JPS62502660A - 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「外来遺伝子の転写を調節する方法と、雑種プロモーター」車量 この発明は大体、外来遺伝子の転写を調節する方法と雑種プロモーターに関する ものであるが、特に酵母の外来遺伝子の転写を調節する方法と雑種プロモーター について示している。

バクテリアや酵母などの多くの微生物は生物によって生産される物質を大量に得 るのに存効であるが、その際の生合成の手段として、用いる微生物にとっては外 来のものである遺伝子（いわゆる外来遺伝子）を利用する。特に、酵母細胞の外 来遺伝子生産物に、かなりの興味がもたれている。というのも、酵母細胞は、炭 水化物（すなわち、グリコシド）をタンパクに付けて、糖タンパク生産を支配す る遺伝子を活性化して発現させることができ、また、遺伝子産物の分泌を可能に するタンパクを修飾することができ、さらに酵母細胞のもつ免疫原性を高めるこ とによって、表面抗原、たとえばＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現するこ とができるからである。そのうえ、酵母は、一般的に安全である（ＧＲＡＳ）と みなされており、発酵、醸造産業においても発酵生産技術は発展をとげてきてい る。

一般に、タンパク質をコードしている遺伝子は二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮ Ａ）であり、その二本鎖のうちの一本鎖が、情報伝達リボ核ｅｌ　ＣｔｎＲＮＡ ＞に、ＲＮＡポリメラーゼ■の働きによって、転写される。　＋ｍＲＮ＾は、タ ンパクに翻訳され、それがさらに、分泌、糖付加へと進んでいく、遺伝子が転写 されるためには、最初のヌクレオタイド塩基が転写される付近の領域、すなわち 遺伝子の上流”末端において、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間に開始複合物 が形成される。それから、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子に沿って下流域に動くに つれて、ｍＲＮＡが合成され、ターミネータ−とよばれるＤＮＡサイトに達する と転写が終わる。遺伝子の上流域にあり、転写開始複合物をプロモートするのに 十分な能力をもつ５′近傍ＤＮ’＾配列はプロモーターとして知られている。こ のプロモーターの中と最初のヌクレオタイドがｏ＋ＲＮＡにとりこまれる地点（ 転写開始複合物かつ（られるとこる）の近く　（一般に２５〜１５０塩基対上流 ）にτＡＴＡボックス共通構造として知られている７塩基配列が発見されている 。このＴＡＴＡボックス共通構造は明らかに、ある特定の距離にある下流域での 転写開始を決定している。多少の違いは認められるが、このＴＡＴＡボックス共 通構造は、コンセンサスな配列酵母では、上流調節配列もしくは上流活性化配列 （ＵＡＳｓ）とよばれる一定のサイトがあり、これは、転写開始領域の数百ヌク レなシグナルに反応して、転写を調節している。Ｇｕａｒｅｎｔｅ、ｃｅｌｌ＋ 　３６：７９９−８００（１９８４）。

あるひとつのＵＡＳ、　ＵＡＳｃ　（ｕｐｓｔｒｅａＩＩ＋　ａｃｔｉｖａｔｉ ｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が、ガラクトース代謝に関与す る２つの酵素をコードする遺伝子、すなわちガラクトキナーゼをコードするＧＡ ＬＩ遺伝子とＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼをコードするＧＡＬＩＯ遺伝子 の間に発見されている。このＧＡＬＩとＧＡＬＩＯ遺伝子の主な転写開始領域は 、酵母のクロモシームｎ　ＤＮＡの６０６の塩基対によって分離されている。Ｊ ｏｔ＋ｎ５ｔｏｎ、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ＋、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４：１４４０ −１４４８（１９８４）　。

ＧＡＬＩとＧＡＬＩＯ遺伝子はある遺伝子領域から互いに反対方向に転写される 。ＧＡＬＩ遺伝子の転写開始地点は１つのストランドのＴＡＴＡボックスの下流 であるが、このストランドはＧＡＬＩＯ遺伝子の転写開始地点（第２の、ＴＡＴ Ａボックスの下流にある）があるストランドとは逆向きである。

このＧＡＬＩ／ＧＡＬＩＯの関与する遺伝子領域のＤＮＡ配列は炭素源による２ つの遺伝子の調節機構と関係している。Ｙｏｃｕｍ、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．Ｃ ｅ１１．８ｉｏ１．４：１９８５−１９９８（１９８４）。

これらの遺伝子をもつ酵母細胞を、非発酵性の炭素源であるラクトース、グリセ ロール、エタノールなどで培養すると、これらの遺伝子は低い、基本的なレベル で発現する。これらの遺伝子の転写はガラクトースで培養すると１０００倍にな る。一方、これらの遺伝子は異化代謝産物による制御をうけやすく、グリコース で培養してもガラクトースで培養した場合はど充分に転写が行なわれない。

ＵＡＳＧは転写を活性もしくは抑制する他の遺伝子の支配もうけ手いる。ＧＡＬ ８０遺伝子はＧＡＬ４遺伝子によって生産されるタンパク質に結合して、そのク ンバク質を不活性化する機能をもっとされているネガティブな調節因子、レギュ レーターをコードしている。

ガラクトース存在下では、ＧＡＬ８０レギュレーターは機能しないで、ＧＡＬ４ タンパク質は転写を活性化する。大部、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ：Ｍｅｔａｂｏ ｌｉｓｎ＋　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　ＥＸ　ｒｅｓ廊　の中の　遺伝子発現の調節機 能ニガラクトースとリン酸の代謝’　−、５ｔｒａｔｈｅｒｎ、ｅｔ　ａｌ、ｅ ｄｓ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｄａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１５９−１８０（１９８２）、　ＧＡＬ８２遺伝子とＧＡＬ ８３遺伝子を含むいくつかの遺伝子はグリコース抑制を示すが、その作用機序は まだよくわかっていない＊　ＭａｔｓｕｍｏＬｏ、ｅｔ　ａｌＪ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、　１５３　：　１４０５−１４１４（１９８３）　。

ＵＡＳｓの性質は、１番目のプロモーターのＩＩＡＳを２番目のプロモーターの 別のＵＡＳにエンドヌクレアーゼを用いて置換すること、もしくは、機能をもっ たプロモーター中にＵＡＳをエンドヌクレアーゼを用いてそう人すること（すな わち、外来１１Ａｓとの置換もしｉｏｌ、虹９９−１０８（１９８５）、ＵＡＳ Ｇを置換するというのはＵＡＳ、を誘導ｉｔ伝子（ＣＹＣ１）であるＵＡＳに置 換することである。このことについては、Ｇｕａｒｅｎｔｅら（前述）が報告し ているが、それによると、ここで用いられているＵＡＳｒ、はガラクトース誘導 性を示すにもがかわらず、グリコース抑制を介在する配列を含んでいないようで ある。またＵＡＳ、をそう人するというのはｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉνｅなプロモ ーター（リポソームのタンパクｔｃｍ　１　とｃｙｈ　２）にＵＡＳ、をそう人 することである。このことについてはＦｒ１ｅｄ　ら（前述）が報告しいるがこ れはガラクトース誘導性とグルコース抑制の両方に関するものである。

プロモーターもしくはＵＡＳ／−プロモーターの雑種（いわゆるハイブリッドプ ロモーターゝ）の活性は、そのプロモーターによって制御される遺伝子の最終生 産物である特異的なクンバク質の量を測定してめる。　ＵＡＳｓは転写開始地点 からはさまざまな距離に位置し、またＵＡＳｓと転写開始地点は逆になることが ある（Ｆｒｉｅｎｄｅｔ　ａｌ、前述、Ｇｕａｒｅｎｔｅ、　ｅｔ　ａｌ、ｃｅ ｌｌ、　３６：５０３−５１１（１９８４））　、また機能的なＵＡＳｓは用い られている初期ＤＮＡ部分のサブ−フラグメントを構成している（Ｗｅｓｔ、ｅ ｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．旧ｏｆ、　４：２４６７−２４７８　（１９８ ４）　）。ＵＡＳ／プロモーターｌテスト遺伝子の組合せは一般的には、酵母− バクテリアのシャトルベクターで組たてられている。

プラスミドは、環状の２本鎖ＤＮＡ構造をしており、染色体ＤＮＡとは独立して 複製していく、酵母とバクテリアのシャトルベクターは、酵母細胞での複製酵素 と因子によって認識されるいわゆるμとよばれる複製開始点のようなりＮＡ複製 開始サイトを含むＤＮＡ配列をもっている。また酵母とバクテリアのシャトルベ クターは、バクテリア細胞における複製酵素と因子によって認識される開始サイ トを含むバクテリアのプラスミドの複製開始点ももっている。

１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　７７：４５５９−４５６３（１９８０） 。これらのシャトルベクターは、そのなかでプラスミドを構成し増幅しやすいバ クテリアのＥｓｃｈｅｒ＋ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）と、そのなかで プラスミドが外来ＤＩｌＡを発現させるための形質転換ベクターとして用いられ る酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｓ、ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）の両方で複製可能であり、選択もでき、両方から回収できるもの である。ＳＬｉｎｃｈｃｏｍｂ。

ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、　２８２：３９−４３（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍ ａｎ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、７：１４１−１５３　（１９７９）；Ｔｓｃｈｕ ｍｐｅｒ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、１０：１５７−１６６（１９８０）。

酵母とバクテナアのシャトルベクターは、酵母細胞の形質転換に実用的である。

　ＹＲｐ７と名付けられているシャトルベクターは、自己複製可能な染色体上の ＡＲ５配列と同様、Ｎ−（５°−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ＞ａｎｔｈｒａ ｎｉｌａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅとよばれるトリプトファン合成に必要な酵素 をコードするＴｌ１ＰＩ遺伝子をもっている。だから、ＴＲＰＩ遺伝子は、酵母 細胞内にＹＲｐ７をもつかどうかをセレクトするマーカーとして用いることがで きる。つまり、けｐｌ゛遺伝子型のものや、さもなくば、必須アミノ酸であるト リプトファンを合成できないものをセレクトすることができるわけである。５ｔ ｒｕｈｌ、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ） 、７６：１０５３−１０３９（１９７９）　。

Ｉｓｏ−１−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅを生産するＣＹＣ１遺伝子の研究によって、 通切な転写終結の重要性が示された。まちがった転写終結はとなりの遺伝子への 転写継続につながる＊　Ｚａｒｅｔ、ｅｔ　ａｌ、ｃｅｌｌ、　２８：５６３− ５７３（１９８２）、酵母ＤＮ＾の＋ｎＲＮＡへの転写効率は、遺伝子領域をコ ードするポリペブタイドの３°末端下流域もしくはその近くに、ｐｏｌｙ−Ａｔ ａｉｌ　とよばれる、アデニンを含むヌクレオタイドをもつテールがくっついく サイト、もしくは転写終結配列もしくはその両方が存在するかどうかによる。

このシャトルベクターとしてしばしば示されるバクテリアと酵母の雑種ベクター は、他の生物の遺伝子（外来遺伝子）を酵母細胞で発現させるのに有用である。

Ｂ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ 　ｋｉｎａｓｅ（ＰＧＫ）プロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、Ｅｕ ｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、７３６５７）、 ａｒｇ３ブロモ−クー（Ｃａｂｅｚｏｎ、ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａ ｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、１０６８２８）　、ａｌｃｈｏｈｏ ｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＤＨＩ）遺伝子のプロモーター（Ｒｕｔｔ ｅｒ、ｅｔ　ａｌ。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、７２３１８ ）　、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｂａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒ ｏｇｅｎａｓｅ（ＧＰＤ）プロモーターＣＢｉｔｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎ ｅ、　３２：２６３−２７４（１９８４））によって生産されてきた。別のＧＰ Ｄプロモーターはｔｈａｕｍａｔｉｎ様のタンパク質や、ｃｈｙ＋ｎｏｓｉｎｍ のタンパク質の発見に用いられている。　Ｅｄｅｎｓ、ｅｔ　ａｌ、Ｊｕｒｏｐ ｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　１２９６２８　ｍ仔 牛のｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ　Ｊ牛の成長モルモン、ヒト白血球インターフェロ ン、レニン、プロレニンもＧＡＬプロモーターとの融合によって酵母で発現して いる。Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ、ｅｔ　ａｔ、＋Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、１２８７４３．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａ ｌ。

Ｕ、に、Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ＮＯ，２１３７２０８Ａ。

解糖系の酵素をコードする酵母の遺伝子はかなり高レベルで発現する。ＡＤＨプ ロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ。

１０ニア７９１−７８０８（１９８２））やｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｅｒａｔ ｅ　ｋｉｎａｓｅ　（ＰＧに）遺伝子のプロモーター（Ｄｅｒｙｎｃｋ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋１１：１８１９−１８３７（ １９８３）　）のような解糖系の酵素のプロモーターを用いた酵母の発現ベクタ ーもつ（られている。

特に、解糖系の酵素のＧＰＤは外来遺伝子の発現に有効な将来性のあるプロモー ターである。　ＧＰＤは商品化されているパン酵母の乾燥重量を５χまで増やし ており（Ｋｒｅｂｓ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２００：４７１−４７８（１ ９５３）　）　、この酵素をコードしているｍＲＮＡはｐｏｌｙ−Ａを含む酵母 の全ｍＲＮＡの２−５χを示した（Ｈｏｌｌａｎｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒ　、１７：４９００−４９０７（１９７８））　、　Ｓ、ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅには、３つのタンデム構造をとらないＧＰＤの構造遺伝子があるが 、それらはすべて植物のように成長する酵母で転写される＠　Ｈｏ１ｌａｎｄ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２５紅５２９１−５２９９　（１９ ８３）　、　Ｍｕｓｔｉ　、　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｇｅｎｅ、　２５：１３３ −１４３　（１９８３）。この３つのＧＰＤ遺伝子のうちの１つの遺伝子の生産 物（これは、ＰＧＡＰ４９１の遺伝子によってコードされているのだが）が細胞 のｃｐｏ　ｕ素の９（１９８３）。だから、この遺伝子のＧＰ［ｌプロモーター は外来遺伝子生産物を大量につくるのにかなり有効であると考えられている。

外来遺伝子のホストとして、酵母が用いられるにもかかわらず、ヒト免疫インタ ーフェロン（ＴＦＮ−γ）のように、いくつかの外来遺伝子産物は酵母に対する 毒性がある。その結果、ＩＦＮ−ｒを構成的に発現するプラスミドは不安定で、 ＩＦＮ−γを生産する酵母細胞を大量に培養するのはむつかしい、だから、大量 に培養ができるまでは、外来遺伝子による生産物の生産を抑制し、集菌時期に外 来遺伝子による生産物の生産を誘導するような方法が望ましい。

本発明の要約 本発明によって得た雑種プロモーターは、酵母における外来遺伝子の転写を効率 よく支配する。この雑種プロモーターはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　−３− ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターの有用な部分か ら構成されている。つまりこのｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐ ｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターに外来の調節配列の上流の有 効な部分を雑種プロモーターの下流域末端に隣接したＴＡＴＡボックス共通構造 の上流域地点でそう人したものである。雑種プロモーターは、ＴＡＴＡボックス 共通構造が上流の調節配列と、転写開始サイトの間に位置するように構成されて いる。

本発明によって得た雑種プロモーターは、以下の表Ｉに示したプロモーターを部 分的に含んでいる。すなわち、有効な５°伸長、対立遺伝子の変化とそれによる 制限サイトの修飾、また表■に示したプロモーターの下流末端に隣接したＴＡＴ Ａボックスの共通構造を含んでいる。外来遺伝子の上流の調節配列は以下の表■ に示したように、を効な欠失フラグメントをもっており、表■に示したプロモー ターに、Ｔａｔａボックス共通構造から上流移転（表１に示したＡｖａ　Ｉ［サ イトをもっていて、その点で修飾がおこっている）でそう人したものである。

本発明によって得た酵母の転写調節を介在するＤＮＡ部分は雑種プロモーターを もっている。この雑種プロモーターは、雑種プロモーターの下流末端に隣接する ＴＡＴＡボックス共通構造の上流のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏ ｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　プロモーターの一地点に外来遺伝 子の上流調節配列のを効な部分がそう人された。　ｇｔｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄ ｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　プロモーターの有 効な部分を順次構成していく。外来遺伝子は雑種プロモーターの下流末端に隣接 したＴＡＴＡボックス共通構造の下流にそう人される。

酵母の遺伝子の転写を支配するために、本発明で用いた方法は、酵母のｇｌｙｃ ｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ プロモーターにおけるＴＡＴＡボックス共通構造の上流の配列を活性化する外来 遺伝子の有効な上流域をそう人して、雑種プロモーターの下流域に隣接するＴＡ Ｔ＾ボックス共通構造の下流域にある外来遺伝子を導入するものである。

本発明によるもうひとつの方法で、外来遺伝子産物を高収率で得ながら、ホスト の酵母細胞中の外来遺伝子産物による毒性をコントロールすることができる。こ の方法においては、外来遺伝子は、ＧＰＤプロモーターのようなｃｏｎｓｔｉｔ ｕｔｉｖｅな酵母のプロモーターを正常な（すなわち、ＵＡＳをそう入せずに） 状態で支配している。正常なｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅなプロモーターはｃｏｎ ｓｔｉｔｕｔｉｖｅなプロモーターと同時にそう人された外の上流調節配列によ ってホストの細胞が増殖している間は抑制されている。外来遺伝子産物の生産に 十分な数の形質転換されたホストの細胞があるときは、外来遺伝子産物が生産さ れている間は、外来の調節配列によって正常なｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅなプロ モーターが誘導される。

星圭至翌里 図１はＧＰＤプロモーターの制限酵素切断点地図と、ＧＰＤ　（Ｓ）プロモータ ーをつくるためにこのプロモーターにＳａｌ　ｌサイトをつくったその方法を図 式で説明している。

図２は、プラスミドＰ２−２からのＬＩＡＳ、を分離を説明している。

図３は、プラスミドｐＧＰＤ（Ｇ）−２をつくる方法を説明している。

図４は、ベクターＧＰＤ　（Ｓ）γ４を説明している。

図５は、ベクターｐＧＰＤ（Ｇ）　Ｔ　４を説明している。

図６は、本発明によるベクターの発現におけるプロモーターの構造変化を示して いる。

図７は、酵母細胞・ｐＧＰＤ（Ｇ）　ｒ　４−９の培養時のガラクトース誘導性 のＩＦＮ−ｒの発現を説明している。

図８は、本発明によって得られたＧＰＤ（Ｇ）γ４−９プロモーターのグリコー ス抑制を示している。

図９は、ベクターｐＧＤＰ（Ｇ）　（ＨＢｓ）をつくる方法を示している。

図１０は、ベクターｐＧＰＤ（Ｇ’）　（ＰｒｅＳ）をつくる方法を示している 。

翌−！ 本発明によれば、ＬＩＡＳをＧＰＤポータプルプロモーターの制限酵素サイトに そう人している。　Ｂｉｔｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ、　３２：２６３− ２７４（１９８４）、このために必要なヌクレオタイド配列を表■に示した。

表　ｌ ＣＣ ＧＧ ＵＡＳは、ポータプルプロモーターのＴＡＴＡボックスの上流にそう人される。

　ＵＡＳをそう人によって、プロモーター、たとえば、構成的なプロモーターの スイッチを入れるプロモーターの調節ができる。

特に、Ｌ憇ｒｅＶＩ３ｊａｅのＧＰＤポータプルプロモーターは、上流のＬＩＡ Ｓｅ　ＩＨ節配列を導入することによって、表■に示したようにＡＶａｌｌサイ トで修飾される。このことはＪｏｈｎｓｔｏｎらによってすでに発表されている （Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４：１４４０−１４４８（１９８４）　）　（ 表■参照）。本発明による雑種プロモーターとその方法の実例を照会した配列は 表■のＤｄｅ　ｉとＳａｕ　３ａ制限酵素サイトの間の配列である。

この配列は、のちに、［ｌＡＳ、と関与してくる。

表　■ １０　２０　コ０　４０ ＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＧ　ＣＡＡＣＭＣＡＣＡＧＴＣＡＴＡＴ ＣＣＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴ　ｃＴＴＧＴＧ ＴＣＡＧＴＡＴＡＧＧＴＡＡＧＡＧＴＴＭＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴ　ＧＴＣＡＣＡ ＣＡＣＴＴＧＧＴＴＡＣＡＴＡＧＧＴＣＧＴＧメＨ被ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　 ＡＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＭ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＡＴＡＧＧＡＴ ＴＴＴＴＴＴＧＧ　ＭＧ　ＡＧＡＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＡＴ表　ｌ 　（続き） ＴＧＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴ　ＣＧＣＧＴＴ　ＣＣＴ　ＧＭ　 ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧＡＣＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＭＧ　ＴＧＧ　ＣＣ Ａ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧ 　ＣＣＧ　ＣＡＣＴＧＣＴＣＣＧＡＡ　ＣＡＡ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＴＴＣＴＡＣ ＡＡＴＡＣＧ　ＧＡＧ　ＣＧＣＧＧＣＧＴＧ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＧＴＴ 　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＭＧ　ＡＴＧ　ＴＴＡ５１０　５２０　５３０　５４０　’ ＡＣＴ　ＡＧＣＴＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＭ　ＡＡ Ａ　ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＡＣＣＴＧＡ　ＴＣＣＡＡＡ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　 ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＣＴＣＣＴＴ　ＴＴＴ　ＡＡＣＣＧＴ　ＣＡＴ　ＴＧＧＡＣＣ ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＴＡＧ　 ＴＴＴ　ＭＴ　ＴＧＴ　ＴＧＧ６ＥＩＯ６９０７００７１０ 表　ロ　（続き） 結果として得られた雑種プロモーターは、酵母細胞において、ヒトのＩＦＮ−γ を発現させるのに有用であった。もとのＧＰＤポータプルプロモーターと比較す ると、雑種プロモーター、−一般にＧＰＤ　（Ｇ）とよばれているーは、炭素源 によって調節されている。ラクトースのような非発酵性の糖を用いると、発現量 は、低い基本的なレベルである。ガラクトース、もしくはガラクトースとラクト ースを足したのちを用いるとＩＦＮ−ｒの発現量は５０−２０００倍になる。

グリコースを用いた場合の発現量はラクトースを用いた場合と匹敵する。一方、 グルコースとガラクトースの両方を用いると、ガラクトースのみを用いた場合に 比べて、発現量が抑えられる。もとのプロモーターは、グルコースを用いた場合 もガラクトースを用いた場合も、ＩＦＮ−γの発現量は変わらない。これらの結 果がら、グリコース抑制はＵＡＳ、、のＤＮＡ配列によるものであることが示さ れる。

雑種プロモーターは、ＵＡＳ、の方向もしくはＵＡＳｃをたくさんそう人するこ ととは関係なしに、転写を調節する。

特に、ｐＧＰＤ（Ｓ）−２をつくるために、ＧＰＤプロモーターのＴＡＴＡボッ クスより５゛側に２４０塩基対はなれたところ（転写開始領域より５”側に３３ ７塩基対はなれたところ）にあるＡＶａ　ＩＩｌサイトＳａｔ　ｌサイトに変え る。　ｐＧＰＤ（Ｓ）　γ４をつくるために、ＩＦＮ−γをコードする化学的に 合成された遺伝子と酵母のＰＧＫにとりこまれると酵母の導入最適コドンを翻訳 しない遺伝子を、ｐＧＰＤ（Ｓ）−２のＢａ−旧サイトにクローニングする。サ ブクローニングしたＵａＳ、フラグメントをｐＧＰＤ　（Ｓ）　ｒ　４のＳａｌ 　ｌサイトにクローニングして、ｐＧＰＤ（Ｇ）　γ４プラスミドを作製する。

本発明のこれらの点は、以下の実例で説明する。

実例１では、本発明で用いるプラスミドの構造を詳細に述べている。実例２では 、ＩＦＮ−ｒを発現するベクターの構造と、それによるＵＡＳｃ　１１節につい て述べている。実例３では、酵母のもとのプロモーターと本発明による雑種プロ モーターのプラスミドのコピー数について述べている。最後に、実例４では、本 発明で得た雑種プロモーターによって調節される外来遺伝子の発現についてｐＧ ＰＤ−２とｐＰＧ７０プラスミドの構造についてはＢｉｔｔｅｒらが報告してい る、Ｂｉｔｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ、　３２：２６３−２７４（１９８ ４）。ｐΔ２２　（ＧＰ［ｌ）プラスミドは、Ｂｉｔｔｅｒらが報告している（ 前述）ＧＰＤ　Ｈｉｎｄ　ｍ如ＩＩボークプルプロモーターをＢｉｔｔｅｒらの 方法（前述）に従って、ＥｃｏＲｌサイトをＣ１ａ　ｌサイトにつないだ、ＰＢ Ｒ３２２からの誘導プラスミドｐΔ２２に、クローニングして作製した。

ｐ２−２プラスミドは、ＧＡＬＩとＧＡＬＩＯを逆向きに転写する６７６塩基対 の遺伝子開領域と、遺伝子をコードする領域の一部を含むＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ　ＤＮＡの２キロベースのＥｃｏＲＩフラグメントをもっている。

ｐ２−２プラスミドは、ｈｙｂｒｉｄｉｙａｔｉｏｎのｐｒｏｂｅとして、Ｓ、 ｃａｒｌｓｂｅｒ且ｕ旦のＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ遺伝子クラスターを用いて（Ｃ ｉｔｒｏｎ、ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：２６９−２７８（１９８４）　）　、Ｓ、ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムライブラリーからクローニングしたものである。

ＤＮＡ組みかえ操作の方法は、すべて、門ａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ １ｅｃｕｆａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９Ｂ２）　（ここ では、参考文献にのせである）に述べられている標準的な方法を用いた。

図１に示したように、Ｓａｌ　Ｉ制限酵素サイトをＧＰＤポータプルプロモータ ーのＴＡＴＡボックスから５°側に２４０塩基対はなれた位置してＧＰＤプロモ ーターをもつ９５０塩基対のフラグメントは、アガロースゲル電気泳動で精製し た。このフラグメントを、ＧＰＤプロモーターの一３８２領域で開裂する紅虹■ で消化した（Ｂｉｔｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ。

前述）。Ｃｏｈｅｓ　ｉｖｅ末端はＫｌｅｎｏｗフラグメントと錘ＩＩリンカ− を混合ＤＮＡフラグメントをＨ４ｎｄｌ［ＩとＢａｍＨＩで切る。こうして得た ３５５塩基対と３１５塩基対のＤＮＡフラグメントをポリアクリルアミドゲル電 気泳動で精製した。

図２に示したように、ｐ２−２プラスミドはＥｃｏＲＩで消化した。できた２キ ロベースの酵母ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製した。Ｄｄ ｅ　ＩとＳａｕ　ＩＩＩＡで２キロベースのフラグメントを消化すると、Ｇｕａ ｒｅｎｔｅらが報告している（Ｇｕａｒｅｎｔｅ、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、＾Ｃａｄ、５Ｃ１ＵＳ＾）、７９ニア４１０−７４１４（１９８２））　 ＩＪ＾Ｓ６をもっていると考えられる約３６５塩基対のフラグメントを含むより 小さなフラグメントが１シリ−、ズできる。このフラグメントにＩＩＡＳ、が含 まれることは、５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｙａｔｉｏｎによ つて確認されたが、このことによって、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらが報告している（Ｊ ｏｈｎｓｔｏｎ、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４：１４４０− １４４８（１９８４）　）　ＵＡＳｃ、の配列に由来するオリゴヌクレオタイド ５’　−ＣＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＧＡＴ−３’に、このフラグメントだけがｈ ｙｂｒｉｄｉｚｅ　Ｌｐていることが示された。

この３６５塩基対のフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製した。５ａ ｌｌリンカ−を加えて（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、前述）、このフラグメ ントをｐＢＲ３２２にクローニングして、ＵＡＳｃのもとに用いられるｐＢＲ（ ＵＡＳｃ　）を作製した。

−３８２８１域にＳａｌ　ＩエサイトをもつＧＰＤ　（Ｓ）ポータプルプロモー ターは、ｐＢＲ３２２にＨｉｎｄｌｌＩ　とＢａｍＨ［を作用して開裂させたと ころに、３５５塩基対と３１５塩基対のフラグメントをクローニングして作製し た。このＧＰ［ｌ　（Ｓ）プロモーターにＨｉｎｄｌｌＩ　とＢａｍＨＩを作用 させて、Ｂｉｔｔｅｒらの報告している（Ｂｉｔｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、前述） 　ｐＰＧ７０にクローニングし、ｐＧＰＤ（Ｇ）−２を作製した（図３参照）実 例　２ インターフェロンγのアナログであるＩＦＮ−γ４Ａ、−これは表■の４セツト めの配列をもっているが−をＣａｒｕｔｈｅｒｓの方法〔並摂１ｃａｌ　ａｎｄ 　Ｅｎｚ　ｍａｔｉｃ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａ　ｍｅｎ ｔｓ、Ｖｅｒｌａｇ　ＣｈｅＩｌｉｅ＋Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒ ｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ、ベージ７１−７９　（１９８２）〕に よる、ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＋ｌｌ１ｄｉｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いて、化 学的に合成した。

表　■ ＴＴＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＴＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＴＴ 　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＣＡＡＡＧＡＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧ　ＣＡＧ　 ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＡＧ　ＴＴＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＧＣＡＡＴＴＣＡ ＡＧＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴ　ＣＴＧ、ＣＴ Ｇ　ＡＡＧＴＣＴ　ＴＴＣＣＧＧ　ＴＭＧＴＧ　ＣＴＴ　ＭＣＴＡＧＧＴＴ　Ｃ ＡＡＴＡＣＣＧＡＣＴＴ　ＡＡＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧ　ＴＴＣＴＧＡＣＣ ＡＴＴＣＴＣＴ　’ｒＴＣＴＣＴ　ＡＧＡＧＴＴ　ＴＡＣＩＦＮ−ｒ４Ａ遺伝子 は、もとの酵母のＰＧＫ遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から５°側にすぐの ところに位置する１８塩基対に相当する、翻訳されない誘導領域をもつ。旧ｔｚ ｅｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ肌、１．Ｏニア７９１ −７８０８（１９８２）。このコード領域は、酵母遺伝子を高く発現する際に、 優先的に用いられるコドンをもっており、またＢｅｎｎｅｔｚｅｎ　らの方法（ Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５亙３０１ Ｂ−３０２５（１９８２）　）によって計算されたバイアスインデックス０．９ ９のコドンを含む。合成ＩＦＮ−ｒ遺伝子をクローニングした配列は、コリファ ージＭ１３をサブクローニングして、Ｓａｎｇｅｒらのデオキシ鎖決定法（Ｓａ ｎｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ） 、７４　：　５４６３−５４６７（１９７７）　）によってＤＮＡ配列を決めて 、決定した。

クローニングした合成遺伝子の遺伝子配列を決めたあとは、これを展１−５ａｔ 　Ｔフラグメントとして用いた。このＨｐａ　Ｉ　−Ｓａｌ■フラグメントの末 端は、Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎ ａ。

から入手できる。マングビーンのエンドヌクレアーゼで消化したプラントから得 られた。実例１で示したｐＧＰＤ（Ｓ）−２プラスミドはＢａｍＨｔで開裂して 、付着末端部の突出物は、実例】で述べたように取り除いて、ＩＦＮ−ｒ　４Ａ 遺伝子をプラント末端のライゲーションによって、正しい方向にクローニングし 、図４に示したようにｐＧＰＤ　（Ｓ）　γ４を作製した。

ｐＧＰＤ（Ｓ）　ｒ　４　ベクターは、Ｓａｌ　Ｉ　Ｔ！開裂した。ｐＢ［？（ ＵＡＳｃ　）プラスミドをＳａｔ　Ｉで開裂し、３７５塩基対のフラグメントを 精製して、これをＣａｌ　１で開裂したｐＧＰＤ（Ｓ）　ｒ４にクローニングし 、図５に示したようにｐＧＰＤ（Ｇ）　γ４ベクターを作製した。特定のベクタ ーにおけるＵＡＳ、の方向性は図６に示した。ｐＧＰＤ　（Ｇ）　γ４−９ベク ターは図６に示したｐＧＰＤ　（Ｇ）　γ４の基本的な方向性と一致し、ＵＡＳ ６のＣＡＬＩ隣接末端はビとして図６に示しである。ｐＧＰＤ（Ｇ）　γ４−５ １ラスミドでは、そう人された部分のヘッドとテールを、制限酵素でマフピング する方法で、２つのコピーのＵＡＳａがそう人されていることを確かめた。ｐＧ ＰＤ（Ｇ）　、Ｔ　４−８もＵＡＳｅ配列が２コピーそう入れされているが、ｐ ＧＰＤ　（Ｇ）　γ４−５の配列のコピーとは逆向きである。

Ｓａｌ　Ｔで、ｐＧＰＤ（Ｓ）　γ４を完全消化すると、部分的な匡ｏＲＩ消化 がおこるが、これをＣｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、 Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手できるＫｌｅｎｏｗフラ グメントで末端をうめて、ライゲーションして、ｐＧＰＤ　（ΔＲ５）　ｒ４ベ クターを作製した。このｐＧＰＤ　（ΔＲ３）　ｒ４ベクターは、２　μ／ｐＢ Ｒ３２２のＥｃｏＲｌサイトから、ＧＰＤプロモーターのＳａｌ　ｌサイトまで のＤＮＡ　、−総トータルが３４４塩基対であるが、−が欠失している。

本発明で用いられているＪ１７−３ａホスト細胞は、Ｊ１７株由来の５ＩＣｅｒ ｅｖ　ｉｓ　ｉａｅの細胞である（Ｆｉｔｚｇｅｒａ！ｄ−Ｈａｙｅｓ、ｅｒ　 ａｌ、　Ｃｅ１１．２９ニブラスミドをｃｕｒｉｎｇしたちのである。またＤ？ Ｉ−１（ｌ−１（／　ＭＡＴα、ｔｒｐｌ、ｃｉｒ　”　）　（ＡＴＣＣＮｎ２ ０７４９．１９８５．５．取得〕とよばれる株は、ＲＨ２１８（Ｍ＋ｏｙａｒｒ ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４：４８　：５４（１９７８ ））　（ａ、ｇａｌ　２゜ＴＲＰｌ、　ｃｉｒ　＠）　とＪ１７−３八株（ｅｘ 　、ａｄｅｌ、ｈｉｓ２．ａｌｅｔ１４．ｕｒａ３．　ｔｒｐｌ、ｃｉｒ″）を かけあわせてつくった株である。ベクターは旧ｎｎｅｎらの方法（旧ｎｎｅｎ、 ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　７５： １９２９−１９３３（１９７８）　）によって、ホスト細胞に導入した。

形質転換体は、アミノ酸を含まない０．６７χのｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ 　ｂａｓｅ　（ＹＮＢ）と、０．５χのカザミノ酸を含む２χグルコースで、選 別した。

形質転換体を０．６７χＹＮＢ、　０．５χカザミノ酸で培養して、実験に通し た炭素源を決めた。すべての株を、グルコースを炭素源として含む培地で維持し た。

Ｗｅｃｋらの方法［Ｗｅｃｌｉ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏ ｌｏ　、　５７：２３３−２３７（１９８２）　）を用いて、アッセイした、ｅ ｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔによる、細胞抽出物 中のＩＦＮ−ｒを定量した。細胞を長期間培養して１．１００Ｄ−ｍｌ（１０ｍ ｌの０Ｄ−１培養に対する細胞数に相当する）を取り除いて、細胞を遠沈し、て 集める。水で洗った後、この細胞のブレンドを、ｐＨ８，０の５０ＩＩＩＭのト リス−塩酸、６Ｍ尿素、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭ ＳＦ）０．２＋ｍｌに再懸濁して、ガラスピーズで激しく攪拌して、熔かす。細 胞抽出物の稀釈は、２χの仔牛血清を含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｉｎｉｍ ａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍで行なった。

程々の構成物のプロモーター活性は、生産されたＴＦＮ−ｒのバイオアッセイ測 定によって、測った。このバイオアッセイで、非常に低い発現量のＩＦＮ−γを 正確に定量することができるので、種々の代謝条件下にある相対的なプロモータ ー活性を測定できる。各々のベクターの転写開始点と終結点は、それぞれ異なっ ているので、異なった株を用いたり、生育条件を変えたりすると、ＩＦＮ−１ｍ ＲＮＡの翻訳効率は変わってくる。だから、バイオアッセイによってめた、ＩＦ Ｎ−ｒの発現量はプロモーター活性を、間接的にめたものである。

ｐＧＰＤ（Ｓ）　γ４もしくは、ｐＧＰＤ（Ｇ）　γ４−９のどらちかをもった 、ＤＭ−１株を２χグルコースを含む上述の培地で培養して、飽和状態になると 、それを表■に示した炭素源２χを含む選択培値に接種して１晩、培養した。細 胞をガラスピーズですりつぶしてホスト細胞の抽出液を得、ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ 　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔアンセイ法を用いて、ＩＦＮ−γを定量 した。

もとのＧＰＤ（Ｓ）プロモーターは、００−Ｌ　（すなわち、化学密度が１のと きの１１の培養液）培養液あたり、１．６　ＸＩＯマｕｎｉｔｓのＩＦＮ−γを 生産する。　ＩＦＮ−γタンパクｆｌあたりの比活性をＩ　Ｘ　１０’ｕｎｔｔ ｓとすると、この発現量は、細胞の全タンパク量の１−２χに相当する。

一般に、グリコースで培養したときのｐＧＰＤ　（Ｓ）　γ４の発現量は、ガラ クトース、ラクトース、ガラクトースとラクトースたしたもので、培養したとき の発現量よりも、同じか、わずかに高い。グルコースで培養すると、ｇｌｙｃｅ ｒａｌｄｅｈｙｄｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの 酵素活性が、１０００倍になるとの報告もある（Ｍａｉｔｒａ、ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、皿４７５　（１９７１））　、表■に示したように、 このようなＧＰＤ活性の増大は、大部分は、ＧＰＤの前にあるｍＲＮＡの翻訳効 率の増加、もしくは酵素の活性あるいは安定性の増大による。また、この実例で 用いた、６５１塩基対のＧＰＤプロモータ一部分は、転写がグルコースによって 誘導されるのに必要なりＮＡ配列を含まない。

ＧＰＤ　（Ｇ）プロモーターは、炭素源によって、明らかに発現調節に違いを示 す。表■に示すように、ＩＦＮ−γの発現量は、グルコースで培養すると、もと のプロモーターに比べて、明らかに減少する。

また、雑種プロモーターをもつ株を、ガラクトースで培養すると、発現量が１０ ０−２００倍になる。ラクトースで培養した場合の雑種プロモーターの発現量は 、さまざまであるが、ガラクトースで培養した場合に比べると、常に少ない、ラ クトースとガラクトースをあわせた培地で培養すると、誘導が最大になる。それ に比べて、グルコース２ｚとガラクトース２ｚで培養した場合は、２０−４０χ の誘導しかおこらない。これらの結果から、雑種プロモーターは、いくつかの機 能的な状態をもつことがわかる。このプロモーターは、ガラクトース存在下で誘 導される。またラクトースでは誘導されずに、グルコースでは抑制される。この 実験における（グルコース＋ガラクトース）グルコース抑制の度合いは、まだよ くわがっていない、というのも培養している間に、グルコースが消費されるため 、グルコース濃度がかかわるためである（あとに述べる図８考察を参照のこと） 。

本発明による雑種プロモーターを用いた、ＩＦＮ−ｒ生産において、ｐＧＰＤ（ Ｇ）　ｒ　４−８ベクターをもつＤＭ−１株のホスト細胞を、１１の選択培地を いれた１６１の培養器に接程する（前述）、細胞を３０Ｃで、好気的に培養して 、グルコースを消費させる。４８時間後に、ガラクトースをＬｏｇ／　１加えて 、培養を続ける。

適当な時期に、細胞をサンプリングして、全細胞中のＴＦＮ−ｒの量を、前述し たパイオアフセイによって、定量する。その結果、この培養条件下で、２０００ 倍の誘導量が得られ、培養液１１あたりのＩＦＮ−ｙ量は、最終的に２．２　Ｘ 　１０”ｕｎｉｔｓとなる（図７参照）。

別の実験では、ｐＧＰＤ（Ｇ）　ｒ　４−９をもつＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　 ＤＭ−１細胞を２χグルコースを含む選択培地で、飽和状態になるまで培養した 。

培養液を、２χガラクトースを含む選択培地で、１　：　１０００に稀釈して、 そのときのグルコース濃度を図８に示した。細胞を、図８に示すような細胞濃度 （ＯＤ）になるまで、−晩培養した。全細胞抽出液中によって定量し、結果は、 Ｌｌｎｉｔｓル培養液もしくはＵｎｉｔｓｌｏｏ−Ｌ培養液で示した。

その結果、図８に示したように、今まで以上のグルコースによる、プロモーター の抑制が、示された。また、図８から、グルコースが培養液中に存在するときも 、ガラクトースによる誘導はおこることがわかる。この結果より、グルコースを 含む培地で細胞を培養すると、外来遺伝子の発現が抑制されること、ガラクトー スを含む培地で細胞を培養すると、外来遺伝子の発現が誘導されること（同時に 抑制に必要な基本的なレベル以下のグルコースが存在しながら）が、考えられた 。

去ｊ［−１ 本発明による種々のプロモーターを含むベクターのプラスミドのコピー数を決め るために、酵母のＰＧＭ遺伝子の３”コード領域をもつＤＮＡフラグメントを、 ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎのｐｒｏｂｅとして用いた。

転写終結シグナルとして、この同じＤＮＡフラグメントを発現ベクターがもって いるので、このｐｒｏｂｅは、もとの染色体上のＰＧＫ遺伝子と、ＰＧＫターミ ネータ−１−これは、５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ｆｏｒ＋ｅａｔの大きさで 分離したものであるが−をもつ、プラスミド支持フラグメントの両方をとらえる ことができる。これらの実験で、染色体上のＰＧＫ遺伝子は、プラスミドのコピ ー数をめる際に、内部コントロールとして用いられた。

５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法を行なうために、雑種のｐｒｏｂｅを、Ｐｌ、に ターミネータ−１旧ｔｚｅｍａｎらの報告しているＢＧＴ　Ｕ　−）１’ｉｎｄ 　Ｉ［［３８０塩基対のフラグメント（Ｈ４ｔｚｅｉａｎ、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０　ニア７９１−７８０８（１９８２）　 ）をｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎで得た。プロットを５×５ＳＰＥ％　５ 　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　溶液、０．５ＸＳＤＳ　、　１００　＃ｇ／＋１の サケの精子の変性ＤＮＡ中で、６０℃６０分間処理して、ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄ ｉｚｅする。

Ｈｙｂｒｊｄｉｚａｔｉｏｎは５　Ｘ５ＳＰＥ、　Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液、０．５χＳＤＳ　、　１００μｇ／ｍｌのサケの精子の変性ＤＮＡ　、　 １０’ｃｐｍ／　ｕｇのＤＮＡより大きな比活性をもつ１０ｈｃｐｍ以上のｐｒ ｏｂｅ中で行なった。

対数増殖期にある酵母を、１．０　Ｍ　５ｏｒｂｉｔｏ＋、０．１　Ｍ　ｓｏｄ ｉｕｍ　ｃｔｔｒａｔｅ、　０．０６　Ｍ　ＭａＪＤＴＡ（ｐＨ５，８）　、　 ２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む溶液中で、４＋ａｇ／ｍｌのＺ ｙ＋ｅｏｌｙａｓｅ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｔ 、Ｉｎｄｉａｎａ）で、３７℃、１０−２０分間、インキュベートして、スフェ ロプラストにして、そのスフェロプラストから、ホスト細胞ＤＮＡを抽出した。

スフェロプラストを、遠心で集めて、２０＋ａＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１７ ゜５）、５０ｍＭ　ＮＨ，ＣＩ、　１０ｍＭ　ＭＣＩ、　６ｍＭ　ＭｇＣｈ　、 ０．１χＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む溶液に懸濁して溶菌した。　ＳＤＳと ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｅｌｋ ｈａｒｔ、　ｒｎｄｉａｎａ）をそれぞれ、０．５％、　５０μｇ／ｍｌ加えて 、抽出液を３７℃で一晩インキユベートした。この液を経時的に、ｐｈｅｎｏｌ ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（１：１）で抽出して、５ｏχ、ｌ５ＯｐｒＱｐａｎＯ １＋ｓ次いで７０χｅＬｌ＋ａｎｏｌ中で、沈澱させた。

ＤＮＡを実験に適した制限酵素で消化して、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍａｎ ｉａｔｊｓ、ｅｔ　ａｌ、＋　前述）によって、ＴＢＥ　）ｌ）衝液で作った０ 、７２のアガロースゲルの大きさで分けて、ＢＡ　８５ニトロセルロースフィル ター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　Ａ　５ｃｈｕｅ目より入手可能）上に移した、Ｔ ｈｏｍａｓ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔｌ　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　（ＵＳ Ａ）　、　７７：５２０１−５２０５　（１９８０）。

５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ解析法による結果を表Ｖに示した。

表■に示したように、ＤＭ−１株は、いろいろなベクターで形質転換されると、 プラスミドのコピー数が、かなり違ってくる。　ｐＧＰＤ（Ｓ）　γ４ベクター では、１細胞あたり１コピーより少ない。それに対して、ｐＧＰＤ　（Ｇ）　γ ４−９をグルコースで培養すると、１細胞あたり約６０のコピー数を示す。ｐＧ ＰＤ（Ｇ）　γ４−９をもつＤＭ−１株を、まずグルコースで培養しておいて、 その後、ガラクトースで１晩（４〜５世代時間に値する）培養すると、プラスミ ドのコピー数は、１細胞あたり３０−６０になる。

もとのプロモーターと雑種プロモーターでコピー数が異なるのは、ＤＩＩＡ配列 がプラスミドの安定性に与える影響、もしくは、ＩＦＮ−γの発現量による。後 者の可能性を調べるために、ｐＧＰｌｌ　（Ｇ）　γ４−９をもつＤＭ−１株を 、ガラクトースで５０世代以上、連続的に培養した。その結果、この株のプラス ミドのコピー数は、１細胞あたり１以下に落ちた。

これは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現によって、プラスミドの安定性が減少すること を示している。明らかに、ＩＦＮ−γは、酵母に対して毒性を示しており、この 毒性は、ｐＧＰＤ　（Ｓ）　γ４をグルコースで維持しているときに、低いコピ ー数を示す原因である。

表■の結果より、遺伝子産物による毒性が示される場合でも、本発明によって得 た雑種プロモーターは、グルコースで培養したときのプロモーターの抑制によっ て、高いプラスミドのコピー数（たとえば、表Ｖに示すように６０コピー）を得 ることができるかもしれないと考えられる。その結果、このプロモーターをガラ クトースで誘導すると、低いコピー数しかもたないもとのプロモーターを用いた 場合よりも、外来遺伝子の発現量がより大きくなるかもしれない。だから、本発 明ではめる外来遺伝子の発現量を高いレベルで保ちながら、高密度の細胞を培養 することによって、外来遺伝子産物の毒性の問題を解決している。

汰１ｉ ２つのＢ型肝炎表面抗原の外来遺伝子、つまり、ｍａｔｕｒｅなり型肝炎表面抗 原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子（ＨＢｓ）とｐｒｅ−ｓＯＢ型肝炎表面抗原（Ｐｒｅ− ５ＨＢｓＡＧ、これは、Ｂ型肝炎のゲノムのＰｒｅＳ領域によってコードされて いる１７４の付加アミノ酸をもっている）の遺伝子（ＰｒｅＳ）を、それぞれ、 ＩＦＮ−Ｔ　ｙｆ：得るために用いた実例１と実例２の手法でｐＧＰＤ（Ｇ）− ２とｐＧＰＤ（Ｇ’）−２プラスミドにクローニングした。

ｐＧＰＤ（Ｇ）−２とｐＧＰＤ（Ｇ’）−２は両方ともｐＧＰＤ（Ｓ）−２とｐ ＢＲ（ＵＡＳｆ、）由来である。ｐＢＲ（ＵＡＳｃ　）プラスミドをＳａｌ　１ で開裂して、ｔｌＡｓＧを分離し、これをアガロースゲルで精製した。ｐＧＰＤ （Ｓ）−２１ラスミドは、Ｓａｌ　Ｉで開裂した。開裂したプラスミドを１１　 Ａ　Ｓ　ｃと混ぜて、標準的な手法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、前述）で つないだ。このｌｉｇａｔｉｏｎ混合物をＥ、ｃｏｌｉに形質転換して、この混 合物からクローニングしたプラスミドＤＮＡ　と、ｐＧＰＤ（Ｇ）−２とｐＧＰ ［ｌ　（Ｇ“）−２を含むプラスミドＤＮＡは、制限酵素を作用させて解析して 同定した。　ｐＧＰＤ（Ｇ）−２と名付けたクローンは、１つのｔｌＡＳ、をも っているが、その中では、ＧＡＬ　１に近接した末端が、ＧＰＤポータプルプロ モーターのＴＡＴＡボックス共通構造に向かっていた。

ｐＧＰＤ（Ｇ’）−２と名付けたクローンは、ｐＧＰＤ（Ｇ）−２の向きと逆向 きの１つのＵＡＳｅをもっていた。

図９に示したように、）ＩＢｓ遺伝子は、ｐｉｆＢｓ−２プラスミド（Ｂｉｔｔ ｅｒら、前述）由来である。このｐＨＢｓ−２プラスミドを、前述の実例１と実 例２で示したのと同じ条件下で、Ｂａｇ）ｌ　ＩとＥｃｏＲＩで消化した。匡ｏ ＲＩ−Ｂ肥Ｈｌリンカ− ５’−ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　ＣＴＣＧＧＡ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＡＧ −３’は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（前述）の方法によって合成した２つのＩ７を 鎖オリｏＲＩ末端と、ｐ）ＩＢｓ−２に制限酵素を作用して得たフラグメントの 且ｏＲＩ末端を、ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　Ｌ／てｌｉｇａｔｉｏｎすると、ｐＧＰ Ｄ（Ｇ）−２へそう人するのに通した２つのＢａｍＨＩ末端をもつ、２本鎖のＤ ＮＡ部分ができる（実例２で述べた）が、このようにして、ｐＧＰＤ（Ｇ）　（ ＨＢｓ）ベクターを作製した。

ＰｒｅＳ遺伝子を発現させるために、ｐＳＶＳＴ−ＨＢＶプラスミドを用いた。

ｐｓＶｓＴ−）ＩＢＶプラスミドを用いた。ｐＳＶＳＴ−ＨＢＶプラスミドは、 ｐＳＶ４ＳＥＴプラスミド（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎと 相互共有であり、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　５ｅｒｉａ ｌ　ｍ５８４１３２１９８４年２月２７日Ｊｅｆｆｒａｙ　Ｋ、Ｂｒｏｗｎｅに よる、タイトルがＰａｐｏｖａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ″に構 造が述べられている。ここでは引用文献におさめられている。

）とＨＢＶと名付けたＢ型肝炎のゲノムフラグメント由来である。

血清型がＡＤＷのＢ型肝炎ゲノム（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、ｅｔ　ａｌ、　Ａｎ ｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ″の５７−７０ページ、Ｂ、Ｆｉｅｌ ｄｓｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 １９８０）を並虹Ｉで消化して、１６６０塩基対のフラグメントを分離した。こ のＨｐａ　Ｉ末端の末端をうめてプラントをつくり、５ａ１１リンカ−（Ｃｏｌ ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　ＲｅｓｅａｒｃｈＪａｌｔｈａｍ、門ａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓ）ヲ、Ｓａし■で開裂したｐＳＶ４３ＥＴプラスミドにクローニングし たＨｈａ　Ｉフラグメントに加えて、ｐｓＶｓＴ−ＨＢＶプラスミドを作製作用 させて、２つのＳａｌ　１末端をもつＰｒｅＳ遺伝子フラグメントを作る（図１ ０参照）、この［ｌＮＡフラグメントをｄＴＴＰとｄＣＴＰの存在下ｅＳ遺伝子 の２番目のフラグメントと、切断したプラスミドをアニーリングして、つないで 、ＧＩＧＰＤ　（Ｇ）　（ＰｒｅＳ）プラスミドを作った。

ＤＭ−１細胞を、ｐＧＰＤ　（Ｇ）　（ＨＢｇ）とｐＧＰＤ（Ｇ）　（Ｐｒｅｙ ）を用いて、形質転換して、前述の実例２で説明したように、培養した。Ａｕｓ ｚｙｍｅ　Ｕイムノアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋Ｎｏ ｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）によって測定した、異種タンパク の発現量を表■に示した。

竹表昭６２−５０２６６０　（１１） ＦＩＧ、　７ １０″［，１ｍ 時間 ＦＩＧ、８ ｔｏ　＋　０．５　０．１ ％グルコニス ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌ○ 手続補正書（方式） ％式％ ／、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８６１００６８０ ２発明の名称 外来遺伝子の転写を調節する方法と、 雑種プロモーター ３、補正をする者　事件との関係　特許出願人居所　アメリカ合衆国　９１３２ ０　カリフォルニア　サウザンドオークス　オーク　テラス　レイン　１９００ 名称アムジエン 代表者　ウェイスト、　ロバート　ディ。

（国　籍：アメリカ合衆国） り１代　理　人 神戸市中央区東町１２６番地の１貿易ビル９階（発送日：昭和６２年８月１１日 ） ｇ、補正の対象 タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文（内容に変更なし） 国際調費報告 °”−″１°°５°１ｉｏｎ　Ｎ″’ＰＣＴ１０Ｓ８６１００６８０ｋｌ−−門 一−−１１ｅ−＾”””””ＰＣ？１０５８６１００６１１０

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母がもっている、外来遺伝子の転写を効果的に調節している雑種プロモー ターは、以下に示す部分をもっている。つまり、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ −３−ｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターの効果的な 部分、 雑種プロモーターの下流末端に隣接した、ＴＡＴＡボックスとの共通構造、 いわゆるＴＡＴＡボックスの上流のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏ ｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターの位置に、外来の上流調 節配列の効果的な部分をもつそう入部分をもっている。
2. ２．上流の活性化配列について述べている請求の範囲１で、示したような雑種プ ロモーターは、誘導もしくは抑制の両方の作用をもつ上流の調節配列である。
3. ３．上流の調節配列について述べている請求の範囲２で、示したような雑種プロ モーターは、ガラクトースによって誘導される。
4. ４．上流の調節配列について述べている請求の範囲２で示したような雑種プロモ ーターは、グルコースによって抑制される。
5. ５．上流の調節配列について述べている請求の範囲１で示したような雑種プロモ ーターは、培地の炭素源に何を使うかによって、調節される。
6. ６．上流の活性化配列について述べている請求の範囲１で示したような雑種プロ モーターは、ＧＡＬＩ−ＧＡＬ１０遺伝子間領域から上流の調節配列をもってい る。
7. ７．ＧＡＬＩ−ＧＡＬ１０遺伝子間領域について述べている請求の範囲６で示し たような雑種プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅの遺伝子領域にある。
8. ８．ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏ ｇｅｎａｓｅプロモーターについて述べている請求の範囲１で示したような雑種 プロモーターは、酵母のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔ ｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのプロモーターである。
9. ９．酵母のｇＩｙｃｅｒａ１ｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙ ｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターについて述べている請求の範囲８で示したよう な雑種プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの ｇ１ｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ ｎａｓｅプロモーターである。
10. １０．酵母において、外来遺伝子の転写を効果的に調節している雑種プロモータ ーは、以下の部分を含んでいる。つまり、それについては表１に示してあるよう に、効果的な５例の伸長、対立遺伝子の変化、制限酵素サイトの修飾を含むプロ モーターの少なくとも一部分、 それについては、表Ｉに示してあるように、いわゆるプロモーターの下流末端に 近接したＴＡＴＡボックスとの共通構造それについては表ＩＩに示してあるよう に、外来の上流調節配列の少なくとも一部分、つまり、表Ｉに示したあるように 、いわゆるＴＡＴＡボックスから上流の位置にあるプロモーターの一部にそう入 された、効果的な欠失フラグメントを含む、また、表Ｉに示してあるように、Ａ ｖａＩＩサイトとそこでおこる何らかの修飾を含む部分などをもっている。
11. １１．酵母において、調節可能な転写を仲介するＤＮＡ部分は以下の部分をもっ ている。また、酵母において、外来遺伝子の転写を効果的に調節する雑種プロモ ーターは、以下の部分をもっている。つまり、ｇ１ｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ− ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターの効果的な 部分、雑種プロモーターの下流末端に近接するＴＡＴＡボックスとの共通構造、 いわゆるＴＡＴＡボックスの共通構造の上流のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ− ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーター上の、外来 の上流調節配列の効果的な部分を含むそう入部分ＴＡＴＡボックスとの共通構造 の下流にある外来遺伝子などをもっている。
12. １２．外来遺伝子について述べている請求の範囲１１で示したような転写が調節 できる遺伝子はγ−インターフェロン遺伝子の効果的な部分をもっている。
13. １３．γ−インターフェロン遺伝子について述べている請求の範囲１２で示した ような調節可能な遺伝子、ヒトのγ−インターフェロン遺伝子である。
14. １４．外来遺伝子について述べている請求の範囲１１で示したような調節可能な 遺伝子は、Ｂ型肝炎表面抗原の遺伝子である。
15. １５．Ｂ型肝炎表面抗原の遺伝子について述べている請求の範囲１４で示したよ うな調節可能な遺伝子は、ＰｒｅＡ−ＨＢｓＡｇ遺伝子である。
16. １６．Ｂ型肝炎表面抗原の遺伝子によいて述べている請求の範囲１４で示したよ うな調節可能な遺伝子は、ＨＢｓＡｇ遺伝子である。
17. １７．酵母において、遺伝子の転写を調節する方法は以下に示すステップをもっ ている。 すなわち、酵母のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄ ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅプロモーターのＴＡＴＡボックス共通構造の上流の、 外来の上流活性化配列の効果的な部分をそう入して、そして、ＴＡＴＡボックス 共通構造の下流の外来遺伝子を導入するステップから成っている。
18. １８．請求の範囲１７に示したような方法は、さらに、ガラクトースでプロモー ターを誘導するステップから成っている。
19. １９．請求の範囲１７で示したような方法は、さらに、グルコースでプロモータ ーを抑制するステップから成っている。
20. ２０．外来遺伝子産物を高収率で得る一方、雑種プロモーターを含むベクターを 用いて形質転換した酵母ホスト細胞に対する、外来遺伝子産物の毒性を調節する 方法には、以下のステップが含まれている。すなわち。正常なｃｏｎｓｔｉｔｕ ｔｉｖｅな酵母プロモーターの支配下で外来遺伝子を発現させるｃｏｎｓｔｉｔ ｕｔｉｖｅなプロモーターにそう入した外来の上流調節配列によって、形質転換 されたホスト細胞の増殖期において、正常なｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅなプロモ ーターを抑制する外来遺伝子産物が生産される時期に、上流の調節配列によって 、正常なｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅなプロモーターを誘導するステップから成っ ている。