JPH07503137A - 血清ヒトアルブミン，製剤及び利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血清ヒトアルブミン、製剤及び利用 本発明はヒト血清アルブミンの製剤、その製造法及びその利用に関する。

ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）は５８５アミノ酸で分子量が６６ＫＤの非グリ コツル化モノマータンパク質である。その球状の構造は連続した９つの二重ルー プを形成する１７のジスルフィド架橋により保持されている（ＢｒｏｗｒｌＩ、 Ｊ、Ｒ，、”Ａｌｂｕｍｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ 　Ｕｓｅｓ”、Ｒｏｓｉｎｏｅｒ、Ｖ。

Ｍ、ｅｔ　ａｌ　（ｅｄｓ、）Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆ。

ｒｄ、（１９７７）２７−５１）　。ＩＳＡをコードする遺伝子は高度に条里性 であることが既知であり、種々の条件下における電気泳動分析により３０より多 い見掛は止具なる遺伝子変異型が同定された（Ｗｅｉｔｋａｍｐ、Ｌ、Ｒ，ｅｔ 　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、３７（１９７３）２９１−２２６）。

ＩＳＡの遺伝子は１４のイントロン配列により１５のエキソンに切断され、推定 “キャッピング部位からポリ（Ａ）の付加のための最初の部位まで１６．９６１ ヌクレオチドを含む。

ヒトアルブミンは肝臓の肝細胞で合成され、続いて血流中に分泌される。この合 成はまず第１に前駆体であるプレブローＨ３Ａを与え、それはナセントポリペプ チドを分泌経路に方向付ける１８アミノ酸のシグナル配列を含む。

ＨＳＡは血中で最も豊富なタンパク質であり、血清１リツトル当たり約４０ｇの 濃度である。従っていつでもヒトの体内を約１６０ｇのアルブミンが循環してい る。ＨＳＡの最も重要な役割は血流の正常な容量オスモル濃度の保持である。そ れは又、種々の物質に関する例外的な結合能力を有し、疎水性分子（ステロイド 及び胆汁酸塩など）の内因性輸送、及び種々の治療物質の輸送の両方で役割を果 しており、治療物質はそれぞれの作用部位に輸送されることもできる。さらにＨ ＳＡは最近プロスタグランディンの代謝に関連するとされた。

ＨＳＡは血漿タンパク質に関する世界市場の４０％に相当する。その商業的興味 は、この産物が例えば外科手術、事故又は出血の際の血液損失を補うためのいわ ゆる置換溶液（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）として広く、及び 患者１人に対して１日当たり数十グラムという高投薬量で用いられるという事実 にある。現在Ｈ８Ａの年間消費量は３００トンより多いと見積もることができる 。

現在まで市場で入手できるＨＳＡはヒト由来の生物材料からの精製により生産さ れている。特に献血から得た血漿の分別のための従来の方法により（Ｃｏｈｎ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、６８（１９４６）４５９ｐｐ）　 、又はＪ、Ｌｉａｕｔａｕｄ　ｅｔ　ａｌ（１３ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆＩＡＢＳ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ；Ａ：　”Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄｇ、Ｋａｒｇｅｒ　（ｅｄ、）、Ｂａ１ ｅ。

２７　（１９７３）１０７ｐｐ）により記載の方法に従いヒト胎盤からの抽出に より得られる。

遺伝子工学及び新規な抽出及び精製法の発達により、純度がより高く安定性がよ り優れ、ウィルス汚染（例えばＢ型肝炎及びＡＩＤＳ）の危険のない改良された 製品を低コストで得る可能性が開かれた。ＩＳＡ市場の重要性から、このタンパ ク質を組み換え経路により生産する可能性が広（研究されてきた。かくして多数 の発現系が組み換えＨＳＡの生産に関して研究された。

さらに特定するとバクテリア宿主に関し、最初の遺伝子工学実験では宿主生物と してバクテリアＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）が用いラレタ。か＜シテ欧州特許ＥＰ 　２３６　２１０．ＥＰ　２００　５９０．ＥＰＩ９８　７４５又はＥＰ　１　 ９２９は種々の発現ベクター、種々の転写プロモーター及び分泌のための種々の シグナルを用いてＥ、コリ中でＨＳＡを生産する方法につき記載している。続い てバシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＩＳ Ａの分泌に関する研究も行われたが、この系で得られるアルブミンの量はまだ満 足できるものとは思われない（Ｓａｕｎｄｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａａｔ ｅｒｉｏｌ、１６９　（１９８７）２９１７）。

真核宿生に関し、宿主生物として酵母を用いたＨＳＡの生産が開発された。かく してＳ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４（１９８６）７２６）におい て、キレート形成プロモーターの制御下で自分自身のシグナルペプチドにより方 向付けされたＩＳＡの分泌を示すことができた。ビールの製造中に後−発酵法（ ｐｏｓ　ｔ−ｆ　ｅ　ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いたビール 酵母におけるＨＳＡの生産も言及された（ＥＰ　２０１　２３９）。最近、特許 出願ＥＰ　３６１　９９１は、宿主生物としてプラスミドｐＫＤｌから誘導した ベクターで形質転換した酵母クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ玉） を用いた特に有効な系につき記載している。この系を用い、培地中で特に多量の 分泌Ｈ３Ａを得ることができた。最後に、ピキア　バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　 ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組み換えＩＳＡの生産も記載された（ＥＰ　３４４ 　４５９）。さらにＨＳＡの精製も多数の研究の主題であった（ＥＰ　３１９　 ０６７）。

しかし組み換え経路によるＩＳＡの生産に当てられた大きな努力にもかかわらず 、この製品はまだ市場に存在しない。これは製薬学的に用いることができるＨＳ Ａを工業的規模で、及び経済的に有利な条件下で得ることを可能にする遺伝子工 学に基づく非常に有効な方法の開発が困難であることと結び付いている。特に生 産性の問題は多少解決されたと思われるが（天然のヒト血清アルブミンの三次構 造と一致する三次構造を有する正しく成熟した分泌アルブミンの多量の生産）、 先行技術に記載されている方法により製薬学的に用いることができるＨＳＡを得 ることはできない。生産されるＨＳＡがある質的標準に従うことは、実際に不可 欠である。特に製薬学的用途を与えられた場合、組み換えＨＳＡは天然のアルブ ミンの物理化学的性質を有し、均一性、純度及び安定性に関するある基準を満た していなければならない。かくして薬局方は血漿アルブミンの溶液に関して一定 の数のパラメーター、すなわちｐＨ値、タンパク質含有量、ポリマー及び凝集物 の含有率、アルカリ性ホスファターゼ、カリウム及びナトリウムの含有量、なら びに一定のタンパク質組成を設定している。一定の吸収、安定性の試験、発熱物 質及び毒性に関するアッセイに準拠することも必要である（“Ａｌｂｕｍｉｎｊ 　ｈｕｍａｎｉ　５ｏｌｕｔｉｏ＋Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｐｈａｒｍａｃｏｐ。

ｅｉａ　（１９８４）２５５を参照）。

遺伝子工学法を含む先行技術の方法の主な問題の１つは、それが着色組み換えＨ ＳＡを生成することである。この現象は、培地中で組み替えＩＳＡを発現させ、 分泌させる系の場合に最も重要である。これに関し本出願の実施例Ｂ１及びＢ２ は、先行技術の条件下で宿主生物として酵母を用いた発現系の場合の着色の問題 を例示している。実施例Ｂ１は限定的ではないが、用いた発酵の様式（流加、バ ッチ、連続）にかかわらず調べたすべての株の場合に観察された着色現象を例示 している。さらに本目的のために行った多数の努力にかかわらず、精製によりこ の着色を除去することはできなかった（実施例Ｂ２を参照）。これらの条件下で 組み換え経路により生産され、着色のないＨＳＡは先行技術に記載されていない 。しかしこの着色の存在は組み換えＩＳＡの製薬学的利用の障害となる。実際に かくして得られた製品は、着色に責任のある成分を含むために不均一である。さ らに着色が調剤により変わり、先行技術はこの着色を制御することができないの で、その組成が限定されない。これらの条件下で、常に組み換えＨＳＡの同一の 調剤を得ることを可能にする再現性のある方法を限定するのは非常に困難である 。最後に、着色に責任のある成分の存在の故に、先行技術の組み換えＨＳＡはも しかすると免疫原性である。

本発明の特徴の１つは、優れた品質であり、抽出ＩＳＡの性質を有し、製薬分野 で用いることができる組み換えＩＳＡの製剤の提供である。

さらに特定すると本発明の１つの特徴は、既知の方法で精製した後（ａ縮、沈澱 、クロマトグラフィーなど）の比色分析指数（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ　１ｎｄ ｅｘ）が０．２より小である組み換えＩＳＡの製剤の提供である。本発明の目的 の場合、比色分析指数は２８０ｎｍにおける吸収に対する３００ｎｍにおける吸 収の比率（ｉ　＝ＯＤ３゜。１０Ｄ２ａｏ）を意味すると理解される。この比率 は、与えられた溶液においてその濃度に依存しない吸収を反映するので、ＩＳＡ に関する比色分析を十分に特性化している。

本発明の１つの目的は、製薬学的に用いることができる組み換えＩＳＡの製剤を 工業的量で、及び経済的に有利な量で生産することを可能にすることである。

ここで出願人は、組み換え経路により工業的量で非−着色ＩＳＡ溶液を得られる ことを示した。本発明は、生産されるＩＳＡの品質が宿主又は選ばれるベクター 、あるいは培地からのＩＳＡの精製法ばかりでな（、生産培地の組成自身に大き く結び付いていることを示すことに基づく。

か（して特に炭素源及び生産培地の調製の条件を修正することにより、比色分析 指数が０．２より小である組み換えＨ３Ａ溶液を得ることができた。

従って本発明の第１の主題は、比色分析指数が０２より小であり、真核又は原核 宿主における外因性ＤＮＡ配列の発現から生ずることを特徴とするヒト血清アル ブミンである。

本発明は比色分析指数が領　２より小の組み換えＩＳＡを初めて与える。かくし て本発明は免疫原性反応め危険が非常に低く、製薬分野で用いることができる組 み換えＩＳＡを与える。さらに血漿Ｈ３Ａと比較して本発明のＩＳＡは均一であ り、完全に限定された組成であるという利点を与える。実際にその多重性の故に 多数のＨ３Ａ変異型が存在する。

か（して同定された変異型の中でいくつかの変異型は置換プロペプチドを保存し ており（Ｂｒｅｎｎｅｎ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ　λヱ４　（ １９７８）９０８；Ｇａ１ｌｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｒｅｖ、Ｆｒ、Ｔｒａｎｓｆｕｓ、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｈ６ｍａｔｏｌ。

ｋｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕｎｏ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏｌ、ＦＩｕｉｄｓ　Ｐｌ）、又はＣ−末 端の欠失（Ｇａｌｌｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１ 　（１９８６）４２８３）を有する。さらに構造的変化が同定されていない多く の変異型がある。このために非常に多数のヒトのドナーに由来する生物材料の抽 出により得た血漿ＩＳＡは、その多重から生ずるＨ３Ａ変異型をすべて含む可能 性がある。本発明は、同定された１種又はそれ以上のＤＮＡ配列の発現による遺 伝的経路で生産されるために、均一で限定されたＩＳＡを与える。

本発明のＩＳＡは比色分析指数が０．１５より小であるのが好ましい。

本発明のＩＳＡは比色分析指数が０．　１より小であるのがさらに好ましい。

本発明のＩＳＡの多の物理化学的特性、すなわち特にその蛍光スペクトルを実施 例Ｂ５に示す。これらのパラメーターはすべて本発明のＩＳＡの品質を示す。

本発明の目的の場合外因性ＤＮＡ配列は、用いられる宿主中に人工的に導入され 、ＩＳＡをコードするいずれのＤＮＡも意味すると理解される。特にそれは宿主 に依存してゲノム配列、ｃＤＮＡ、混成配列などであることができる。しかし本 発明をより良く遂行するために、ｃＤＮＡの使用が好ましい。そのような配列は すでに先行技術に記載されてし）る（特にＥＰ３６１　９９１及びＤｕｇａｉｃ ｚｙｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｓｕｐｒａｍｏｌ、５ｔｒｕｃｔ、＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

５ｕｐｐ１．５　（１９８１）を参照）。さらにこの外因性ＤＮＡは一般にコー ド配列の５°末端に連結された転写及び翻訳の開始のための領域を含み、該配列 の転写及び翻訳を方向付け、調節することができる。これらのプロモーター領域 の選択は用いられる宿主に従って変えることができる。

本発明の枠内で外因性ＤＮＡはベクターの一部であるのが好ましく、それは自律 又は組み込み複製を与えるものであることができる。さらに特定すると自律複製 ベクターは、選ばれた宿主中の自律複製配列を用いて調製することができる。例 えば酵母の場合、これはプラスミド：ｐＫＤＩ（ＥＰ　２４１　４３５）、２μ （Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ２７５　（１９７８）１０４−１０９）など、又は 別の場合染色体配列（ＡＲ３）に由来する復製起点であることができる。組み込 みベクターに関し、これらは例えば相同的組み換えによりベクターの組み込みを 許す宿主ゲノムのある領域に相同な配列を用いて調製することができる。

これに関し、ｒＤＮＡを用いると外因性ＤＮＡの多重組み込みが可能になり、従 って細胞当たり高いコピー数でそれが存在することができる。

好ましい様式の場合、本発明のＩＳＡは真核又は原核宿主における外因性ＤＮＡ 配列の発現から、及び該配列の発現産物の培地への分泌から得られる。実際に製 薬学的品質のＩＳＡを組み換え経路により培地中で直接得ることができることは 特に有利である。この場合、外因性ＤＮＡ配列はＩＳＡをコードする配列の上流 に、あるいは適宜転写及び翻訳の開始のための領域とコード配列の間に、ナセン トタンパク質を用いられた宿主の分泌経路に方向付ける“リーダー”配列を含む 。この“リーダー”配列はＩＳＡの天然の“リーダー”配列であることができる が、異種配列（他のタンパク質をコードする遺伝子に由来する）、あるいは人工 のものであることさえできる。これらの配列の１つの選択は特に用いられる宿主 により指示される。例えば用いられる宿主が酵母の場合、異種“リーダー”配列 としてフェロモン因子α、インバーターゼ又は酸ホスファターゼのリーダー配列 を用いることができる。

本発明の枠内で用いることができる真核宿主の中で、動物細胞、酵母又は菌を挙 げることができる。特に酵母に関し、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ）　、クルイベロミセス、ピキア・パストリス、シュワニオミセス（Ｓｃｈ ｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）又はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母を挙 げることができる。動物細胞に関してはＣＯ５，ＣＨＯ及びＣ１２７細胞などを 挙げることができる。本ｒｍａ　ｓｓｐ、）を挙げることができる。

原核宿主として以下のバクテリア、Ｅ、コリ、バシルス（Ｂａｃｉｌ±旦且）又 はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の使用が好ましい。

本発明の他の主題は、比色分析指数が０．２より小のＩＳＡの製造法に関してお り、それに従い以下の段階が行われるニー第１段階で、用いられる宿主に適した 転写及び翻訳シグナルの制御下でヒト血清アルブミンをコードする外因性ＤＮＡ を真核又は原核宿主細胞中に導入し、 一部２段階で、かくして得た細胞をアルコール、非還元糖、有機酸又は炭素Ｃ４ の酸素上が置換されたグルコース誘導体から選ばれる少なくとも１種の炭素源を 含む限定された組成の培地で、あるいはアルデヒド型の不純物の形成を排除する 、又は制限するように調製された培地で培養し、 一部３段階で生産されたＩＳＡを回収する。

さらに特定すると、本発明の方法の第１段階の際に外因性ＤＮＡは種々の方法に より宿主細胞に導入することができる。特に導入は形質転換、接合（ｃｏｎｊｕ ｇａｔｉｏｎ）又はエレクトロポレーションにより行うことができる。

形質転換に関し、種々の方法が先行技術に記載されている。特にそれは、酢酸リ チウム及びポリエチレングリコールの存在下でＩｔｏ　ｅｔａｌ、（Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１５３　（１９８３）１６３−１６８）に記載の方法に従って、 あるいはエチレングリコール及びジメチルスルホキシドの存在下でＤｕｒｒｅｎ ｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１８　（１９９０）７）の方法に従 って全細胞を処理することにより行うことができる。別の方法も特許出願ＥＰ３ ６１　９９１に記載されている。さらに特定すると原核細胞の場合、Ｄａｇｅｒ ｔ　ｅｔａ　１．　（Ｇｅｎｅ　６　（１９７９）２３−２８）により記載の方 法に従ってＣａＣｌ２の溶液を用いた処理及び続（熱ショックにより形質転換を 行うことができる。動物細胞の場合、Ｈａｙｎｅｓ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、１１　（１９８３）６８７−７０６）ｌ：従うリン酸カルシウ ム法によりそれを行うこともできる。

エレクトロポレーションに関し、Ｋａｒｕｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（ＦＥＢＳ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ　１８２　（１９８５）９０）により記載の方法を有利に用いること ができる。

これらの方法のいずれかの選択は、特に選ばれる宿主及び用いられる外因性ＤＮ Ａの関数として確定される。

本発明の方法で用いることができる真核宿主の中に、上記の動物細胞、酵母又は 菌を挙げることができる。原核細胞の中では上記で限定されたいずれのバクテリ アも用いることができる。

本発明の好ましい実施態様の場合、方法は宿主細胞として真核細胞を用いて行わ れる。

宿主細胞として酵母を用いて本発明の方法を行うのがさらに好ましい。

方法で用いることができるＩＳＡをコードする外因性ＤＮＡは上記で定義した通 りである。それはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　％ゲノムＤＮＡ又は混成りＮＡであるのが好 ましい。しかし本発明のより良い遂行のためにｃＤＮＡの使用が好ましい。さら にこの外因性ＤＮＡは一般にコード配列の５°末端に連結した転写及び翻訳の開 始のための領域を含み、該配列の転写及び翻訳を方向付け、調節することができ る。この領域の選択は用いられる宿主の関数として変えることができる。

本発明の特に有利な実施態様の場合、外因性ＤＮＡは用いられた宿主の分泌経路 にナセントタンパク質を方向付ける“リーダー”配列を、成熟Ｈ３Ａをコードす る配列の上流に含む。そのような配列は上記で定義した。さらに本発明の枠内で 、外因性ＤＮＡはベクターの一部であるのが好ましく、ベクターは上記の通り自 律又は組み込み複製を与えるものであることができる。

本発明の好ましい実施態様の場合、生産法はＩＳＡが制限培地（ＣＯｎｔｒｏｌ 　ｍｅｄｉｕｍ）中に分泌されることを特徴とする。実際に、組み換え経路によ り製薬学的品質の）（ＳＡを制限培地から直接得られるのが特に有利である。

本発明の方法の第２段階は、ＩＳＡをコードする外因性ＤＮＡ配列の発現を可能 にする条件下で組み換え細胞を培養することである。この段階は生産されるＩＳ Ａの量及び品質に直接影響を与えるので特に重要である。本発明は製薬学的品質 の血清アルブミンの生産を可能１こする培養条件につき初めて記載する。

本発明の方法で用いることができるアルコールの中に好ましくは、炭素数が少な くとも２の単純アルコール仁タノールなど）、あるいはポリアルコール（グリセ ロール、ソルビトールなど）を挙げることができる。非還元糖として例えばスク ロースを、有機酸として酢酸塩又は乳酸塩を挙げることができる。本発明で用い ることができるグルコース誘導体は、さらに特定すると以下の式： に対応し、式中でＲは水素以外である。例えば三糖を挙げることができ、１〜４ 型のグリコシド結合を有する三糖、例えばマルトース、セロビオース又はラクト ースが好ましい。

これらの化合物の１つ又はそれ以上の選択は、用いられる宿主により指示される 。しかし宿主を修飾して好ましい炭素源を同化できるようにすることもできる。

これらの種々の炭素源は別々に、又は組み合わせて用いることもできる。例えば グルコース誘導体とアルコールの組み合わせは非常に良い結果を与える。同様に 単純アルコールとポリアルコールの組み合わせも非常に高品質のアルブミンを与 える。さらに予想に反した結果は、この種の組み合わせが、ある場合にはＩＳＡ の生産量を増加させることもでき、従って製造法の収率を上げることもできると いうことである。

本発明の方法は、アルデヒド型の不純物の形成を排除するか、又は制限するよう に調製された培地中で行うこともできる。この種の調製は、限定された組成の培 地において上記の炭素源の１つ又はそれ以上が用いられる場合一般に無益である 。そのような不純物の形成の制限のために種々の方法を用いることができ、その 選択は培地（炭素源の性質）及び考慮されている宿主に依存する。例えば冷温で 炭素源を滅菌するのが有利である（例えば実施例Ｂ４に例示する濾過により）。

本発明の第３段階は、生産された）（ＳＡを培地から抽出することを可能にする 。ＩＳＡが組み換え細胞により培地中に分泌される場合、この抽出は遠心によっ て得られた培養上澄み液から直接行うことができる。

ＩＳＡが分泌されない場合、抽出の前に培養中の細胞を破壊してそれらが含むＩ ＳＡを遊離することが必要である。この前段階は種々の物理的又は物理化学的手 段（音波処理、粉砕、浸透圧ショック、熱ショックなど）により行うことができ る。

抽出は当該技術分野における熟練者に既知の、及び文献に記載の種々の方法で行 うことができる。一般にこれらの方法には遠心、沈澱及びクロマトグラフィ一段 階が含まれる。これらの種々の方法のいくっがを実施例に例示する。

他の主題は上記で定義したＩＳＡを含む製薬学的組成物に関する。

本発明を以下の実施例を用いてさらに完全に記載するが、実施例は例示であって 制限ではないと考えるべきである。

図の説明 履１：混成プロモーターＰＧＫ／ＧＡＬの構築。Ｐ＝プロモーター；ＵＡＳ＝“ 上流活性化配列”。

履ス：ヘクターｐＹＧ４０１の構築の戦略及び提示。Ｐ−プロモーター、Ｔ＝転 写ターミネータ−；互±且＝アンピシリンに対する耐性を与える遺伝子：ａｐｈ ＝ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）に対する耐性を与える遺伝子 。

［ＩＮ３・プラスミドｐＰ４−３３の構築及び提示。

」ニブラスミドｐＹＧ６５の構築及び提示。

区立ニブラスミドｐＹＧ７０の構築及び提示。

」旦ニブラスミドｐＹＧ７２の構築及び提示。

履工：ブラスミドｐＹＧ４０４△ＨｒｎｃｌＩＩＩの構築及び提示。

４旦　プラスミドｐＹＧ１２８の構築及び提示。

履旦、プラスミドｐＹＧ１３１及びｐＹＧ１３２の構築及び提示。

［１＞１０ニブラスミドｐＹＧ６００の制限地図。ｂｌａ＝ｌミニアンピシリン る耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子。

図１１ニブラスミドｐＹＧ７０−２の構築の戦略。ａｐｈ＝ゲネチシン（Ｇ４１ ８）に対する耐性を与える３°−アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺 伝子；ｐｒｏｍ−プロモーター、ＩＲ＝逆方向反復塩基配列、０ＲＩ＝複製起点 ；ＬａｃＺ’＝β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子。（＊）で記した部位は、連結 の後に該酵素により認識される切断部位を再構築することなく対応する部位と適 合する末端を有する。

図１２ニアダブター１〜３の構築のために供給された合成オリゴデオキシヌクレ オチドＡ−Ｆの配列。

図１３＝プラスミドｐＹＧ７０−３の構築の戦略。説明に関しては図１１を参照 。ｔｅｒｍ＝ターミネータ−０１１を参照。

図１６及び１７：アルブミンの種々の調剤のＵＶスペクトル二図１６＝（１）実 施例Ｂ１及びＢ２のアルブミンＢＣＱ７５９　：　（２）実施例Ｂ５のアルブミ ンＢＣＱ８０４ＬＥ　；　（３）対照アルブミンＣＩ　Ｍ）。図１７：実施例Ｂ ５のアルブミンＢＣＱ８３５ＧＥ０一般的クローニング法 塩化セシウム−エチジウムプロミド勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、制限 酵素を用いた消化、ケル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの 電気溶出、Ｅ、コリにおける形質転換などの従来の分子生物学的方法は文献に記 載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、Ｎ。

Ｙ、、１９８６；Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄｓ、）、“Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ″、Ｊ ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７）。

試験管内におけるオリゴデオキシヌクレオチドによる特定部位の突然変異誘発は 、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売のキットを用いてＴａｙｌ。

ｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、よ旦（１９８５）８ ７４９−８７６４）により開発された方法に従って行う。ヌクレオチドの配列決 定はＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、７４　（１９７７）５４６３−５４６７）により記載のジデオキシ法に従 って行う。特定のＤＮＡの酵素増幅はＭ条件下で“ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃ ｙｃｌｅｒ”　（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の勧告 に従ってＰＣＲ反応（“ポリメラーゼ−触媒連鎖反応”）により行う。

実施例 Ａ−ヒト血清アルブミン発現ベクターの構築１、混成プロモーターＰＧＫ／ＧＡ Ｌの制御下のＨ３Ａ発現ベクターの構築＋ｐＹＧ４０１ ヒト血清アルブミン発現ベクターをプラスミドｐＹＧ１９　（ＥＰ　３６１　９ ９１）から調製する。後者は以下の要素を含むニーｐＹＧ１９を、安定でクルイ ベロミセス属の酵母において複製可能なマルチコピープラスミドとするプラスミ ドｐＫＤｌの配列（ＥＰ　３６１　９９１）、 −８，セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のプロモーターの制御下でプレプロ形態をコ ードする構造遺伝子を含むヒト血清アルブミン発現カセット。

−バクテリア性レプリコン及び選択マーカー（アンピシリンに対する耐性を与え るｂｌａ遺伝子）、及び 一酵母に０４１８に対する耐性を与えるａｐｈ遺伝子。

ベクターｐＹＧ４０１はプラスミドｐＹＧ１９からヒト血清アルブミン発現カセ ットのレベルにおける修飾により構築した。ｐＹＧ４０１にＬＩＯ遺伝子のプロ モーターの間の混成プロモーターの制御下にある。

この混成プロモーターは、ＰＧＫプロモーターのＵＡＳ（“上流活性化配列（Ｕ ｐｓｔｒｅａｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）＋）領域（Ｓｔａ ｎｗａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

１互（１９８７）６８５５）をＧＡＬＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターのＵＡＳ領 域（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．４　 （１９８４）１４４０；Ｗｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４　（１９８４）２４６７）で置換することにより得た。

この混成プロモーターは以下の方法で構築した（図１を参照）ニブラスミドｐＹ Ｇ２９の製造は出願ＥＰ　３６１　９９１に詳細に記載されている。このプラス ミドはプラスミドｐＹＧ１９から５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメントの 形態で単離され、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８中にクローニングされたＳ 、セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のプロモーターを含む。その後それを特定部位の 突然変異誘発により修飾し、以下の制限部位を導入したニ ーＡＴＧに対して−２５の位置に１つの追加のＨｉｎｄｌ　Ｉ　１部位。この部 位の導入は、種々のクローニング段階の後にＰＧＫプロモーターの本来の領域と 同一のヌクレオチド領域をＡＴＧの近（に復帰させることを可能にする。実際に ＡＴＧコドンの周りは、真核遺伝子の翻訳の開始の効率に実質的に影響すること が知られている（Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４７　（１ ９８３）１−４５；Ｈａｍｉ　Ｉｔｏｎ、Ｒ，、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ　 １５　（１９８７）３５８１−３５９３）。

−ＵＡＳ領域の両側に２つのＮｏｔＩ部位。

ＧＡＬ１／ＫＡＬ１０プロモーターのＵＡＳは、Ｍｉｙａｊｉｍａｅｔ　ａｌ、 （Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ　１２　（１９８４）６３９７−６４１４；Ｃｌ ｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｐｏｕｗｅｌｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ　（ｉ９８５）　Ｖｌ　−Ｂ−ｉ　１−２）により記載のプラスミドｐＧ１ から単離した。このプラスミドを３７３０５番としてＡＴＣＣに寄託する。

プラスミドｐＧ１はプラスミドｐＵＣ８のＨｉｎｄｌ　ｌ　１部位に挿入された Ｓ、セレビシアエのＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを含む０．５ｋｂのフラ グメントを有し、プラスミドＤＵＣ８からＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの 形態でそれを切り出すことができる（図１）。

このフラグメントをｐＧｌから切り出し、精製し、続いてその制限酵素切断部位 がＵＡＳ領域の両側に位置する酵素ＲｓａＩ及びＡｌｕＩで消化した。か（して 電気溶出により１４３ｂｐのフラグメントを単離し、続いてリンカ−５°　−Ｇ ＣＧＧＣＣＧＣ−３’　を付加することによりＮｏｔＩフラグメントに変換した 。続いてこのフラグメントをあらかじめＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＹＧ２ ９中にクローニングした。

得られたプラスミドをｐＹＧ３２と呼ぶ（図１）。

この混成プロモーターを有する発現ベクターを得るために、混成プロモーターを 有するＳａｌ　ｌ−ＨｌｎｄＩＩ　１７ラグメントをｐＹＧ３２から単離し、以 下の２つの相補鎖から成る合成Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢｓｔＥＩＩ７ダプターに 連結した：５°−ＡＧＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡＡＡＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＡＣ Ａ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ−３’、及び５’　−ＧＴ　ＴＡＣＣＣＡ　ＣＴＴ 　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴＴＡＴ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡ−３°　（転 写開始コドンを太字で示す）。このアダプターはＳ、セレビシアエのＰＧＫ構造 構造遺伝子上直上流置し、プレプロＨ３Ａをコードする遺伝子の第１コドンから 天然の遺伝子に存在するＢｓｔＥ１１部位までを含む２２ｂｐを再構築する（図 １）。

続いてか（して得られ、混成プロモーター及びアルブミン構造遺伝子の５“末端 を有する５ａｉｌ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、アルブミン遺伝子の残り及び Ｓ、セレビシアエの土遺伝子のターミネータ−を有するプラスミドｐＹＧ１９が ら単離したＢｓｔＥＩＩ−３ａｃｌフラグメントに連結することにより、ヒト　 アルブミン発現カセットを再構築した（図２）。

かくして得られたカセットを用い、プラスミドｐＹＧ１９が有する５ａｉｌ−Ｓ ａｃＩ発現カセットを置換した。

得られたベクターをｐＹＧ４０１と呼ぶ（図２）。

２、プロモーターＫＩＡＤＨ４の制御下のＨ３Ａ発現ベクターの構築・プラスミ ドｐＹＧ１３２ ２、　１　Ｋ、ラクチス（Ｋ、Ｉａｃｔｉｓ）からのプロモーターＫｌら得た異 種プローブを用い、クルイベロミセス　ラクチスＣＢ５２３５９／１５２に関す る全ゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得た。さらに特 定するとライブラリは、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３５９／１５２のＤＮＡを酵素５ ａｕ３Ａを用いて部分的に消化した産物を置換ベクターラムダ−Ｌ４７のＢａｍ ＨＩ部位中にクローニングすることにより得た。ハイブリッド形成に用いたプロ ーブは、Ｓ、セレビ／アエのＡＤＨ２構造遺伝子をコードする領域を最初の７０ ｂｐを除イテ含む９８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントである（プ ローブＡ）。このフラグメントはｐＢＲ３２２，ＡＤＲ２，ＢＳａと呼ばれるプ ラスミド（Ｗｉ］Ｉｊａｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１２３（１９８１）６ ０５−６１４；Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　（１９８３）２６７４−２６８２）から酵素消化 によって得られる。

かくして約８ｋｂのフラグメントを単離し、プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ １部位にサブクローニングし、プラスミドｐ６−４−９８を生成する（図３）。

続いてこのプラスミドが有するＢａｍＨＩ挿入片を制限酵素を用いてマツピング し、ＫＩＡＤＨ４遺伝子のプロモーター領域を、プローブＡ及びプラスミドｐＢ Ｒ３２２，ＡＤＲ２，ＢＳａの約１１００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグ メントに対応する第２のプローブ（プローブＢ）を用いたディファレンシャルリ ゾブリダイジエイション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ）によりこのフラグメント上で位置決定した。

第２段階でプラスミドｐ６−４−９８を酵素ＨｉｎｄｌｌＩで消化し、２．２ｋ ｂのフラグメントを単離した。続いてこのフラグメントを標準的方法により精製 し、プラスミドｐＴＺ１９のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位にサブクローニングし、プ ラスミドｐ６−２２００−２　（図３）を生成した。

サブクローニングされたフラグメントを分析すると、それがＫＩＡＤＨρ遺伝子 の最初の１４のコドン及びその上流に位置する発現の調節のための要素を含む領 域を有することが明らかになる。

Ｂｇ１１１部位と翻訳開始コドンＡＴＧの間の部分（約１．２ｋｂのフラグメン ト）を、連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ヱ４　（１９７７）５４６３）を用いて配列 決定した。

２．２　ポータプル（ｐｏｒｔａｂ］ｅ）プロモーターＫＩＡＤＨ４（Ｂｇｌ　 Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ）の構築ブ５スミＦｐ６−２２００−２１：存在する２、２ ｋｂのＨｉ　ｎｄ　Ｉ　ＩＩフラグメント中にＫＩＡＤＨ４遺伝子のＡＴＧコド ンに対して−１６の位置のＢａｍＨＩ制限部位を挿入することにより、ポータプ ルプロモーターを調製した。

この部位の挿入によりプロモーター領域ＫＩＡＤＨ４のみを含む１゜２ｋｂのＢ ｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントの生成が可能になる。又、かくして得た プロモーターの下流に、発現することが望ましいいずれの遺伝子を導入すること も可能にする。

ＢａｍＨＩ部位は、二重プライマー法（ｄｏｕｂｌｅ　ｐｒｉｍｅｒｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂＰｒｅｓ ｓ、１９８９）を用いた特定部位の突然変異誘発によりＫＩＡＤＨ４遺伝子の翻 訳開始の部位（ＡＴＧ）に対して−１６の位置で導入した。この突然変異誘発に 用いた合成オリゴデオキシヌクレオチドの配列を下記に示す。生成されたＢａｍ ＨＩ部位に下線を引き、ＡＴＧをイタリックで示し、星印は最初の配列と比較し て修飾された塩基を示す。

ＩＳ＝最初の配列１Ｍ５−修飾配列。

５’−ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＣＧ ＣＡＡＴστＴＣＡＧＡτＴ−３’　Ｉ工Ｓ）かくして得たプラスミドをｐＰ４ ”３３と呼ぶ（図３）。

２．３　ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）発現ベクターの構築ヒト血清アルブミン 発現ベクターの構築のために、−酵母レプリコン（事実上は天然のプラスミドｐ ＫＤ１の全配列）、−Ｋ　ラクチスのＬＡＣ４遺伝子のプロモーターの制御下に あり、Ｓ。

トアルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）をコードする遺伝子、ＩＳＡをコードする構造遺伝 子はＳ、セレビシアエのＰＧＫ遺伝子の直上流の領域に対応する２５ヌクレオチ ドの配列の前にある、 −酵母にゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を与えるａｐｈ遺伝子、及び −Ｅ、コリのためのレプリコン及び選択マーカー（アンピシリンに対する耐性を 与える互±且遺伝子） を含むプラスミドｐＹＧ４０４　（ＥＰ　３６１　９９１を参照）の誘導体を調 製した。

ｐＹＧ４０４△Ｈと呼ばれるこのプラスミドは、特定部位の突然変異誘発により ａｐｈ遺伝子に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位が破壊されていることのみがｐＹＧ ４０４と異なる。この修飾により、プラスミドｐＹＧ４０４△Ｈ中にＳａ　ｌ　 ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントとして存在するＬＡＣ４プロモーターを やはりＳａｌ　ｌ−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメントの形態で構築されたプロモ ーターＫＩＡＤＨ４により置換することができるようになる。

（ａ）プラスミドｐＹＧ４０４△Ｈの構築（図４〜７）クローニングベクターｐ ＹＧ４０４におけるＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ部位を欠失させるために種々のサブクロ ーニング段階を行い、中間構築物：ｐＹＧ７２を得た（図６）。このベクターは 、ＵＲＡ３遺伝子を含むＳａｃ■フラグメントがａｐｈ遺伝子中に存在するユニ ークＨｉｎｄＩＩＩ部位と共に除去されたプラスミドｐＫａｎ７０７　（ＥＰ　 ３６１　９９１）に対応する。この部位において特定部位の突然変異誘発を行う ために、咲遺伝子を有する１、３ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをプラスミドｐＫ ａｎ７０７からバクテリオファージＭ１３ｍｐ７にサブクローニングし、ベクタ ーｐＹＧ６４を得た（図４）。以下のオリゴデオキシヌクレオチド：５’　−Ｇ ＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴ且　ＴＴＧＣＣＡ　ＴＴＣＴＣＡ　ＣＣＧ −３’　を用いた特定部位の突然変異誘発によりＨｉｎｄＩ１１部位を破壊しく 一般的クローニング法を参照）、ロイシン１８５をコードするＣＴＴトリプレッ トをトリブレ、ソトＣＴＣで置換した。この変化は、得られるタンパク質配列を 変更しない。得られたプラスミドをｐＹＧ６５と呼んだ（図４）。プラスミドｐ ＹＧ７２の構築のために、ベクターｐＫａｎ７０７のバクテリアレプリコンを含 む部分を、酵素ＥｃｏＲＩを用いた消化及びＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いた再環 化により単離し、中間プラスミドｐＹＧ６９を生成した。後者に存在し、ａｐｈ 遺伝子を含むＰｓｔＩフラグメントを、プラスミドｐＹＧ６５から得、同等の突 然変異を行ったフラグメントにより置換した。

この構築物をｐＹＧ７０と呼んだ（図５）。続いてＥｃｏＲＩと５ａｃ１部位の 間の４．７ｋｂのｐＫＤ１配列をこのベクター中に導入し、ｐＹＧ７２を得た（ 図６）。

ベクターｐＹＧ４０４△Ｈは、プラスミドｐＹＧ４０４　（ＥＰ　３６１　９９ １）から５ａｌＩ−３ａｌＩフラグメントの形態で得た発現カセットをｐＹＧ７ ２　（図７）の対応する部位において挿入することによＩＩコの構築（図８） プラスミドｐＰ４−３３から得たＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメント上に あるプロモーターＫＩＡＤＨ４を以下の方法で修飾し、それをプラスミドｐＹＧ ４０４△Ｈから誘導された発現ベクターで用いるために適応させたニ プラスミドｐＰ４−３３を酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その後「マ ング・ビーンＪ　（’Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ”　）ヌクレアーゼで処理して末端を 平滑化した後、プロモーターＫＩＡＤＨ４を有する１、２ｋｂのフラグメントを アガロースゲルから単離し、あらかじめ酵素Ｃ１ａＩを用いて直鎖状とし、　’ Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ’　ヌクレアーゼ及びコラジアルカリ性ホスファターゼ（ｃ 　ｒ　ｐ）で処理したベクターｐＢＣＳＫ十（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊ ｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）中にサブクローニングした。この方法で得たプラスミ ド（ｐＹＧ１２８、図８）は、１．２ｋｂのＳａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　 Ｉフラグメントの形態でプロモーターＫＩＡＤＨ４を単離することを可能にする 。

（ｃ）ベクターｐＹＧ１３２の構築（図９）発現ベクターｐＹＧ４０４△Ｈ（２ ，３，（ａ）を参照）を酵素Ｓａ１■及びＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで消化すると、プ ロモーターＬＡＣ４を上記のプロモーターＫＩＡＤＨ４で置換することが可能に なる。

このクローニングを行うために、ｐＫＤ１部分を含む８．７ｋｂのＳａ　ｌ　ｌ −Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメント、及びブレプローＨ３Ａをコードする遺伝 子を有する１、９ｋｂのＩ（ｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　Ｉ７ラグメン トをベクターｐＹＧ４０４△Ｈから単離し、プラスミドｐＹ０１２８から得、プ ロモーターＫＩＡＤＨ４を有する１、２ｋｂの５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグ メントの存在下で連結した。２つのプラスミドをこの方法で得た− 一プロモーターＫＩＡＤＨ４の制御下で発現されることが望まれているいずれの 遺伝子をもユニークＨｉｎｄｌｌＩ部位における挿入を許すクローニングベクタ ーに相当するｐＹＧ１３１　（図９）、及び−Ｈ１ｎｄｌＩＩ部位に導入された ブレブローＨ３Ａ遺伝子を含むこと以外はプラスミドｐＹＧ１３１と同一である ｐＹＧ１３２（図９）。

３、に、ラクチスのＬＡＣ４遺伝子のプロモーターの制御下のＨＳＡ発現ベクタ ーの構築ニブラスミドｐＹＧ１０２３３．１．に、ラクチスからのＰＧＫ遺伝子 の単離±遺伝子は、Ｓ、セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のＮ−末端部分に相当する 異種プローブ（Ｄｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１ ０　（１９８２）２６２５−２６３７）を用いて部分ゲノムライブラリをスクリ ーニングすることにより、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３５９から単離した。さらに特 定すると用いたプローブは１．　３ｋｂのＰｖｕ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント に相当する。

サザンブロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、９８　（１９７５）５０３）において、用いたプローブは４ｋｂのＨｉｎ ｄｌｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに含まれるＤＮＡ配列に特異的にハイブ リッド形成する。この配列を前記のプローブを用いたコロニーハイブリッド形成 により単離した。そのために、プラスミドｐＵｃ１８のＨｉｎｄｌ１１部位に導 入された３〜５ｋｂのサイズのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む、株Ｃ３Ｂ２ ３５９からの限定（ｌｉｍｉｔｅｄ）ゲノムＤＮＡライブラリＤＮＡを調製し、 スクリーニングした。

かくしてプラスミドｐＹＧ６００　（図１０）を有するクローンを単離６９）に より記載されている。

３．２．に、ラクチスのＰＧＫ遺伝子を有するヒト血清アルブミン発現ベクター の構築 図５に記載のプラスミドｐＹＧ７０を以下の通りに修飾した。

（ａ）プラスミドｐＹＧ７０の制限部位の修飾（図１１）。

続くクローニング段階を容易にするために、プラスミドｐＹＧ７０からいくつか の制限部位を抑制しく５ｕｐｐｒｅｓｓｅｄ）（ｉ）、２つのアダプターをそれ に加えた（ｌｉ及び１ｉｉ）。

（ｉ）ＳｐｈＩ部位の除去 プラスミドｐＹＧ７０をｓｐｈ　Ｉで消化し、続いてファージＴ４　ＤＮＡポリ メラーゼの存在下における消化により付着末端を除去した。リガーゼの存在下の 連結の後、プラスミドｐＹＧ７０△５ｐｈＩが得られた（図１１を参照）。

（ｉ　ｉ）アダプター１の挿入 アダプター１は、図１２に示す合成オリゴデオキシヌクレオチドＡ及びＢのハイ ブリッド形成により得た。そのために、２μｇの各オリゴデオキシヌクレオチド を２０μｌに足りるハイブリッド形成緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝 液ｐＨ７，５；３０ｍＭ　ＮａＣ１；７゜５ｍＭ　ＭｇＣｈ：０．２５ｍＭ　Ａ ＴＰ；２ｍＭ　ＤＴＴ；領２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中でインキュベートし、続いて温 度を８０℃に１０分間上げ、ゆっくり室温に戻した。

かくして得られたアダプターは以下の酵素：５ａｃＩ　；Ｓａｌ　Ｉ　；Ｍｌｕ Ｉ；Ｂｓ５ＨＩＩ及び５ｆｉＩに関する切断部位を含み、プラスミドｐＹＧ７０ △５ｐｈＩに存在する５ａｌＩ部位をその導入の間に除去することを可能にする 。このアダプターをあらかじめ酵素５ａｌＩ及びＳａｃ　Ｉで消化したプラスミ ドｐＹＧ７０△５ｐｈＩ中に連結により導入した。

得られたプラスミドをｐＹＧ７０−１と呼ぶ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アダプター２の導入 アダプター２は図１２に示すオリゴデオキシヌクレオチドＣ及びＤを用い、アダ プター１に関して記載した方法に従って調製した。このアダプターは以下の酵素 ：５ｆｊｌ＋ＡａｔｌＩ；５ｐｈＩ；ＮａｒＩ及び５ａｃｌに関する切断部位を 含み、プラスミドｐＹＧ７０−１に存在するＥｃｏＲ１部位をその導入の間に除 去することを可能にする。あらかじめ酵素ＥｃｏＲＩ及び５ａｃｌで消化したプ ラスミドｐＹＧ７０−１中にそれを連結により導入し、プラスミドｐＹＧ７０− ２を形成した（図１１）。

（ｂ）ヒト血清アルブミン発現カセットの導入用いたヒト血清アルブミン発現カ セットはニーに、ラクチスのＬＡＣ４遺伝子の誘導プロモーター、−ヒト血清ア ルブミン（プレプロ形態）をコードする構造遺伝子、及このカセツトをプラスミ ドｐＹＧ４０４　（ＥＰ　３６１　９９１）から５ａｌＩ−Ｓａｃｌフラグメン トの形態で単離し、続いてあらかじめ対応する酵素で消化したプラスミドｐＹＧ ７０−２に連結により導入した。

得られたプラスミドをｐＹＧ７０−３と呼ぶ（図１３）。

（ｃ）　Ｋ、ラクチスのＰＧＫ遺伝子の挿入に、ラクチスのＰＧＫ遺伝子をプラ スミドｐＹＧ６００　（図１０）から単離し、プラスミドｐＹＧ１００２にサブ クローニングし、プラスミドｐＹＧ１００３を生成し、続いて後者からＭｌｕｌ −ＢｓｓＨＩ　１７ラグメントの形態で単離した。

ｐＹＧ１００２中にサブターニングすることにより、Ｋ、ラクチスの旦旦ム遺伝 子をそのプロモーターを含まないＭｌｕＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントの形態で 得ることが可能になった。

プラスミドｐＹＧ１００３は以下の方法で得た（図１４）ニブラスミドｐＩｃ２ ０Ｈ（Ｍａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３ス（１９８４）４８１）を、ア ダプター３を導入するためにＢｇｌｌｌ及びＥｃｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲＩ 、Ｂｓ５ＨＩ　ｌ５ＣＩａＩ、ＮｈｅＩＳＭｌｕＩ及びＢｇｌｌＩ部位を与える このアダプターは、オリゴデオキシヌクレオチドＥ及びＦ（図１２）のハイブリ ッド形成により上記の要領で（２，（ａ）　（ｉ　ｉ）　）得た。得られたプラ スミドをｐＹＧ１００２と呼ぶ。Ｋ、ラクチスのＰＧＫ遺伝子をこの新しいプラ スミドに、プラスミドｐＹＧ６００から誘導したＣ１ａｌ−ＮｈｅＩフラグメン トの形態で導入した。得られたプラスミドをｐＹＧ１００３と呼ぶ（図１４）。

Ｋ、ラクチスのＰＧＫ遺伝子を有するプラスミドｐＹＧ１００３がら誘導したＭ ｌ　ｕ　ｌ−Ｂｓ　ｓＨＩ　Ｉフラグメントを、続いてプラスミドｐＹＧ７０− ３の対応する部位に導入し、プラスミドｐＹＧ７０−４を生成する（図１５）。

このプラスミドにおいて、Ｋ、ラクチスのＰＧＫ遺伝子は今後、キラー毒素の二 方向に１プロモーターの制御下に置かれる。

（ｄ）酵母レプリコンの挿入 プラスミドｐＹＧ７０−４　（図１５）及びｐＫＤｌ（ＥＰ　３６１９９１）を ｓｐｈ　Ｉで消化し、リガーゼの存在下で一緒に連結した。この連結の最後に、 プラスミドｐＫＤ１のコンフォーメーション（Ａ型又はＢ型）及びプラスミドｐ ＹＧ７０−４に対応する部分のｐＫＤｌに対する配向に依存して４種のベクター が得られる。

これらの構築物の１つを選択し、ｐＹＧ１０２３と呼ぶ（図１５）。

このベクターはニ ーｐＹＧ１０２３を、安定で酵母、好ましくはクルイベロミセス属の酵母におい て複製可能なマルチコピープラスミドとするプラスミドｐＫＤ１の全配列、 する構造遺伝子を含むヒト血清アルブミン発現カセット、−Ｅ、コリに関するレ プリコン及び選択マーカー（アンピシリンに対すＢ−組み換え経路を介したヒト 血清アルブミンの生産Ｂ１．この実施例はベクターｐＹＧ４０１　（実施例Ａｌ ）で形質転換した酵母に、ラクチスＣＢ５６８３を用いた組み換えＩＳＡの生産 のための従来の方法を記載する。この実施例は先行技術を例示するものである。

培養は、２リツトルの発酵槽中で流加様式の２８℃において行った。

最初に発酵槽は０．７リツトルの基本培地（ｂａｓｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ）（グル コース　２ｇ／ｌ、酵母抽出物　３ｇ／Ｌ塩類）を含む。指数的成長相の５０ｍ １の培養物（凍結懸濁液から接種）を用いて発酵槽に接種する。予備的バッチ式 発育相の後、指数的に追加の負荷（グルコース、濡れとうもろこしくｃｏｒｎ　 ５ｔｅｅｐ）、アンモニウム塩＝４０％／１３％／７％［ｗ／ｖ］）を加える。

６４時間の培養後、ブロスを遠心し、上澄み液を２μ膜上で精密濾過する。精製 法は、高塩濃度（３，５Ｍ　ＮａＣ１）によりアルブミンが溶離されるＢｌｕｅ 　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　（ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃｅ）上のアフィニティークロマト グラフィ一段階、続いて濃縮及びダイアフィルトレージョンの後にＱ−セファロ ース”高速流（ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ）”型イオン交換器上の通過を含む。かくし て精製されたＩＳＡは５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において均一なバンドを有し、 生物化学的特性化のための多数の試験において参照標準とした天然のアルブミン と区別できない。しかし、得られたＩＳＡの溶液は、もっと広範囲の精製、及び ／又は活性炭の使用などの処理により除去することが不可能な比色分析指数ｉ＝ ０．２６の黄色の着色、ならびに３６０ｎｍで励起した後の異常な蛍光を有する （図１６．１８及び　１９）。

Ｂ２．実施例Ｂ１で記載した条件下で得た組み換えアルブミンＢＣＱ７５９のバ ッチは、精製の後でｉ＝０．２６の比色分析指数を有する。

多数の追加のクロマトグラフィーの試み及び物理化学的処理は、この着色を減少 させることができない。

この着色のアルブミンへの結合の性質を分析するために、変性−再生サイクルを 以下の通りに行った： ５０ｍｇｏ）ＢＣＱ７５９を、２ｍｌの７Ｍ　グアニジン−ＨＣｌ及び０．３Ｍ 　β−メルカプトエタノール中でインキュベートすることにより変性させる。こ の溶液を１００°Ｃで１時間加熱する。冷却後、ＩＳＡに強力に結合している（ しかし共有結合ではない）小分子を除去するために、５００μｌの変性ｒＨ３Ａ を、８Ｍ　ウレア及び領　３Ｍ　β−メルカプトエタノールで平衡化したＴＳＫ 　３０００ＳＷカラム中に注入する。２８０ｎｍにおいて吸収を示す画分を５０ ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、８Ｍウレア溶液、ｐ）ｉｓ、Ｏに対して窒素下で終夜透 析し、続Ｌｖて５０ｍＭ　ＮａＣＬ　１ｍＭ　還元グルタチオン及び領　１ｍＭ 酸化グルタチオンを含む１リツトルの再生緩衝液５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、ｐ Ｈ９，５に対して窒素下で４８時間透析する。水に対する最後の透析の後、ＵＶ スペクトルを得、着色指数１２＝１２２を算出する。同一の条件下で対照標準胎 盤性アルブミン（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＭｅｒｊｅｕｘ、ｉ＝０．０７）は再生の 後、１２＝０．１４を示す。

この実施例は、アルブミンへの色素の結合が基本的に共有結合性であることを明 確に示す。従って精製法により組み換えアルブミンを有意に脱色することを試み るのは無益である。

Ｂ３．　この実施例では、炭素源が着色の出現の必須の原因であることを示すこ とができる簡単な実験を記載する。

対照標準アルブミン（ｉ＝０．０７）を酵母を接種せずに３角フラスコ中の種々 の培地においてインキュベートする。調べた培地は以下の通りに定義される基本 培地Ｂｏ・ 塩　酢酸アンモニウム　７ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４４，４ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，５ｇ／ｌ ＣａＣｌ□、２Ｈ２００，Ｉｇ／ｌ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／ｌ Ｚｎ５Ｏｎ、７Ｈ２０１００ｍｇ／ｌ Ｆｅ５○４．７Ｈｚ０　１５ｍｇ／］ Ａ　Ｉ　ＣＩ　３．　６８２０　１ｍｇ／　ｌＣｏＣｌ３，６Ｈ２０２ｍｇ／］ ＣｕＳＯ４，５Ｈ２００，１３ｍｇ／ＩＫＩ　Ｏ，３３ｍｇ／Ｉ Ｈ３ＢＯ３１，４７ｍｇ／ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４０，６７ｍｇ／ｌ ビタミン　メソイノシトール　２ｍｇ／ｌニコチン酸　２ｍｇ／］ ヒオチン　２ｍｇ／］ パントテン酸カルシウム　２ｍｇ／ｌ アミノ酸　Ｌ−Ｇｌｕ　Ｏ，６ｇ／Ｉ Ｌ−Ｌｙｓ、ＨＣＩ　０．３０ｇ／Ｉ ＤＬ−Ｈｉ　ｓ、　ＨＣｌ　領３０ｇ／ｌ及び炭素源： ３角フラスコＥ１ニゲルコース（精密濾過）　２０ｇ／ＩＥ２：ラクトース　２ ０ｇ／Ｉ Ｅ３．対照標準（炭素源なし） を含む。

３種の３角フラスコを５０ｍｇ／ｌの）ＩＳＡと共に、２８°Ｃで撹拌しながら ３日間インキュベートする。

３日後、培地を遠心し、０．２μ膜上で濾過する。５ｍｌのアフィニティー担体 Ｂｌｕｅ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ（ＩＢＦ　Ｆｒａｎｃｅ）を加え、混合物を 穏やかに撹拌する。１時間後、母液を焼結ガラス上で分離し、アルブミンを３． ５Ｍ　ＮａＣｌ溶液を用いて溶離する。続いて溶離液を濃縮し、１０ｋＤの限外 濾過膜上で水を用いてダイアフィルトレージョンする。

分光光度分析はアルブミンの着色指数に関して以下の結果を与える。

３角フラスコＥｌ　ｉ＝０．　１６ Ｅ２　ｉ＝０．１２ Ｅ３　ｉ＝０．０９ 対照標準Ｈ３Ａ　ｉ＝０．０７ 従ってこの実施例は、酵母を含まない培養条件下で炭素源がアルブミンの着色の 増加を引き起こすことを明確に示している。

Ｂ４．前記の実施例で得た結果を完全なものとするために、参照標準アルブミン を同一の条件下で： ３角フラスコＥ４：オートクレープＢｏ＋グルコース培地　２０　ｇ／　Ｉ Ｆ５：精密濾過Ｂｏ十 グルコース培地　２０　ｇ／　Ｉ Ｆ５：精密濾過Ｂｏ十 スクロース培地　２０ｇ／ｌ の存在下でインキュベートした。

小分子の除去のために培地を濃縮及びダイアフィルトレージョンした後、着色指 数をＵＶで決定した： Ｂ５．前記の実施例で得た結論を実際の培養の間に証明するために、酵母に、ラ クチスにより３角フラスジ中で生産された組み換えアルブミンの着色を分析した 。

ａ）実施例Ａ３に記載のベクターｐＹＧ１０２３を用いて形質転換した株に、ラ クチス２呈に’　ＣＢ５２９５．９１＋３角フラスコ　Ｅ７＝ＢＯ＋ラクトース Ｌｏｇ／ｌ＋エタノール１０ｇ／Ｉ Ｅ８＝Ｂｏ＋ラクトース２０　ｇ／　］Ｅ９＝Ｂｏ十精密濾過グルコース２０ｇ ／ＩＥ１０＝Ｂｏ＋ラクトースＬｏｇ／ｌ＋グルコース１０ｇ／１ ２５０ｍ１の３角フラスコ中で２８℃においてノ＜・ソチ様式で７２時間培養し た後に生産された組み換えアルブミンをＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５アニオン交換 カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製し、活性炭で処理してタンパク質に共有 結合していない着色を除去する。ＵＶ分析の後に得られた結果は以下の通りであ る： Ｅ７　、ｉ＝Ｑ、１１　ＢＣＱ８０４ＬＥ　（図１６．１８及び１９を参照） Ｂ８　ｉ＝ｏ、１４　ＢＣＱ８０４Ｌ Ｅ９　ｉ−０，１７ＢＣＱ８０４Ｇ ＥＩＯｉ＝０．１５　ＢＣＱ８０４ＬＧｂ）実施例Ａ２に記載のベクターｐＹＧ １３２を用Ｌ％で形質転換した株に、ラクチスＣＢ５２９３．９１・ ３角フラスコ・Ｅ１１＝Ｂｏ＋グリセロール１０ｇ／］十エタノール１０ｇ／］ 上記と同一の条件下で生産された組み換えアルブミンは、Ｍｏｎ。

Ｑ上の簡単な精製の後、ｉ＝０．０９の着色指数を与える（ＢＣＱ８３５ＧＥ） ：図１７を参照。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ 遺伝子Ａ Ｎ曹ｅ６ Ｆｉｇｕｒｅ　８ ＦＩＧＬＩＲＥ　１０ オリゴデオキシヌクレオチド Ｆ　Ｉｔ；ＬＩＲＥ　１２ ｒｌＣＬＩ匪１３ ＦＩＣＵ虹１ム ＦＩＧ研（１５ Ｃｏ＋ｚｔｒｏｌ　Ｉｌｌ　＋　ｉ　＋　０．０７Ｆｉｇｕｒｅ　１６ ＵＶスペクトル −ＢＣＱ８３５ＧＥ　＝　ｉ・０，０９Ｍ Ｆｉｇｕｒｅ　ユ７ 励起スペクトル ４３０ｍｎにおける発光 □参照標準　−−−−ＢＣＱ８０４ＬＥ　・・・・・・・・ＢＣＱ　７５９波長 発光スペクトル ３６０ｍｎにおける励起 一参照標準　−−−−ＢＣＱＩ１０４ＬＨ曲四ＢＣＯ７５９波長 国際調査報告 、＝　ＰＣＴ／ＦＲ９３１０００７２ ＋−一一＋−−−−−＋−ＰＣＴ／ＦＲ９３１０００７２フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／Ｃｌ２Ｎ１５１０ ９　ＺＮＡ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （７２）発明者　シュン、ジエラール フランス国９１３１０モントルリ・ルーピルジュールオルシュ・リュデグランジ ャルダンＩ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．比色分析指数が０．２より小であり、クルイベロミセス属の酵母における外 因性ＤＮＡ配列の発現から生ずることを特徴とするヒト血清アルブミン。
2. ２．比色分析指数が０．１５より小であることを特徴とする請求の範囲１に記載 のヒト血清アルブミン。
3. ３．比色分析指数が０．１より小であることを特徴とする請求の範囲２に記載の ヒト血清アルブミン。
4. ４．外因性ＤＮＡがＨＳＡをコードするｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列及び混 成配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか１つに記載の ヒト血清アルブミン。
5. ５．外因性ＤＮＡがＨＳＡをコードする配列の５′末端に結合した転写及び翻訳 の開始のための領域を含むことを特徴とする請求の範囲４に記載のヒト血清アル ブミン。
6. ６．外因性ＤＮＡが自律又は組み込み複製を与えるものであることができるベク ターの一部であることを特徴とする請求の範囲１〜５のいずれか１つに記載のヒ ト血清アルブミン。
7. ７．クルイベロミセス属の酵母における外因性ＤＮＡ配列の発現及び該配列の発 現産物の培地中への分泌から生ずることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれ か１つに記載のヒト血清アルブミン。
8. ８．外因性ＤＮＡ配列が成熟ＨＳＡをコードする配列の上流に、用いられた宿主 の分泌経路にナセントタンパク質を方向付ける“リーダー”配列を含むことを特 徴とする請求の範囲７に記載のヒト血清アルブミン。
9. ９．“リーダー”配列がＨＳＡの天然の“リーダー”配列、異種“リーダー”配 列又は人工の“リーダー”配列であることができることを特徴とする請求の範囲 ８に記載のヒト血清アルブミン。
10. １０．比色分析指数が２より小であり、５′〜３′の方向に転写及び翻訳の開始 のための領域、用いた宿主の分泌経路にナセントタンパク質を方向付ける“リー ダー”配列、及びヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡを含む外因性ＤＮＡ 配列の、クルイベロミセス属の酵母における発現から生ずることを特徴とするヒ ト血清アルブミン。
11. １１．以下の段階： −第１段階で、用いられる宿主に適した転写及び翻訳シグナルの制御下のヒト血 清アルブミンをコードする外因性ＤＮＡを真核又は原核宿主細胞に導入し、 −第２段階で、かくして得られた細胞をアルコール、非還元糖、有機酸及び炭素 Ｃ４の酸素上が置換されたグルコース誘導体から選ばれる少なくとも１種の炭素 源を含む限定された組成の培地中、あるいはアルデヒド型の不純物の形成を排除 するか又は制限するように調製された培地中で培養し、 −第３段階で、生産されたＨＳＡを回収するを行うことを特徴とする、比色分析 指数が０．２より小のヒト血清アルブミンの生産法。
12. １２．外因性ＤＮＡが請求の範囲４、５、６、８又は９のいずれか１つの通りに 定義されることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
13. １３．ＨＳＡが培地中に分泌されることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方 法。
14. １４．真核宿主が動物細胞、酵母及び菌から選ばれることを特徴とする請求の範 囲１１に記載の方法。
15. １５．原核宿主かバクテリアＥ．コリ、バシルス及びストレプトミセスから選ば れることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
16. １６．宿主がサッカロミセス、クルイベロミセス、ピキア、シュワニオミセス及 びハンセヌラ属の酵母から選ばれることを特徴とする請求の範囲１４に記載の方 法。
17. １７．宿主がクルイベロミセス属の酵母から選ばれることを特徴とする請求の範 囲１６に記載の方法。
18. １８．アルコールを炭素数が少なくとも２の単純アルコール及びポリアルコール から選ぶことができることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
19. １９．グルコース誘導体が二糖から、好ましくは１〜４型のグリコシド結合を有 する二糖から選ばれることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
20. ２０．培地が数種の炭素源の組み合わせを含むことを特徴とする請求の範囲１１ に記載の方法。
21. ２１．炭素源がグルコース誘導体とアルコールの組み合わせ、又は単純アルコー ルとポリアルコールの組み合わせから成ることを特徴とする請求の範囲２０に記 載の方法。
22. ２２．培地があらかじめ冷温で滅菌されることを特徴とする請求の範囲１１に記 載の方法。
23. ２３．請求の範囲１〜１０のいずれか１つに記載のＨＳＡを含む製薬学的組成物 。