, ja tähän tilavuuteen lisättiin vettä 10 mikrolitraksi. Tähän lisätään 10 ^ul 2 x väkevöityä SDS-geelin kuormituspuskuria (100 mM DTT lx puskurissa), ja näytteitä keitettiin 15 minuuttia. Keitetyt näytteet siirrettiin 12 % SDS-akryyliamidigeelille (Laemmli). Geelielektroforeesin jälkeen proteiinit siirrettiin nitroselluloosapaperille (Towbin et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76_, 4350-4354 (1979)). HBsAg saatiin ilmaistuksi HBsAg-antiseerumeilla (muodostettu plasmasta saatua HBsAg-pro- 125 teiinia vastaan) sekä I-merkityllä proteiinilla A. Nitro-selluloosapaperia käytettiin Kodak XAR-5-filmin valottamiseen yön yli -70°C:n lämpötilassa. Monomeerin kvantitoiminen tapahtui laskemalla radioaktiiviset vyöhykkeet nitroselluloosa-paperilta gamma-laskurissa. Standardina käytettiin S.

• t cerevisiae-hiivan tuottamaa yhdistelmä-HBsAg-proteiinia (100-500 ng/ura).

Esimerkki VII

HBsAg-proteiinin ilmentymistaso Pichia pastoris-hiivassa HBsAg-proteiinin muodostuminen lukuisissa transformoiduissa P. pastoris-kannoissa määritettiin esimerkissä VI kuvatulla menetelmällä, käyttäen liukoiseksi tekemiseen esimerkin VI osassa 1 esitettyä menettelytapaa. Tulokset esitetään yhteenvedon omaisesti taulukossa II.

li 95929 35

Taulukko II

Transformoitu kanta GS115 (pBSAGl5l) GS115 (pBSAG5) fenotyyppi Aoxl- His+ Aoxl+ His+ vektorin tila yhtenäistyivä autonominen HBsAg-taso (ravistelupullo)a soluja/1 ΙΟ11 1011 monomeeri (%) 7 1,5 22 nm hiukkanen (%) 2,5 0,2 monomeeri (mg/1) 8,4 1,8 22 nm hiukkanen (mg/l)^ 3 0,24 HBsAg-tasoa (fermentorikasvatus) soluja/1 3,5 x 10^ 8 x 10^ monomeeri (%) 7 1 22 nm hiukkanen (56) 2,9 0,1 monomeeri (mg/1294 96 22 nm hiukkanen (mg/l)*3 122 10 g proteiinimääritykset; mitattu Bradford-menetelmällä ^HBsAg-proteiinia viljelyalustan litraa kohden; 0D600 = 5 X 107 solua/ml = 0,14 mg kuiva-ainetta/ml = 0,06 mg proteiinia/ml.

Edellä esitetyistä tuloksista nähdään, että Pichia pastoris-hiivassa voidaan tuottaa suuria määriä HBsAg-proteiinia, kun tuotanto tapahtuu Pichia pastoris-hiivasta peräisin olevan primäärin alkoholioksidaasigeenin (A0X1) säätelyn alaisuudessa.

Claims (22)

95929

1. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää: (a) likimäärin 2,9 kbprtä pitkän säätelevän alueen, joka on johdettu Pichian dihydroksiasetonisyntetaasigeenistä tai likimäärin 2,0 kbprtä pitkän säätelevän alueen, joka on johdettu Pichian primäärisen alkoholin oksidaasigeenistä (AOX1) tai likimäärin 3 kbprtä pitkän säätelevän alueen, joka on johdettu Pichian p40-geenistä, joka kykenee säätämään lähetti-RNArn kopioitumista polypeptidiä koodaavan alueen 5'-päähän sijoitettuna; ja joka mainittu säätelevä alue reagoi vähintään yhdelle seuraavista olosuhteista: (i) läsnäolevalle metanolille viljelyalustässä, jonka kanssa mainitun DNA-kappaleen sisältävä isäntäorganismi on kosketuksissa; (ii) läsnäolevalle hiilen lähteelle viljelyalustassa, jonka kanssa mainitun DNA-kappaleen sisältävä isäntäorganismi on kosketuksissa, joka hiilen lähde ei aiheuta kataboliittista tukahtumista ja joka on muuta kuin metanolia; ja (iii) hiilen lähteen ehtymiselle siinä viljelyalustassa, jonka kanssa mainitun DNA-kappaleen sisältämä isäntäorganismi on kosketuksissa, sen jälkeen kun isäntäorganismia on ensin kasvatettu kataboliittisen tukahtumisen aiheuttavaa hiilen ja energian lähdettä käyttäen; sekä (b) polypeptidiä koodaavan alueen, joka koodaava alue koodaa hepatitis B -viruksen pinnan antigeeniä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että Pichian primäärisen alkoholin oksidaasin (A0X1) säätelevä alue identifioidaan kuvion 2 restriktiokartalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu sii- . tä, että Pichian DAS-säätelevä alue identifioidaan kuvion 1 restriktiokartalla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että Pichian p40- säätelevä alue identifioidaan kuvion 3 restriktiokartalla. 95929

5·-GAATTCATGG ACAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT CCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAC GTATGTTCCC CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGCCTTTC GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTCCGTATA CATTTAAGGC CT-3'

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että A0X1- tai p40- tai DAS-säätelevä alue on johdettu Pichia pastoriksesta.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen DNA:n 3'-ketjun alavirran puolella polypeptidiä koodaavasta alueesta, joka mainittu DNA:n 3'-ketju kykenee säätelemään polyadenylaatiota sekä po-lypeptidiä koodaavan alueen koodaavan lähetti-RNA:n kopioitu-misen päättymistä.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että DNA-kappale käsittää lisäksi yhden tai useamman ylimääräisen DNA-ketjun, joka on peräisin bakteeriperäisestä plasmidi-DNArsta, bakteriofagin DNArsta, hiivan plas-midi-DNA:sta sekä hiivan kromosomaalisesta DNA:sta.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että hiivan kromosomaalinen DNA käsittää autonomisesti replikoituvan DNA-ketjun ja markkerigeenin.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen peräkkäin järjestäytyneen DNA-ketjun, muodostuen ensimmäisestä istutettavasta DNA-kappaleesta, valikoitavasta markkerigeenistä ja toisesta istutettavasta DNA-kappaleesta; joka ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat kumpikin pituudeltaan vähintään noin 200 nukleotidiä ja niiden nukleotidiketjut ja Pichia-suvun lajien geno-misen DNA:n osat ovat keskenään homologisia; joka DNA-kappale ja markkerigeeni ovat sijoittuneet ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen 3'-pään ja toisen istutettavan DNA-kappaleen 5'- . pään väliin; ja joka ensimmäinen ja toinen istutettava DNA- kappale ovat suuntautuneet toisiinsa nähden niin kuin ne ovat suuntautuneet Pichia-hiivan genomissa.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että polypeptidiä koodaava alue muodostuu olennaisesti 95929 seuraavasta, arviolta 700 emäsparin pituisesta EcoRI-Stul-kappaleesta:

11. Plasmidi, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-kappaleen, bakteeriperäistä plasmidi-DNA:ta, valikoitavan hiivamarkkerigeenin ja hiivan autonomisen replikaatioketjun.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi valitaan seuraavista: pBSAG5 (NRRL B-18028), pBSAG5I, kuten on esitetty kuvassa 11, ja pBSAGISI (NRRL B-18021), kuten on esitetty kuviossa 11, jossa kuviossa C vastaa Clal-restriktiokohtaa ja jossa pBSAG5 ja pBSAGSI eroavat Clal-kappaleen suuntautumisessa.

13. Pichia-suvun kannan olennaisesti puhdas viljelmä, tunnet-tu siitä, että kanta on transformoitu ilmentämisvektorilla, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen DNA-ketjun. il 95929

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen Pichia-suvun kannan olennaisesti puhdas viljelmä, tunnettu siitä, että kanta on transformoitu plasmideilla, jotka on valittu seuraavista: pBSAG5 (NRRL B-18028), pBSAG5I ja pBSAGI5I (NRRL B-18021) valitulla plasmidilla, kuten ne on määritelty patenttivaatimuksessa 12.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen oleellisesti puhdas viljelmä, tunnettu siitä, että mainittu kanta on suvusta Pichia pastoris.

16. Menetelmä hepatitis B -viruksen pinnan antigeenin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 11 mukaisella plasmidilla transformoitua hiivakantaa viljellään ravintoalustassa, jonka käsittämä vähintään yksi hiilen ja energian lähde valitaan metanolista ja hiilen lähteestä, joka ei saa aikaan kataboliittista tukahtumista.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu Pichia-kanta, joka kykenee kasvamaan metanolissa, joka on hiilen ja energian lähteenä, on Pichia pastoris GS 115.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu Pichia-kanta, joka kykenee kasvamaan metanolissa, joka on hiilen ja energian lähteenä, on Pichia • <' pastoris GS 190.

19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoitu Pichia-kanta on Pichia pastoris PPF l.

20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu sii- . tä, että (a) patenttivaatimuksen 11 mukaisella plasmidilla transformoitua hiivakantaa viljellään ravintoalustassa, joka sisältää vähintään yhden kataboliittista tukahtumista aiheuttavan hiilen ja energian lähteen, ja (b) vaiheessa (a) saatu tuote siirretään olosuhteisiin, joissa hiilen lähde ehtyy. 95929

21. Jonkin patenttivaatimuksen 16-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi hepatitis B -viruksen pinnan antigeenin eristämisen ja puhdistamisen.

22. Plasmidi, joka on käyttökelpoinen ilmentämisvektoreiden muodostamiseen hepatitis B -viruksen pinnan antigeenin tuottamiseksi Pichia-hiivan primäärisen alkoholin oksidaasin (A0X1) säätelevien alueiden säätelyn alaisuudessa, joka alue on saatavissa kloonista pPG4.0 (NRRL B-15868) 5'-EcoRI-restriktio-kohdasta 3'-Sall-restriktiokohtaan, jossa lähtöplasmidia pPG2.5, joka sisältää mainitun säätelevän alueen, käsitellään BamHI:llä, Bal31:llä, Klenow-ligaasilla ja ligatoidaan EcoRI-linkkereihin, jolloin saadaan kuvan 4 mukainen plasmidi pAOP2.