CS276453B6

CS276453B6 - Process for preparing surface antigen hepatitis b

Info

Publication number: CS276453B6
Application number: CS868641A
Authority: CS
Inventors: Juerg Friedrich Tschopp; James Michael Cregg; Michael Miller Harpold; Richard Gordon Buckholz
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1992-06-17
Also published as: ZA868601B; DK565186A; NO176025B; JPS62190085A; AU6538486A; EP0226846A1; ES2058055T3; IN166428B; DE3688831D1; YU46031B; US4895800A; DK565186D0; NO176025C; NZ218286A; PL262598A1; EG17949A; IL80754A0; KR870005099A; PT83819A; CA1285895C

Description

Vynález se týká použití technologie rekombinace ONA pro přípravu povrchového antigenu hepatitis B. Konkrétněji se vynález týká přípravy povrchového antigenu hepatitis B v kvasinkách. V souvislosti s tím se vynález týká též nových konstrukcí DNA kódujících povrchový antigen hepatitis B a nových organismů transformovaných shora popsanými konstrukcemi ONA.

V posledních letech se rozvinula technologie rekombinace DNA, která poskytuje možnost řízené produkce ohromného množství různých použitelných polypeptidů pomocí mikroorganismů. Pomocí různých mikroorganismů již bylo vyrobeno mnoho eukaryotických polypeptidů, například lidský růstový hormon, leukocytové interferony, lidský insulin a lidský proinsulin. Očekává se, že pokračující aplikace metod, které jsou již k dispozici, v budoucnu umožní produkci pomocí mikroorganismů u dalších požadovaných polypeptidických produktů. Jedním z takových užitečných polypeptidických produktů je povrchový antigen hepatitis B.

Virus hepatitis B (sérové hepatitidy) se přenáší mezi lidmi a projevuje se infekcemi, které chronicky zeslabují lidský organismus a mohou mít postupně za následek těžké poškození jater, primární karcinomy a nakonec smrt. Ve většině případů je možno u infekcí způsobených hepatitis B očekávat úplně vyléčení. Velké části populace, zejména v mnoha afrických a asijských zemích jsou však chronickými nosiči a představují tak nebezpečný potenciál pandemického přenosu této choroby.

Účinnou profylaxí proti viru hepatitis B je podávání vakciny proti viru hepatitis B, kterou je Obvykle vysoce přečištěný povrchový antigen hepatitis B. Taková vakcina je účinná po předcházení infekcím způsobeným tímto virem. Jako skupiny obyvatelstva, které jsou zvláště silně ohroženy těmito infekcemi je možno uvést osoby, které vyžadují léčení pomocí transfuzí krve nebo dlalýzou, zdravotnický personál, který přichází s těmito osobami do styku apod. Kromě toho je tato vakcina rovněž účinná pro zabránění vzniku nového nosiče a bylo by možno s její pomocí úplně eliminovat virus hepatitis B na zemi.

Virus hepatitis B z buněčných kultur- není infekční a lze ho tedy získávat pouze z infikovaných lidí nebo vyšších primátů. Neexistuje tedy až dosud prostředek pro získání a udržování dostatečných zásob viru hepatitis B pro použití na přípravu antigenu sloužícího pro imunizaci proti viru hepatitis B.

Vakcina proti viru hepatitis se obvykle připravuje tak, že se z krevní plasmy nosičů viru hepatitis B izoluje a přečistí povrchový antigen hepatitis B. Čištění še však musí provádět s vysokou účinností, protože v čištěné krevní plasmě jsou obsaženy jen velmi níz’ké koncentrace požadovaného antigenu. Z těchto důvodů bylo až dosud velmi obtížné připravovat požadovanou vakcinu proti viru hepatitis B v průmyslovém měřítku.

Úkolem vynálezu je tedy vyřešit způsob výroby povrchového antigenu hepatitis B ve vysokém výtěžku.

Dalším úkolem vynálezu je příprava nových konstrukcí DNA, které by byly schopny exprimovat povrchový an.tigen hepatitis B na vysoké úrovni.

Tyto a další úkoly, které vynález řeší, jsou zřejmé z dalšího popisu a definice předmětu vynálezu.

Podstata vynálezu

Nyní se v souvislosti s vynálezem zjistilo, že povrchový antigen hepatitis B je možno produkovat ve vysokých výtěžcích kultivací kvasinkových buněk transformovaných konstrukcemi DNA obsahujícími sekvence kódující povrchový antigen hepatitis B za řízení regulačními oblastmi, které jsou responsivní vůči methanolu, zdrojům uhlíku nepotlačujÍGÍm katabolit a nedostatku zdroje uhlíku.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen kvasinek rodu Pichia transformovaný plasmidem v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku zvolený ze souboru zahrnujícího

CS 276 453 B6

i) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie zvolený ze skupiny zahrnující methanol a zdroj uhlíku nevykazující katabolitovou represi, ii) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie vykazující katabolitovou represi s tou podmínkou, že v případě ii) se získaný produkt podrobí podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku, přičemž uvedený plasmid obsahuje DNA fragment, DNA bakteriálního plasmidu, selektovatelný kvasinkový markerový gen a kvasinkovou autonomní replikační sekvenci, kde uvedený DNA fragment obsahuje

a) regulační oblast, která je schopna řídit transkripci mediátorové RNA, pokud je umístěn na konci 5’ polypeptidové kódovací oblasti, přičemž tato regulační oblast je responsivní k alespoň jedné z podmínek zahrnujících

i) přítomnost methanolu v kultivačním prostředí se kterým hostitelský organismus, obsahující uvedený DNA fragment, ve styku, ii) přítomnost zdroje uhlíku nevykazujícího katabolitovou represi odlišného od methanolu v kultivačním prostředí, se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku a iii) nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku poté; co byl hostitelský organismus nechán růst na zdroji uhlíku a energie vykazujícím katabolitovou represi a

b) polypeptid kódující oblast, přičemž tato kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části.

Předmětem vynálezu je také fragment DNA, plasmid a transformovaný kmen rodu Pichia, které jsou popsány dále a které slouží k provádění způsobu podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. 1 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti dihydroxyaceton syntázového genu (DAS) u kvasinek rodu Pichia.

Na obr. 2 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti primárního alkohol oxidázového genu (AOX1) u kvasinek rodu Pichia.

Na obr. 3 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti genu p40 u kvasinek rodu Pichia.

Na obr. 4 je znázorněna restrikční mapa plasmidu pA0P₂·

Na obr. 5 je znázorněno schéma, podle kterého se postupuje při konstrukci plasmidu pBSAG5 a pBSAG5I.

Na	obr.	6	je	znázorněna	restrikční	mapa	plasmidu	pHBS-5
Na	obr.	7	je	znázorněna	restrikční	mapa	plasmidu	pAOT-1
Na	obr.	B	je	znázorněna	restrikční	mapa	plasmidu	pY333.

Obr. 9 ilustruje konstrukci plasmidu pYM39 z plasmidů pSA0H5 a pTHBS3.

Obr. 10 ilustruje konstrukci plasmidu pYMI6 z plasmidů pYM39 a pPG3.2.

Obr. 11 ilustruje konstrukci plasmidu pBSAGI5I z plasmidů pYMI6 a pBSAG5I,

Obr. 12 ilustruje inserci části plasmidu pBSAGI5I na lokus primárního alkoholu oxidázového genu (A0X1) chromosomu kvasinek rodu Pichia.

Obr. 13 znázorňuje schéma, podle kterého se postupuje při konstrukci plasmidu pTHBS3. V obrázcích se pro označení restrikčních enzymů používá následujících zkratek:

ϊ

CS 276 453 Β6

Zkratka _Restrikční enzym

As	AsuII
B	BamHI
^β2	BglII
^Bc	BC1I
C	Clal
^H2	HincII
^H3	HindlII
K	KpnII
Nd₁	Ndel
Nr	Nrul
Ps	Pstl
Pvi	Pvul
Pv₂	PvuII
*1	EcoRI
^R5	EcoRV
S	Sáli
Sp	Sphl
Ss	Sstl
St	Stul
Xb	Xbal
Xh	Xhol

Na připojených obrázcích jsou restrikční místa použitá pro manipulaci fragmentů DNA, která však byla zničena při spojování (ligaci), označena tak, že je zkratka zničeného mís ta uvedena v závorkách.

Při způsobu podle vynálezu se používá nového fragmentu DNA, který obsahuje regulační oblast a polypeptid kódující oblast, přičemž polypeptid kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části a regulační oblast je schopna řídit transkripci mediá torové RNA, pokud je umístěna na konci 5' genu kódujícího polypeptid. Kombinace regulační oblasti genu, povrchového antigenu hepatitis B (HBsAg) a transkripčního terminátorového fragmentu je v tomto popisu dále označována termínem exprimačnl kazeta nebo exprimační jednotka. Regulační oblast použitá podle vynálezu je responsivní alespoň k jedné z podmínek zvoleně ze souboru zahrnujícího

a) přítomnost methanolu v kultivačním médiu, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku,

b) přítomnost zdroje uhlíku nepotlačujícího katabolit, odlišného od methanolu, v kul tivačním médiu, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku a cj nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku, poté, co byl hostitelský organismus ponechán růst na zdroji uhlíku a energie potlačujícím katabolit.

Součástí vynálezu jsou dále též nové lineární a cirkulární plasmidy obsahující shora popsané exprimační kazety.

Do rozsahu vynálezu spadají dále v podstatě čisté kultury kmenů kvasinek, které jsou transformovány shora popsanými lineárními nebo cirkulárními plasmidy.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, který se vyznačuje tím, že se kultivuje kmen kvasinek transformovaný shora popsanými plasmidy za takových podmínek, za kterých se dosáhne exprese požadovaného bílkovinného produktu.

Regulační oblasti používané při prováděni způsobu podle vynálezu jsou charakterizovány svou schopností odezvy na média obsahující

CS 276 453 B6

1) methanol,

2) zdroje uhlíku nepotlačující katabolit, jako například glycerol^, galaktóza, ethylacetát apod.,

3) zdroje uhlíku potlačující katabolit, jako například glukóza, ethanol, fruktóza apod., provede-li se poté kultivace za podmínek nedostatku zdroje uhlíku.

Jako příklady regulačních oblastí, které vyhovují shora uvedeným kritériím, je možno uvést regulační oblasti, jejichž restrikční mapy jsou znázorněny na obr. 1, 2 a 3. Regulační oblast znázorněná na obr. 1 je odvozena od dihydroxyaceton syntázového genu (DAS) Pichia pastoris. Regulační oblast znázorněná na obr. 2 je odvozena od primárního hlavního alkoholoxidázového genu (A0X1) Pichia pastoris (Pichia má dva alkohol oxidázové geny, které jsou v tomto popisu označovány A0X1 a A0X2). Regulační oblast znázorněná na obr. 3 je odvozena od genu p40 Pichia pastoris. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že z methylotrofních kvasinek, jako jsou například kvasinky Pichia pastoris je možno izolovat jiné regulační oblasti, které mají shora popsané vlastnosti. Použití takových regulačních oblastí, které mají podobné regulační vlastnosti jako konkrétní shora uvedené regulační oblasti, rovněž spadá do rozsahu vynálezu.

Povrchový antigen hepatitis B (HBsAg) byl izolován nedávno (Valenzuela a další (1979) Nátuře 280, 815) a lze ho získat působením vhodného restrikčního enzymu, na vhodné vektory, jako je například pHBS-5 (viz obr. 6, a Valenzuela a další, (1982), Nátuře 298, 347), pHBV-T-lA (Genentech, EPA, 73 657), pHBS-56 (identifikační číslo ATCC 40 047; viz EPA 120 551) atd.

Gen povrchového antigenu hepatitis B byl modifikován působením exonukleázy Bal31, aby se odstranily virální nekódující sekvence na konci 5' genu hepatitis B. Konec 3’ genu HBsAg byl modifikován digeraci endonukleázou a přidáním linkeru, aby se odstranily virální nekódující sekvence na konci 3’ genu hepatitis B. Gen povrchového antigenu hepatitis B byl dále modifikován, aby obsahoval vhodná restrikční místa pro manipulaci fragmentu DNA.

Výsledný fragment DNA je EvoRI-StuI inzert a má tuto sekvenci nukleotidů:

- GAATTCATGG	AGAACATCAC	ATCAGGATTC	CTAGGACCCC
TGCTCGTGTT	ACAGGCGGGG	TTTTTCTTGT	TGACAAGAAT
CCTCACAATA	CCGCAGAGTG	TAGACTCGTG	GTGGACTTCT
CTCAATTTTČ	TAGGGGGATC	TCCCGTGTGT	CTTGGCCAAA
ATTCGCAGTC	CCCAACCTCC	AATCACTCAC	CAACCTCCTG
TCCTCCAATT	TGTCCTGGTT	ATCGCTGGAT	GTGTCTGGGG
CGTTTTATCA	TATTCCTCTT	CATCCTGCTG	CTATGCCTCA
TCTTCTTATT	GGTTCTTCTG	GATTATCAAG	GTATGTTGCC
CGTTTGTCCT	CTAATTCCAG	GATCAACAAC	AACCAGTACG
GGACCATGCA	AAACCTGCAC	GACTCCTGCT	CAAGGCAACT
CTATGTTTCC	CTCATGTTfiC	TGTACAAAAC	CTACGGATGG
AAATTGCACC	TGTATTCCCA	TCCCATCGTC	CTGGGCTTTC
GCAAAATACC	TATGGGAGTG	GGCCTCAGTC	CGTTTCTCTT
GGCTCAGTTT	ACTAGTGCCA	TTTGTTCAGT	GGTTCGTAGG
GCTTTCCCCC	ACTGTTTGGC	TTTCAGCTAT	ATGGATGATG
TGGTATTGGG	GGCCAAGTCT	GTACAGCATC	GTGAGTCCCT
TTATACCGCT	GTTACCAATT	TTCTTTTGTC	TCTGGGTATA
CATTTAAGGC	CT-3'
Strukturální	genové konstrukce	s regulační oblastí podle	vynálezu se mohou amplifiko
it, reprodukovat	a experimovat v organismech různými způsoby	. Pro autonomní replikaci
kvasinkách je užitečný prvek autonomní replikační sekvence	(ARS). Jako příklady je mož-
i uvést PARS1 a	PARS2 odvozené od	Pichia pastoris (viz dosud	nevyřízenou patentovou při-

CS 276 453 B6 hlášku USA 6. 666 577, autor: Cregg, převedenou na firmu Philips Petroleum Co.). Když je naproti tomu požadována integrativní transformace hostitele, nepoužívá se žádného prvku ARS. Přednostní metoda, jak dosáhnout integrativní transformace je popsána v dosud nevyřízené patentové přihlášce USA č. 791 013, autor: Cregg, převedená na firmu Phillips Petroleum Co., která zahrnuje použití místně směrovaného integračního vektoru, který obsahuje

- první insertovatelný fragment DNA,

- selektovatelný markerový gen a

- druhý insertovatelný fragment DNA.

První a druhý insertovatelný fragment DNA by měl mít délku vždy alespoň asi 200 nukleotidů a měl by obsahovat nukleotidové sekvence, které jsou hormologičké s částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia. Různé složky integrativního vektoru , jsou uspořádány do série za vzniku lineárního fragmentu DNA tak, že exprimační kazeta a selektovatelný markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5' druhého insertovatelného fragmentu DNA. Vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA v sériově uspořádaném lineárním fragmentu je stejná jako v genomu Pichia.

Do DNA použité pro transformaci hostitelského kmene je nutno zahrnout alespoň jeden selektovatelný markerový gen. To usnadňuje selekci a izolaci těch organismů, do kterých byla zavedena transformační DNA. Markerový gen dodává transformovanému organismu určitý rys fenotypu, který hostitel dříve neměl, například navrácení schopnosti produkovat specifickou aminokyselinu v tom případě, kdy netransformovaný hostitelský kmen vykazoval defekt při postupu biosyntézy specifické aminokyseliny.

Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do vektorů používaných při provádění tohoto vynálezu je možno rovněž zavést přídavné sekvence DNA, jako například DNA bakteriálního plasmidu, DNA bakteriofágu apod. Tyto sekvence umožňují amplifikaci a udržování těchto vektorů v bakteriálních hostitelích.

Exprese v transformovaných kvasinkách.

Shora popsané plasmidy podle vynálezu jsou použitelné v kmenech kvasinek, které lze transformovat. Regulace exprese genu v kvasinkách za použití nových fragmentů DNA podle vynálezu se může provádět tak, že se transformované organismy vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku. Vystavení těmto podmínkám poté, co byly organismy ponechány růst na různých zdrojích uhlíku jak potlačujících katabolit, tak nepotlačujících katabolit, indukuje expresi genového produktu, který je udržován pod kontrolou regulačních oblastí podle vynálezu. Jiný způsob, jak dosáhnout exprese požadovaného genového produktu ve vhodném kmeni transformovaných kvasinek, spočívá v tom, že se kvasinky nechají růst na methanolu. Ještě dalším způsobem pro vyvolání exprese požadovaného genového produktu je růst transformovaných kvasinek na mediích, které obsahují zdroje uhlíku nepotlačující katabolit.

Regulační oblasti podle vynálezu jsou užitečné pro expresi ve všech kmenech kvasinek, poněvadž se ukázalo, že jsou indukovány za různých podmínek. Kvasinky schopné růstu na methanolu nebo na zdrojích uhlíku nepotlačujících katabolit mohou být přinuceny ke tvorbě cizích, tj. heterologických polypeptidú přímo, zatímco kvasinky schopné růstu na zdrojích uhlíku potlačujících katabolit mohou být přinuceny ke tvorbě cizích polypeptidú tím, že se jejich buňky takto získané vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku.

Při způsobu podle vynálezu se přednostně používá transformovaných kmenů kvasinek, které spadají do následujících rodů.

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Schizosaccharomyces,

CS 276 453 B6

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis,

Pichia a Kluyveromyces.

Kvasinkám z těchto rodů se dává přednost s ohledem na bezpečnou manipulaci s nimi, na jejich podmínky růstu a na další faktory, které jsou dobře prozkoumány a odborníkům v tomto oboru známy.

Při jednom provedení způsobu podle vynálezu se obzvláštní přednost dává těm kmenům kvasinek, které jsou schopny růst na methanolu, jakožto zdroji uhlíku a energie. Kvasinky, o nichž je známo, že jsou schopny růstu na methanolu zahrnují tyto rody:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis a Pichia.

Vzhledem k tomu, že regulační oblasti podle tohoto vynálezu jsou rovněž indukovány růstem na zdrojích uhlíku nepotlačujících katabolit a za podmínek nedostatku zdroje uhlíku, může se při provádění tohoto vynálezu použít kmenů kvasinek, které jsou schopny růstu na takových nemethanolických substrátech, jako je glukóza, ethylacetát, glycerol, ethanol, laktóza, galaktóza,· fruktóza, sacharóza a směsi dvou nebo více těchto látek. Exprese genového produktu pod kontrolou regulačních oblastí podle vynálezu je možno dosáhnout tím, že se hostitelský organismus nechá růst na vhodném nemethanolickém zdroji uhlíku nepotlačujícím katabolit, jako je například glycerol, nebo galaktóza nebo tím, že se hostitelský organismus nechá růst na vhodném zdroji uhlíku potlačujícím katabolit, jako je například ethanol, glukóza a fruktóza, načež se vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku.

Z hostitelských kmenů kvasinek se obzvláštní přednost dává mutantu Pichia pastoris GS115, což je mutant defektní, pokud se týče jeho schopnosti produkovat histidin. V důsled ku defektní dráhy vedoucí ke tvorbě histidinu způsobené vadným genem kódujícím histidinol dehydrogenázu byl mutant GS115 určen jako mutant s genotypem his4. Mutant GS115 je odvozen od Pichia pastoris NRRLY-11430 a je uložen pod registračním číslem NRRLY-15851 ve sbírce kultur Severního oblastního výzkumného centra ministerstva zemědělství USA (Northern Regio nal Research Center of the United States Department of Agriculture) v Peorii ve státě Illinois, USA. Tento konkrétní hostitel je užitečný proto, poněvadž se jedná o auxotrofní mutant s defektní dráhou vedoucí k produkci histidinu. Transformace tohoto hostitele vekto rem, který obsahuje mezi jinými sekvencemi DNA sekvence kódující funkci genu HIS4, umožňuje snadnou selekci transformovaných hostitelů.

Dalším přednostním kmenem kvasinek pro použití při provádění tohoto vynálezu je mutant Pichia pastoris GS190, což je mutant defektní, pokud se týče jeho schopnosti produkovat arginin. Defektnost dráhy vedoucí ke tvorbě argininu je způsobena mutací genu kódujícího argininosukcinát lyázu. Mutant GS190 je odvozen od kmene Pichia pastoris NRRL Y-11430

CS 276 453 B6 a je uložen ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture v Peorii, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL Y-18014.

Ještě dalším přednostním hostitelským kmenem kvasinek je dvojnásobně auxotrofní mutant PPF1, což je mutant, který je defektní jak pokud se týče dráhy vedoucí ke tvorbě histidinu, tak dráhy vedoucí ke tvorbě argininu. Je to způsobeno tím, že u mutantu PPF1 došlo jak k mutaci genu kódujícího histidinol dehydrogenázu, tak k mutaci genu kódujícího argininosukcinát lyázu. Mutant PPF1 je uložen ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture v Peorii, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL Y-18017.

Rovněž Escherichia coli je vhodným hostitelem pro plasmidy podle vynálezu. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že mnohé kmeny E. coli jsou vhodnými hostiteli. Několik kmenů používaných při práci na tomto vynálezu je uvedeno dále:

Označení kmene Identifikační číslo

MC1061 není známo

LE392 ATCC 33572

MM294 ATCC 33625

Transformační postup Píchla pastoris

Experimentální postupy vedoucí k transformaci Pichia pastoris byly již popsány dříve a jsou podrobněji uvedeny v příkladu I.

Pichia pastoris může být transformován enzymatickou digerací buněčných stěn za vzniku sferoplastů. Sferoplasty se pak smísí s transformační DNA a inkubují v přítomnosti vápenatých iontů a polyethylenglykolu a pak se regenerují v selektivním růstovém médiu deficientním na histidin. Transformační ONA zahrnuje gen HIS4, v němž je hostitelský kmen deficientní. Na použitém selektivním médiu přežívají proto jen transformované buňky.

Extrakce povrchového antigenu hepatitis B

Odborníkům v tomto oboru je zřejmě, že existují četné metody pro extrakci heterologického proteinu z jednobuněčného rekombinantního hostitele. Pro izolaci povrchového antigenu hepatitis B HBsAg připraveného způsobem podle vynálezu je možno použít jakékoliv známé technologie drcení buněk a koncentrace proteinů a/nebo extrakce z rozdrcených buněk. Stanovení povrchového antigenu hepatitis B

Transformované buňky se nechají shora uvedeným způsobem růst za vhodných podmínek exprese. Po rozdrcení buněk se rozpustná a nerozpustná frakce analyzuje na HBsAg. Rozpustná frakce se analyzuje na 22 nm částice za použití komerční analytické soupravy AUSTRIA®II (Abbot Laboratories). Jak rozpustná, tak nerozpustná frakce se analyzuje na monomer za použití postupů Western blotting proceduře, při kterých se používá antisera proti monomerrtí

125 formě HBsAg a proteinu A značeného radioaktivním jodem I.

Vynález je podrobněji popsán v následujících příkladech provedení. Příklady mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklady

V příkladech se používá následujících zkratek, které mají tento význam:

SDS	natrium dodecylsulfát
EOTA	ethylendiamintetraoctová kyselina
TEMED	Ν,Ν,Ν',Ν' - tetramethylendiamin
DTT	dithiothreitol
BSA	albumin z hovězího séra
EtBr	ethldiumbromid

CS 276 453 B6

O

PMSF	fenylmethylsulfonylfluorid
Ci	Curie
Zymolyasa	60 000 zdroj: Miles Laboratories

Pufry a roztoky používané v následujících příkladech mají dále uvedené složení

1 M Tris pufr:	121,1 g Tris báze v 800 ml ^0, pH upraveno na požadovanou hodnotu přidav kem koncentrované (35 %) vodné HC1, před konečnou úpravou pH roztok ponechán vychladnout na teplotu místnosti, zředěn na konečný objem 1 litr.
Pufr TE:	1,0 mM EDTA v 0,01 M (pH 7,4) Tris pufru
PBS (fosforeč-	10 mM fosforečnanu sodného (pH 7,0)
nanem tlumený roztok kuchyňské soli)	0,15 M NaCl
SDS gelový pufr	62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8) 2% SDS 10% glycerol 100 mM dithiothreitol 0,001% bromfenolová modř
Médium YPD	1 % bakto-kvasinkový extrakt 2 % bakto-pepton 2 % dextrosa
Médium SD:	6,75 g kvasinkový dusíkový základ bez aminokyselin (DIFCO) 2 % dextrosa v 1 litru vody.
SED:	1 M sorbitol 25 mM EDTA 50 mM DTT
pufr SCE:	9,1 g sorbitol 1,47 g citrát sodný 0,168 g EDTA 50 ml H₂0 pH pomocí HC1 na 5,8
CaS:	1 M sorbitol 10 mM CaCl₂filtrační sterilizace
roztok PEG:	20 % polyethylenglykol-3350 10 mM CaGl₂ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) filtrační sterilizace
SOS:	1 M sorbitol 0,3x médium YPD 10 mM CaCl₂.

CS 276 453 B6

Složení základních solí (pro růst transformovaných kvasinek Pichia ve fermentoru)

Základní soli Koncentrace

H₃PO₄, 85 %	4,2 ml/1
CaS0₄ . 2H₂0	0,18 g/1
^K2^S04	2,86 g/1
MgS0₄ . 7H₂0	2,34 g/1
KOH	0,65 g/1

Médium uváděné pro Pichia (pro růst GS115/pBSAG5 ve fermentoru)
	Koncentrace ve	vodě
H₃P0₄ (85 %)	3,5 ml/1
CaS0₄ . 2H₂0	0,15 g/1
k₂so₄	2,38 g/1
MgS0₄ . 7H₂0	1,95 g/1
KOH	0,65 g/1
FeS0₄ . 7H₂0	0,065 g/1
CuS0₄ . 5H₂0	0,006 g/1
ZnS0₄ . 7H₂0	0,020 g/1
MnS0₄ . H₃0	0,003 g/1
Biotin	0,000041 g/1
zdroj uhlíku	20 až 100 g/1
Roztok stopových solí [pro růst	GS115 CpBSAGISl)]
	Koncentrace ve	vodě
CuS0₄ . 5H₂0	0,06 g/1
KI	0,08 g/1
MnS0₄ . H₂0	0,3 g/1
Na₂Mo0₄ . 2H₂0	0,2 g/1
H₃B0₃	0,02 g/1
ZnS0₄ . 7H₂0	2,0 g/1
FeCl₃ . 6H₂0	4,8 g/1
h₂so₄	3 až 5 ml/1 (po	Odstranění zákalu)
ivací pufr:	4,3 mM Na₂HP0₄

1,5 mM KH₂PO₄

2,7 mM KC1

0,15 M NaCl % albumin z hovězího séra 0,02 % azidu sodného konečná hodnota pH 7,4

CS 276 453 B6

Solubilizační pufr: 10 mM natrium fosfátový pufr (pH 7,5)

0,5 M NaCl

0,1 % Triton X-100 mM PMSF

Pokud není uvedeno jinak, představují shora uvedené roztoky základní koncentraci (lx). Tam, kde se v příkladech používá různých koncentračních úrovní, je tato skutečnost označena uvedením násobku základní koncentrace (lx) roztoku.

Příklad I

Postup transformace Pichia pastoris

A. Růst buněk

1. Kolonie Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) se inokuluje do asi 10 ml YPD média a kultura se protřepává při 30 °C po dobu 12 až 20 hodin.

2. Po fázi růstu

3. Po notě 0D_éQ020 hodin.

4. Kultura se izoluje při dosažení θΟ^θθ asi 0,2 až 0,3 (po asi 16 až 20 hodinách) odstředěním při 1 500 g po dobu 5 minut.

asi 12 az 20 hodinách se buňky zředí na asi 0,01 az 0,1 a udržuji se v log v médiu YPD při 30 °C po dobu asi 6 až 8 hodin.

asi 6 až 8 hodinách se 100 ml média YPD inokuluje 0,5 ml násadové kultury o hodasi 0,1 (nebo ekvivalentním množstvím) a třepe se při 30 °C po dobu asi 12 až

8. Příprava sferoplastů

1. Buňky se jednou promyjí 10 ml sterilní vody (všechna odstřelování ve stupních 1 až 5 se provádějí po dobu 5 minut při 1 500 g).

2. Buňky se jednou promyjí 10 ml čerstvě připraveného SED.

3. Buňky se promyjí dvakrát 10 ml sterilního 1 M sorbitolu.

4. Buňky se resuspendují v 10 ml pufru SCE.

5. Přidá se 5 až 10 /Jl 4 mg/ml Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories). Buňky se inkubují při 30 °C po dobu asi 30 až 60 minut.

Vzhledem k tomu, že příprava sferoplastů je kritickým stupněm transformačního postupu, měla by se tvorba sferoplastů monitorovat následujícím způsobem: Před nebo těsně po přidání zymolyázy a v různých dobách v průběhu inkubačni periody se 100 /j1 alikvotní díly buněk * přidají k 900 jul 5% SDS a 900 yUl 1 M sorbitolu. Inkubace se zastaví v okamžiku, kdy dochází k lysi v SOS, ale ne v sorbitolu (obvykle mezi 30 a 60 minutami inkubace).

6. Sferoplasty se dvakrát promyjí 10 ml sterilního 1 M sorbitolu při odstřeňování (1 000 g) po dobu 5 až 10 minut. (Doba a rychlost odstřeňování se mohou různit; používá se odstřeňování, které postačuje pro vytvoření pellety, ale které nezpůsobuje praskání).

7. Buňky se jednou promyjí v 10 ml sterilního CaS.

8. Buňky se resuspendují celkem v 0,6 ml CaS.

C. Transformace

1. Vzorky DNA (do objemu nejvýše 20 >ul) se umístí do sterilních polypropylenových zkumavek o rozměrech 12 x 75 mm. (ONA by měla být ve vodě nebo pufru TE; aby se dosáhlo maximálních frekvencí transformace s malými množstvími DNA, je účelné přidat ke každému vzorku asi 1yul 5 mg/ml DNA ze sonikované E. coli.

CS 276 453 B6

2. Ke každému vzorku DNA se přidá 100 pl sferoplastů. Inkubace se provádí po dobu asi 20 minut při teplotě místnosti.

3. Ke každému vzorku se přidá 1 ml roztoku PEG a inkubace se provádí při teplotě místnosti po dobu přibližně 15 minut.

4. Vzorky se 5 až 10 minut odstřeňují při 1 000 g a dekantuje se roztok PEG.

5. Vzorky se resuspendují ve 150 pl SOS a inkubují se 30 minut při teplotě místnosti.

6. Přidá se 850 pl sterilního 1 M sorbitolu a alikvotní díly vzorků se dále popsaným způsobem umístí na misky. ·

0. Regenerace sferoplastů ,

1. Předpis pro regenerační agarové médium:

a. Agar-KCl- 9 g bakto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml t-^O, autoklávování.

b. 10X glukóza - 20 g dextróza, 100 ml H₂0, autoklávování.

c. lOx SC- 6,75 g dusíkové báze kvasinek bez aminokyselin, 100 ml HjO, autoklávování (před nebo po autoklávování se přidá kterákoliv požadovaná aminokyselina nebo nukleová kyselina až do koncentrace 200 Aig/ml).

d. přidá se 30 ml lOx glukózy a 30 ml lOx SC k 300 ml roztaveného agar-KCl roztoku. Přidá se 0,6 ml 0,2 mg/ml biotinu a kterékoli jiné požadované aminokyseliny nebo nukleové kyseliny do koncentrace 20 pg/ml. Roztavený regenerační agar se udržuje při 55 až 60 °C.

2. Umístování transformačních vzorků na misky:

Spodní agarová vrstva 10 ml regeneračního agaru se nalije na každou misku alespoň 30 minut před dohotovením transformačních vzorků. 10 ml alikvotní díly regeneračního agaru se rozdělí do zkumavek v lázni o teplotě 45 až 50 °C během doby, kdy jsou transformační vzorky v SOS. Celé množství vzorku se přidá k 10 ml alikvotnímu dílu roztaveného regeneračního agaru udržovaného při 45 až 50 °C a směsi se nalijí na misky obsahující 10 ml pevnou spodní agarovou vrstvu z regeneračního agaru,

3. Stanovení kvality Sféroplastového preparátu

Oddělí se 10 pl jednoho vzorku a lOOnásobně zředí přídavkem k 990 pl l.M sorbitolu. Oddělí se 10 pl lOOnásobně zředěného roztoku a provede se nově 100 násobné zředění přídavkem k dalšímu 990 pl alikvotnímu dílu 1 M sorbitolu. Na miskách se YPD agarové médium převrství vždy 100 pl obou zředěných roztoků za účelem stanovení koncentrace nesféroplastovaných celých buněk zbylých v preparátu. Přidá se 100 pl každého z obou zředěných roztoků k 10 ml regeneračního agaru, doplněného 40 pg/ml histidinu za účelem stanovení celkového množství regenerovatelných sferoplastů. Příznivé hodnoty pro transformační experiment jsou

3 až 3.10 celkem regenerovatelných sféroplastů/ml a asi 1.10 celých buněk/ml.

Příklad II

Konstrukce rodiny vektorů pA0P2

1. Plasmid pPG2.5 (plasmid na bázi pBR322 obsahující přibližně 2,5 kbp EcoRI-SalI fragment z plasmidu pPG4.0, kterýžto plasmid obsahuje primární alkoholoxidázový gen (A0X1) a regulační oblasti a je dostupný v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15868 ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA) se digeruje BamHI.

2. Linearizovaný plasmid se digeruje BAL31;

3. Na výslednou DNA se působ! Klenowovým fragmentem, aby se aktivovaly tupé konce a provede se ligace k EcoRI linkerům;

4. Produkty ligace se transformují do kmene E. coli MM294;

CS 276 453 B6

5. Transformanty se podrobí skríningu koloniovou hybridizací za použití syntetického oligonukleotidu s následující sekvencí:

TTATTCGAAACGGGAATTCC.

Tento oligonukleotld obsahuje sekvenci promotoru AOXl až po kodon ATG iniciace, nikoliv však včetně něho, připojenou k sekvenci EcoRl linkeru.

6. Pozitivní klony se sekvencují Maxam-Gllbertovou technikou. Všechny tři pozitivní klony mají následující sekvenci:

5'...TTATTCGAAACGAGGAATTCC.. .3'.

Všechny si podržely A z ATG (podtrženo ve shora uvedené sekvenci). Bylo rozhodnuto, že toto A pravděpodobně nebude na závadu; všechny následující klony jsou deriváty těchto pozitivních klonů. Tyto klony obdržely laboratorní označení pAOPl, pA0P2 a pA0P3.

7. Při skríningu produktů ligace BAL31/linker byly identifikovány dva další klony. Mají následující sekvenci:

5'... TAATTATTCGGAATTCC ...3' pAOXl EcoRl

Tyto klony byly označeny pAOP5 a pA0P6. *

Při variaci tohoto postupu se plasmid pPG2.5 rozštěpí AsuII místo BamHI, na linearizovaný fragment se působí Klonowovým fragmentem (neprovádí se zpracování BAL31, jako tomu bylo shora) a provede se ligace k EcoRl linkerům. Výsledný plasmid obsahuje sekvence promotoru AOX1, nikoliv však iniciační kodon ATG. Takto připravený plasmid byl označen pAOP4 a má následující sekvenci:

5'... TAATTATGGAATTC ...3' pAOXl EcoRl

Promotor A0X1 (pAOXl) responduje na katabolickou represi uhlíku prudkým přerušením syntesy enzymu. Kromě toho responduje AO promotor na nedostatek zdroje uhlíku. Růst na methanolu vede k další indukci A0X1 promotoru. Kromě toho je z rozsáhlého studia, které je například publikováno v Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold a Gingeras, Molecular and Cellular Biology, květen 1985, str. 1111 - 1121, zřejmé,že fragment A0X1 promotoru použitý podle vynálezu je regulován podobným způsobem jako promotor AOX1 v chromosomu. Všechny klony připravené a izolované způsobem popsaným v tomto přikladu responduji na katabolickou represi, nedostatek zdroje uhlíku a indukci methanolem, jako to činí samotný A0X1 promotor

Popis AO terminátoru

Fragment Stuí-HindlII použitý jako AO terminátor obsahuje sekvence poskytující templát pro polyadenylaci transkriptu AOX1 mRNA. Tyto sekvence zahrnují

TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-polyadenylace.

Když je Stuí-HindlII fragment umístěn na plasmidu 3' k polypeptid kódující oblasti, promotuje terminaci RNA. Byly izolovány terminační sekvence AOXl a lze je získat z plasmidu pPG3.2, což je plasmid na bázi pBR322 obsahující terminační sekvence AOXl. Plasmid transformovaný do hostitele E. coli bude veřejnosti k dispozici po udělení patentu na tuto přihlášku ve sbírce Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois USA pod identifikačním číslem NRRL B-15999.

Příklad III

Sekvence stupňů použité pro přípravu plasmidů v tomto příkladu jsou souhrnně něny na obr. 5.

znázor13

CS 276 453 B6

Konstrukce pBSAG5 a pBSAG5I

1. Konstrukce pCFL2

Vektor pA0P2, který obsahuje A0X1 promotor bez TG z ATG na svém 3'- konci se rozštěpí HincII. DNA fragment obsahující promotor byl izolován a ligován do pBR322, který byl před tím rozštěpen HindlII a vyplněn Klenowovým fragmentem. Touto reakcí vznikl vektor pCFL2.

2. Konstrukce pBSA0P2 pBR322-BglII, což je pBR322, jehož místo PvuII bylo nahrazeno místem BglII, byl digerován EcoRI a Claí. Linearizovaný plasmid byl ligací spojen s 5 AOXl-obsahujícím Clal/EcoRI fragmentem z pCFL2. Výsledný vektor byl označen pBSA0P2.

3. Konstrukce pBSAG22

Plasmid pHBS-5 (který popsal Valenzuela a další V Nátuře 298, 347 - 350 (1982); viz obr. 6), který obsahuje HBsAg gen insertovaný do místa EcoRI v pBR322, byl digerován Claí. Pomocí exonukleázy Bal31 bylo v obou směrech vyjmuto přibližně 60 bázových pásů. Zbývající fragment DNA byl digerován BamHI a vyplněn Klenowovým fragmentem. Po ligaci byla směs přibližně 20Q transformantů rozštěpena Ncol. Linearizované plasmidy byly izolovány a podrobeny nové ligaci. Po transformaci E. coli mělo přibližně 10 % všech plasmidů (označených pBSAGl) nově vytvořené místo Ncol. pBSAGl byl digerován Ncol, vyplněn Klenowovým fragmentem a digerován BamHI. Tento fragment plasmidu byl ligován k pBSA0P2, který byl před tím digerován EcoRI, vyplněn Klenowovým fragmentem a digerován BamHI. Výsledný vektor byl označen pBSAG22.

4. Konstrukce pB5AG4, pBSAG5, pBSAG5I

Plasmid pAOT-1, což je plasmid na bázi pBR322 získaný ligací 1,6 kbp Sall-HindlII fragmentu pPG3.2 (dostupného v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15999) do Sall-HindlII rozštěpeného pBR322 Δ EcoRI (tj. pBR322 se zničeným místem EcoRI; viz obr. 7), který nese 3'-A0X1 transkripční terminační fragment se rozštěpí Xbal a Pstl. Fragment obsahující terminátor se ligací spojí s p8SAG22, který byl před tím štěpen Xbal a Pstl, za vzniku pXP-1. pBSAG22 se digeruje Dral, pak se přidají Srul linkery a nakonec se použije Stul a EcoRI pro další digeraci. HBsAg strukturální gen se isoluje a liguje do pXP-1, který byl před tím štěpen Stul a EcoRI, za vzniku pBSAG4.

HBsAg obsahuje fragment Claí z pBSAG4 se liguje na jedinečné místo Claí pY333 (viz obr. 8) za vzniku pBSAG5 a pBSAG5I. Restrikční mapa plasmidu pBSAG5I je uvedena na obr. 11, Plasmidy pBSAG5 a pBSAG5I se liší pouze v orientaci fragmentu Claí, který obsahuje exprimeční kazetu 5 -AOXl/HBsAg/3 '-A0X1. V pBSAG5 sousedi tedy fragment 5*-A0Xl s genem Pichia HIS4, zatímco k fragmentu 3*-A0Xl přiléhá autonomní element PARS2. Plasmid pBSAG5 transformovaný do hostitele E. coli byl uložen ve sbírce kultur Northern Region Research Center of the United States Department of Agriculture, kde bude po udělení patentu na tuto přihlášku dostupný pro veřejnost. Kmen E. coli MC1061-pBSAG5 obdržel identifikační číslo NRRL B-18028.

Příklad IV

Konstrukce hostitele GS115 Pichia pastoris exprimujícího HBsAg (pBSAGI5I)

V tomto příkladu je popsána příprava hostitele Pichia pastoris, u kterého je v chromosomu primární alkohol oxidázový gen (A0X1) nahrazen genem povrchového antigenu hepatitis B.

Pro přípravu mutantu hostitele P. pastoris Aoxl^-, který exprimuje HBsAg se zkonstruuje plasmid pBSAGI5I, jak je to znázorněno na obr. 9 až 11.

Prvním stupněm při konstrukci je digerace A0X1 promotor-LacZ genového exprimačního vektoru pSA0H5 a A0X1 promotor-HBsAg exprimačního vektoru pTHBS3, které jsou připraveny

CS 276 453 B6 způsoby uvedenými dále a znázorněnými na obr. 13, restrikční endonukleázou HindlII. Pro přípravu pTHBS3 se plasmid pAOT-1 (viz obr. 7) rozštěpí Stul, liguje pomocí EcoRI linkerů a pak digeruje Pstl. Izoluje se EcoRI-Pstl fragment obsahující 3'-AOXl fragment. Vektor pAOP3, který obsahuje 5'-A0Xl sekvence, se rozštěpí EcoRI a Sstl; výsledný 5'-A0Xl fragment se liguje do E. coli-S. cerevisiae shuttle vektoru pSEYIOl (Douglas a další, 1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81 3983 - 3987), který byl před tím štěpen EcoRI a Sstl. Výsledkem ligace těchto pA0P3 a pSEYIOl fragmentů je plasmid pTA020. Plasmid pTA020 obsahuje geny URA3 a ampicilinu pro selekci v S. cerevisiae a bakteriích, 2 /j kruh pro replikaci v S. cerevisiae a 5^#-A0Xl sekvence.

Plasmid pTAO2O se zčásti štěpí Pstl. Linearizovaný vektor se izoluje a štěpí EcoRI. Největší fragment (který obsahuje 2 /1 kruhové Sekvence, gen URA3 a 5'rAOXl fragment) se liguje k 3'-A0Xl fragmentu získanému z pAOT-1, za vzniku vektoru pTHBSl.

HBsAg-obsahující EcoRI z pHBS-5 se izoluje digerací EcoRI a pak se liguje s pTHBSl, který byl před tím digerován EcoRI a zpracován bakteriální alkalickou fosfatázou. Výsledný vektor označený pTHBS2 obsahuje gen HBsAg vsunutý mezi 3'- a 5'-A0Xl sekvence.

Plasmid pY33O (který je k dispozici v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL 8-15890) se štěpí EcoRI, vyplní Klenowovým fragmentem a pak štěpí Pstl. P. pastoris HIS4/PARS1 obsahující fragment se isoluje a liguje s Pstl-Sstl fragmentem z vektoru pTHBS2 (který obsahuje HBsAg gen lemovaný Á0X1 sekvencemi). Touto ligací se získá vektor pTHBS3.

1,4 kbp fragment získaný z pTHBS3 po digeraci s HindlII (kterýžto fragment obsahuje HBsAg gen, AQX1 terminační sekvenci a část AOX1 promotorové sekvence) se izoluje a insertuje do 7,7 kbp fragmentu z pSA0H5, který obsahuje Pichia HIS4 gen, většinu A0X1 promotoro vě sekvence a sekvence z pBR322. Pak se izoluje 9,1 kbp rekombinantní plasmid, pYM39, který obsahuje restaurované AOX1 promotorové sekvence.

Ve druhém stupni konstrukce se plasmid pPG3,2 (dostupný v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15999) digeruje PvuII a 1,5 kbp fragment, který obsahuje sekvence bezprostředně 3' vzhledem k A0X1 genu se insertuje na jedinečné místo Nrul pYM39. Izoluje sé 10,6 kbp rekombinantní plasmid, pYMI6, který obsahuje PvuII fragment orientovaný tak, že 3'AOXl genové proximálni sekvence jsou orientovány k části vektoru tvořené HIS4 genem. Plasmid pYMI6 obsahuje všechny komponenty požadované pro deleci A0X1 genu z hostitele Pichia a expresi HBsAg pod kontrolou AOX1 promotoru, ale neobsahuje uspořádaný HBsAg genový fragment pBSAG5.

Posledním stupněm konstrukce je proto rekombinace požadovaného HBsAg genu do vektoru s deleci A0X1 genu. Za tím účelem se pYMI6 a pBSAGSI (plasmid identický s pBSAG5, který se liší jen tím, že fragment Clal, který obsahuje exprimační kazetu HBsAg má opačnou orientaci) se digerují restrikčními enzymy Pstl a SphI. 6,3 kbp fragment z pBSAGSI, který obsahuje uspořádanou HBsAg genovou exprimační kazetu a Pichia HIS4 gen, se insertuje do 4,6 kbp fragmentu z pYMI6, který obsahuje ~i‘ A0X1 sekvence á většinu pBR322 za vzniku konečného 10,9 kbp plasmidu pBSAGISI; Plasmid pBSAGI5I, nesený hostitelem E. coli, je uložen ve sbír ce kultur Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois pod identifikačním číslem NRRL B-18021.

Pro transformaci P. pastoris his4 mutantního kmene GS115 (NRRL Y-15851) se pBSAGI5I nejprve digeruje restrikčním enzymem BglII za vzniku 7,2 kbp lineárního vektoru, který obsahuje 0,85 kbp sekvence od konce 5’ AOX1 genu na jednom konci a 1,1 kbp sekvence od konce 3’ AOX1 genu na druhém konci (obr. 12). Asi 2 jug BglII štěpeného pBSAHI5I se transformuje do GS115 selekcí na histidinovou prototrofii. Transformací vznikne asi 5 x 10^ His⁺ kolonií.

Transformační pochody, při kterých se pBSAGI5I insertuje jako lineární molekula na chromosomální lokus A0X1 má za následek deleci genu A0X1, a bude veřejnosti k dispozici po udělení patentu na tuto přihlášku. His⁺-transformované kmeny, ve kterých došlo k požadované lineární inserci se proto identifikují podle velmi pomalého růstu na methanolu. (P.

CS 276 453 Βδ pastoris má druhý slabší alkohol oxidázový gen A0X2, který produkuje dostatečné množství alkohol oxidázy pro pomalý růst na methanolu těch kmenů, které jsou defektní, pokud se týče primárního alkohol oxidázového genu).

Postup identifikace His⁺ transformantů, které nejsou schopny dobře růst na methanolu zahrnuje nejprve izolaci His⁺ buněk uložených v selektivním agaru. Přitom se postupuje tak, že se agar převede do 50 ml zkumavky obsahující 20 ml sterilní vody a pomocí Brinkmanova homogeniseru se zpracovává na prášek po dobu 30 sekund při nízké rychlosti. Zbytky agaru se oddělí od buněk přefiltrováním směsi přes gázu a promytím agaru 30 ml sterilní vody. Kvasinkové buňky se pak zředí na optickou hustotu Aggg 0,1, sonikují se pomocí Bransonova sonifikátoru nastaveného do polohy 4, aby se shluky kvasinkových buněk rozdělily a zředí se stonásobně sterilní vodou. Alikvotní díly o objemu 10 a 100 /ii se rozprostřou na misky s agarem obsahujícím 0,67 % dusíkaté báze kvasinek bez aminokyselin (Difco) a 0,1 % glu-¹kozy. Po třídenní inkubaci při 30 °C se kolonie, které se vyvinou v miskách, podrobí skríningu, pokud se týče jejich schopnosti růstu na methanolu tak, že se replikují na sérii misek s agarem obsahujícím 0,67 % kvasinkové báze bez aminokyselin a následující zdroje uhlíku: 1) žádný zdroj uhlíku, 2) 0,5 % methanolu a 3) 2 % glukózy. Z kolonií, které rostly na 2 % glukózy nebylo schopno 32 % růst dobře na methanolu.

Aby se potvrdilo, že došlo k inserci pBSAGI5I sekvencí, jak je to znázorněno na obr. 12, podrobí se jeden kmen P. pastoris, který je defektní, pokud se týče utilizace methanolu, celkové extrakci DNA, která se pak digeruje restrikčními endonukleázami a hybridizuje metodou Southern blot pomocí vzorků značených Ρ. V jedné sérii zkoušek Southern blot se DNA z Aoxl” kmene GS115 (pBSAGI5I) a Aox⁺ kmene GS115 digerují HindlII a hybridizují značeným pG4.0, což je plasmid, skládající se z A0X1 genu a sekvencí z pBR322, který je dostupný v hostiteli E. coli ve sbírce kultur Northern Reglonal Research Center, Peoria, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL B-15868. V řadách obsahujících GS115 DNA je obsažen 2,3 kbp fragment, který zakódovává A0X1. Tento 2,3 kbp fragment však chybí a žádné nové fragmenty nejsou obsaženy v řadách,obsahujících GS115 (pBSAGI5I) DNA. Tento výsledek ukazuje, že gen A0X1 byl z kmene GS115 (pBSAGI5I) deletován.

Příklad V

Růst kvasinek Plchia transformovaných vektory kódujícími HBsAg

1. Růst GS115 (pBSAG5) ve fermentoru

V třepaoí baňce se při 30 °C nechá přes noc vyrůst 10 % inokulum na kvasinkové dusíkaté bázi (YNB) + 2 % glukózy. Inokulum se přidá ke sterilizovaným základním solím (jejichž pH bylo nastaveno na 4) ve fermentoru. Glukózová vsázka se přidává ředicí rychlostí 0,05 až 0,1 h^-'*·. Když dosáhne hustota buněk ustáleného stavu a koncentrace glukózy ve fermentoru se blíží hodnotě pod 100 ppm, indukuje se produkce HBsAg změnou uhlíkového zdroje ve vsázce na methanol nebo směs 50 % glukózy a 50 % methanolu.

2. Růst GS115 (pBSAGI5I) (Aoxl^-) ve fermentoru

Optimální exprese rozpustné HBsAg Ausria aktivity (3 až 4 % rozpustného proteinu) se dosáhne růstem tohoto Aoxl organismu vsázkovým způsobem na mediu obsahujícím glycerol a pak methanol. Inokulum se může nechat vyrůst na YNB + glycerol. Základní soli a glycerol (konkrétně bylo použito 1 % solí a 4 % glycerolu) a biotin se mohou ve fermentoru autoklávovat. Po ochlazení by se mělo pH nastavit na hodnotu od 3,5 do 6 a před inokulací by se měly přidat stopové soli (2,5 ml/1). Před nebo po vyčerpání glycerolu se může začít uvádět 100 % methanol. Koncentrace methanolu dó 2 % neinterferují s akumulací HBsAg, která může pokračovat až 200 hodin. 5 % methanolu ve fermentoru však zastavuje akumulaci HBsAg.

Růstu do vyšších hustot buněk lze dosáhnout zvýšením koncentrace solí. Pro zvýšení hustoty buněk, které rostou na methanolu je obzvláště důležité zvýšení koncentrace Zinku. Když nebyl růst limitován zinkem, dosáhlo se vyšších koncentrací extraktovatelné Ausria

CS 276 453 B6 aktivity, ale byla vyšší i hodnota extrahovatelného proteinu, takže došlo k celkovému poklesu Ausria aktivity, vyjádřené jako percentuální podíl rozpustného proteinu.

3. Růst buněčných kultur GS115 (pBSAG5) a GS115 (pBSAGI5I) v třepacích baňkách

Transformovaná kolonie se soustředí a ňaproužkuje na SD misku. Pruh buněk se inokuluje v 50 ml YNB bujónu (1 χ YNB, 5yug/ml biotinu) s 5 % glukózy ve 250 ml třepací baňce. Tře páni se provádí přes noc při 30 °C a otáčkách 250 min^-1 ve vzduchové třepačce. Ranní hodnota hustoty ODggg činí 2 až 3. Z třepací baňky se odstraní 100 OD^gg jednotek buněk (asi 109 buněk) a ty se odstředí v odstředivce IEC během 7 minut při 2000xg a teplotě místnosti. Buněčná peleta se resuspenduje v 500 ml YNB bujónu s 2 % glycerolu ve dvoulitrové třepací baňce (OD^gg - 0,2). Kultura se inkubuje při 30 °C a otáčkách 250 min¹ ve vzduchové třepač ce dokud se nedosáhne OD^gg 2 až 3. V případě hostitele Aoxl” se z kultury odstraní 500 jednotek OOggg· Buněčná suspenze se 7 minut odstřeďuje na IEC při 2000xg. Buněčná peleta se resuspenduje v 500 ml YNB bujónu s 0,5 % methanolu (1,0 OD^gg). ^v případě Aoxl⁺ hostitele se z kultury oddělí 170 OD^gg, odstředí za stejných podmínek a resuspenduje v 50 ml YNB bujónu za použití 0,5 % methanolu (0,3 Οθ/gg)· Obě kultury se třepou ve dvoulitrových třepacích baňkách při 30 °C a otáčkách 250 min^-1. Kdykoliv se dosáhne OD^gg 2, zředí se kultury stejným růstovým mediem. Periodicky se odebírají 100 OD^gg vzorky a odstřeďují se 7 minut při 200xg. Výsledné buněčné pelety se mohou 1 až 2 týdny skladovat ve zmrazeném stavu při -70 °C.

Příklad VI

Stanovení HBsAg: 22 nm částice a HBsAg monomer

1. Příprava extraktů a stanovení proteinu

Všechny následující operace se provádějí při teplotě 0 až 4 °C. Zmrazená buněčná peleta se nechá roztát, pak se promyje dvakrát 2 ml ledového solubilizačního pufru. Buňky (100 jednotek ODggg) se převedou do připravené skleněné zkumavky (13 x 100 mm). K buněčné peletě se přidá 0,35. ml solubilizačního pufru a 0,5 g skleněných kuliček opraných kyselinou (o průměru 0,45 mm). Suspenze se třepe v mixeru vytvářejícím vír, nastaveném na maximální hodnotu 4x vždy 1 minutu a v jednominutových intervalech mezi třepáním se udržuje na ledu. Pak se buněčná suspenze vyjme a skleněné kuličky se promyji 0,35 ml solubilizačního pufru. Promývací pufr se smísí s buněčnou suspenzí a převede do Eppendorfovy trubice. Extrakt se odstřeďuje v Eppendorfově odstředivce po dobu 15 minut. Oddělí se supernatant (rozpustná frakce; 0,7 ml). Pro extrakci HBsAg proteinu ze zbývající pelety se k peletě přidá 0,7 ml 2x koncentrovaného SDS-solubilizačního pufru a směs se míchá ve vírovém mixeru a vaří po dobu 15 minut. Pak se směs 15 minut odstřeďuje a supernatant (nerozpustná frakce) se oddělí od rozdrcených buněk. Alikvotní díly rozpustné a nerozpustné frakce se analyzují na obsah proteinu za použití TCA precipitace a Lowryho metody. Jako standard >

koncentrace proteinu slouží BSA. Jak nerozpustná, tak rozpustná frakce mívá obvykle koncentraci proteinu v rozmezí od 3 do 15 mg/ml.

2. Alternativní postup přípravy extraktů

Tento postup popisuje podmínky extrakce monomerního heterologického proteinu HBsAg nebo proteinového komplexu, 22 nm částice, z kultur Pichia Pastoris transformovaných vektory obsahujícími sekvence kódující protein HBsAg.

Kultury P. pastoris se nechají růst do dosažení hustoty buněk 10 až 100 ODggg jednotek na mililitr. Alikvotní díl 100 DDggg jednotek se převede do kultivační zkumavky z borosilikátového skla o rozměrech 13 x 100 mm a promyje se dvakrát 20 objemy solubilizačního pufru.

Buňky se peletizují (IEC klinickou centrifugou) a k peletě se přidá 0,5 g kyselinou opraných skleněných kuliček (o průměru 0,5 mm) a pak 0,35 ml solubilizačního pufr. Solubilizační pufr obsahuje buď 0,5 M chloridu sodného a 0,1 % Triton-u X-100 (hmotnost/objem),

CS 276 453 B6 jako kontrolní vzorek nebo 3 M koncentraci jodidu draselného nebo thiokyanátanu draselného, popřípadě v přítomnosti 0,1 % Triton-u X-100. Všechny roztoky jsou tlumeny na pH 7,5 10 mM fosforečnanu sodného. Směs se míchá čtyřikrát vždy po dobu jedné minuty maximální rychios- . tí ve vírovém mixeru, V přestávkách se směs chladí na ledu po dobu alespoň jedné minuty, Po skončení lyse se roztok rozdrcených buněk vyjme, skleněné kuličky se promyjí 0,35 ml solubilizačního pufru a oba roztoky se spojí a 15 minut odstřelují při 13000xg. Supernatanty se oddělí a analyzují na imunoreaktivní HBsAg částici (stanovení Ausria) a na celkový obsah proteinu, který lze srazit kyselinou trichloroctovou(Lowry). Výsledky, ve formě přehledu 5 pokusů, jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka I

Podmínky lyse	A	B	C
	HBsAg 22 nm	veškerý	HBsAg 22 nm
	částice	Protein	částice/protein
	(/ig/ml)	(/jl/ml)	(% hmot.)
sůl (koncentrace)
NaCl (0,5 M) + Triton	203 až 249	8,6 až 11,2	2,1 až 3,2
KI (3 M) + Triton	5,1 až 150	0,85 až 3,4	0,5 až 8,1
KI (3 M) - Triton	71 až 136	2,5 až 4,3	2,3 až 7,2
KSCN (3 M) + Triton	2,4 až 50	0,6 až 1,9	0,8 až 9,6
KSCN (3 M) - Triton	80 až 125	1,6 až 4,3	3,B až 16,7

Protože v žádném z případů s obsahem jodidu draselného nebo thiokyanatanu draselného se nedosáhlo vyšších hodnot HBsAg částice než v případě použití chloridu sodného (sloupec

A), je zřejmé, že jodid draselný nebo thiokyanátan draselný inhibují uvolňování veškerého proteinu (sloupec B), čímž se zvyšuje specifická aktivita částice dva až pětkrát (sloupec C).

TM

3. Stanovení 22 nm částice (souprava AUSRIA II)

Rozpustná frakce se zředí na 1000 až lOOOOnásobek zřeňovacím pufrem Ausria a alikvotni vzorky 25 a 100 jul se analyzují takto:

První inkubace

1. Pro konstrukci standardní křivky ředění se na dna jednotlivých jímek na reakční desce odpipetuje 0,1 až 4 ng kontrolní látky při celkovém objemu 200 /j1 (4 negativní kontrolní vzorky).

V případě analyzovaných vzorku se rovněž na dna oddělených jímek odpipetuje 200 jul zředěné rozpustné frakce.

2. Do každé jímky obsahující analyzovaný nebo kontrolní vzorek se opatrně vloží jeden kroužek. Alternativně se mohou kroužky rozdělit do důlků před uvedením analyzovaných nebo kontrolních vzorků.

3. Reakční deska se pak zakryje a kryt se uhladí, aby byly kroužky zakryty a aby se odstranily zachycené vzduchové bubliny.

4. Reakce se pak 2 hodiny inkubuje při 45 °C.

5. Krycí uzávěr se odstraní a zahodí. Kapalina se odsaje a každý kroužek se dvakrát opláchne 4 až 6 ml destilované nebo deionizované vody.

Druhá inkubace

95

6. Do každé jímky obsahující kroužek se odpipetuje 200 pl I-Anti-HBs.

CS 276 453 B6

7. Reakční deska se zakryje novým krytem a kryt se uhladí, aby byly kroužky zakryty a aby se odstranily zachycené vzduchové bubliny.

8. Reakční deska se pak 1 hodinu inkubuje při 45 °C.

9. Krycí uzávěr se sejme a zahodí. Kapalina se odsaje a každý kroužek se promyje 4x tak, jako ve stupni 5.

10. Kroužky se ihned převedou do řádně označených počítacích trubic.

Měření pomocí gamma-scintilačniho počítače:

11. Počet impulzů se měří po dobu 1 minuty.

12. Vzorky se měří do 24 hodin od posledního promytí.

Koncentrace 22 nm částic se vypočítá za použití standardní křivky sestrojené způsobem uvedeným ve stupni 1.

4. Stanovení monomeru (stanovení Western)

Ekvivalentní objem 2 /ig proteinu (rozpustné nebo nerozpustné frakce) obvykle 2 až 5 jul se zředí vodou na 10 pl. Přidá se 10 pl 2x koncentrovaného SOS gelového pufru (10 mM

DTT v lx pufru) a vzorek se vaří po dobu 15 minut. Povařené vzorky se nanesou na 12 % SOS akrylamidový gel (Laemmli). Po elektroforéze gelu se proteiny přenesou na nitrocelulózový papír (Towbin a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76, 4350 - 4354 (1979)). HBsAg se dete125 guje pomocí HBsAg antisera (vzneseného proti HBsAg z plasmy) a I-značeného proteinu A. Nitrocelulózový papír se exponuje na film Kodak XAR-5 přes noc při -70 °C. Kvantifikace mo nomeru se provede spočítáním radioaktivních pásů z nitrocelulózového papíru v gamma počítači. Rekombinantní HBsAg produkované S. cerevisiae (100 až 500 jug/pruh) se používá jako standardů.

Příklad VII

Úroveň exprese HBsAg v Pichia pastoris

Zkušebním postupem Uvedeným v příkladu VI za použití solubilizačního postupu uvedeného v části 1 příkladu VI se určí produkce HBsAg několika transformovanými kmeny P. pastoři Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce Π.

CS 276 453 B6

Tabulka II

transformovaný kmen	GS115 (pBSAGI5I)	GS115	(pBSAG5)
fenotyp	Aoxl His⁺	Aoxl⁺	His⁺
stav vektoru	integrovaný	autonomní
hladina HBsAg^{3 * * * * * * *} (třepací baňka)
počet buněk na 1 litr	10¹¹	IQ¹¹
monomer (%)	7	1,5
částice 22 nm (¾)	2,5	0,2
monomer (mg/1)¹³	8,4	1,8	*
částice 22 nm (mg/1)¹³	3	0,24

hladina HbSAg³ (růst ve fermentoru)

počet buněk na 1 litr	3.5xlO¹²	BxlQ¹²
monomer (¾)	7	1
částice 22 nm (¾)	2,9	0,1
monomer (mg/1)¹³	294	96
částice 22 nm (mg/1)¹³	122	10

^a stanovení proteinu; měření prováděno Bradfordovou metodou.

^b HBsAg na litr kultivačního média; ODggg = 5 x 10? buněk/ml = 0,14 mg sušiny/ml = 0,06 mg proteinu/ml.

Shora uvedené výsledky ukazují, že v Pichia pastoris se může produkovat vysoká hladina HBsAg, pokud je tento proces řízen regulační oblastí Pichia pastoris pro primární alkohol oxidázový gen (A0X1).

Shora uvedené příklady slouží pouze pro ilustrací vynálezu a nelze je považovat za omezující materiál pro následující definici předmětu vynálezu. Oo rozsahů nárokované ochrany spadají i určité variace a modifikace, které se nevzdalují od podstaty a ducha vynálezu .

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen kvasinek rodu Pichia transformovaný plasmidem v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku zvolený ze souboru zahrnujícího

CS 276 453 B6

a) regulační oblast, která je schopna řídit transkripci mediátorové RNA, pokud je umístěn na konci 5’ polypeptidové kódovací oblasti, přičemž tato regulační oblast je respon sivní k alespoň jedné z podmínek zahrnujících

i) přítomnost methanolu v kultivačním prostředí se kterým hostitelský organismus, obsahující uvedený DNA fragment, ve styku, ii) přítomnost zdroje uhlíku nevykazujícího katabolitovou represi odlišného od methanolu v kultivačním prostředí, se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku a iii) nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku poté, co byl hostitelský organismus nechán růst na zdroji uhlíku a energie vykazujícím katabolitovou represi a

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se povrchový antigen hepatitis B izoluje a čistí.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že regulační oblast v DNA fragmentu je charakterizována restrikční mapou znázorněnou na obr. 2.

4 až 8, vyznačující pA0P2, znázorněného se tím, na obr.

že regulační ob4.

13. Fragment DNA obsahující

14. Fragment DNA podle nároku 13, v němž je regulační oblast charakterizována restrikční mapou znázorněnou na obr. 2.

15. DNA fragment podle nároku 13 obsahující 3’ sekvenci DNA za polypeptid kódující oblastí, přičemž tato 3' sekvence DNA je schopna řídit polyadenylaci a terminaci transkripce mediátorové RNA, kódované touto polypeptid kódující oblastí.

16. DNA fragment podle nároku 13, který dále obsahuje alespoň jednu přídavnou sekvenci DNA odvozenou ze skupiny zahrnující

DNA bakteriálního plasmidu,

CS 276 453 B6

DNA bakteriofágu,

DNA kvasinkového plasmidu a

DNA kvasinkového chromosomu.

17. DNA fragment podle nároku 16, v němž DNA kvasinkového chromosomu obsahuje autonomně se replikující sekvenci DNA a markerový gen.

18. DNA fragment, podle kteréhokoliv z nároků 13 až 17, který dále obsahuje do série uspořádanou DNA zahrnující

- první insertovatelný fragment DNA,

- selektovatelný markerový gen a

- druhý insertovatelný fragment DNA, přičemž první a druhý insertovatelný fragment DNA má vždy délku alespoň 200 nukleotidů a obsahuje nukleotidově sekvence, které jsou homologické a částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia, přičemž DNA fragment a markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5' druhého insertovatelného fragmentu DNA a vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA je stejná jako v genomu Pichia.

19. DNA fragment podle nároku 13, v němž polypeptid kódující oblast v DNA fragmentu se skládá v podstatě z EcoRI-StuI fragmentu o asi 700 bázových párech s touto strukturou

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že DNA fragment obsahuje 3' sekvenci DNA za polypeptid kódujíc! oblastí, přičemž tato 3' sekvence ONA je schopna řídit polyadenylaci a termlnaci transkripce mediátorové RNA, kódované touto polypeptid kódující oblastí.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že DNA fragment dále obsahuje alespoň jednu přídavnou sekvenci ONA odvezenou ze skupiny zahrnující

DNA bakteriálního plasmidu,

DNA bakteriofágu,

DNA kvasinkového plasmidu a

DNA kvasinkového chromosomu.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že DNA kvasinkového chromosomu obsahuje autonomně se replikující sekvenci DNA a markerový gen.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že DNA fragment dále obsahuje do série uspořádanou DNA zahrnující

- první insertovatelný fragment DNA,

- selektovatelný markerový gen a

- druhý insertovatelný fragment DNA, 'přičemž první a druhý insertovatelný fragment DNA má vždy délku alespoň 200 neukleotidů a obsahuje nukleotidové sekvence, které jsou hcmologické s částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia, přičemž DNA fragment a markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5’ druhého insertovatelného fragmentu DNA a vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA je stejná jako v genomu Pichia.

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že polypeptid kódující oblast v DNA fragmentu Se skládá v podstatě z EcoRI-StuI fragmentu a asi 700 bázových párech s touto strukturou

CS 276 453 B6

-GAATTCATGG AGAACATGAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT CCTCACAATA CCGGAGAGTC TAGAGTCGTG GTGGACTTCT CTCAATTTTC TAGDGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATGACTCAC CAACCTCGTG TCCTCCAATT TGTCGTGGTT ATGGCTGGAT GTGTCTGCGG CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTGAGTC CGTTTCTCTT GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTGGTAGG GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA CATTTAAGGC CT-3'.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, dem je pBSAG5.

že uvedeným plasmi

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, midem je BSAG5I, znázorněný na obr.

11.

vyznačující se tím, že uvedeným plašil. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, midem je pBSAGI5I, znázorněný na obr. 11.

vyznačující se tím, že uvedeným plas

12.

last a 3

Způsob podle kteréhokoliv z nároků sekvence jsou odvozeny z plasmidu

5’-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT GCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC GCAAAATACG TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA CATTTAAGGC CT-3' 20. Plasmid obsahující DNA fragment podle nároku 13, bakteriální plasmidovou selekt ovatelný kvasinkový markerový gen s kvasinkovou automní replikační sekvenc