KR920004050B1 - B형 간염 표면 항원 및 신규 dna 단편 및 그의 제조방법 - Google Patents

B형 간염 표면 항원 및 신규 dna 단편 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 표면 항원 및 신규 DNA 단편 및 그의 제조방법
제 1 도는 피치아(Pichia) 디히드록시아세톤 합송효소 유전자(DAS) 조절지역의 제한지도이다.
제 2 도는 제 1 피치아 알콜 산화효소 유전자(AOX1) 조절 지역의 제한지도이다.
제 3 도는 피치아 p40 유전자 조절지역의 제한지도이다.
제 4 도는 플라스미드 pAOP2의 제한지도이다.
제 5 도는 플라스미드 pBSAG5와 pBSAG5I의 조립에 관한 개요를 제공해준다.
제 6 도는 플라스미드 pHBS-5의 제한지도이다.
제 7 도는 플라스미드 pAOT-1의 제한지도이다.
제 8 도는 플라스미드 pYJ33의 제한지도이다.
제 9 도는 플라스미드 pSAOH5와 pTHBS3으로부터 플라스미드 pYM39을 조립하는 과정을 예증해준다.
제 10 도는 플라스미드 pYM39와 pPG3.2로부터 플라스미드 pYMI6을 조립하는 과정을 예증해준다.
제 11 도는 pYMI6과 pBSAG5I로부터 플라스미드 pBSAGI5I를 조립하는 과정을 예증해준다.
제 12 도는 플라스미드 pBSAG5I의 일부분을 피치아 염색체의 제 1 알콜 산화효소(AOX1) 좌위속에 삽입하는 과정을 예증해준다.
제 13 도는 플라스미드 pTHBS3의 조립에 관한 개요를 제공해준다.
본 발명은 B형 간염 표면 항원을 생산하기 위하여 재조합 DNA 기술을 이용하는 것에 관한 것이다. 한가지 특색에 있어서, 본 발명은 효모속에서 B형 간염 표면 항원을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 특색에 있어서, 본 발명은 B형 간염 표면 항원을 암호화하는 신규의DNA 조립물(constructs)에 관한것이다. 다른 특색에 있어서, 본 발명은 전술한 DNA 조립물에 의하여 형질 전환된 신규의 유기체에 관한 것이다.
최근 재조합 DNA 기술이 발전됨에 따라, 막대한 종류의 유용 폴리펩티드들을 미생물에 의하여 조절 생산하는 것이 가능하게 되었다. 예컨대 인간의 성장 호르몬, 백혈구 인터페론, 인간의 인슐린 및 인간의 프로인슐린과 같은 많은 진핵 폴리펩티드들이 이미 미생물에 의하여 생산되어 왔다. 이미 연구중인 계속되는 기술 응용에 의하면, 장래에는 다른 각종 유용 폴리펩티드 생성물들이 미생물에 의하여 생산될 수 있을 것으로 예기된다. 그와같이 유용한 폴리펩티드 생성물중의 하나가 B형 간염 표면 항원이다.
B형 간염(혈청 간염)비루스는 인간들 사이에서 옮겨지며, 그 자체가 만성적 쇠약화 전염병으로서 나타나는데, 이 병은 점차적으로 격심한 간 손상을 일으키고 원발성 암을 일으키며 끝내는 죽음에 까지 이르게한다. 대부분의 경우에 있어, B형 간염 전염병으로부터의 완전한 회복은 예기될 수 있는 일이다. 그러나, 특히 다수의 아프리카와 아시아 국가에서는 인구의 많은 부분이 이 질병을 전국적으로 옮길 수 있는 위험한 잠재성을 지닌 만성 보균자들이다.
B형 간염의 효과적인 예방법은, 통상 고도로 정제된 B형 간염 표면 항원인 B형 간염 비루스 왁찐을 투여하는 것이다. 그러한 B형 간염 비루스 왁찐은 비루스에 전염되는 것을 예방하는데 효과적이다. 특히 높은 위험도를 갖는 그룹은 수혈이나 투석 처리를 요하는 사람들, 그러한 그룹과 함께 일하는 의료 요원등이다. 또한 그러한 왁찐은 새로운 보균자의 발생을 방지하는데에도 효과적이므로, B형 간염 비루스를 지상에서 완전히 제거하는 것이 가능할 수 있다.
B형 간염 비루스는 세포 배양물내에서 전염성이 없었으므로, 오직 전염된 인간이나 고등 영장동물로부터만 얻어질 수 있다. 그래서, B형 간염에 대한 면역용 항원을 생산하는데 사용되는 B형 간염 비루스의 충분한 공급물을 얻고 유지하기 위한 수단의 이용이 가능하지 않았었다.
B형 간염 비루스 왁찐은 B형 간염 비루스 보균자의 혈장으로부터 B형 간염 표면 항원을 분리해내고 정제함으로써 제조되는 것이 보통이다. 그러나 정제되는 혈장속에는 요구되는 항원이 매우 낮은 농도로만 존재하기 때문에 그러한 정제는 극도로 효율적으로 수행되어야 한다. 그러므로 지금까지는 소요의 B형 간염 비루스 왁찐을 산업상의 규모로 제조하기가 매우 어려웠었다.
본 발명에 따라, 메탄올, 비-이화물질 억제(non-catabolite repressing) 탄소원 및 탄소원 기아 현상에 반응하는 조절지역(regulatory regions) 조절하의 B형 간염 표면 항원 코우딩 서열로 이루어진 DNA 조립물에 의하여 형질전환이 된 효모 세포를 배양함으로써, B형 간염 표면 항원이 높은 수율로 생산될 수 있다고 밝혀졌다.
첨부된 도면에서는, 사용된 제한 효소를 나타내기 위하여 다음과 같은 약어를 사용하였다.
Figure kpo00001
도면에 있어서, DNA 단편의 조작을 위해 사용되지만 연결(ligation)시에는 파괴되는 제한 자리들은 그 파괴 자리에 대한 약어를 괄호안에 넣어 표시하였다.
본 발명에 따르면, (1) B형 간염 표면 항원 또는 그의 일부를 암호화하는 폴리펩티드 코우딩 지역과, (2) 그 폴리펩티드 코우딩 유전자의 5'-말단에 위치했을때 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있는 조절지역으로 이루어진 신규의 DNA 단편이 제공된다. 조절 지역과 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 유전자와 전사종결 단편과의 조합을 이제부터는 발현 카세트 또는 발현 단위라 부르기로 한다. 본 발명을 실시하는데 사용된 조절지역은 하기 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)에서 선택되는 최소한 한가지 조건에 대하여 반응한다.
(ⅰ) 그 발현 카세트를 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 메탄올의 존재 ; (ⅱ) 그 발현 카세트를 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속에서의 메탄올 이외의 비-이화물질 억제 탄소원의 존재 ; (ⅲ) 그 발현 카세트를 함유한 숙주 유기체를 이화물질 억제 탄소 및 에너지원상에서 배양한 후 그 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속에서의 탄소원 기아현상.
더 나아가, 본 발명에 따르면 전술한 발현 카세트를 함유한 신규의 선형 및 환형 플라스미드가 제공된다.
한층 더 나아가, 본 발명에 따르면 전술한 선형 또는 환형 플라스미드로 인하여 형질이 전환된 효모 균주의 본질상 순수한 배양물이 제공된다.
본 발명의 또다른 특색에 따르면, 원하는 단백질 생성물의 발현이 얻어지는 조건하에서 전술한 플라스미드로 인하여 형질전환된 효모균주를 배양하는 것으로 구성되는, B형 간염 표면 항원의 제조방법이 기술된다.
본 발명을 실시하는데 사용된 조절지역은 하기 (1), (2) 및 (3)을 함유하는 배지에 대하여 반응하는 능력을 그 특징으로 한다.
(1) 메탄올, (2) 예컨대 글리세롤, 갈락토스, 아세테이트등의 비-이화물질 억제 탄소원, (3) 예컨대 글루코스, 에탄올, 프럭토스등의 이화물질 억제 탄소원에 뒤이은 탄소원 기아현상.
상기 기준을 만족시키는 예시적 조절 지역들이 제 1, 2 및 3 도에 나와있는 제한지도에 의하여 묘사되어 있다. 제 1 도에 묘사된 조절지역은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 디히드록시아세톤 합성효소(DAS) 유전자에서 유래된 것이다. 제 2 도에 묘사된 조절지역은 피치아 파스토리스의 제 1 알콜 산화효소(AOX1)에서 유래된 것이다(피치아는 본 명세서내에서 AOX1 및 AOX2라고 일컬어지는 두가지의 알콜 산화효소 유전자를 갖고 있다). 제 3 도에 묘사된 조절지역은 피치아 파스토리스의 p40 유전자로부터 유래된 것이다. 당분야에 통상의 지식을 가진자라면, 전술한 성질을 갖는 다른 조절지역들이 예컨대 피치아 파스토리스 같은 메틸로트로픽 효모로부터 분리될 수 있다는 것을 잘 알 수 있을 것이다. 전술한 조절지역의 성질들과 유사한 조절 성질들을 갖는 그같은 추가의 조절지역들도 본 발명의 의도내에 포함된다.
B형 간염 표면 항원(HBsAg) 유전자는 이전에 분리되었으며[발렌쥬엘라 일행(1979)의 Nature 280,815 참조], 예컨대 pHBS-5[제 6 도 및 발렌쥬엘라 일행(1982)의 Nature 298,347참조], pHBV-T 1A(게넨 테치의 EPA 73,657), pHBS-56(ATCC 기탁번호 40,047 ; EPA 120,551 참조)등의 각종 벡터를 적합한 제한 효소로 처리함으로써 이용이 가능하다.
B형 간염 표면 항원 유전자는, Bal 31 엑소뉴클리아제로 처리하여 간염 유전자의 5'-말단에 있는 비루스 비(非) 코우딩 서열을 제거함으로써 개조되었다. HBsAg 유전자의 3'-말단은 엔도뉴클리아제로 소화시키고 링커를 첨가하여 간염 유전자의 3'-말단에 있는 비루스 비코우딩 서열을 제거함으로써 개조되었다. B형 간염 표면 항원 유전자는 DNA 단편의 조작을 위한 편리한 제한 자리가 통합되도록 더 개조되었다. 이렇게 하여 만들어진 DNA 단편은 EcoR I-Stu I 삽입물이며, 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
5'-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC
TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT
CCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT
CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA
ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG
TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG
CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA
TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC
CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG
GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT
CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG
AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC
GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT
GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG
GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG
TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT
TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA
CATTTAAGGC CT-3'
본 발명의 제한지역-구조 유전자 조립물은 증식, 재생산 및 여러가지 방법으로의 발현을 위하여 유기체에게 공급될 수 있다. 효모내에서의 자율 복제를 위하여는, 자율 복제 서열(ARS) 요소가 유용하다. 그 예로써, 피치아 파스토리스로부터 유래된 PARS1 및 PARS2가 있다[동시 계류중인 미합중국 출원 SN 666,577(발명자 : 크레그, 양수인 : 필립스 페트롤리움 캄파니) 참조]. 숙주의 통합(integrative) 형질전환이 대신 요구되는 경우에는 ARS 요소가 사용되지 않을 것이다. 통합 형질전환을 성취시키기 위하여 바람직한 방법은 동시 계류중인 특허출원 일련번호 791,013(발명자 : 크레그, 양수인 : 필립스 페트롤리움 캄파니)에 기술되어 있으며, 첫번째 삽입(insertable) DNA 단편, 선택성 표시(marker) 유전자 및 두번째 삽입 DNA 단편으로 구성된 자리-지적 통합 벡터를 사용하는 방법이다.
첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은 각각 그 길이가 약 200개 이상의 뉴클레오티드에 상당하며, 피치아속에 속한 종의 게놈 DNA 부분들과 상동하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 통합 벡터의 여러가지 성분들은 발현 카세트와 선택성 표식 유전자가 첫번째 삽입 DNA 단편의 3' 말단과 두번째 삽입 DNA 단편의 5' 말단 사이에 위치하도록 DNA의 선형 단편을 이루면서 연속적으로 배치되어 있다. 첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은, 피치아 게놈속에서의 배향과 같이, 서로에 대하여 연속적으로 배치된 선형 단편으로 베향되어 있다.
숙주 균주를 형질전환시키기 위해서는 한개 이상의 선택성 표식 유전자를 DNA 속에 포함시켜야만 한다. 이렇게 하면 형질전환용 DNA가 통합된 유기체의 선택 및 분리가 수월해진다. 표식 유전자는 숙주가 갖고 있지 않던 표현형 특색을 형질전환된 유기체에게 부여해준다(예 : 형질전환되지 않은 숙주 균주가 특수 아미노산 생합성 경로에 있어서 결합을 갖고 있는 경우 그 특수 아미노산을 생산하는 능력을 회복시킴).
당업자라면 잘 알 수 있듯이, 추가의 DNA 서열들, 예컨대 박테리아 플라스미드 DNA , 박테리오파아지 DNA 및 그와 유사한 것들을 본 발명을 실시하는데 사용된 벡터속에다 통합할 수도 있다. 그러한 서열들은 이들 벡터가 박테리아 균주속에서 증식되고 유지될 수 있게끔 해준다.
전술한 본 발명의 플라스미드는 형질전환될 수 있는 효모균주속에서 실용성을 갖는다. 본 발명의 신규 DNA 단편에 의한 효모속에서의 유전자 발현 조절은 형질전환된 유기체가 탄소원 기아현상을 겪도록 함으로써 성취될 수 있다. 여러가지의 이화물질 억제 탄소원과 비-이화물질 억제 탄소원상에서 배양한 후 탄소원 기아현상이 일어나도록 하면, 본 발명의 조절지역의 조절하에 유지된 유전자 생성물의 발현이 유도된다. 형질전환된 효모의 적합한 종(種)속에서 원하는 유전자 생성물을 발현시키기 위한 또다른 방법은, 형질전환된 효모를 메탄올상에서 배양하는 것이다. 원하는 유전자 생성물의 발현을 유도하는 또다른 방법은, 형질전환된 효모를 비-이화물질 억제 탄소원이 들어있는 배지위에서 배양하는 것이다.
본 발명의 조절지역들은 여러가지 조건하에서 유도된다고 밝혀졌으므로, 본 조절지역들은 모든 효모 균주내에서의 발현에 유용하다. 따라서 메탄올 위에서 혹은 비-이화물질 억제탄소원위에서 생장할 수 있는 효모들은 외래, 즉 이종 폴리펩티드가 직접 생산되게끔 하는 한편, 이화물질 억제 탄소원 위에서 생장할 수 있는 효모들은 그렇게 배양된 효모세포에게 탄소원 기아 현상의 조건을 가함으로써 외래 폴리펩티드가 생산되게끔 한다.
본 발명의 공정에 있어 바람직한 형질전환 효모균주의 예로써, 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로프시스(Torulopsis), 피치아(Pichia), 및 클로이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 속(屬)에 속한 멤버들이 포함된다. 이들 속으로부터 유래된 효모들은 그의 취급 안정성, 배양조건등이 잘 확립되어 있고 당업자들에게 공지되어 있으므로 바람직하다.
본 발명의 공정에 대한 한가지 실시형태에 사용되기 위한 특히 바람직한 효모 균주는 탄소 및 에너지원로서의 메탄올 위에서 생장할 수 있는 것들이다. 메탄올위에서 생장할 수 있는 것으로 알려진 효모중에는 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로프시스(Torulopsis), 및 피치아(Pichia)와 같은 속의 멤버들이 포함된다.
또한 본 발명의 조절지역은 비-이화물질 억제 탄소원위에서 뿐만 아니라 탄소원 기아현상의 조건에서 배양함으로써 유도될 수도 있으므로, 글루코스, 아세테이트, 글리세롤, 에탄올, 락토스 갈락토스, 프럭토스, 수크로스등과 같은 비-메탄올성 기질 및 이들중 둘 이상이 모인 혼합물은 본 발명을 실시하는데 있어 역시 유용한 것들이다. 숙주 유기체를 적합한 비-이화물질 억제성, 비-메탄올성 탄소원(예 : 글리세롤 또는 갈락토스)위에서 배양함으로써, 혹은 숙주 유기체를 적합한 이화물질 억제성 탄소원(예 : 에탄올, 글루코스 및 프럭토스)위에서 배양한 후 이 숙주 유기체가 탄소원 기아현상을 겪도록 함으로써, 본 발명의 조절지역의 조절하에서 유전자 생성물이 발현될 수 있다.
특히 바람직한 숙주 효모 균주는 히스티딘 생산능력이 결여된 변이주인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115(KFCC-10359 : 1987. 4. 22일 기탁)이다. GS115는 히스티드놀 탈수소효소-코우딩 유전자에 영향을 주는 히스티딘 경로에 있어서의 결함으로 말미암아 변이주 유전자형 his4를 갖는 것으로서 명명되어 왔다. GS115는 피치아 파스토리스 NRRL Y-11430으로부터 유래되며, 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날 리서치 센터에 기탁되었으며, NRRL Y-15851이라는 기탁번호가 주어졌다. 이같은 특별한 숙주는 히스티딘 경로에 결함이 있는 영양 요구 변이주이기 때문에 유용한 것이다. 다른 DNA 서열중에서도 HIS4 유전자 기능을 암호화하는 서열을 갖고 있는 벡터로 이 숙주를 형질전환시키면 형질전환된 숙주를 편리하게 선택할 수 있게 된다.
본 발명을 실시하는데 사용되기 위한 또다른 바람직한 효모균주는 아르기니노숙시네이트 리아제 코우딩 유전자에 영향을 주는 아르기닌 경로에 결함이 있는 변이주 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) GS190(KFCC-10357 : 1987. 4. 22일 기탁)이다. GS190은 피치아 파스토리스 NRRL Y-11430으로부터 유래되며, 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날 리서치 센터에 기탁되었으며, NRRL Y-18014라는 기탁번호가 주어졌다.
또다른 바람직한 숙주 효모 균주는 이중 영양요구 변이주 PPF1인데, 히스티딘 경로와 아르기닌 경로에 결함이 있는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) PPF1(KFCC-10364 : 1987. 4. 22 기탁)은 히스티디놀탈수소효소 코우팅 유전자에 영향을 주는 히스티딘 경로와 아르기니노숙시네이트 리아제 코우팅 유전자에 영향을 주는 아르기닌 경로에 결함이 있다. PPF1은 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날 리서치 센터에 기탁되었으며, NRRL Y-18017이라는 기탁번호가 주어졌다.
또한 에세리히아 콜리(Escherichia coli)는 본 발명의 플라스미드를 위한 적합한 숙주이다. 당업자라면, 다수의 E. 콜리 균주가 적합한 숙주라는 것을 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명의 작업에 사용된 몇가지 균주를 요약해보면 다음과 같다.
Figure kpo00002
피치아 파스토리스를 형질전환시키기 위한 실험 과정은 이전에 기술된 바 있으며, 이제 아래에서(실시예 I)보다 더 상세히 제시될 것이다.
피치아 파스토리스는 세포벽을 효소로 소화시켜 스페로플라스트를 얻은후 ; 스페로플라스트를 형질전환용 DNA와 혼합하고, 칼슘이온과 폴리에틸렌글리콜 존재하에 배양한 다음, 히스티딘이 결여된 선택 생장 배지속에서 재생시킴으로써 형질전환나시킬 수 있다.
형질전환용 DNA 중에는, 숙주 균주속에 결여되어 있는 HIS4 유전자가 포함되며, 이런경우, 형질전환된 균주만이, 사용된 선택 생장배지위에서 살아남는다.
단세포 재조합 숙주로부터 이종 단백질을 추출하는데 이용될 수 있는 수많은 방법들을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 세포를 파괴하고 파괴된 세포로부터 단백질을 농축 및 /또는 추출하기 위한 당업자에게 공지된 그 어떤 기술이라도, 본 발명에 따라 생산된 HBsAg를 회수하는데 적합한 것이다.
형질전환된 세포들은 전술한 바와 같이 발현을 위한 적절한 조건하에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 파괴한 후, 가용성 분류물과 불용성 분류물에 대한 HBsAg 분석을 하였다. 가용성 분류물에 대해서는 상업상 이용가능한 "AUSRIA
Figure kpo00003
II" 분석 키트(아보트 연구소)를 사용하여 22nm 입자 분석을 하였다. 가용성 분류물 및 불용성 분류물에 대하여 웨스턴 블로팅 과정을 이용함으로써 단량체 분석을 하였는데, 이때 사용된 것은 방사능 125 I-표지 단백질 A와 단량체 형태의 HBsAg에 대항하여 생긴 항혈청이었다.
이제 다음과 같은 비제한적 실시예에 따라 본 발명을 보다 더 상세히 기술하고자 한다.
[실시예]
실시예 전반에 걸쳐서, 다음과 같은 의미를 갖는 약어들이 사용되었다.
SDS 황산도데실나트륨
EDTA 에틸렌디아민사초산
TEMED N, N, N', N'-테트라메틸렌디아민
DTT 디티오트레이톨
BSA 소의 혈청 알부민
EtBr 브롬화에티듐
PMSF 페닐메틸설포닐 불화물
Ci 퀴리
자이몰리아(zymolyase) 60,000 공급처 : 마일즈 연구소
하기 실시예들에서 사용된 완충액과 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다.
1M 트리스 완충액 H2O 800mL내의 트리스염기 121.1g ; 농축(35%) 수
성 HCl을 첨가함으로써 pH를 원하는 값으로 조절함 ;
용액을 실온으로 식히고, 최종 pH를 조절한후 최종 부
피가 1L 되도록 희석함.
TE 완충액 0.01M(pH 7.4) 트리스 완충액내의 1.0mM EDTA
PBS(인산염-완충식염) 10mM 인산나트륨(pH 7.0) 0.15M NaCl
SDS 겔 충전 62.5mM 트리스-HCl(pH 6.8)
(loading) 완충액
2% SDS
10% 글리세롤
100mM 디티오트레이톨
0.001% 브로모페놀블루
YPD 배지 1% 박토-효모 추출물
2% 박토-펩톤
2% 덱스트로스
SD 배지 아미노산이 결여된 효모 질소염기 6.75g
(DIFCO)
2% 덱스트로스
(물 1L내)
SED 1M 소르비톨
25mM EDTA
50mM DTT
SCE 완충액 소르비톨 9.1g
구연산나트륨 1.47g
EDTA 0.168g
H2O 50mL
(HCl을 사용하여 pH를 5.8로 조절)
CaS 1M 소르비톨
10mM CaCl2
(여과멸균)
PEG 용액 20% 폴리에틸렌글리콜-3350
10mM CaCl2
10mM 트리스-HCl(pH 7.4)
(여과멸균)
SOS 1M 소르비톨
0.3×YPD 배지
10mM CaCl2
기초염(basal salt) 조성물(형질전환된 피치아의 발효조내 배양을 위한것)
Figure kpo00004
다른 언급이 없는한, 상기 용액들은 기본(1X)농도로 사용되었음을 나타낸다. 실시예 전반에 걸쳐, 다른 농도 수준이 사용되는 경우에는 그 용액을 기본(1X)노도의 배수로서 나타내었다.
[실시예 I]
피치아 파스토리스 형질전환 과정
[A. 세포배양]
1. 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851)의 콜로니를 YPD 배지 10mL속에 접종하고, 배양물을 30℃에서 12-20시간동안 진탕한다.
2. 약 12-20시간이 지난후, 세포들을 약 0.01-0.1의 OD600으로 까지 희석하고, 30℃의 YPD 배지속에서 약 6-8시간동안 대수증식기로 유지시킨다.
3. 약 6-8시간이 지난후, YPD 100mL에다 OD600이 약 0.1인 종균 0.5mL(또는 그에 해당하는 양)을 접종한다. 12-20시간동안 30℃에서 진탕을 한다.
4. OD600이 약 0.2-0.3일때 1500g에서 5분간 원심분리시킴으로써 배양균을 거두어 들인다.
[B. 스페로플라스트의 제조]
1. 세포를 무균수 10mL속에서 한번 세척한다.(단계 1-5에 있어서의 모든 원심분리는 1500g에서 5분간 수행한다.)
2. 세포를 새로이 제조된 SED 10mL속에서 한번 세척한다.
3. 세포를 무균 1M 소르비톨 10mL속에서 두번 세척한다.
4. 세포를 SCE 완충액 10mL속에서 재현탁시킨다.
5. 4mg/mL 자이몰리아제 60,000(마일즈연구소) 5-10μL을 첨가하고, 세포를 30℃에서 약 30-60분간 배양한다.
형질전환 과정에 있어서 스페로플라스트의 제조는 중요한 단계이므로, 스페로플라스트의 생성을 다음과 같이 조절하여야 한다. 자이몰리아제를 첨가하기 전 혹은 바로후에, 그리고 배양기간중의 여러번에 걸쳐서, 세포의 부분표본 100μL를 5% SDS 900μL 및 1M 소르비톨 900μL에다 첨가한다. 세포가 SDS속에서는 용해되지만 소르비톨속에서는 용해되지 않는 점에서 배양을 중지한다(보통은 배양한지 30 내지 60분 사이임).
6. 1000g에서 5-10분간 원심분리시킴으로써 스페로플라스트를 무균 1M 소르비톨 10mL속에서 세척한다. (원심분리 시간 및 속력은 여러가지 일 수 있다. 원심분리는 스페로플라스트들이 펠릿화되기에는 충분해야 하지만, 이들이 그 힘에 의해 파열될 정도가 되어서는 않된다.)
7. 세포를 무균 CaS 10mL속에서 한번 세척한다.
8. 세포를 CaS 총 0.6mL속에서 재현탁 시킨다.
[C. 형질전환]
1. DNA 샘플(20μL 이하의 부피)을 12×75mm의 무균 폴리프로필렌 튜브속에 집어넣는다. (DNA는 물 또는 TE 완충액속에 있어야 한다. 소량의 DNA를 사용하여 최대의 형질전환 빈도를 얻기 위해서는 각각의 샘플속에 5mg/mL의 음파처리 E. 콜리 DNA 약 1μL을 첨가함이 타당하다.)
2. 스페로플라스트 100μL을 각각의 DNA 샘플속에 첨가하고, 실온하에 약 20분간 배양한다.
3. PEG 용액 1mL을 각각의 샘플속에 첨가하고, 실온하에 약 15분간 배양한다.
4. 세포를 1000g에서 5-10분간 원심분리시키고, PEG 용액을 경사분리시킨다.
5. 샘플을 SOS 150μL속에 재현탁시키고, 실온하에 30분간 배양한다.
6. 무균 1M 소르비톨 850μL을 첨가하고, 샘플의 부분표본을 플레이팅(plating)한다. (아래의 기재사항 참고).
[D. 스페로플라스트의 재생]
1. 재생 한천 배지에 대한 처방
a. 한천-KCl : 박토-한천 9g, KCl 13.4g, H20 240mL,가압멸균.
b. 10X 글루코스 : 텍스트로스 20g, H20 100mL 가압멸균.
c. 10X SC : 아미노산이 결여되어 있는 효모 질소염기 6.75g, H20 100mL, 가압멸균. (가압멸균 전이나 후에, 요구되는 아미노산 또는 핵산을 200μg/mL의 농도에 이르기까지 첨가한다.)
d. 10X 글루코스 30mL과 10X SC 30mL을 용해된 한천-KCl 용액 300mL속에 첨가한다. 0.2mg/mL의 비오틴 0.6mL 및 요구되는 다른 아미노산 또는 핵산을 20μg/mL의 농도로 첨가한다. 용해된 재생 한천을 55-60℃에서 유지시킨다.
2. 형질전환된 샘플의 플레이팅 : 형질전환 샘플이 준비되기 최소한 30분 전에, 평판 한개당 재생 한천 10mL로 이루어진 바닥 한천 층을 쏟아 붓는다. 형질전환 샘플이 SOS내에 있는 기간동안, 재생 한천의 10mL 부분표본들을 45-50℃의 욕조내에 있는 튜브돌속에 분배한다. 다량의 각 샘플을, 45-50℃에서 유지시킨 용해된 재생한천의 10mL 부분표본들속에 첨가하고, 재생 한천의 고형 10mL 바닥 한천층이 들어있는 평판위에다 그 각각을 쏟아 붓는다.
3. 스페로플라스트 제제의 품질측정 : 10μL의 샘플 하나를 꺼내어 1M 소르비톨 990μL에다 첨가함으로써 100배 희석한다. 100배 희석물중에서 10μL을 꺼내어 1M 소르비톨의 두번째 990μL 부분표본에다 첨가함으로써 다시 100배 희석한다. 그 두 희석물의 100μL 부분표본들을 YPD 한천 배지위에 펴발라서, 제제속에 남아있는 스페로플라스트화 되지않은 온전한 세포의 농도를 측정한다. 각각의 희석물 100μL을, 40μg/mL의 히스티딘이 보충된 재생한천 10mL에다 첨가하여, 재생가능한 전체 스페로플라스트를 측정한다. 형질전환 실험에 대한 우수한 값은, 재생가능한 전체 스페로플라스트가 1-3×107/mL이고, 온전한 세포가 1×103/mL인 경우이다.
4. 평판을 30℃에서 3-5일간 배양한다.
[실시예 II]
[pAOP2 족(family)벡터의 조립]
1. 플라스미드 pPG2.5(플라스미드 pPG4.0으로부터의 약 2.5Kbp EcoR I-Sa1I 단편을 함유하는 pBR322-기제 플라스미드 ; 이 플라스미드는 제 1 알콜 산화효소 유전자(AOX1)와 조절지역을 갖고 있으며, 1987. 4. 22일자 E. 콜리 LF 392-pPG4.0으로 KFCC-l0358호로 기탁되고 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날 리서치 센터로부터 이 콜리숙주내에서 NRRL B-15868로서 입수가능함)를 BamH I 로 소화시켰다.
2. 선형으로 된 플라스미드를 BAL31로 소화시켰다.
3. 생성된 DNA를 클레나우(Klenow)단편으로 처리하여 무딘말단(blunt ends)을 향상시키고 EcoRI 링커(linker)에다 연결하였다.
4. 연결 생성물을 E. 콜리 균주 MM 294속으로 형질전환 시켰다.
5. 하기 서열의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 클로니 하이브리드화 기술에 의하여 형질전환체들을 선별시험하였다 :
5'TTATTCGAAACGGGAATTCC
상기 올리고뉴클레오티드는 ATG 개시 코오돈에 이르기까지 AOX1 프로모터 서열을 함유한다(그 코오돈을 포함하지는 않음). 이때 상기 서열은 EcoRI 링커의 서열에 융합되어 있다.
6. 양성 클론(clones)의 배열을 막삼-질버트 기술에 의하여 결정하였다. 모든 세 양성 클론들은 다음과 같은 서열을 가졌다.
5'...TTATTCGAAACGAGGAATTCC...3'
이들 모두는 ATG의 "A"를 보유하였다(상기 서열속에 밑줄이 그어져 있음). 이 A는 아마도 유해한 것이 아닐것이라고 결정되었으므로, 뒤이은 모든 클론들은 이들 양성 클론들의 유도체이다. 이 클론들에게는 각기 pAOP1, pAOP2 및 pAOP3라는 실험실 명칭이 주어졌다.
7. 다른 두 클론은 BAL31/링커-연결 생성물의 선별 시험에 의하여 동정하였다. 이들은 다음과 같은 서열을 갖는다.
5'...TAATTATTCGGAATTCC...3'
pAOX 1 ECoRI
이 클론들에게는 pAOP5와 pAOP6이라는 명칭이 주어졌다.
상기 과정의 한가지 변형으로서, pPG2.5를 BamH I 대신 AsuII로 자르고, 선형으로 된 단편을 클레나우 단편으로 처리하고(위에서 실시한 것과 같은 BAL 31 처리는 하지 않음), EcoRI 링커에다 연결하였다. 생성된 플라스미드 속에서 AOX1 프로모터 서열이 들어있으며 ATG 개시 코오돈은 부재한다. 이렇게하여 만들어진 플라스미드를 pAOP4라고 이름지었으며, 그 서열은 다음과 같다.
5'...TAATTATGGAATTC...3'
pAOX1 EcoRI
AOX1 프로모터(pAOX1)는 효소 합성의 격심한 중지에 의한 탄소 이화물질 억제에 대하여 반응을 한다. 또한 AO 프로모터는 탄소 기아현상에 대하여 반응을 한다. 메탄올위에서의 배양에 의하면, AOXl 프로모터가 더 유도된다. 더우기, 본 발명에서 사용된 AOX1 프로모터 단편이 염색체내 AOX1 프로모터와 유사한 방식으로 조절된다는 것은 광범위한 연구들[예컨대 엘리스, 브루스트, 카우츠, 워터즈, 하폴드 및 진거라스에 의하여 문헌(분자 및 세포 생물학, 1985, 5, p.1111-1121)에 기술된 연구]에 의하여 자명해진다. 본 실시예에 기재된 바와같이 제조 및 분리된 각각의 를론은, AOX1 프로모터 그 자체가 그러하듯, 이와물질 억제, 탄소 기아현상 및 메탄올 유도에 대하여 반응을 한다.
[AO 종결자(terminator)에 대한 기재]
AO 종결자로서 사용된 Stu I-HindIII 단편 속에는 AOX1 mRNA 복제물의 폴리아데닐화용 주형을 제공하는 서열들이 들어있다. 이들 서열에는 다음과 같은 것이 포함된다.
TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-폴리아데닐화
stu I-HindIII 단편이 플라스미드 상에서 폴리펩티드 코우딩 지역에 대해 3'에 위치할 경우, RNA의 종결이 촉진된다. AOX1 종결 서열은 분리가 되어 있으며, AOX1 종결 서열이 들어있는 pBR322-기제 플라스미드인 pPG3.2로부터 회수될수 있다. E. 콜리 숙주속으로 형질전환시킨 이 플라스마드 E. 콜리 LE 392-pPG3.2(KCTC 8247P : 1987. 4. 30 기탁)는 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날리서치 센터에 NRRL B-15999라는 기탁번호하에 기탁이 되어 있다.
[실시예 III]
본 실시예의 주제인 플라스미드 제조를 위하여 사용된 단계들의 순서가 첨부도면 제 5 도에 요약되어 있다.
[pBSAG5와 pBSAG5I의 조립]
1. PCFL2의 조립
3'-말단에서 ATG의 TG가 없는 AOX1 프로모터를 함유한 벡터 pAOP2를 HinoII로 잘랐다. 이같은 프로모터-함유 DNA 단편을 분리해내고, 미리 HindIII으로 잘리우고 클레나우 단편으로 채워진 pBR322에다 연결하였다. 이러한 반응결과, 벡터 pCFL2가 만들어졌다.
2. pBSAOP2의 조립
PvuII자리가 Bg1II 자리로 대치된 pBR322인 pBR322-Bg1II를 EcoRI 및 Cla I으로 소화시켰다. 이러한 선형화 플라스미드와 pCFL2로 부터의 5'AOX1-함유 Cla I/EcoRI 단편을 연결반응에 의하여 결합시켰다. 생성된 벡터를 pBSAOP2라고 이름지었다.
3. pBSAG22의 조립
pBR322내의 EcoRI 자리속에 삽입된 HBsAg 유전자가 들어있는 플라스미드 pHBS-5[발렌쥬엘라 일행의 Nature 298. 347-350(1982)에 기재되어 있음 ; 제 6 도 참조]를 Cla I로 잘랐다. Bal31 엑소뉴클리아제를 사용하여 약 60개의 염기쌍을 양쪽 방향에서 제거하였다. 남아있는 DNA 단편을 BamHI로 소화시키고, 클레나우 단편을 채워넣었다. 연결을 시킨후, 200개 정도로 된 형질전환체의 푸울(pool)을 Nco I로 잘랐다. 선형으로 된 플라스미드들을 분리해내고 다시 연결하였다.
E. 콜리를 형질전환시킨 후, 모든 플라스미드중 약 10%(명칭 pBSAGl)가 새로이 만들어진 Nco I 자리를 가졌다. pBSAG1을 Nco I 로 소화시키고, 클레나우 단편을 채워넣고, BamHI로 소화시켰다. 이 플라스미드 단편을 미리 EcoRI로 소화되고 클레나우 단편이 채워지고 BamHI로 소화된 pBSAOP2에다 연결하였다. 생성된 벡터를 pBSAG22라고 이름지었다.
4. pBSAG4, pBSAG5, pBSAG5I의 조립
3'-AOX1 전사 종결 단편을 갖고있는 플라스미드 pAOT-1[pPG3.2(E. 콜리 숙주내에서 NRRL-B-l5999로서 입수가능)의 1.6kbp Sal I-HindIII 단편을 Sal I-HindIII 절단 PBR322 ΔEcoRI(즉, EcoRI 자리가 파괴된 pBR322 ; 제 7 도 참조)]에다 연결함으로써 유도된 pBR322-기재 플라스미드를 XbaI과 PstI로 잘랐다. 종결자-함유 단편을, 미리 XbaI 및 PstI로 잘리운 pBSAG22에다 연결하여 pXP-1을 얻었다. pBSAG22를 DraI로 소화시킨후 StuI 링커를 첨가하고, 최종적으로는 StuI과 EcoRI을 사용하여 더 소화시켰다. HBsAg 구조 유전자를 분리해내고, 미리 StuI 및 EcoRI로 잘리운 pXP-1에다 연결하여 pBSAG4를 얻었다.
pBSAG4로 부터의 ClaI 단편을 함유한 HBsAg를 pYJ33의 독특한 ClaI 자리(제 8 도 참조)에다 연결하여 pBSAG5와 pBSAG5I을 얻었다. 플라스미드 pBSAG5I의 제한지도가 제 1l 도에 나와있다. 플라스미드 pBSAG5와 pBSAG5I는 5'-AOX1/HBsAg/3'-AOXl 발현 카세트를 함유한 ClaI 단편의 방위(orientation)에 있어서만 다르다. pBSAG5에 있어서는 5'-AOX1 단편이 피치아 HIS 4유전자에 인접해 있는 한편, 3'-AOXl 단편은 자율적 요소인 PARS2에 인접해 있다. E. 콜리 숙주속으로 형질 전환시킨 플라스미드 pBSAG5는 미합중국 농무성의 노던 리죠날리서치 센터에 기탁되어있다. E. 콜리 균주 MC1061-pBSAG5(KCTC 8250P : 1987. 5. 21기탁)에게는 NRRL B-l8028이라는 기탁번호가 주어졌다.
[실시예 IV]
[피치아 파스토리스 HBsAg 발현 숙주 GS115(pBSAGI5I)의 조립]
제 1 알콜 산화 효소 유전자(AOXl)가 피치아 염색체내의 B형간염 표면항원(HBsAg)유전자로 대치된 피치아 파스토리스 숙주의 제조과정이 본 실시예에 기술되어 있다.
P. 파스토리스 HBsAg 발현-Aox1-변이주 숙주를 생산하기 위하여 플라스미드 pBSAGI5I를 제 9-11 도에 요약된 바와같이 조립하였다. 이러한 조립에 있어서의 첫번째 단계는 Aox1 프로모터-LacZ 유전자 발현 벡터 pSAOH5와 Aox1 프로모터-HBsAg 발현 벡터 pTHBS3(아래에 기재되고 제 16 도에 개설된 바와같이 제조된것)을 제한 엔도뉴클리아제 HindIII으로 소화시키는 것이었다. PTHBS3을 제조하기 위하여, 플라스미드 pAOT-1(제 7 도 참조)을 Stu1로 자르고, EcoRI 링커와 연결한후 PstI로 소화시켰다. 3'-AOX1 단편이 들어있는 EcoRI-PstI로 소화시켰다. 3'-AOX1 단편이 들어있는 EcoRI-PstI 단편을 분리해냈다. 5'-AOXl 서열이 들어있는 벡터 pAOP3을 EcoRI과 SstI로 자르고, 생성된 5'-AOX1 단편을 미리 EcoRI와 SstI로 잘리운 E. 콜리-S. 세레비시에 셔틀(shuttle)벡터 pSEY101[더글라스 일행(1984)의 Proc. Natl. Acad, Sic. USA. 81, 3983-3987]에다 연결하였다. pAOP3 단편과 pSEY101 단편을 연결한 결과, 플라스미드 pTA020이 만들어졌다. 플라스미드 pTA020속에는 URA3 유전자와 암피실린 유전자(각각 S. 세레비시에와 박테리아내에서의 선택을 위한것), S. 세레비시에 내에서의 복제를 위한 2μ고리 및 5'-AOX1 서열이 들어있다.
플라스미드 pTA020을 PstI을 사용하여 부분적으로 잘랐다. 선형으로 된 벡터를 분리해내고 EcoRI로 잘랐다. 가장 큰 단편(2μ고리 서열, URA3 유전자 및 5'AOX1 단편이 들어 있는것)을 pAOT-1으로부터 얻어진 3'-AOX1 단편에다 연결함으로써 벡터 pTHBS1이 만들어졌다.
pHBS-5로 부터의 HBsAg-함유 EcoRI 단편을 EcoRI로 소화시킴으로써 분리해낸후, 미리 EcoRI로 소화되고 박테리아성 알칼리 포스파타제로 처리된 pTHBS1과 연결하였다. 생성된 벡터(명칭 : pTHBS2)는 3'-서열과 5'-AOX1 서열사이에 삽입된 HB sAg 유전자를 갖는다.
플라스미드 pYJ30(E. 콜리 숙주내에서 B-15890으로서 입수가능)을 EcoRI로 자르고, 클레나우 단편으로 채운후 PstI로 잘랐다.
P. 파스토리스 HIS4/PARS1-함유 단편을 분리해내고, 벡터 pTHBS2(AOX1 서열들이 측면에 있는 HBsAg 유전자를 함유함)로 부터의 PstI-SstI 단편과 연결하였다. 이렇게 연결하면 벡터 pTHBS3이 얻어진다.
pTHBS3을 HindIII으로 소화시켰을때 얻어진 1.4kbp의 단편(이 단편 속에는 HBsAg 유전자, AOX1 종결 서열 및 AOX1 프로모터 서열의 일부분이 들어있음)을 회수하고, pSAOH5로 부터의 7.7kbp 단편(피치아 HIS4 유전자, 대부분의 AOX1 프로모터 서열 및 pBR322로 부터의 서열이 들어있음)속에 삽입하였다. 복원된 AOX1 프로모터 서열이 들어있는 9.1kbp의 재조합 플라스미드 pYM39를 분리해냈다.
두번째 조립단계에서는, 플라스미드 pPG3.2(E. 콜리 숙주내에서 NRRL D-15999로서 입수가능)를 PvuII로 소화시키고, AOX1 유전자의 바로 3'에 있는 서열을 함유하는 1.5kbp 단편을 pYM39의 단일 NruI 자리에 삽입하였다. 10.6kbp의 재조합 플라스미드 pYMI6을 분리해냈는데, 이 플라스미드 속에는 3'AOX1 유전자 기부(proximal)서열이 벡터의 HIS4 유전자 부분을 향하도록 배양된 PvuII 단편이 들어있었다. 플라스미드 pYM16은 피치아 숙주로 부터 AOX1 유전자를 삭제하고 AOXl 프로모터 조절하에 HBsAg을 발현하는데 필요한 모든 성분을 갖고 있으나 pBSAG5의 트리밍(trimming)된 HBsAg 유전자 단편을 갖고 있지는 않다.
그러므로 마지막 조립단계는 원하는 HBsAg 유전자를 AOX1 유전자 삭제 벡터속에 재조합시키는 것이었다. 이를 위하여 pYMI6과 pBSAG5I(HBsAg 발현 카세트를 갖는 ClaI 단편이 반대로 배향되었다는 것외에는 pBSAG5와 동일한 플라스미드)를 제한효소 PstI과 SphI로 소화시켰다. pBSAG5I로 부터의 6.3kbp단편(트리밍된 HBsAg 유전자 발현 카세트와 피치아 HIS4 유전자가 들어있는 것)을 pYMI6으로부터의 4.6kbp 단편(3'AOX1 서열과 대부분의 pBR322이 들어 있는 것)에다 삽입하여, 10.9kbp의 최종 플라스미드 pBSAGI5I을 얻었다. 플라스미드 pBSAGI5I는 E. 콜리 숙주내에 넣어진 E. 콜리 MC 1061-pBSAGI5I (KFCC-10356 : 1987. 4. 22 기탁)로 이리노이주 페오리아시에 있는 미합중국 농무성의 노던 리죠날 센터에 기탁되었으며, NRRL B-18021이라는 기탁번호를 받았다.
P. 파스토리스 his4 변이주 균주 GS115(NRRL Y-15851)를 형질전환시키기 위하여, pBSAGI5I를 먼저 제한효소 Bgl II로 소화시켜 7.2kbp의 선형 벡터를 얻었는데, 이 벡터의 한쪽 말단에는 AOX1 유전자의 5'로부터 나온 서열 0.85kbp가 들어있고 다른쪽 말단에는 AOX1 유전자의 3'로 부터 나온 서열 1.1kbp가 들어있었다(제 12 도). 히스티딘 기본 유기영양성에 대한 선택을 함으로써, BglII로 절단된 pBSAGI5I 약 2μg을 GS115속으로 형질전환시켰다.
pBSAGI5I이 AOX1 염색체 좌위에 선형 분자로서 삽입된 형질전환으로 인하여, AOX1 유전자가 삭제되었다. 그러므로, 원하던 선형 삽입이 일어난 His+-형질전환 균주는 메탄을 위해서 매우 느리게 생장하는 것을 보고 동정하였다(P. 파스토리스는 제 2 의 "더약한"알콜산화효소 유전자 AOX2를 갖는데, 이 유전자는 제 1 알콜 산화효소 유전자가 결여된 균주속에서 느린 속도로 메탄올 생장을 하기에 충분한 알콜 산화효소를 생산한다).
메탄올 위에서 잘 생장할 수 없는 His+형질전환체의 동정과정중 처음단계는 선택 한천속에 묻힌 His+세포를 회수하는 것이었다. 이 회수단계는 한천을 20ml의 무균수가 들어있는 50mL짜리 튜브속으로 옮기고 브링크만 균등기를 사용하여 이 한천을 낮은 속도하에 30초간 분쇄함으로서 수행되었다. 혼합물을 가제를 통해 여과하여 무균수 30mL을 사용하여 한천을 헹구어줌으로써 한천 부스러기를 세포로 부터 분리시켰다. 그런다음 효모 세포들을 A600에서의 광학농도 0.1로 희석하고, 브랜슨 초음파 처리기를 4로 세팅시켜 놓고 10초간 음파처리하여 별도의 효모세포 덩어리를 부수고, 무균수를 사용하여 l00배 희석하였다. 10μL 및 100μL로 부분 표본을, 아미노산을 갖지 않는 효모 질소(Difco) 0.67%와 글루코스 0.1%가 함유된 한천 평판위에 펴발랐다. 30℃에서 3일간 배양한 후, 평판 위에 나타난 콜로니들에 대하여 메탄올 위에서의 생장능력을 선별시험 하였다. 이때 사용된 방법은, 아미노산이 결여된 효모 질소 0.67%가 들어있고, 1) 탄소원이 들어있지 않거나, 2)메탄올 0.5%, 또는 3)글로코스 2%가 탄소원으로서 들어있는 일련의 한천 플레이트상에 콜로니들을 복사 플레이팅하는 것이었다. 2%글루코스 상에서 생장한 콜로니들중에서 32%는 메탄올 위에서 잘 생장할 수 없었다.
pBSAGI5I 서열들이 제 12 도에 나와있는 것과 같이 삽입되었음을 확인하기 위하여, 메탄올 사용성에 결함이 있는 P. 파스토리스 균주들중의 어느 하나로부터 전체 DNA를 추출해내고, 제한 엔도뉴클리아제로 소화시키고, 서던 블롯법에 의하여 32p-표지 탐침과의 하이브리드를 만들었다. 한 세트의 서던 블롯에 있어서, Aox1-균주, GS115(pBSAGI5I)및 Aox1+스트레이닝(straining) GS115로 부터의 DNA들을 HindIII으로 소화시키고, 표지된 pPG 4.0(AOX1 유전자 및 pBR322로 부터의 서열로 이루어진 플라스미드이며, E. 콜리 숙주에 넣어진 채로 이리노이주 페오리아시에 있는 노던 리죠날 리서치 센터로 부터 NRRL B-15868로서 입수가능함)과의 하이브리드를 만들었다. AOX1을 암호화하는 2.3kbp의 단편이, GS115 DNA를 함유하는 레인속에서 관찰되었다. 그러나 GS115(pBSAGI5I)DNA를 함유하는 레인속에는 2.3kbp 단편이 부재하였으며 새로운 단편들이 나타났다. 이러한 결과는, AOX1 유전자가 GS115(pBSAGI5I)로부터 삭제되었음을 입증해주었다.
[실시예 V]
[HBsAg-암호화 벡터로 인하여 형질전환이 된 피치아 효모의 배양]
1. 발효조내에서의 GS115(pBSAG5)의 배양
l0% 접종물을 진탕 플라스크(30℃)내의 효모 질소(YNB)+2% 글루코스내에서 하룻밤 배양하였다. 이 접종물을 발효조속의 무균 기초염(pH를 4로 조절한것)에다 첨가하였다. 희석률을 0.05 내지 0.1h-l로 하여 글루코스 공급물을 첨가하였다. 세포 농도가 안정된 상태의 수준에 달하고 발효조의 글루코스 수준이 100ppm 미만에 근접했을때, 공급 탄소원을 메탄올 또는 50% 글루코스-50% 메탄올 혼합물로 바꿈으로써 HBsAg 생산이 유도되었다.
2. 발효조내에서의 GSlI5(pBSAGI5I)(Aox1-)의 배양
가용성 HBsAg 아우스리아(Ausria)활성(가용성 단백질 : 3-4%)의 최적 발현은, 이 Aox1-유기체를 글리세롤 위에서 뱃치식으로 배양한 후, 메탄올-함유 공급물 위에서 배양함으로써 성취된다. 접종물은 YNB+글리세롤 위에서 배양될 수 있다. 기초염과 글리세롤(1% 및 4% 글리세롤이 사용되었음)과 비오틴을 발효조내에서 가압 멸균할 수 있다. 냉각시킨 후에는 pH를 3.5 내지 6으로 조절해야 하며, 접종에 앞서 미량염(2.5mL/L)을 첨가해야 한다. 글리세롤이 고갈되기 전이나 후에 100%의 메탄올이 개시될 수 있다. 2% 정도의 메탄올 수준은 HBsAg 축적을 방해하지 않으며, 이 기간은 200시간정도 지속될 수 있다. 그러나 발효조내의 5% 메탄올은 HBsAg 입자의 축적을 멈추게 할 것이다.
더 높은 세포 농도에 이르기까지의 배양은 공급물 염의 농도를 증가시킴으로써 수행되었다. 메탄올 위에서 배양할 경우 세포 농도를 증가시키기 위해서는 아연의 양을 증가시키는 것이 특히 중요하다. 추출 가능한 아우스리아 활성의 더 높은 수준은 배양이 아연에 제한되지 않고 추출가능한 단백질 또한 높을 경우에 성취되었으며, 이때 가용성 단백질의 퍼센트로서의 아우스리아 활성에 있어서는 순(net)감소가 초래되었다.
3. GS115(pBSAG5) 및 GS115(pBSAGI5I) 세포배양물의 진탕 플라스크 배양형질 전환된 콜로니 하나를 뽑아서 SD 평판위에 스트리킹하였다. 세포 획선 하나를 5% 글루코스가 포함된 YNB 배양액(1×YNB, 5μg/ml의 비오틴) 50mL(250mL짜리 진탕 플라스크속에 들어있음)에다 접종하고, 공기 진탕기 속에서 분당 250회전으로 30℃하에 하룻밤 진탕하였다. 아침에 읽은 OD600은 2-3이었다. 100OD600단위의 세포(세포 약 109)를 진탕 플라스크에서 분리해내고, IEC 원심분리기내에서 200Xg, 실온하에 7분간 원심분리시켰다. 2% 글리세롤이 포함된 YNV 배양액 500mL(2리터짜리 진탕 플라스크속에 들어있음)속에다 세포 펠릿을 재현탁시켰다(OD600=0.2). OD600이 2-3 OD600에 달할때까지, 공기 진탕기 속에서 이 배양물을 30℃, 250rpm하에 배양하였다. Aox1-숙주의 경우에는 500OD600을 배양물로 부터 분리하였다. 세포 현탁액을 IEC내에서 7분동안 2000Xg로 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 0.5% 메탄올이 포함된 YNB 배양액 500mL속에 재현탁시켰다(OD600=0.1). Aoxl+숙주의 경우에는, 170 OD600의 세포를 배양물로 부터 분리해내고, 동일한 조건하에 원심분리시키고, 0.5%메탄올이 포함된 YNB 육즙 500mL속에 재현탁시켰다(OD600=0.3). 그 두 배양물을 2리터짜리 진탕 플라스크 속에서 30℃, 250rpm하에 진탕하였다. OD600
Figure kpo00005
2이 얻어질때면 언제든지, 동일한 배지를 사용하여 배양물을 2배 희석하였다. 100OD600샘플들을 주기적으로 분리해내고 2000Xg로 7분간 원심분리시켰다. 생성된 세포 펠릿은-70℃에서 1-2주간 동결 보관될 수 있다.
[실시예 VI]
[HBsAg의 분석 : 22nm 입자 및 HBsAg 단량체]
1. 추출물과 단백질 제제의 측정
다음에 나오는 모든 작업은 0.4℃에서 수행되었다. 동결 세포 펠릿을 녹인후, 얼음처럼 차가운 가용화 완충액 2mL로 2회 세척하였다. 세포(100 OD600단위)를 1회용(disposable)유리 튜브(13×100mm)속으로 옮겼다. 가용화 완충액 0.35mL과 산-세척 유리 비이드(직경 : 0.45mm)0.5g을 세포 펠릿에다 첨가하였다. 이 현탁액을 와동 믹서상에서 최대 세팅으로 놓고서 매 1분씩 4회 진탕하고, 각각의 교반 기간 사이의 1분 간격동안 얼음 위에서 정치시켰다. 온전한 세포 슬러리를 분리해내고 유리 비이드를 0.35mL의 가용화 용매로 세척하였다. 세척 완충액을 세포 슬러리와 합하고 에펜도르프 튜브속으로 옮겼다. 추출물을 에펜도르프 원심분리기 속에서 15분간 원심분리시켰다. 상청액(가용성분류물 ; 0.7mL)을 펠릿으로부터 분리시켰다. HBsAg 단백질을 펠릿으로 부터 추출시키기 위하여, 2×농축 SDS-겔 충전완충액을 펠릿에다 첨가하고, 혼합물을 와동 믹서위에서 교반하고, 15분간 끓였다. 혼합물을 15분간 원심분리시킨 후, 상청액(불용성 분류물)을 세포 부스러기로부터 분리시켰다. TCA 침전 및 로우리법을 사용하여, 가용성 분류물과 불용성 분류물로 부터의 부분 표본들에 대한 단백질 함량 분석을 하였다. 단백질 농도 표준으로는 BSA를 사용하였다. 불용성 분류물과 가용성 분류물은 둘다 3-15mg/mL의 단백질 농도를 가졌다.
2. 추출물을 제조하기 위한 또다른 과정
이 보고서에는 단량체 이종 단백질 HBsAg 또는 단백질 복합체 22nm 입자(HBsAg 단백질을 암호화하는 서열이 함유된 벡터로 인하여 형질전환이 된 피치아 파스토리스의 배양물로 부터 유래된 것)를 추출하기 위한 조건이 기재되어 있다.
P. 파스토리스의 배양물을 밀리리터당 10-100 OD600단위의 세포 농도로까지 배양하였다. 100 OD600단위의 부분 표본을 13×100mm 붕규산염 배양물 튜브속에 옮기고, 가용화 완충액 20부피로 2회 세척하였다.
세포들을 펠릿으로 만든후, 이러한 펠릿화 세포(IEC 임상원심분리기)에다 산-세척 유리 비이드(0.5mm) 0.5g을 첨가한 후 가용화 완충액 0.35mL을 첨가하였다. 가용화 완충액 속에는 0.5M NaC1과 0.1% Triton X-100(중량/부피)(대조용)가 들어있거나, 혹은 0.1%의 Triton X-100 존재 또는 부재하에 3M농도의 요오드화칼륨 또는 티오시안화칼륨이 들어있었다. 10mM 인산나트륨을 사용하여 모든 용액을 pH7.5로 완충시켰다. 와동 믹서를 사용하여 혼합물을 최대 속도로 4회 교반하였고, 매회 교반 사이에 l분씩의 간격을 두었다. 간격중에 혼합물을 얼음위에서 적어도 1분간 냉각하였다.용해가 완결된 후 파괴된 세포들의 용액을 분리해내고, 유리 비이드를 가용화 완충액 0.35mL로 세척한 후, 두 용액을 합하여, 13,000xg로 15분간 원심분리시켰다. 상청액들을 분리해내고, 면역 반응성 HBsAg 입자(아우스리아 분석)와 전체 트리클로로초산 침전 단백질(로우리)분석을 하였다. 다섯 실험에 대한 결과가 하기 표 I에 나와있다.
[표 I]
Figure kpo00006
요오드화칼륨이나 티오시안화칼륨이 함유된 조건들중 그 어떤것도, 염화나트륨을 사용하는 조건에 비해 더 높은 HBsAg 입자의 값을 제공하지 못하지만(컬럼 A), 요오드화칼륨이나 티오시안화칼륨은 전체 단백질의 방출을 억제함으로써(컬럼 B), 입자의 특이 활성이 2-5배 증가된다(컬럼)는 것이 명백하다.
3. 22nm 입자 분석(AUSRIATMII 키트)
아우스리아 희석 완충액을 사용하여 가용성 분류물을 1000-10,000배 희석하고, 25 내지 100μL의 부분 표본들을 다음과 같이 분석하였다.
[첫번째 배양]
1. 표준 곡선을 만들기 위하여, 최종 부피가 각기 200μL이고 0.1ng에서 4ng까지의 대조물이 들어있는 희석 시리즈를 반응 트레이의 각 웰속의 바닥에다 피페팅하였다(4개의 음성 대조물과 함께).
분석하고자 하는 샘플의 경우에는, 희석된 각각의 가용성 분류물 200μL을 반응 트레이의 별도의 웰속의 바닥에다 피페팅하였다.
2. 샘플 분류물 또는 대조물이 들어있는 각각의 웰속에 비이드 하나씩을 조심스럽게 첨가하였다. 그와는 달리, 대조물 또는 샘플을 첨가하기 전에 비이드를 분배할 수도 있다.
3. 커버 씨일(cover seal)를 반응 트레이에다 적용시킨 후, 부드럽게 탁탁쳐서 비이드가 덮혀지고 붙잡힌 어떠한 기포라도 제거되도록 하였다.
4. 반응을 45℃에서 2시간 동안 배양하였다.
5. 커버 씨일을 제거하여 버렸다. 액체를 흡출기로 빨아내고, 각각의 비이드를 증류수 또는 탈이온수 4-6ml로 2회 세척하였다.
[두번째 배양]
6.125I-항-HBs200μL을 비이드가 들어있는 각각의 웰속에 피페팅하였다.
7. 새로운 커버 씨일을 적용하고, 반응 트레이를 부드럽게 탁탁쳐서 비이드가 덮혀지고 붙잡힌 어떠한 기포라도 제거되도록 하였다.
8. 반응 트레이를 45℃에서 1시간 동안 배양하였다.
9. 커버 씨일을 제거하여 버렸다.
10. 비이드들을 적절하게 동정된 계수 튜브속으로 즉시 옮겼다.
감아 신틸레이션 계수계(Scintillation Counter)읽기 :
11. 카운트 속도를 1분간 측정하였다.
12. 최종 세척후 24시간내에 샘플을 계수하였다.
단계 1에 기재된 바와같이 하여 만들어진 표준 곡선을 사용해서, 22nm 입자의 수준을 계산하였다.
4. 단량체 분석(웨스턴 분석)
단백질(가용성 혹은 불용성 분류물) 25μg에 해당하는 부피(보통 2-5μL)에다 H2O를 넣어 최종 부피가 10μL이 되도록 하였다. 2x 농축 겔 충전 완충액(1x 완충액 100mM DTT)10μL을 가하고 샘플을 15분간 끓였다. 끓여진 샘플을 12% SDS 아크릴아미드 겔(Laemmli)위에 투입시켰다. 겔 전기 영동후, 단백질을 니트로셀룰로스 종이[우빈 일행의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354(1979)]에 옮겼다. HBsAg항 혈청(형장-유도 HBsAg에 대항하여 생긴것)및125I-표지 단백질 A를 사용하여 HBsAg를 검출하였다. 니트로셀룰로스 종이를 -70℃에서 하룻밤 동안 Kodak XAR-필름에 노출시켰다. 니트로셀룰로스 종이로 부터의 방사능 밴드를 감마-계수계속에서 계수함으로써 단량체를 정량하였다. S. 세레비시애에 의하여 생산된 재조합 HBsAg(100-500ng/레인)를 표준물로서 사용하였다.
[실시예 VIl]
[피치아 파스토리스내에서의 HBsAg 발현 수준]
형질전환된 몇몇 P.파스토리스 균주에 의한 HBSAg의 생산은 실시예 VI의 제 1 부에 기재된 가용화 보고서를 이용하여 실시예 VI에 설명된 분석 조서에 의해서 측정하였다. 결과는 표 II에 요약되어 있다.
[표 II]
Figure kpo00007
a단백질 분석 : 브래드포드 방법에 의하여 측정
b배지 1리터당 HBsAg : OD600=5×107세포/mL=0.14mg 건조중량/mL=0.06mg 단백질/mL
위에 제시된 결과들은, 피치아 파스토리스에서 유래된 제 1 알콜 산화효소 유전자(AOX1)조절지역 조절하에 있을 경우 피치아 파스토리스내에 많은 양의 HBsAg가 생산될 수 있음을 입증해준다.

Claims (20)

  1. (1) 하기 (a)와 (b)로 이루어진 DNA 단편, 즉 (a)폴리펩티드 코우딩 지역의 5'말단에 위치할 경우 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있고, (i)이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 메탄올 존재, (ii)이 DNA 단면을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속에서의 메탄올 이외의 비-이화 물질 억제 탄소원 존재 및 (iii)이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체를 이화 물질 억제 탄소 및 에너지 원위에서 배양한 후 그 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 탄소원 기아현상중에서 선택되는 한가지 이상의 조건에 대하여 반응하는 조절지역 및, (b)B형 간염 표면 항원 또는 그 일부를 암호화하는 폴리펩티드 코우딩 지역으로 이루어진 DNA 단편, 또는 (2)그와같은 DNA 단편과 아울러 박테리아 플라스미드 DNA, 선택성 효모 표식 유전자 및 효모 자율복제 서열로 이루어진 플라스미드로 인하여 형질 전환이 된 효모 균주를 메탄올, 이화물질 비(非)-억제 탄소원, 또는 그 혼합물, 또는 하나 이상의 이화물질 억제탄소 및 에너지원으로 이루어진 영향 배지속에서 배양하고, 상기 탄소 및 에너지원이 이화물질 억제 탄소 및 에너지원일 경우에는 그 배양 단계의 생성물에게 탄소원 기아현상의 조건을 가해줌을 특징으로 하는 B형 간염표면 항원의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 단편이 도면 제 2 도의 제한지도에 나와 있는 것과 같음을 특징으로 하는 조절지역을 갖고 있는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 단편에 상기 폴리펩티드 코우딩 지역에 의해서 암호화된 메신저 RNA의 전사종결 및 폴리아데닐화를 조절할 수 있는, 폴리펩티드 코우딩 지역 아래쪽 DNA 3' 서열이 부착되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 단편에 박테리아 플라스미드 DNA,박테리오파아지 DNA, 효모 플라스미드 DNA, 효모 염색체 DNA 또는 그중 둘이상으로 부터 유래된 하나 이상의 DNA 서열이 부착되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 효모 염색체 DNA가 자율 복제 DNA 서열 및 표식 유전자로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 자율복제 서열이 PARS1 또는 PARS2인 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 단편에 첫번째 삽입 DNA 단편, 선택성 표식 유전자 및 두번째 삽입 DNA 단편으로 이루어진 연속 배열 DNA가 부착되어 있으며 ; 이에 상기 첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은 각각 그 길이가 적어도 약 200뉴클레오티드에 상당하고 또 피치아 속에 속한 종의 게놈 DNA 부분과 상동하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 있으며 ; 상기 DNA 단편과 상기 표식 유전자는 상기 첫번째 삽입 DNA 단편의 3' 말단과 상기 두번째 삽입 DNA 단편의 5' 말단 사이에 위치하며 ; 상기 첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은 피치아의 게놈속에 배향되는 것과 같이 서로에 대하여 배향됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우딩 지역이, 필수적으로 아래애 나와 있는 약 700 염기쌍 단편, 또는 그의 아(sub)단위, 또는 그의 변이체나 기능상의 등가물로 이루어져 있는 방법
    5'-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC
    TGCTCGTGDT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT
    CCTCACAATA CCGCAGAGDC TATACTCGTG GTGGACTTCT
    CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA
    ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG
    TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATGGCTGGAT GTGTCTGCGG
    CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA
    TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC
    CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG
    GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT
    CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG
    AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC
    GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT
    GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG
    GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG
    TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT
    TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA
    CATTTAAGGC CT-3'
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 B형 간염 표면 항원을 분리하고 정제함을 특징으로 하는 방법.
  10. (a)폴리펩티드 코우딩 지역의 5' 말단에 위치할 경우 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있으며, (i) 이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 메탄올 존재 ; (ii)이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속에서의 메탄올 이외의 비-이화물질 억제 탄소원 존재 및 (iii) 이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체를 이화물질 억제 탄소 및 에너지원 위에서 배양한 후 그 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 탄소원 기아현상 중에서 선택되는 한가지 이상의 조건에 대하여 반응하는 조절지역을 (b) B형 간염 표면 항원 또는 그 일부를 암호화하는 폴리펩티드 코우딩 지역에 부착시킴을 특징으로 하는 신규 DNA 단편의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조절지역이 도면 제 2 도의 제한지도에 나와 있는 것과 같음을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우딩 지역에 의해서 암호화된 메신저 RNA의 전사 종결 및 폴리아데닐화를 조절할 수 있는 DNA 3' 서열을 폴리펩티드 코우딩 지역 아래쪽 DNA에 부착시킴을 특징으로 하는 방법.
  13. (a)폴리펩티드 코우딩 5' 말단에 위치할 경우 메신저 RNA의 전사를 조절할 수 있고, (i)이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 메탄올 존재, (ii) 이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속에서의 메탄올 이외의 비-이화물질 억제 탄소원 존재 및 (iii) 이 DNA 단편을 함유한 숙주 유기체를 이화물질 억제 탄소 및 에너지원 위에서 배양한 후 그 숙주 유기체와 접촉하고 있는 배지속의 탄소원 기아현상중에서 선택되는 적어도 한가지 조건에 대하여 반응하는 조절지역 및, (b) B형 간염 표면 항원 또는 그 일부를 암호화하는 폴리펩티드 코우딩 지역으로 이루어짐으로 특징으로 하는 DNA단편.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 조절지역이 도면 제 2 도의 제한지도에 나와 있는 것과 같음을 특징으로 하는 DNA 단편.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 DNA 단면에 상기 폴리펩티드 코우딩 지역에 의해서 암호화된 메신저 RNA의 전사종결 및 폴리아데닐화를 조절할 수 있는 폴리펩티드 코우딩 지역 아래쪽 DNA 3' 서열이 부착되어 있음을 특징으로 하는 DNA 단편.
  16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 DNA 단편에 박테리아 플라스미드 DNA, 박테리오파아지 DNA, 효모 플라스미드 DNA, 효모 염색체 DNA 또는 그중 둘 이상으로 부터 유래된 하나 이상의 DNA 서열이 부착되어 있음을 특징으로 하는 DNA 단편.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 효모 염색체 DNA가 자율복제 DNA 서열 및 표식 유전자로 이루어짐을 특징으로 하는 DNA 단편.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 자율복제 서열이 PARS1 또는 PARS2인 DNA 단편.
  19. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 DNA 단편에 첫번째 삽입 DNA 단편, 선택성 표식 유전자 및 두번째 삽입 DNA 단편으로 이루어진 연속 배열 DNA가 부착되어 있으며 ; 이때 상기 첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은 각각 그 길이가 적어도 약 200뉴클레오티드에 상당하고 또 피치아 속에 속한 종의 게놈 DNA 단편들은 각각 그 길이가 적어도 약 200 뉴클레오티드에 상당하고 또 피치아 속에 속한 종의 게놈 DNA부분과 상동하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 있으며 ; 상기 DNA 단편과 상기 표식 유전자는 상기 첫번째 삽입 DNA 단편의 3' 말단과 상기 두번째 삽입 DNA 단편의 5' 말단사이에 위치하며 ; 상기 첫번째 및 두번째 삽입 DNA 단편들은 피치아의 게놈속에 배향되는 것과 같이 서로에 대하여 배향됨을 특징으로하는 DNA 단편.
  20. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우딩지역이, 아래에 나와 있는 약 700염기쌍 단편, 또는 그의 아(sub) 단위, 그의 변이체나 기능상의 등가물로 이루어진 DNA 단편
    5'-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC
    TGCTCGTGDT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT
    CCTCACAATA CCGCAGAGDC TATACTCGTG GTGGACTTCT
    CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA
    ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG
    TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG
    CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA
    TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGGC
    CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG
    GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT
    CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG
    AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC
    GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT
    GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG
    GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG
    TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT
    TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA
    CATTTAAGGC CT-3'
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