DD252614A5 - Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigenen - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von neuen DNA-Bauteilen, die die regulatorischen Bereiche und den Strukturkodierungsbereich fuer Hepatitis B-Oberflaechenantigen (HBsAg) enthalten, beschrieben. Die verwendeten regulatorischen Bereiche reagieren auf Methanol, Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquellen und Katabolit-Repressionskohlenstoffquellen unter anschliessender Einhaltung von Kohlenstoffmangelbedingungen. Die DNA-Bauteile koennen einer Reihe von linearen und kreisfoermigen Plasmiden einverleibt werden. Derartige Plasmide werden zur Transformation von geeigneten Wirten und schliesslich zur Bildung und Isolierung von Hepatitis B-Oberflaechenantigen in hohen Ausbeuten verwendet.
Description
Titel der Erfindung:
Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen.
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen.
Mit zunehmender Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik in den zurückliegenden Jahren ist die kontrollierte Herstellung einer grossen Anzahl von wertvollen Polypeptiden mit Hilfe von Mikroorganismen möglich geworden. Viele eukaryontische Polypeptide, z.B. menschliches Wachstumshormon,
^303*1
Leukozyteninterferone, menschliches Insulin und menschliches Proinsulin, werden bereits mit Hilfe von Mikroorganismen hergestellt. Die weitere Anwendung der bereits zur Verfügung stehenden Technik lässt die Herstellung einer Reihe von weiteren wertvollen Polypeptiden mit Hilfe von Mikroorganismen erwarten. Ein derartiges Polypeptid ist das Hepatitis B-Oberflächenantigen.
Der Hepatitis B-(Serum Hepatitis)-Virus wird unter Menschen übertragen und verursacht chronisch entkräftende Infektionen, die mit zunehmendem Verlauf zu schweren Leberschädigungen, primären Karzinomen und schliesslich zum Tod führen können. In den meisten Fällen lässt sich eine vollständige Wiedergenesung von Hepatitis B-Infektionen erwarten. Jedoch sind grosse Bevölkerungsteile, insbesondere in vielen afrikanischen und asiatischen Ländern chronische Träger dieser Krankheit, was die Gefahr einer pandemischen Übertragung der Krankheit mit sich bringt.
Eine wirksame Prophylaxe gegen den Hepatitis B-Virus besteht in der Verabreichung eines Hepatitis B-Virus-Impfstcffs, bei dem es sich im allgemeinen um ein hochgereinigtes Hepatitis B-Oberflächenantigen handelt. Ein derartiger Hepatitis B-Virus-Impfstoff verhindert eine Infektion durch den Virus. Gruppen mit erhöhtem Risiko sind Personen, die Bluttransfusionen oder eine Dialysebehandlung benötigen, medizinisches Personal, das diese Gruppen betreut, und dergl. Ferner ist ein derartiger Impfstoff auch insofern wirksam, dass er die Entstehung neuer Überträgergenerationen verhindert, so dass es möglich sein könnte, den Hepatitis B-Virus auf der ganzen Welt vollständig zu beseitigen.
Der Hepatitis B-Virus ist gegenüber Zellkulturen nicht infektiös und kann daher nur von infizierten Menschen oder höheren Primaten erhalten werden. Somit ist es nicht möglich, den Hepatitis B-Virus in Mengen, die zur Antigenherstellung zur Immunisierung gegen Hepatitis B-Virus ausreichen, zu erhalten.
43031-
k 5 2 6 14
Hepatitis B-Virus-Impfstoff wird im allgemeinen hergestellt, indem man Hepatitis B-Oberflächenantigen aus Blutplasma von Hepatitis- B-Virusträgern isoliert und reinigt. Eine derartige Reinigung muss jedoch in äusserst wirksamer Weise durchgeführt werden, da im zu reinigenden Plasma nur sehr geringe Konzentrationen des gewünschten Antigens vorliegen. . Somit hat es sich bisher als sehr schwierig erwiesen, den gewünschten Hepatitis B-Virus-Impfstoff in grosstechnischem Masstab herzustellen.
Ziel der Erfindung; ^
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen bereitzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen bereitzustellen, das in hohen Ausbeuten abläuft. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuen DNA-Bausteinen, die zur Expression von Hepatitis B-Oberflächenantigen in hohen Konzentrationen in der Lage sind.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hepatitis B-Oberflächenantigen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen durch Transformation erhaltenen Hefestamm in einem Nährmedium züchtet, das
(I) mindestens eine Kohlenstoff- und Energiequelle . aus der Gruppe Methanol und Katabolit-Nichtrepressionskohlenstoffquellen, oder
(II) mindestens eine Katabolit-Repressionskohlenstoff- und -energiequelle
enthält, mit der Massgabe, dass im Fall (II) das erhaltene Produkt Kohlenstoffmangelbedingungen
ausgesetzt wird, wobei das Plasmid ein DNA-Fragment,
252 ί 1
1 bakterielle Plasmid-DNA,
ein selektierbares Hefe-Markergen und eine autonome Hefe-Replikationssequenz enthält und wobei das DNA-Fragment folgendes umfasst: 5 (a) einen regulatorischen Bereich, der zur Kontrolle
der Transkription von Messenger-RNA bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-kodierenden Bereichs in der Lage ist, wobei der regulatorische Bereich auf mindestens einen der folgenden Zustände reagiert (i) Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist, (ii) Anwesenheit einer von Methanol abweichenden Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquelle im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist, und (iii) Kohlenstoffmangelbedingungen im Kulturmedium,
mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus nach Wachstum des Wirtsorganismus auf 20- einer Katabolit-Repressionskohlenstoff- und -energiequelle in Kontakt ist; und
(b) einen Polypeptid-Kodierungsbereich, der für Hepatitis B-Oberfläc.henantigen oder Teile davon kodiert
-
Fig. 1 ist eine Restriktionskarte des regulatorischen Bereichs des Pichla-Dihydroxyaceton-synthase-Gens (DAS). . '
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte des regulatorischen Bereichs des ersten Pichia-Alko.hol-oxidase-Gens (A0X1).
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte des regulatorischen Be-35reichs des Pichia-p^lO-Gens.
Fig. 4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pA0P2.
-5.5.(17- η3Go w
O Γ ί .ί j
Fig. 5 zeigt schematisch die Konstruktion der Plasmide pBSAG5 und pBSAG5I.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pHBS-5. 5 Fig. 7 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pAOT-1.
Fig. 8 ist eine Restriktionskarte des Plasmids ρ J33.
Fig. 9 erläutert die Konstruktion des Plasmids pYM39 aus den Plasmiden pSA0H5 und pTHBS3.
Fig. 10 erläutert die Konstruktion des Plasmids pYMl6 aus den Plasmiden pYM39 und pPG3.2. 15 Fig. 11 erläutert die Konstruktion des Plasmids pBSAGI5I aus den Plasmiden ρΥΜΙβ und pBSAG5I.
Fig. 12 erläutert die Insertion eines Teils des Plasmids pBSAGI5I in die Stelle der ersten Alkohol-oxidase (A0X1 ) des Pichia-Chromosoms.
Fig. 13 zeigt in schematischer Weise die Konstruktion des Plasmids pTHBS3. 25 In den Figuren werden folgende Abkürzungen für die Restriktionsenzyme verwendet.
| Abkürzung | Restriktionsenzym |
| As | Asull |
| B | Bairitil |
| B2 | BgIIl |
| Bc | Bell |
| C | CJaI |
| H2 | üincll |
| H3 | Hindill |
| K | Kpnll |
-5Λ87- A3031C
Ί5Ϊ6 1
- 6 Abkürzung Restriktionsenzym
Nd1 Ndel
Nr Nrül
r, Ps Pstl
Pv1 Pvul
Pv2 Pvull
R5
S
Sp Sphl
Ss Sstl
St StUl
Xb Xbal
Xh #ΛοΙ
In den Figuren sind für die Manipulation von DNA-Fragmenten verwendete Restriktionsstellen, die nach der Ligation zerstört werden, so gekennzeichnet, dass die Abkürzung für die zerstörte Stelle in Klammern gesetzt ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von DNA-Fragmenten, die aus einem regulatorischen Bereich und einem Polypeptid-kodierenden Bereich bestehen, wobei der Polypeptid-kodierende Bereich für Hepatitis B-Oberflächenantigen oder Teile davon kodiert und der regulatorische Bereich in der Lage ist, die Transkription von Messenger-RNA bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-kodierenden Gens zu kontrollieren. Die Herstellung dieser DNA-Fragmente wird durchgeführt, indem man die einzelnen Bestandteile miteinander kombiniert.
•Die Kombination aus regulatorischem Bereich, Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Gen und einem transkriptionalen Terminatorfragment wird nachstehend als Expressionskassette oder Expressionseinheit bezeichnet. Der in der erfindungsgemässen Praxis verwendete regulatorische Bereich reagiert
-5 5.31·. A3031 ^
-ΤΙ auf mindestens einen der folgenden Zustände:
Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium, mit dem ein die .Expressionskassette enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist, Anwesenheit einer von Methanol abweichenden Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquelle im Kulturmedium, mit dem ein die Expressionskassette enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist; und
Kohlenstoffmangelbedingungen im Kulturmedium, mit dem ein die Expressionskassette enthaltender Wirtsorganismus nach Wachstum des Wirtsorganismus auf einer Katabolit-Repressionskohlenstoff- und -energiequelle in Kontakt ist.
Ferner werden erfindungsgemäss neue lineare und kreisförmige Plasmide mit einem Gehalt der vorstehend beschriebenen Expressionskassetten hergestellt.
Weiter betrifft die Erfindung die Bereitstellung von im wesentlichen reinen Kulturen von Hefestämmen, die mit den vorstehend beschriebenen linearen oder kreisförmigen Plasmiden transformiert sind.
Die in der erfindungsgemässen Praxis verwendeten regulatorischen Bereiche sind durch ihre Fähigkeit zur Reaktion auf Medien mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen charakterisiert:
(1) Methanol,
(2) Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquellen, z.B. Glycerin, Galactose, Acetat und dergl.,
(3) Katabolit-Repressionskohlenstoffquellen, z.B. Glucose, Ethanol, Fructose und dergl. unter anschliessenden Mangelbedingungen an Kohlenstoffquellen.
Beispiele für regulatorische Bereiche, die den vorstehenden Kriterien genügen, sind durch die Restriktionskarten in Fig. 1, 2 und 3 wiedergegeben. Der in Fig. 1 wiedergegebene regulatorische Bereich leitet sich vom Dihydroxyaceton-synthase (DAS)-Gen von Pichia pastoris ab. Der in Fig. 2 dargestellte regulatorische Bereich leitet sich vom primären
-5.5.37- 43 031
Zwii 6 1
-δι Alkohol-oxidase (A0X1)-Gen von Pichia pastoris ab (Pichia weist zwei Älkohol-oxidase-Gene auf, die hier als AOX1 und
' A0X2 bezeichnet werden).Der in Fig. 3 dargestellte regulatorische Bereich leitet sich vom p40-Gen von Pichia pastoris ab. Für den Fachmann ist es ersi.chtlich, dass andere regulatorische Bereiche mit den vorstehend beschriebenen . Eigenschaften aus methylotrophen Hefen, z.B. Pichia pastoris, isoliert werden können. Derartige zusätzliche regulatorische Bereiche mit regulatorischen Eigenschaften, die denen der vorstehend beschriebenen regulatorischen Bereiche ähnlich sind, fallen ebenfalls unter den Gegenstand der Erfindung.
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Gen ist bereits früher isoliert worden (Valenzuela et al., Nature, Bd. 280, (1979), S. 815) und ist durch entsprechende Restriktionsenzymbehandlung einer Reihe von Vektoren zugänglich, z.B. pHBS-5 (vgl. Fig. 6 sowie Valenzuela et al., Nature, Bd. (1982), S. 3M7), pHBV-T-1A (EP-A- 73 657; Genentech), pHBS-56 (ATCC Nr. 40 047; EP-A-120 551) und dergl.
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde durch Bal3T-Exonucleasebehandlung zur Entfernung der viralen nicht-kodierenden Sequenzen am 5'-Ende des Hepatitisgens modifiziert. Das 3'-Ende des HBsAg-Gens wurde durch Endonucleaseverdauung und Zugabe eines Linkers zur Entfernung von viralen, nicht-kodierenden Sequenzen am 3'-Ende des Hepatitisgens modifiziert. Das Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Gen wurde ferner modifiziert, um für die Manipulation des DNA-Fragments zweckmassige Restriktionsstellen einzubauen. Beim erhaltenen DNA-Fragment handelt es sich um ein EcoRI-StuI-Insert mit folgender Nucleotidsequenz:
-£ 5.87- 43031-
5'-GAATTCATGG TGCTCGTGTT CCTCACAATA CTCAATTTTC ATTCGCAGTC TCCTCCAATT CGTTTTATCA TCTTCTTATT CGTTTGTCCT GGACCATGCA CTATGTTTCC AAATTGCACC GCAAAATACC GGCTCAGTTT GCTTTCCCCC TGGTATTGGG TTATACCGCT CATTTAAGGC
AGAACATCAC ACAGGCGGGG CCGCAGAGTC TAGGGGGATC CCCAACCTCC TGTCCTGGTT TATTCCTCTT GGTTCTTCTG CTAATTCCAG AAACCTGCAC CTCATGTTGC TGTATTCCCA TATGGGAGTG ACTAGTGCCA ACTGTTTGGC GGCCAAGTCT GTTACCAATT CT-3'
ATCAGGATTC TTTTTCTTGT TAGACTCGTG TCCCGTGTGT AATCACTCAC ATCGCTGGAT CATCCTGCTG GATTATCAAG GATCAACAAC GACTCCTGCT TGTACAAAAC TCCCATCGTC GGCCTCAGTC TTTGTTCAGT TTTCAGCTAT GTACAGCATC TTCTTTTGTC
CTAGGACCCC TGACAAGAAT GTGGACTTCT CTTGGCCAAA CAACCTCCTG GTGTCTGCGG CTATGCCTCA GTATGTTGCC AACCAGTACG CAAGGCAACT CTACGGATGG CTGGGCTTTC CGTTTCTCTT GGTTCGTAGG ATGGATGATG GTGAGTCCCT TCTGGGTATA
Die erfindungsgemässen Konstruktionen aus Regulations-Bereich-Strukturgen können den Organismen durch Amplifikation, Reproduktion und Expression auf einer Reihe von Wegen
25 zugeführt werden. Für die autonome Replikation in Hefe ist ein autonomes Replikationssequenz (ARS)-Element geeignet. Beispiele hierfür sind die von Pichia pastoris abgeleiteten Elemente PARS1 und PARS2 (vgl. US-Anmeldung SN 666 577, Erfinder Cregg, übertragen auf Philips Petroleum Co.). Wird
30 statt dessen eine integrative Transformation des Wirts gewünscht, so wird kein ARS-Element verwendet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzielung einer integrativen Transformation ist in der US-Anmeldung SN 791 013, Erfinder Cregg, übertragen auf Philips Petroleum Co., beschrieben, wobei ein
35 ortsgerichteter Integrationsvektor verwendet wird, der folgende Bestandteile umfasst:
ein erstes insertierbares DNA-Fragment, ein selektierbares Markergen und
-5Λ87
430315
- 10 * ein zweites insertierbares DNA-Fragment.
Das erste und zweite insertierbare -DNA-Fragment weisen jeweils mindestens eine Länge von etwa 200 Nucleotiden auf und besitzen Nucleotidsequenzen, die zu den Bereichen der Genom-DNA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind. Die verschiedenen Komponenten des integrativen Vektors werden seriell unter Bildung eines linearen DNA-Fragments angeordnet, so dass sich die Expressionskassette und das selektierbare Markergen zwischen dem 3'-Ende des ersten insertierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten insertierbaren DNA-Fragments befinden. Das erste und zweite insertierbare DNA-Fragment sind im seriell angeordneten linearen Fragment so zueinander orientiert, wie sie im Genom von Pichia orientiert sind.
Es ist erforderlich, der zur Transformation des Wirtstamms verwendeten DNA mindestens ein selektierbares Markergen einzuverleiben. Dies erleichtert die Selektion und Isolation von solchen Organismen, denen die transformierende DNA einverleibt ist. Das Markergen verleiht dem transformierten Organismus ein phänotypisches Merkmal, das beim. Wirt nicht vorhanden war, z.B. die Wiederherstellung der Fähigkeit zur Bildung einer speziellen Aminosäure, sofern der nichttransformierte Wirtstamra einen Defekt im Biosyntheseweg der speziellen Aminosäure aufwies.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zusätzliche DNA-Sequenzen ebenfalls den in der erfindungsgemässen Praxis verwendeten Vektoren einverleibt werden können, z.B. bakterielle Plasmid-DNA, Bakeriophagen-DNA und dergl. Diese Sequenzen ermöglichen die Amplifikation und die Aufrechterhaltung dieser Vektoren in bakteriellen Wirten.
Expression in transformierter Hefe
Die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemässen Plasmide eignen sich zur Verwendung in Hefestämmen, die transfor-
-5.5.37- H3G31-
fiert werden können. Die Regulation der Genexpression in Hefe durch die erfindungsgemässen DNA-Fragmente kann erzielt werden, indem man die transformierten Organismen einem Mangel (starvation) an Kohlenstoffquellen aussetzt. Durch die Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen nach dem Wachstum auf einer Reihe von Katabolit- und Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquellen wird die Expression des Genprodukts unter der Kontrolle der erfindungsgemässen regulatorischen Bereiche induziert. Ein weiteres Mittel zur Erzielung der Expression des gewünschten Genprodukts in entsprechenden Spezies von transformierter Hefe besteht in der Züchtung der transformierten Hefe auf Methanol. Ein weiteres Mittel zur Erzielung der Expression des gewünschten Genprodukts besteht in der Züchtung der transformierten Hefe auf Medien, die Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquellen enthalten.
Die erfindungsgemässen regulatorischen Bereiche eignen sich zur Expression in sämtlichen Hefestämmen, da gezeigt werden konnte, dass die regulatorischen Bereiche unter einer Reihe von verschiedenen Bedingungen induziert werden können. So kann man Hefen, die zum Wachstum auf Methanol oder auf Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquellen in der Lage sind, zur direkten Bildung von fremden, d.h. heterologen Polypeptiden veranlassen. Hefen, die zu Wachstum auf Katabolit-Repressionskohlenstoffquellen in der Lage sind, kann man zur Bildung von fremden Polypeptiden veranlassen, indem man die so gezüchteten Hefezellen Mangelbedingungen an Kohlenstoffquellen aussetzt.
Im erfindungsgemässen Verfahren werden vorzugsweise transformierte Hefestämme folgender Gattungen verwendet:.
Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis, Pichia und Kluyveromyces. Hefen dieser Gattungen werden aufgrund ihrer sicheren Handhabungsbedingungen, ihrer günstigen Wachstumsbedingungen und dergl. bevorzugt. Derartige Hefen sind dem Fachmann geläufig.
Besonders bevorzugte Hefestämme zur Verwendung bei einer
-5.5.37- 43
Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens sind solche, die zum Wachstum auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle in der Lage sind. Beispiele für zum Wachstum auf Methanol fähige Hefen sind Hefen der Gattungen: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis und Pichia.
Da die erfindungsgemässen regulatorischen Bereiche auch durch Züchtung auf Nichtkatabolit-.Repressionskohlenstoffquellen sowie unter Mangelbedingungen in bezug auf Kohlenstoffquellen induziert werden, sind in der erfindungsgemässen Praxis auch Hefestämme geeignet, die zum Wachstum auf nicht-methanolischen Substraten, wie Glucose, Acetat, Glycerin, Ethanol, Lactose, Galactose, Fructose, Saccharose und dergl. sowie Gemische aus zwei oder mehr dieser Bestandteile, geeignet sind. Durch Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigneten Nichtkatäbolit-reprimierbaren, nicht-methanolischen Kohlenstoffquelle, z.B. Glycerin oder Galactose, oder durch Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigneten Katabolit-reprimierbaren Kohlenstoffquelle, z.B. Ethanol, Glucose und Fructose, wobei man anschliessend den Wirtsorganismus Mangelbedingungen in bezug auf Kohlenstoffquellen aussetzt, kann die Expression eines Genprodukts unter der Kontrolle der erfindungsgemässen regulatorischen Bereiche erreicht werden.
Ein besonders bevorzugter Wirtshefestamm ist die Mutante Pichia pastoris GS115, bei der es sich um eine Mangelmutante in bezug auf die Fähigkeit zur Bildung von Histidin handelt. GS115 wurde aufgrund seines Defekts im Histidin-
Stoffwechsel, der das für Histidinol-dehydrogenase kodierende Gen betrifft, als mutanter Genotyp his4 bezeichnet. GS115 ist von Pichia pastoris NRRL Y-I1430 abgeleitet und wurde beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Nr. NRRL Y-15851 hinterlegt. Dieser spezielle Wirt ist geeignet, da es sich um eine auxotrophe Mutante mit einem Mangel im Histidinstoffwechsel handelt. Die -Transformation
-£5.87- 43031-
dieses Wirts mit einem Vektor, der neben anderen DNA-Sequenzen auch Sequenzen, die für die HIS^-Genfunktion kodieren, enthält, erlaubt eine einfache Selektion der transformierten Wirte
5
Ein weiterer, in der erfindungsgemässen Praxis bevorzugter Hefestamm ist die Mutante Pichia pastoris GS190, bei der es sich um eine Mutante mit einem Mangel im Argininstoffwechsel, der das für die Argininosuccinat-lyase kodierende Gen betrifft, handelt. GS190 ist von Pichia pastoris NRRL Y-11430 abgeleitet und wurde beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois unter der Nr. NRRL Y-18014 hinterlegt.
Ein weiterer bevorzugter Wirtshefestamm ist die doppeltauxotrophe Mutante PPF1, die sowohl einen Mangel im Histidinstoffwechsel als auch im Argininstoffwechsel aufweist. PPF1 weist einen Mangel im Histidinstoffwechsel, der das für Histidinol-dehydrogenase kodierende Gen betrifft, sowie im Argininstoffwechsel, der das für Argininosuccinat-lyase kodierende Gen betrifft, auf. PPF1 wurde beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois unter der Nr. NRRL Y-18017 hinterlegt.
Escherichia coli eignet sich ebenfalls als Wirt für die erfindungsgemässen Plasmide. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass viele Stämme von E. coli geeignete Wirte darstellen. Verschiedene, erfindungsgemäss verwendbare Stämme sind nachstehend zusammengestellt.
Stammbezeichnung Hinterlegungsnummer MC1061 nicht bekannt
LE392 ATCC Nr. 33572
MM294 ATCC Nr. 33625
Pichia pastoris-Transformationsverfahren Die experimentellen Verfahren zur Transformation von Pichia
CU7- h3Q31C;
pastoris sind früher beschrieben worden und werden nachstehend näher dargelegt (Beispiel I).
Pichia pastoris lässt sich durch enzymatische Verdauung der Zellwände unter Bildung von Sphäroplasten transformieren. Die Sphäroplasten werden sodann mit der transformierenden DNA vermischt und in Gegenwart von Calciumionen und PoIyethylenglykol inkubiert und anschliessend in einem selektiven Wachstumsmedium mit einem Mangel an Histidin regeneriert. Die transformierende DNA umfasst das HIS4-Gen, das beim Wirtsstamm fehlt. Somit können nur transformierte Zellen auf dem verwendeten selektiven Wachstumsmedium überleben.
Extraktion von Hepatitis B-Oberflächenantigen Der Fachmann kennt zahlreiche Verfahren zur Extraktion eines heterologen Proteins aus einem einzelligen rekombinanten Wirt. Beliebige, dem Fachmann geläufige Verfahren zum Aufbrechen von Zellen und zur Konzentration und/oder Extraktion von Protein aus den aufgebrochenen Zellen eignen sich zur Gewinnung des erfindungsgemäss gebildeten HBsAg.
Die transformierten Zellen wurden unter geeigneten Expressionsbedingungen, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet. Anschliessend wurden die Zellen aufgebrochen und sodann die löslichen und unlöslichen Fraktionen auf HBsAg analysiert·. Die lösliche Fraktion wurde auf 22 nm-Teilchen mit der handelsüblichen "AUSRIA® II"-Testpackung (Abbott Laboratories) analysiert. Die löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden auf Monomere unter Verwendung von Western-Blotting-Verfahren, bei denen Antiseren gegen die monomere Form von HBsAg und radioakti· wurden, analysiert.
125 HBsAg und radioaktiv J-markiertes Protein A verwendet
«0315
Ausführungsbeispiele
Die folgenden Abkürzungen werden in den gesamten Beispielen verwendet und haben folgende Bedeutungen:
10
SDS
EDTA
TEMED
DTT
BSA
EtBr
PMSF
Ci
Natriumdodecylsulfat Ethylendiamintetraessigsäure N,N,N',N'-Tetramethylendiamin Dithiothreit
Rinderserumalbumin Ethidiumbromid Phenylmethylsulfonylfluorid Curie
Zymolase .60 000
Quelle: Miles Laboratories
Die in den Beispielen verwendeten Puffer und Lösungen haben die nachstehend angegebenen Zusammensetzungen: 1m Tris-Puffer 121,1 g Tris-Base in 800 ml H3O;
Einstellung des pH-Werts auf den gewünschten Wert durch Zugabe von konzentrierter (35%) wässriger HCl;
Abkühlung der Lösung auf Raumtemperatur vor der endgültigen pH-Einstellung; Verdünnen auf ein Endvolumen von 1 Liter.
25 TE-Puffer
1,0 millimolar EDTA in 0,01 m (pH-Wert 7,4) Tris-Puffer..
PBS (phosphat- 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert gepufferte Koch- 7,0) salzlösung) 0,15 m NaCl.
SDS-Gelbeschikkungspuffer
35
62,5 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 6,8)
2% SDS
10% Glycerin
100 millimolar Dithiothreit 0,001% Bromphenolblau
4 5.37- A3031
Γ"
YPD-Medium
1% Bacto-Hefeextrakt 2% Bacto-Pepton 2% Dextrose
5 SD-Medium
6,75 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäure (DIFCO) 2% Dextrose in 1 Liter Wasser
10 SED 1 m Sorbit
25 millimolar EDTA 50 millimolar DTT
SCE-Puffer
15 9,1 g Sorbit 1 ,M7 g Natriumeitrat 0,168 g EDTA 50 ml H2O
pH-Wert auf 5,8 mit HCl
20 CaS 1 m Sorbit
10 millimolar CaCI steril filtrieren
PEG-Lösung
25 20% Polyethylenglykol 3350 10 millimolar CaCl3-
10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,4)
steril filtrieren
SOS
30 1 m' Sorbit
0,3 x YPD-Medium 10 millimolar CaCl,
Basissalzzusammensetzung (für das Fermenter-Wachstum von transformierter Pichia)
35 O λ
-5.5.37. '43031
H3PO4, 85% 4,2 ml
CaSO4.2H2O . 0,i8g K2SO4 2,86 g
MgSO4.7H2O .2,34 g
KOH ' 0,65 g
Pichia Zufuhrmedium (für das Fermenter-Wachstum von GS115/
| pBSAG5) | 10 | H3PO4 (85%) | g/Liter Wasser |
| CaSO4.2H2O | 3,5 ml | ||
| K2SO4 | 0,15 | ||
| MgSO4.7H2O | 2,38 | ||
| KOH | 1,95 | ||
| 15 | FeSO4.7H2O | 0,65 | |
| CuSO4.5H2O | 0,065 | ||
| ZnSO4.7H2O | 0,006 | ||
| MnSO4-H3O | 0,020 | ||
| Biotin | 0,003 | ||
| 20 | Kohlenstoffquelle | 0,000041 | |
| 20-100 g | |||
Spurensalzlösung (zum Wachstum von GS115(pBSAGI5I)) 25
| 5H2O | g/Liter Wasser | |
| CuSO4. | 0,06 | |
| KJ | H2O | 0,08 |
| MnSO4. | 4.2H20 | 0,3 |
| Na2MoO | 0,2 | |
| H3BO3 | 7H2O | 0,02 |
| ZnSO4. | 6H2O | 2,0 |
| FeCl3. | 4,8 | |
| H2SO4 | 3-5 ml/Liter | |
| (zur Entfernung von | ||
| Trübungen) | ||
-5.5.37- 4-3031 C
1 Ausria-Verdünnungspuffer
4,3 millimolar Na2 1,5 millimolar KH3PO4 2,7 millimolar KCl 0,15m NaCl 1% Rinderserumalbumin 0,02% Natriumazid endgültiger pH-Wert 7,4
10 Solubilisierungspuffer
10 millimolar Natrium phosphat puffer (pH-Wert 7,5) 0,5 m NaCl 0,1% Triton X-100 2 millimolar PMSF
Sofern nicht anders angegeben, stellen die vorstehenden Lösungen die verwendete Grundkonzentration (1x) dar. Sofern in den Beispielen davon abweichende Konzentrationen angewandt werden, wird dies so gekennzeichnet, dass für die jeweilige Lösung der Multiplikationsfaktor für die Grundkonzentration (1x) angegeben wird.
Pichia pastoris-Transformationsverfahren A. Zellwachstum
1. Eine Kolonie von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) wird auf etwa 10 ml YPD-Medium überimpft und 12 bis 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet.
2. Nach etwa 12 bis 20 Stunden werden die Zellen auf einen ODßOO-Wert von etwa 0,01 bis 0,1 verdünnt und etwa 6 bis 8 Stunden bei 30°C in YPD-Medium in der logarithmischen Wachstumsphase gehalten.
3. Nach etwa 6 bis 8 Stunden werden 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der Anzuchtkultur mit einem 0DgQQ-Wert von etwa
0,1 (oder mit einer hierzu äquivalenten Menge) beimpft. Sodann wird etwa 12 bis 20 Stunden bei 30°C geschüttelt.
4. Die Kultur wird bei einem ODgOQ-Wert von etwa 0,2 bis 0,3 (nach etwa 16 bis 20 Stunden) durch 5-minütige Zentrifugation bei 1500 g geerntet.
B. Herstellung von Sphäroplasteh
1. Die Zellen werden 1 mal in 10 ml sterilem Wasser gewasehen. (Sämtliche Zentrifugationen in den Stufen 1 bis 5 werden 5 Minuten bei 1500 g durchgeführt).
2. Die Zellen werden 1 mal in 10 ml frisch hergestelltem SED gewaschen.
3. Die Zellen werden 2 mal in 10 ml sterilem 1 m Sorbit
gewaschen.
4. Die Zellen werden in 10 ml SCE-Puffer resuspendiert.
5. 5 bis 10 ^l 4 mg/ml Zymolase 60 000 (Miles Laboratories)
werden zugesetzt. Die Zellen werden etwa 30 bis 60 Minuten bei 3O0C inkubiert.
Da die Herstellung der Sphäroplasten eine kritische Stufe beim Transformationsver.fahren darstellt, ist bei der Sphäroplastenbildung auf folgendes zu achten: 100 jjl-Aliquotanteile der Zellen werden zu 900 ,ul 5% SDS und 900 ,ul 1 m Sorbit vor oder unmittelbar nach der Zugabe der Zymoläse zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationsdauer gegeben. Die Inkubation wird zu dem Zeitpunkt gestoppt, wenn die Zellen der Lysis in SDS aber nicht in Sorbit unterliegen (im allgemeinen zwischen 30 und 60 Minuten Inkubationsdauer.
6. Die Sphäroplasten werden 2 mal durch 5- bis 10-minütige
Zentrifugation bei 1000 g in 10 ml sterilem 1 m Sorbit gewaschen (die Zentrifugationszeit und ^geschwindigkeit '
-.15.87·
können variieren; die Zentrifugation .soll zur Pelletbildung der Sphäroplasten ausreichen, jedoch soll die angewandte Kraft nicht zum Aufbrechen der Zellen führen.
7. Die Zellen werden 1 mal in 10 ml sterilem CAS gewaschen. 8. Die Zellen werden in insgesamt 0,6 ml CaS resuspendiert.
C. Transformation
1. DNA-Proben (bis zu 20 μΐ) werden in sterile Polypropylenröhrchen der Abmessungen 12 χ 75 mm gegeben. (DNA soll in Wasser oder TE-Puffer vorliegen. Zur Erzielung maximaler Transformationsfrequenzen mit geringen DNA-Mengen ist es ratsam,' jede Probe mit etwa 1 pl 5 mg/ml ultraschallbehandelter E. coli-DNA zu versetzen).
2. Die einzelnen DNA-Proben werden mit jeweils 100 μΐ Sphäroplasten versetzt und etwa 20 Minuten bei Raumtem-. peratur inkubiert.
3. Die einzelnen Proben werden mit jeweils 1 ml PEG-Lösung versetzt und etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Die Proben werden 5 bis 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, und die PEG-Lösung wird dekantiert.
5. Die Proben werden in 150 yl SOS resuspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
6. 850 ul steriles 1 m Sorbit werden zugesetzt, und Aliquotanteile der Proben werden auf die nachstehend beschriebene Weise ausgestrichen.
D· Regeneration der Sphäroplasten
1. Rezept für das Regenerationsagarmedium:
a. Agar-KCl: 9 g Bacto-Agar, 13,4 g KCl, 240 ml H3O, AutOkiavisierung.
31C
-5.5.37- V3031
b. 1OX Glucose: 20 g Dextrose, 100 ml H2O, Autoklavisierung.
c. .1OX SC: 6,75 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren,
100 ml HpO, Autokiavisierung. (Gewünschte Aminosäuren oder Nucleinsäuren werden vor oder nach der Autoklavisierung bis zu einer Konzentration von 200 ^g/ml zugesetzt).
d. 30 ml 10X Glucose und 10 ml 10X SC werden zu 300 ml der geschmolzenen Agar-KCl-Lösung gegeben. 0,6ml 0,2 mg/ml Biotin und beliebige andere gewünschte Aminosäuren oder Nucleinsäuren werden in einer Konzentration von 20 ^g/ml zugesetzt. Das geschmolzene Regenerationsagar wird auf 55 bis 6O0C gehalten.
2. Ausstreichen der Transformationsproben:
Mindestens 30 Minuten vor Fertigstellung der Transformationsproben werden Bodenagarschichten von 10 ml Regenerationsagar pro Platte gegossen. 10 ml Aliquotanteile. Regenerationsagar werden in Röhrchen, die sich in einem Bad von 45 bis 500C befinden, verteilt. Während dieser Zeit befinden sich die Transformationsproben in SOS. Ein Anteil der einzelnen Proben wird zu 10 ml-Aliquotanteilen des geschmolzenen, auf 45 bis 50°C gehaltenen Regenerati'onsagars gegeben. Sodann wird auf die Platten, die eine Bodenschicht aus 10 ml Regenerationsagar enthalten, gegossen.
3. Bestimmung der Qualität der Sphäroplastenpräparation:
10 μΐ einer Probe werden entfernt und durch Zugabe zu 990 ,ul 1 m Sorbit auf das 100-fache verdünnt. 10 μΐ der 100-fachen Verdünnung werden entfernt und durch Zugabe zu weiteren 990 ,ul 1 m Sorbit nochmals auf das 100-fache verdünnt. 100 μΐ Aliquotanteile beider Lösungen werden auf YPD-Agarmedium verteilt, um die Konzentration der im Präparat verbliebenen, nicht der Sphäroplastenbildung unterworfenen vollständigen Zellen zu bestimmen. 100 μΐ der einzelnen Lösungen werden zu 10 ml Regenerationsagar, das mit 40 ^g/ ml Histidin ergänzt ist, gegeben, um die gesamten regenerierbaren Sphäroplast.en zu ermitteln. Gute Werte für ein Trans-
-5.5.37- k
formationsexperiment betragen 1 bis 3 x 10 gesarate regenerierbare Sphäroplasten/ml und etwa 1 χ 10 gesamte Zellen/ml.
4. Die Platten werden 3 bis 5 Tage bei 300C inkubiert. 5
1. Plasmid pPG2.5 (ein Plasmid auf der Basis von pBR322
mit einem Gehalt an dem etwa 2,5 Kbp langen EcoRI-Sall-Fragment aus dem Plasmid pPG4.0, das das primäre Alkohol-oxidase-Gen CAOXt) und regulatorische Bereiche enthält und das beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, in einem E. coli-Wirt unter der Nr. NRRL B-15868 erhältlich ist) wurde mit BamHI verdaut.
2. Das lineare Plasmid wurde mit BAL31 verdaut.
3. Die erhaltene DNA wurde mit Klenow-Fragment behandelt, um die stumpfen Enden zu verstärken, und mit EcoRI-Linkern verknüpft.
4. Die Ligationsprodukte wurden im E. coli Stamm MM294 transformiert.
5. Transformanten wurden durch die Kolonienhybridisierungstechnik unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids mit der Sequenz
5'TTATTCGAAACGGGAATTCC, 30
dem Screening unterworfen. Dieses Oligonucleotid enthält die A0X1-Promotorsequenz bis zum (nicht einschliesslich) ATG-Initiationskodon, verschmolzen mit der Sequenz des EcoRI-Linkers
35
6. Positive Klone werden gemäss dem Maxam-Gilbert-Verfahren sequenziert. Sämtliche drei Positiven wiesen folgende Sequenz auf:
-5.5.37- 43031:
- 23 5 «...TTATTCGAAACGAGGAATTCC...3'.
In sämtlichen Fällen war das "A" von->ATG (in der vorstehenden Sequenz unterstrichen) erhalten. Es wurde entschieden, dass dieses A vermutlich nicht schädlich ist. Somit handelt es sich bei allen folgenden Klonen um Derivate dieser positiven Klone. Diese Klone erhielten die Laboratoriumsbezeichnungen pAOP1, pAOP2 und pAOP3.
7. Zwei weitere Klone wurden durch Screening der BAL31/ Linker-verknüpften Produkte identifiziert. Sie weisen folgende Sequenzen auf:
5'...TAATTATT C GGAATTC C.. . 3'
pAOXlEcoRl
Diese Klone erhielten die Bezeichnungen pA0P5 und pA0P6.
2Q Bei einer Variation des vorstehenden Verfahrens wurde das Plasmid pPG2.5 anstatt mit BamHl' mit AsuII geschnitten. Das linearisierte Fragment wurde mit Klenow-Fragment behandelt (ohne die vorstehend durchgeführte BAL31-Behandlung). Anschliessend wurde die Verknüpfung mit EcoRI-Linkern durchgeführt. Das erhaltene Plasmid enthält A0X1-Promotorsequenzen, in denen das ATG-Initiationskodon fehlt. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid wird als pA0P4 bezeichnet und weist folgende Sequenz auf:
5'...TAATTATGGAATTc..^'
pAOXl EcoRI
Der A0X1-Promotor (pAOXl) reagiert auf die Kohlenstoffkatabolitrepression durch ein starkes Nachlassen der Enzymsynthese. Ferner reagiert der AO-Promotor auf Kohlenstoffmangelbedingungen. Wachstum auf Methanol führt zu einer weiteren Induktion des A0X1-Promotors. Ferner ist aus um-
4 5.37- h-
fangreichen Untersuchungen, z.B. Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold und Gingeras, Molecular and Cellular Biology, Mai 1985, S. 1111-1121, klar ersichtlich, dass das erfindungsgemäss verwendete AOX1-Promotorfragment in ähnlicher Weise wie der AOX1-Promotor im Chromosom reguliert wird. Die einzelnen, gemäss diesem Beispiel hergestellten und isolierten Klone reagieren auf katabolische Repression, Kohlenstoffmangelbedingungen und Methanolinduktion, wie es beim AOX1-Promotor selbst der Fall ist.
Das als AO-Terminator verwendete Stul-Hindlll-Fragment enthält Sequenzen, die eine Matrize (template) für die PoIyadenylierung des A0X1-mRNA-Transkriptionsprodukts darstellen. Diese Sequenzen umfassen folgendes:
TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-Polyadenylierung
Wenn das StuI-Hind'lII-Fragment sich an einem Plasmid in 3?- Stellung,zu einem Polypeptidkodierungsbereich befindet, fördert es die RNA-Termination. Die A0X1-Terminationssequenzen wurden isoliert und können aus Plasmid pPG3.2, bei dem es sich um ein Plasmid auf der Basis von pPR322 mit einem Gehalt an den A0X1-Terminationssequenzen handelt, isoliert werden. Das in einen E. coli-Wirt transformierte Plasmid ist beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, nach Erteilung des US-Patents unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15999 zugänglich.
Die Folge der zur Herstellung der Plasmide, die Gegenstand dieses Beispiels sind, angewandten Schritte, ist in Fig. 5 zusammengestellt.
Konstruktion von pBSAG5 und pBSAGSI 1. Konstruktion von pCFL2
Der Vektor pA0P2, der den AOXf-Promotor minus das TG
. iv30-3i -
von ATG am 3'-Ende enthält, wurde mit Hindi geschnitten.
Das den Promotor enthaltende DNA-Fragment wurde iso-. liert und in pBR322, das vorher .mit Hindlll geschnitten und mit Klenow-Fragment gefüllt war, verknüpft. Durch diese Reaktion entstand der Vektor pCFL2.
2. Konstruktion von pBSA0P2
pBR322-BglII, bei dem es sich um pBR322 handelt, dessen PvuII-Stelle durch eine Bglll-Stelle ersetzt ist, wurde mit EcoRI und CIaI verdaut. Dieses linearisierte Plasmid wurde mit dem 5'-A0X1-enthaltenden Clal-EcoRI-Fragment von pCFL2 in einer Ligationsreaktion kombiniert. Der erhaltene Vektor wurde mit pBSA0P2 bezeichnet.
3. Konstruktion von pBSAG22
Das Plasmid pHBS-5 (beschrieben von Valenzuela et al., Nature, Bd. 298 (1982), S. 347-350; vgl. Fig. 6), das das in die EcoRI-Stelle in pBR322 eingesetzte HBsAg-Gen enthält, wurde mit CIaI verdaut. Etwa 60 Basenpaare wurden in beiden Richtungen mit Bal31-Exonuclease entfernt. Das verbleibende DNA-Fragment wurde mit BamHI verdaut und mit Klenow-Fragment gefüllt. Nach Ligation wurde ein Pool von etwa 200 Transformanten mit Ncol geschnitten. Die linearisierten Plasmide wurden isoliert und religiert. Nach Transformation von E. coli wiesen etwa 10 Prozent sämtlicher Plasmide (mit pBSAGI bezeichnet) eine neu geschaffene Ncol-Stelle auf. pBSAGI wurde mit Ncol verdaut, mit Klenow-Fragment gefüllt und mit BamHI verdaut. Dieses Plasmidfragment wurde mit pBSA0P2, das vorher mit EcoRI verdaut war, verknüpft, mit Klenow-Fragment gefüllt und mit BamHI verdaut. Der erhaltene Vektor wurde mit pBSAG22 bezeichnet.
4. Konstruktion von pBSAG4, pBSAG5 und pBSAG5I
-35 Das Plasmid pAOT-1 (ein Plasmid auf der Basis von pBR322, das durch Ligation des 1,6 kbp-Sall-Hindlll-Fragments von pPG3.2 (erhältlich in einem E. coli-Wirt als NRRL B-15999) in Sall-Hindlll-geschnittenes pBR322Δ EcoRI
-5.UJ- UQ31
(d.h. pBR322 mit zerstörter EcoRI-Stelle; vgl. Fig. 7)), das das 3'-AOXI-transkriptionale Terminationsfragraent trägt, wurde mit Xbal und Pstl geschnitten. Das den Terminator enthaltende Fragment wurde mit pBSAG22, das vorher mit Xbal und Pstl geschnitten war, verknüpft, wodurch man pXP-1 erhielt. pBSAG22 wurde mit Dral verdaut, sodann wurden Stul-Linker zugesetzt, und schliesslich wurden Stul und EcoRI zur weiteren Verdauung verwendet. Das HBsAg-Strukturgen wurde isoliert und in pXP-1, das vorher mit Stul und EcoRI geschnitten war, verknüpft, wodurch man pBSAG4 erhielt.
Das HBsAg enthaltende Clal-Fragment von pBSAG4 wurde in die einzige Clal-Stelle von pYJ33 (vgl. Fig. 8) verknüpft, wodurch man pBSAG5 und pBSAG5I erhielt. Eine Restriktionskarte des Plasmids pBSAG5I ist in Fig. 11 dargestellt. Die Plasmide pBSAG5 und pBSAG5I unterscheiden sich lediglich in der Orientierung des Clal-Fragments, das die 5'-A0X1/HBsAg/3'-A0X1-Expressionskassette enthält. Somit befindet sich in pBSAG5 das 5'-A0X1-Fragment neben dem Pichia HIS4-Gen, während das 3'-A0X1-Fragment sich neben dem autonomen Element PARS2 befindet. Das in einem E. coli-Wirt transformierte Plasmid pBSAG5 wurde beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture hinterlegt, um dessen öffentlichen Zugang nach Erteilung des US-Patents zu gewährleisten. Der E. coli-Stamm MC1061-pBSAG5 erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL B-18028.
Konstruktion des Pichia pastoris-HBsAg-Expressionswirts GSI15 (pBSAGI5I)
Die Herstellung eines Pichia pastoris-Wirts, in dem das erste Alkohol-oxidase-Gen (A0X1) durch das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Gen im Pichia-Chromosom ersetzt ist, wird in diesem Beispiel beschrieben.
Zur Herstellung des P. pastorrs-HBsAg-Expressions-Aox1"-
ÜR7- 4-3031 C
«S Aa
Mutantenwirts, wurde das Plasmid pBSAGI5I gemäss Fig. 9 bis 11 konstruiert. Die erste Stufe bei der Konstruktion bestand in der Verdauung des AOX1-Proraotor-LacZ-Genexpressionsvektors pSAOH5 und des AOX1-Promotor-HBsAg-Expressionsvektors pTHBS3, hergestellt gemäss den nachstehenden Ausführungen und der zusammenfassenden Darstellung in Fig. 13, mit der Restriktionsendonuclease Hindlll. Zur Herstellung von pTHBS3 wurde das Plasmid pAOT-1 (vgl. Fig. 7) mit Stul geschnitten, mit EcoRI-Linkern verknüpft und sodann mit Pstl verdaut. Das das 3·-A0X1-Fragment enthaltende EcoRI-Pstl-Fragment wurde isoliert. Der Vektor pA0P3, der die 5'-A0X1-Sequenzen enthält, wurde mit EcoRI und Sstl geschnitten. Das erhaltene 5'-A0X1-Fragment wurde in den E. coli-S. cerevisiae-Shuttlevektor pSEY101 (Douglas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 81 (1984), S. 3983-3987), der vorher mit EcoRI und Sstl geschnitten war, verknüpft. Das Ergebnis der Verknüpfung dieser pA0P3- und pSEY101-Fragmente war das Plasmid pTA020. Das Plasmid pTA020 enthält die URA3- und Ampicillin-Gene zur Selektion in S.
cerevisiae bzw. Bakterien, den 2 ^m-Kreis für die Replikation in S. cerevisiae und die 5'-A0X1-Sequenzen.
Das Plasmid pTA020 wurde partiell mit Pstl geschnitten. Der linearisierte Vektor wurde isoliert und mit EcoRI geschnitten. Das grösste Fragment (das die zwei ^m-Kreissequenzen, das URA3-Gen und das 5'-A0X1-Fragment enthielt) wurde mit dem aus pAOT-1 erhaltenen 3'-A0X1-Fragment verknüpft, um den Vektor pTHBSI zu bilden.
Das HBsAg enthaltende EcoRI-Fragment aus pHBS-5 wurde durch Verdauung mit EcoRI Isoliert, sodann mit pTHBSI, das vorher mit EcoRI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war, verknüpft. Der erhaltene Vektor, als pTHBS2 bezeichnet, weist das insertierte HBsAg-Gen zwischen den 3'- und 5'-A0X1-Sequenzen auf.
Das Plasmid pYJ30 (erhältlich in einem E. coli Wirt als
-5.5.37- A3031-
NRRL B-I589O) wurde mit EcoRI geschnitten, mit Klenow-Fragment gefüllt und sodann mit Pstl geschnitten. Das P. pastoris-HIS^/PARSI-enthaltende Fragment wurde isoliert und mit dem Pstl-Sstl-Fragment des Vektors pTHBS2 (der das HBsAg-Gen unter Flankierung durch die AOX1-Sequenzen enthält) verknüpft. Diese Ligation liefert den Vektor pTHBS3.
Das aus pTHBS3 bei Verdauung mit Hindlll erhaltene 1 , *i kbp-Fragment (dieses Fragment enthält das HBsAg-Gen, die AOX1-Terminationssequenz und einen Teil der A0X1-Promotorsequenz) wurde gewonnen und in das 7,7 kbp-Fragment von pSA0H5, das das Pichia HIS*»-Gen, den Grossteil der A0X1-Promotorsequenz und Sequenzen von pBR322 enthält, insertiert. Ein 9,1 kbp-rekombinantes Plasmid, pYM39, das die wiederhergestellten A0X1-Promotorsequenzen enthielt, wurde sodann isoliert.
Für die zweite Konstruktionsstufe wurde das Plasmid pPG3.2 (erhältlich in einem E. coli Wirt als NRRL B-15999) mit PvuII verdaut, und ein 1,5 kbp-Fragment, das die Sequenzen in unmittelbarer Nähe zur 3'-Stellung des A0X1-Gens enthielt, wurde in die einzige Nrul-Stelle von pYM39 eingesetzt. Ein 10,6 kbp-rekombinantes Plasmid, ρΥΜΙβ, wurde isoliert, das das PvuII-Fragment in einer solchen Orientierung enthielt, dass die 3'-A0X1-proximalen Gensequenzen zum HIS4-Genteil des Vektors orientiert waren. Das Plasmid ρΥΜΙβ enthielt sämtliche für die Deletion des A0X1-Gens aus einem Pichia-Wirt und für die Expression von HBsAg unter A0X1-Promotorkontrolle, enthielt jedoch nicht das zugeschnittene HBsAg-Genfragment von pBSAG5.
Daher bestand die letzte Konstruktionsstufe in der Rekombination des gewünschten HBsAg-Gens mit einem A0X1-Gendeletionsvektor. Hierzu wurden ρΥΜΙβ und pBSAG5I (ein mit pBSAG5 identisches Plasmid mit Ausnahme des Clal-Fragments, das die HBsAg-Expressionskassette in entgegengesetzter Orientierung enthält) mit den Restriktionsenzymen Pstl und Sphl verdaut. Das 6,3 kbp-Fragment von pBSAG5I, das die zugeschnit-
-S 5.87-
tene HBsAg-Genexpressionskassette und das Pichia HIS4-Gen enthält, wurde in das 4,6 kbp-Fragment von ρΥΜΙβ, das die 3'-AOXI-Sequenzen und den Grossteil von pBR322 enthielt, eingesetzt, um das endgültige 10,9 kbp-Plasmid pBSAGI5I zu bilden. Das Plasmid pBSAGI5I wurde in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, hinterlegt, um dessen öffentliche Zugänglichkeit nach Erteilung des US-Patents zu gewährleisten. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18021.
Zur Transformation des P. pastoris his4-Mutantenstamms GS115 (NRRL Y-15851) wurde pBSAGI5I zuerst mit dem Restriktionsenzym BgIII verdaut, um einen 7,2 kbp-linearen Vektor zu bilden, der 0,85 kbp der Sequenz von 5f des A0X1-Gens an einem Ende und 1,1 kbp der Sequenz von 3' des A0X1-Gens am anderen Ende enthielt (Fig. 12). Etwa 2 ^g des BgIII-geschnittenen pBSAGI5I wurden in GS115 durch Selektion auf Histidin-Prototrophie transformiert. Etwa 5 x 10 His+- Kolonien ergaben sich aus der Transformation.
Transformationsereignisse, bei denen pBSAGI5I in ein lineares Molekül der AOX1-Chromosomenstelle eingesetzt wurden, führten zur Deletion des AOXI-Gens. Daher wurden HiS+-. transformierte Stämme, in denen die. gewünschte lineare Insertion eingetreten war, durch ihre sehr langsame Wachstums geschwindigkeit auf Methanol identifiziert. (P. pastoris weist ein zweites, "schwächeres" Alkohol-oxidase-Gen A0X2 auf, das Alkohol-oxidase in ausreichender Menge bildet, dass Stämme, in denen das primäre Alkohol-oxidase-Gen fehlt, mit langsamer Geschwindigkeit auf Methanol wachsen können).
Das Verfahren zur Identifizierung der.His+-Transformanten, die auf Methanol nicht gut wuchsen, bestand darin, zunächst die His+-Zellen, die in das selektive Agar eingebettet waren, zu gewinnen. Die Gewinnungsstufe wurde durchgeführt, indem man das Agar auf ein 50 ml fassendes Röhrchen mit einem Gehalt an 20 ml sterilem Wasser übertrug und das
-i 5.87-'430.31
. - 30 -
Agar unter Verwendung eines Brinkman-Homogenisators 30 Sekunden mit geringer Geschwindigkeit pulverisierte. Agar-Bruchstücke wurden von den Zellen durch Filtration des Gemisches durch Gaze und Spülen des Agars mit 30 ml sterilern Wasser abgetrennt. Die Hefezellen wurden sodann auf eine optische Dichte bei Ag00 von 0,1 verdünnt, 10'Sekunden unter Verwendung eines auf Stufe 1J eingestellten Branson-Ultraschallgerätsder Ultraschallbehandlung unterworfen, um Hefeklumpen auseinander zu brechen. Sodann wurde mit sterilem Wasser auf das 100-fache verdünnt. Aliquotanteile von 10 und 100 ul wurden auf Agarplatten mit einem Gehalt an 0,67 Prozent Hefe-Stickstoffbasen ohne Aminosäuren (Difco) und 0,1 Prozent Glucose verteilt. Nach 3-tägiger Inkubation bei 300C wurden die auf den Platten aufgetretenen Kolonien einem Screening in bezug auf die Fähigkeit zum Wachstum auf Methanol unterworfen, indem man die Kolonien der Replikaplattierung auf einer Reihe von Agarplatten mit einem Gehalt an 0,67 Prozent Hefe-Stickstoffbasen ohne Aminosäuren und folgenden Kohlenstoffquellen unterwarf: 1) keine Kohlenstoffquelle; 2) 0,5 Prozent Methanol; und 3) 2 Prozent Glucose. Von den auf 2 Prozent Glucose wachsenden Kolonien, zeigten 32 Prozent kein gutes Wachstum auf Methanol.
Zur Bestätigung, dass die pBSAGI5I-Sequenzen gemäss Fig. insertiert waren, wurde die gesamte DNA aus einem der P. pastoris-Stämme mit einem Mangel an Methanolverwertung extrahiert, mit Restriktionsendonuclease verdaut und mit dem Southern-Blotverfahren mit J P-markierten Sonden hybridisiert. In einem Satz von Southern-Blots wurden die DNAs aus dem Aox1'-Stamm GS115 (pBSAGI5I) und dem Aox1+-Stamm GS115 mit Hindlll verdaut und mit pPG4.0,.einem aus dem A0X1-Gen und Sequenzen aus pBR322 zusammengesetzten Plasmid, das in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois als NRRL B-15868 erhältlich ist, hybridisiert. Ein 2,3 kbp-Fragment, das für A0X1 kodiert, wurde in den Bahnen, die GS115-DNA enthielten, beobachtet. Jedoch war das 2,3 kbp-Fragment abwesend, und es traten
-5.5.37- 43031-
keine Fragmente in den Bahnen, die GS115 (pBSAGI5I)-DNA enthielten, auf. Dieses Ergebnis beweist, dass das A0X1-Gen aus dem GS115 (pBSAGI5I)-Stamm deletiert worden war.
Wachstum von mit" HBsAg-kodierenden Vektoren transformierten Pichia-Hefen
1. Wachstum von GSI15 (pBSAG5) in einem Fermenter
Ein 10-prozentiges Inoculum wurde über Nacht in Hefe-Stickstoffbase (YNB) + 2 Prozent Glucose bei 3O0C in einem Schüttelkolben gezüchtet. Das Inoculum wurde zu sterilisierten Basissalzen (auf pH-Wert 4 eingestellt) im Fermenter gegeben. Eine Glucosezufuhr erfolgte mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,05 bis 0,1 h~ . Wenn die Zelldichte eine stationäre Konzentration erreichte und die Fermenter-Glucosekonzentrationen weniger als 100 ppm betrugen, wurde die HBsAg-Bildung durch Veränderung der Kohlenstoffquelle in Methanol oder ein Gemisch aus 50% GIucose-50% Methanol induziert
20
2. Wachstum von GS115 (PBSAGISI)(AoXI") in einem Fermenter
Eine optimale Expression der löslichen HBsAg-Ausria-Aktivität ( 3-4 Prozent lösliches Protein) erfolgte durch Züchtung dieses Aox1"-Organismus in einem absatzweisen Verfahren auf Glycerin, gefolgt von einer methanolhaltigen Einspeisung. Das Inoculum kann auf YNB + Glycerin gezüchtet werden. Basissalze plus Glycerin (1 Prozent und 4 Prozent Glycerin wurden verwendet) und Biotin können im Fermenter autokiavisiert werden. Nach Abkühlung soll der pH-Wert auf 3,5 bis 6 "eingestellt und Spurensalze (2,5 ml/Liter) vor dem überimpfen zugesetzt werden. Mit 100 Prozent Methanol kann begonnen werden, bevor oder nachdem das Glycerin verbraucht worden ist. Methanolkonzentrationen in einer Höhe von 2 Prozent stören nicht die HBsAg-Anreicherung, die 200 Stunden lang fortgesetzt werden kann. Jedoch wird durch 5 Prozent Methanol im Fermenter die Anreicherung von
-5.5.37-
- 32 HBsAg-Teilchen gestoppt.
. Bin Wachstum zu höheren Zelldichten wurde erreicht, indem man die Konzentrationen der Salzzufuhr erhöhte. Erhöhte Zinkkonzentrationen sind für erhöhte Zelldichten bei Züchtung auf Methanol besonders wichtig. Höhere Konzentrationen an extrahierbarer Ausria-Aktivität wurden erreicht, wenn das Wachstum nicht durch Zink limitiert war, wobei jedoch der Anteil an extrahierbarem Protein ebenfalls höher war, wodurch sich eine Nettoabnahme der Ausria-Aktivität als prozentualer Anteil des löslichen Proteins ergab.
3. Schüttelkolbenwachstum von Zellkulturen von GS115 (pBSAG5) und GS115 (pBSAGI5I)
Eine transformierte Kolonie wurde ausgewählt und auf einer SD-Platte ausgestrichen. Ein Zellstrich wurde auf 50 ml YNB-Brühe (1 χ YNB, 5 ;ug/ml Biotin) mit 5 Prozent Glucose in einem 250 ml-Schüttelkolben überimpft und in einem Luftschüttler über Nacht bei 30°C mit 250 U/min geschüttelt.
Die ODgQQ-Ablesung am Morgen betrug 2 bis 3. 100 ODg0Q-Einheiten von Zellen (etwa 10 Zellen) wurden aus dem Schüttelkolben entfernt und 7 Minuten bei Raumtemperatur und 2000 g in einer IEC-Zentrifuge zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 500 ml YNB-Brühe mit 2 Prozent Glycerin in einem 2 Liter-Schüttelkolben resuspendiert (°Dg0Q = 0,2). Die Kultur wurde bei 300C inkubiert und mit 250 U/min in einem Luftschüttler bis zum Erreichen eines 0DgQQ-Werts von 2 bis 3 geschüttelt. Im Fall des Aox1 ""-Wirts wurden 500 ODgA0 aus der Kultur entfernt. Die Zellsuspension wurde 7 Minuten bei 2000 g in einer IEC-Zentrifuge zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 500 ml YNB-Brühe mit 0,5 Prozent Methanol resuspendiert (1,0.ODgnQ). Im Fall des Aox1+-Wirts wurden 170 ODg00 Zellen aus der Kultur entfernt, unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und in 500 ml YNB-Brühe mit 0,5 Prozent Methanol resuspendiert (0,3 0Dg0O^* Beide
Kulturen wurden bei 3O0C und 250 U/min in 2 Liter-Schüttelkolben geschüttelt. Wenn ein ODgOQ-Wert ^ 2 erreicht wurde, wurden die Kulturen mit dem gleichren Wachstumsmedium auf
Λ RR7- 43031
ί, <J /. C ί -ff
das 2-fache verdünnt. 100 ODgOQ-Proben wurden periodisch entfernt und 7 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Die erhaltenen Zellpellets- lass-1 bis 2 Wochen lagern.
tenen Zellpellets- lassen sich nach .Einfrieren bei -7O0C
Beispiel VI . .
Bestimmung von HBsAg: 22 nm-Teilchen und HBsAg-Monomer 1. Herstellung von Extrakten und Proteinbestimmung Alle nachstehend beschriebenen Arbeitsgänge werden bei 0 bis H0C durchgeführt. Das gefrorene. Zellpellet wird aufgetaut und 2 mal mit je 2 ml eiskaltem Solubilisierungspuffer gewaschen. Die Zellen (100 ODgOQ-Einheiten) wurden in EinwegglasrÖhrchen (13 x 100 mm) übertragen. 0,35 ml Solubilisierungspuffer und 0,5 g mit Säure gewaschene. Glasperlen (0,45 mm Durchmesser) wurden zum Zellpellet gegeben. Diese Suspension wurde 4 mal jeweils 1 Minute auf einem auf maximale Frequenz eingestellten Rüttler geschüttelt. Zwischen den einzelnen Rüttelvorgängen wurden die Suspensionen jeweils 1 Minute auf Eis belassen. Der gesamte Zellbrei wurde entfernt, und die Glasperlen wurden mit 0,35 ml Solubilisierungspuffer gewaschen. Der Waschpuffer wurde mit dem Zellbrei vereinigt und in ein Eppendorf-Gefäss übertragen. Der Extrakt wurde 15 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der überstand (lösliche Fraktion, 0,7 ml) wurde vom Pellet entfernt. Zur Extraktion des HBsAg-Proteins aus dem Pellet wurden 0,7 ml 2x konzentrierter SDS-Solubilisierungspuffer zugesetzt. Das Gemisch wurde auf einem Rüttler geschüttelt und 15 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Sodann wurde das Geraisch 15 Minuten zentrifugiert. Der überstand (unlösliche Fraktion) wurde von den Zellbruchstücken entfernt. Aliquotanteile aus den löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden mit Trichloressigsäurefällung und dem Lowry-Verfahren auf ihren Proteingehalt untersucht. BSA diente als Proteinkonzentrationsstandard. Sowohl die unlöslichen als auch die löslichen Fraktionen wiesen im allgemeinen Proteinkonzentrationen im Bereich von 3 bis 15 mg/ml auf.
-5.5.37- 43031
ίΟ
2. Alternatives Verfahren zur Herstellung von Extrakten Diese Vorschrift beschreibt Bedingungen für die Extraktion von monomerem heterologem Protein-HBsAg oder den Proteinkomplex, 22 nm-Teilchen, aus Kulturen von Pichia pastoris, die mit Vektoren mit einem Gehalt an Sequenzen, die für das HBsAg-Protein kodieren, transformiert worden sind.
Kulturen von P. pastoris wurden auf eine Zelldichte von 10 bis 100 ODg00 Einheiten pro ml gezüchtet. Ein Aliquotanteil von 100 ODgQQ-Einheiten wurde auf ein Borsilicat-Züchtungsröhrchen der Abmessungen 13 x 100 ml übertragen und 2 mal mit je 20 Volumina Solubilisierungspuffer gewaschen.
Die Zellen wurden pelletisiert. Anschliessend wurden die . pelletisieren Zellen (klinische IEC-Zentrifuge) mit 0,5 g mit Säure gewaschenen Glasperlen (0,5 mm) und sodann mit 0,35 ml Solubilisierungspuffer versetzt. Der Solubilisierungspuffer enthielt entweder 0,5 m NaCl und 0,1 Prozent Triton X-100 (Gew./Vol.) als Kontrolle oder Kaliumjodid oder Kaliumthiocyanat in einer Konzentration von 3 m in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 Prozent Triton X-100. Sämtliche Lösungen waren mit 10 millimolar Natriumphosphat auf den pH-Wert 7,5 gepuffert. Das Gemisch wurde *} mal jeweils 1 Minute mit einem Rüttler mit maximaler Geschwindigkeit bewegt. Zwischen den Rüttelvorgängen wurde das Gemisch mindestens 1 Minute auf Eis gekühlt. Nach beendeter Lysis wurde die Lösung von gebrochenen Zellen entfernt, und die Glasperlen wurden in 0,35 ml Solubilisierungspuffer gewaschen. t>ie beiden Lösungen wurden vereinigt und 15 Minuten bei 1$ 000 g zentrifugiert. Die überstände wurden ent-
j fernt und:auf iramunoreaktive HBsAg-Teilchen (Ausria-Test) und gesamtes mit Trichloressigsäure fällbares Protein (Lowry) getestet. Die Ergebnisse von 5 Untersuchungen sind in Tabelle I zusammengestellt.
-5.5.37- 43031
5 Salz (Konz.)
- 35 -
HBsAg 22 nra-Teilchen (,ug/ml)
NaCl (0,5 M) + Triton KJ (3M) + Triton KJ (3M) - Triton KSCN (3M) + Triton KSCN (3M) - Triton
203-249 5,1-150 71-136 2,4-50 -125
Gesamtprotein (ill/ml)
8,6-11.2
0,85-3.42,5-4,3
0,6-1,9
1,6-4,3
HBsAg 22 nm-Teilchen/Protein (Gew.-%)
2,1-3,2 0,5-8,1 2,3-7,2 0.8-9,6 3,8-16,7
Während bei keiner der Bedingungen unter Verwendung von Kaliumiodid oder Kaliumthiocyanat höhere Ausbeuten an HBsAg-Teilchen als bei den Bedingungen unter Verwendung von Natriumchlorid (Spalte A) erzielt werden, ist es klar, dass Kaliumiodid oder Kaliumthiocyanat die Freisetzung des gesamten Proteins hemmen (Spalte B) und dadurch die spezifische Aktivität der Teilchen auf das 2- bis 5-fache erhöhen (Spalte C).
3. Bestimmung von 22 nm-Teilchen (Ausria II-Testpackung) Die lösliche Fraktion wurde auf das 1000- bis 10 000-fache mit Ausria-Verdünnungspuffer verdünnt. Aliquotanteile zwischen 25 und 100 μΐ wurden auf folgende Weise getestet:
1. Zur Aufstellung einer Eichkurve wurde eine Verdünnungsreihe mit einem Gehalt an 0,1 bis M ng der Kontrolle in einem Gesamtvolumen von jeweils 200 ^uI auf den Boden der einzelnen Vertiefungen einer Reaktionsplatte (zusammen mit vier negativen Kontrollen) pipettiert.
Für die zu analysierenden .Proben wurden jeweils 200 der verdünnten löslichen Fraktion a^uf den Boden von separaten Vertiefungen der Reaktionsplatte pipettiert.
-5.5.87- 43031
: - 36 -
2. In jede Vertiefung, die eine Probenfraktion oder eine Kontrolle enthielt, wurde vorsichtig eine Perle gegeben. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Perlen vor der Zugabe der Kontrollen oder Proben zu verteilen.
3. Der Deckel wurde auf die Reaktionsplatte aufgebracht. Durch leichtes Klopfen wurden die Perlen bedeckt und eingeschlossene Luftblasen entfernt.
4. Das Reaktionsgeraisch wurde sodann 2 Stunden bei 45°C inkubiert.
5. Der Deckel wurde entfernt und verworfen. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt. Die einzelnen Perlen wurden 2 mal mit 4 bis 6 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen. ·
6. 200^1 J-Anti-HBs wurden jeweils in eine eine Perle enthaltende Vertiefung pipettiert.
7. Ein neuer Deckel wurde aufgebracht. Um die Perlen zu bedecken und eingeschlossene Luftblasen zu entfernen, wurde leicht auf die Reaktionsplatte geklopft.
8. Die Reaktionsplatte wurde sodann 1 Stunde bei 450C inkubiert.
9. Der Deckel wurde entfernt und verworfen. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt. Jede Perle wurde 4 mal gemäss Stufe gewaschen.
10. Die Perlen wurden sofort in entsprechend identifizierte Zählröhrchen übertragen.
11. Die Zählereignisse wurden 1 Minute lang bestimmt.
-5.5.37- h3031
12. Die Proben wurden innerhalb von 24 Stunden nach der endgültigen Waschung ausgezählt.
Der Anteil an 22 nm-Teilchen wurde unter Verwendung der in Stufe 1 aufgestellten Eichkurve ermittelt.
4. Monomerbestimmung (Western-Bestimmung) Ein zu 25^g Protein (lösliche oder unlösliche Fraktion) äquivalentes Volumen (im allgemeinen 2bis 5-^D wurde mit HpO auf 1O7Wl gebracht. 10 jjI eines 2x-konzentrierten SDS-Gelbeschickungspuffers(100 millimolar DTT in 1x Puffer) wurde zugesetzt, und die Probe wurde 15 Minuten gekocht. * . Die gekochten Proben wurden auf ein 12% SDS-Acrylamidgel (Laemmli) aufgesetzt. Nach Gelelektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulosepapier übertragen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354). Das HBsAg wurde mit HBsAg-Antiseren (gegen von
125 Plasma abgeleitetes HBsAg) und J-markiertem Protein A
nachgewiesen. Kodak XAR-5-Film wurde über Nacht bei -7O0C mit dem Nitrocellulosepapier belichtet. Die quantitative Bestimmung des Monomeren wurde durch Auszählen der radioaktiven Banden des Nitrocellulosepapiers in einem Gamma-Zähler durchgeführt. Von S. cerevisiae gebildetes rekombinantes HBsAg (100 bis 500 ng/Bahn) wurde als Standard ^,, 25 verwendet.
Expressionskonzentrationen von HBsAg in Pichia pastoris Die Bildung von HBsAg durch verschiedene transformierte P. pastoris-Stämme wurde gemäss dem in Beispiel VI angegebenen Testverfahren (Solubilisierungsverfahren gemäss Teil 1 von Beispiel VI) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
35
-5.5.37- 43031:
1 3 Zu i
- 38 Tabelle II
| transformierter Stamm | GS115 (pBSAGI5I) . . | GS115 (pBSAG5) |
| 5 Phänotyp | ΑοχΓ HiS+ | Aox1 + HiS+ |
| Zustand des Vektors | integriert | autonom |
| Q HB3Ag-Konzentrationa | (Schüttelkolben) |
| Zellen/Liter | 10' ' |
| Monomer (%) | 7 |
| 22 nm Teilchen (%) | 2,5 |
| Monomer (mg/J) | 8,4 |
| 22 nm-Teilchen (%) | 3 |
| (mg/l)b |
1011 1,5 0,2
1,8 0,24
HBsAg-Konzentration (Fermenterwachstum)
| Zellen/Liter | 3,5 χ 10 |
| Monomer (%) | 7 |
| 22 nm-Teilchen (%) | 2,9 |
| Monomer (mg/D | 294 |
| 22 nm-Teilchen (%) | 122 |
| (mg/l)b |
12
χ 10 1
0,1 96 10
12
Proteinbestimmungen; gemessen nach dem Bradford-Verfahren
HBsAg pro Liter Kulturmedium; OD
600
= 5 x 10' Zellen/ml
= 0,14 mg Trockengewicht/ml = 0,06 mg Protein/ml.
Die vorstehend zusammengestellten Ergebnisse zeigen, dass hohe Konzentrationen an HBsAg in Pichia pastoris unter Kontrolle des primären Alkohol-oxidase-Gen (AOX1)-regulatorischen Bereichs aus Pichia pastoris gebildet werden können.
-5.5.37- ^3031 Z
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung-von Hepatitis.B-Oberflächenantigen, gekennzeichnet dadurch, dass man einen durch Transformation mit einem Plasmid erhaltenen Hefestamm in einem Nährmedium züchtet, das
(I) mindestens eine Kohlenstoff- und Energiequelle aus der Gruppe Methanol und Katabolit-Nichtrepressionskohlenstoffquellen, oder (II) mindestens eine Katabolit-Repressionskohlenstoff- und -energiequelle
enthält, mit der Massgabe, dass im Fall (II) das erhaltene Produkt Kohlenstoffmangelbedingungen ausgesetzt wird,
15
15
wobei das Plasmid
ein DNA-Fragment,
bakterielle Plasmid-DNA,
ein selektierbares Hefe-Markergen und eine autonome Hefe-Replikationssequenz enthält und wobei das DNA-Fragment folgendes umfasst: (a) einen regulatorischen Bereich, der zur Kontrolle der Transkription von Messenger-RNA bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-kodierenden Bereichs in der Lage ist, wobei der regulatorische Bereich
ein DNA-Fragment,
bakterielle Plasmid-DNA,
ein selektierbares Hefe-Markergen und eine autonome Hefe-Replikationssequenz enthält und wobei das DNA-Fragment folgendes umfasst: (a) einen regulatorischen Bereich, der zur Kontrolle der Transkription von Messenger-RNA bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-kodierenden Bereichs in der Lage ist, wobei der regulatorische Bereich
auf mindestens einen der folgenden Zustände reagiert: (i) Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist,
(ü) Anwesenheit einer von Methanol abweichenden
(ü) Anwesenheit einer von Methanol abweichenden
Nichtkatabolit-Repressionskohlenstoffquelle im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirtsorganismus in Kontakt ist, und (iii) Kohlenstoffmangelbedingungen im Kulturmedium, mit dem ein das DNA-Fragment enthaltender Wirts
organismus nach Wachstum des Wirtsorganismus auf einer Katabolit-Repressionskohlenstoff- und -energiequelle in Kontakt ist; und
-5.5.37- 43031-
(b) einen Polypeptid-Kodierungsbereich, der für Hepatitis B-Oberflächenantigen oder Teile davon kodiert. .. .
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass man zusätzlich das Hepatitis B-Oberflächenantigen isoliert und reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass der regulatorische Bereich im DNA-Fragment durch die Restriktionskarte von Fig. 2 charakterisiert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass das DNA-Fragment zusätzlich eine 3'-Sequenz von DNA abwärts vom Polypeptid-Kodierungsbereich enthält, wobei die 3'-Sequenz von DNA in der Lage ist, die Polyadenylierung und Termination der Transkription von durch den Polypeptid-Kodierungsbereich kodierter Messenger-RNA zu kontrollieren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass das DNA-Fragment eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die aus folgender Gruppe abgeleitet sind, enthält:
bakterielle Plasmid-DNA,
Bakteriophagen-DNA,
Hefeplasmid-DNA und
chromosomale Hefe-DNA. j
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,! dass die chromosomale Hefe-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markergen enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass das DNA-Fragment zusätzlich, seriell angeordnete DNA enthält, die folgendes umfasst:
-5.5.37- 43031C
in *τ'
10
15
20
25
30
35
- 41 -
ein erstes insertierbares DNA-Fragment, ein selektierbares Markergen und ein zweites insertierbares DNA-Fragment, wobei die ersten und zweiten insertierbaren DNA-Fragmente jeweils eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden besitzen und Nucleotidsequenzen aufweisen, die mit Bereichen der Genom-DNA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind, wobei das DNA-Fragment und das Markergen sich zwischen dem 3'-Ende des ersten insertierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten insertierbaren DNA-Fragments befinden; und wobei das erste und zweite insertierbare DNA-Fragment zueinander so orientiert sind, wie sie im Genom von Pichia orientiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass der Polypeptid-Kodierungsbereich im wesentlichen aus dem nachstehend dargestellten EcoRI-StuI-Fragment mit etwa 700 Basenpaaren besteht:
5·-GAATTCATGG TGCTCGTGTT CCTCACAATA CTCAATTTTC ATTCGCAGTC TCCTCCAATT CGTTTTATCA TCTTCTTATT CGTTTGTCCT GGACCATGCA CTATGTTTCC AAATTGCACC GCAAAATACC GGCTCAGTTT GCTTTCCCCC TGGTATTGGG TTATACCGCT CATTTAAGGC
AGAACATCAC ACAGGCGGGG CCGCAGAGTC TAGGGGGATC CCCAACCTCC TGTCCTGGTT TATTCCTCTT GGTTCTTCTG CTAATTCCAG AAACCTGCAC CTCATGTTGC TGTATTCCCA TATGGGAGTG ACTAGTGCCA ACTGTTTGGC GGCCAAGTCT GTTACCAATT CT-3'
ATCAGGATTC TTTTTCTTGT TAGACTCGTG TCCCGTGTGT AATCACTCAC ATCGCTGGAT CATCCTGCTG GATTATCAAG GATCAACAAC GACTCCTGCT TGTACAAAAC TCCCATCGTC GGCCTCAGTC TTTGTTCAGT TTTCAGCTAT GTACAGCATC TTCTTTTGTC
CTAGGACCCC TGACAAGAAT GTGGACTTCT CTTGGCCAAA CAACCTCCTG GTGTCTGCGG CTATGCCTCA GTATGTTGCC AACCAGTACG CAAGGCAACT CTACGGATGG CTGGGCTTTC CGTTTCTCTT GGTTCGTAGG ATGGATGATG GTGAGTCCCT TCTGGGTATA
-5.5.37- 43031
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass es sich beim Plasmid um pBSAG5 handelt. .· . ._
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass es sich beim Plasmid um pBSAG5I, wie in Fig. 11 dargestellt, handelt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass es sich beim Plasmid um pBSAGIöI, wie in Fig. 11 dargestellt, handelt.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass es sich beim Hefestamm um einen Stamm der Gattung Pichia handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1J bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass der regulatorische Bereich und die 3'-Sequenz vom Plasmid pA0P2, wie in Fig. 4 dargestellt, abgeleitet sind.
-5.5.37- 'V
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