JPH04339259A - 突然変異菌株の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は実質的に親株以上に高レ
ベルで外来タンパク質を発現する真菌類の菌株（例えば
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）の開発に関する。

【０００２】

【従来の技術】改良された性質、例えば生育特性または
外来ポリペプチドの発現レベルをもつ酵母の菌株を調製
することが知られている。以前の方法では酵素アッセイ
または電気泳動ゲルにのせた抗体を使用した。例えばＥ
Ｐ−Ａ−２０１　　２０８は乳凝固アッセイを用いたＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの過剰分泌変異株を検出するス
クリーニング法を明らかにしており、ここではプロキモ
シンが推定される過剰分泌変異株により発現され、分泌
される。本発明は外来ポリペプチドの発現（および、好
ましくは分泌）のレベルをもつ有用な変異株を同定する
改良法を供給する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明のある解釈は、
外来ポリペプチドを発現することができる真菌のコロニ
ー中での外来ポリペプチドの生産の相対的レベルを決定
する方法を提供し、この方法は固体培地に真菌細胞を植
えること、外来ポリペプチドに選択的に結合する手段を
応用すること、およびその結果できた複合体を視覚化す
ることからなる。

【０００４】「固体」培地は、酵母菌株を固定化するた
めに十分な固体の培地を意味し、それにより産物が視覚
化され、与えられた菌株のコロニーの特性であるとされ
る。液体培地が使用された場合、そのような属性は可能
ではない。適当な栄養を添加された寒天のようなゲルが
通常便利であろう。

【０００５】噴霧または針金を用いた塗布のような一般
に「プレートアウト」と呼ばれる適当な方法により、細
胞は培地上に植えられる。

【０００６】新規の真菌の菌株の選択は、外来タンパク
質、例えばヒトアルブミン（ＨＡ）の生産を含む。非常
に多くの個々の真菌コロニーを、高められたレベルの外
来タンパク質を生産する能力でスクリーニングすること
ができる方法が発見された。

【０００７】

【課題を解決するための手段】酵母によりポリペプチド
が分泌されると、細胞を溶解することなしに生産のレベ
ルを検出することができる。高レベルの生産は、細胞内
でポリペプチドを分泌する正常の能力と共役した高レベ
ルの発現、またはポリペプチドを分泌する強化された能
力に共役した正常レベルの発現、または両方の点で上昇
した能力を示す。ポリペプチドが分泌されないと、細胞
は（外側の薬剤の作用により、または酵母の生育の自然
の成りゆきとして）溶解される。この場合における高レ
ベルの生産は、高レベルの発現を示している。常に真実
であると予測することはできないが、適当な分泌リーダ
ーシグナルが準備されると、ポリペプチドの良好な発現
はまた、しばしば反対に良好な分泌となることを発見し
た。確かに、ポリペプチドを発現および／または分泌す
るための酵母の増加した能力は、ポリペプチド自身に依
存するとは思われない。

【０００８】「ヒトアルブミン（ＨＡ）」という用語は
、ここではヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と区別できな
い物質、または変種あるいはその断片、例えばたった１
個またはいくつかのアミノ酸残基が失われた、あるいは
保存された置換の原因となる形態、またはＥＰ−Ａ−３
２２　　０９４に示されたＨＳＡ類似体のような物質を
示すために用いられる。一般にＨＡの変種または断片は
、重量比で、少なくとも５０％（好ましくは、少なくと
も８０、９０または９５％）のＨＡリガンド結合活性（
例えば、ビリルビン結合）および少なくとも５０％（好
ましくは、８０、９０または９５％）のＨＡ腫瘍活性を
もつ。

【０００９】ＨＡを発現し、分泌する能力をもつ真菌の
菌株の遺伝物質は、標準的な手法の範囲のどれかにより
修飾される。これらは電磁放射線、好ましくは紫外部（
ＵＶ）での露光、または化学変異原物質、例えば１，２
，７，８−ジエポキシオクタン、エチルメタンスルホン
酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）および４−ニトロ−キノリン−
Ｎ−オキサイド（ＮＱＯ）での処理を含み、これらの処
理は宿主に含まれるＤＮＡ配列を修飾する。これらの変
異のいくつかは致死的変異あるいはＨＡの発現および／
または分泌をなくす変異である。いくつかの変異はＨＡ
の発現および分泌を高める能力をもつ。これらの有利な
変異をもつクローンは、ヒトアルブミン（ＨＡ）抗体を
含む固体栄養培地上に細胞がひろげられた場合、個々の
細胞が互いに分離するような方法で、検出され、単離さ
れるべきである。３０℃で７２から９６時間培養される
と、単離コロニーが栄養培地上に観察される。理想的に
は、それぞれのコロニーは単一の細胞から生じる。ＨＡ
を発現し、分泌する能力をもつコロニーはコロニーの周
辺に現われる不透明なハロにより検出される。この形態
は分泌されたＨＡと抗ＨＡ抗体との相互作用による。 ハロの大きさはコロニーにより分泌されるＨＡの量に比
例して変化する。

【００１０】ＨＡコーディング領域は好ましくは、プロ
モーター配列、プロモーターの転写支配下にあるＨＡを
コードするＤＮＡ配列および真核生物の転写終了シグナ
ルを含むＤＮＡ配列からなるハイブリッドプラスミドの
中に含まれる。ハイブリッドプラスミドはまた好ましく
は、例えばプラスミドで形質転換された細胞の増殖にお
いて他の機能を果たす付加的なＤＮＡ配列を含む。ＥＰ
−Ａ−２８６　　４２４の「非組み込み」ベクターは、
用いられているハイブリッドプラスミドの例である。

【００１１】例えば参考文献にあげられているＣｈａｒ
ｄの「ラジオイムノアッセイと関連技術概説」（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ　　１９８２）に明らかにされているような
既知の方法で抗体は生産され、標識される。抗体はポリ
クローンまたは単クローンである。

【００１２】特に外来ポリペプチドがＨＡでないとする
と、抗体とは別の手段によりポリペプチドを視覚化する
ことができる。例えば、既知の方法で標識または印を付
けられたポリペプチドは補因子または補欠分子族（例え
ば、ビオチン、ヘムＦｅ３＋、ＮＡＤまたはＦＡＤ）あ
るいは細胞表層レセプターのようなある天然のリガンド
に対して高い親和性をもつ。

【００１３】選択遺伝子マーカーは、マーカーの表現型
の発現のために、形質転換体の選択を容易にする遺伝子
である。真菌の適当なマーカーは特に、抗生物質耐性を
発現するもの、または栄養要求変異株の酵母の場合のよ
うに、宿主の欠失を補う遺伝子である。相当する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロヘキシミド耐性を与え、ま
たは栄養要求変異酵母、例えばＵＲＡ１、ＵＲＡ３、Ｌ
ＥＵ２、ＨＩＳ４、ＨＩＳ３、ＴＲＰ５およびＴＲＰ１
遺伝子に原栄養株を供給する。

【００１４】ＨＡ分泌のための適当なプロモーターは、
ホスフォグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）遺伝子、Ｇ
ＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＨＯ５）、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＭＦα−
１フェロモン、ＧＢ−Ａ−２１９６　　６３５のプロモ
ーターおよびＧＵＴ２（グリセロール−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ、英国特許公示８９２３５２１．２
、ＳｐｒａｇｕｅとＣｒｏｎａｎ（１９７７）、Ｊ．Ｂ
ａｃｔ．１２９．１３３５−１３４２）に付随したプロ
モーターである。好ましいプロモーターはＰＲＢ１遺伝
子のものである。

【００１５】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅの液胞エンドプロテアーゼＢの構造遺伝子
であるＰＲＢ１は、Ｍｏｅｈｌｅら（（１９８７）Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　　１１５，２５５−２６３）によりＭＫ
４およびＦＰ８と呼ばれる２個のｐｒｂ１を補うプラス
ミドを用いて単離された。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが振盪フラスコ培養で、グル
コース中で生育されると、プロテアーゼＢ活性は、細胞
がグルコースを代謝し、生育の間に蓄積したエタノール
を使うまで、殆ど全く検出されない（Ｓａｈｅｋｉ，Ｔ
．とＨｏｌｚｅｒ，Ｈ．（１９７５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　　３８４、２０３−２１
４；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）、ＵＣＬＡ　　Ｓｙｍ
ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　　Ｂｉｏｌ．Ｎｅｗ　　Ｓｅｒ
．３３、５０５−５１８）。これはグルコースが排出さ
れ、培養がジオーキシックプラトーに入るまで、ｍＲＮ
Ａの蓄積を抑制する転写のコントロール機構の結果であ
ると信じられている（Ｍｏｅｈｌｅら（１９８７）、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ　　１１５，２５５−２６３）。プロテ
アーゼＢ（ｐｒｂ１−）欠損変異株を用いた研究は、ネ
ガティブの細胞が窒素および炭素源の飢餓状態にされた
ときに生じるタンパク質分解におけるプロテアーゼＢを
含む（Ｗｏｌｆ，Ｄ．とＥｈｍａｎｎ，Ｃ．（１９７９
）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，３７５−３８
４；Ｚｕｂｅｎｋｏ，Ｇ．とＪｏｎｅｓ，Ｅ．（１９８
１）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　９７，４５−６４）。

【００１６】ＰＲＢ１遺伝子のＤＮＡ配列は１５０ｂｐ
のＰＲＢ１プロモーターとして報告された（Ｍｏｅｈｌ
ｅら　　（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７
，４３９０−４３９９）。より広範囲のＰＲＢ１プロモ
ーターのＤＮＡ配列はまた、ジーンバンクデータベース
の受け入れ番号Ｍ１８０９７、ローカスＹＳＣＰＲＢ１
に入ることで入手できる。

【００１７】ＰＲＢ１プロモーター全体が、または容易
に決定されるように、その小部分が用いられる。例えば
、開始コドンから上流のＳｎａＢＩ部位までのおよそ１
ｋｂｐ配列が効果的である。

【００１８】適当なプロモーターが外来コーディング配
列がプロモーターの下流に位置し、翻訳開始コドンに関
して正しい読みとり枠であるような制限酵素部位に隣接
してクローニングベクターまたは発現ベクター上に置か
れる。開始コドンはベクター上に（例えば、プロモータ
ーのすぐ３′側）準備され、または外来コーディング配
列の５′端に挿入される。望むならば、本発明のプロモ
ーターと開始コドンの間にリンカーが準備される。好ま
しくは、ＤＮＡ構築物は、クローニングベクター中で構
築物の挿入とクローニングをさせるような合成オリゴヌ
クレオチドリンカーをもつ両端で準備される。プロモー
ター、ＤＮＡコーディング配列および真菌の転写終了シ
グナルは、操作しやすく互いにつながっている。即ち、
それらはそれらの正常な機能が保持されるように並列さ
れる。それ故、その配列は、発現コントロール配列が適
当なコーディング配列の発現をもたらし、および転写終
了シグナルが適当な転写の終了およびポリアデニレーシ
ョンをもたらすようなものである。これらの配列のつな
ぎ目は、好ましくはエンドヌクレアーゼの認識配列をも
つ合成オリゴヌクレオチドリンカーによりもたらされる
。

【００１９】適当なプロモーター、ＤＮＡ断片が前記プ
ロモーターの転写コントロール下にある目的のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列および真核生物の転写終了
シグナルからなる１個または複数のＤＮＡ挿入をもつハ
イブリッドベクターが用いられる。

【００２０】発現コントロール配列とは別に、上記ＤＮ
Ａ断片および転写終了シグナルを含む配列が、プロモー
ターの機能にとって必須ではない、または殆ど重要では
ないが、即ち目的のポリペプチドの発現にとっては、例
えば前記ハイブリッドプラスミドを用いて形質転換され
た細胞の増殖に、重要な機能をはたす付加的なＤＮＡ配
列を含むハイブリッドプラスミドもまた用いられる。付
加的なＤＮＡ配列は原核および／または真核細胞に由来
し、染色体および／または染色体外ＤＮＡ配列を含む。 例えば、付加的なＤＮＡ配列は細菌のまたは真核生物の
プラスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡ、ウイルス
ＤＮＡおよび／または細菌、酵母または高等真核生物の
染色体ＤＮＡのような染色体ＤＮＡに由来する（または
、を含む）。好ましいハイブリッドプラスミドは、細菌
のプラスミド、特に大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２また
はその関連プラスミド、バクテリオファージ、酵母２μ
プラスミドおよび／または酵母染色体ＤＮＡに由来する
付加的なＤＮＡ配列を含む。

【００２１】好ましいハイブリッドプラスミドでは、付
加的なＤＮＡ配列は酵母の複製開始点および酵母の選択
遺伝マーカーをもつ。酵母の複製開始点、例えば自動複
製断片（ａｒｓ）を含むハイブリッドプラスミドは、染
色体とは別に酵母細胞内で、形質転換後保持され、自動
的に体細胞分裂時に複製される。酵母２μプラスミドに
相同な配列を含むハイブリッドプラスミドが同様に用い
られる。これらのハイブリッドプラスミドは、細胞内に
すでに存在する２μプラスミドへ組換えにより組み込ま
れ、あるいは自動的に複製する。ＥＰ−Ａ−２５１　　
７４４の組み込みベクターまたはＥＰ−Ａ−２８６　　
４２４の「非組み込み」ベクターが用いられる。

【００２２】都合の良いことに、ハイブリッドプラスミ
ドに存在する付加的なＤＮＡ配列もまた複製開始点およ
び細菌宿主、特に大腸菌に対しての選択遺伝マーカーを
含む。酵母のハイブリッドプラスミドにおいて、大腸菌
複製開始点および大腸菌マーカーの存在に伴う役にたつ
性質がある。第一に、多量のハイブリッドプラスミドＤ
ＮＡが大腸菌の生育および増幅により得られ、第二に、
ハイブリッドプラスミドの構築は、大腸菌に基づく全て
のクローニング技術を利用して、大腸菌で容易に行われ
る。ｐＢＲ３２２などのような大腸菌プラスミドは、大
腸菌複製開始点および抗生物質、例えばテトラサイクリ
ンおよびアンピシリンに耐性を与える大腸菌の遺伝マー
カーの両者を含み、酵母のハイブリッドベクターの一部
として都合良く用いられる。

【００２３】ハイブリッドベクターは、それぞれとりわ
け発現コントロール配列および目的タンパク質を暗号化
するＤＮＡ配列からなる１個または複数のＤＮＡ挿入を
含む。ハイブリッドベクターが複数のＤＮＡ挿入、例え
ば２から４個のＤＮＡ挿入を含むとすると、これらは直
列に配列して、またはハイブリッドベクターの異なる位
置に存在する。好ましいハイブリッドベクターは、１個
のＤＮＡ挿入または直列配列のＤＮＡ挿入を含む。ＤＮ
Ａ挿入は特に前から後ろへ配置される。

【００２４】ハイブリッドプラスミドは技術的に知られ
た方法により調製される。ハイブリッドベクターの調製
過程は、本発明のプロモーターを含む１個または複数の
ＤＮＡ構築物、ＤＮＡ断片が前記の発現コントロール配
列の転写コントロール下にある目的のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ断片および真菌の転
写終了シグナルを含むＤＮＡ配列を導入する、または前
記ＤＮＡ構築物の成分を連続的に先に決定した順序でベ
クターＤＮＡに導入することからなる。

【００２５】ハイブリッドプラスミドの構築は、従来の
連結法を応用して実施される。プラスミドの構成物は、
通常の制限酵素部位により、および／または合成リンカ
ー分子の手段により、および／または平滑末端連結によ
り連結される。

【００２６】本発明の方法に有効な真菌細胞は、Ｐｉｃ
ｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏ
ｌｅｎ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉ
ｋｏｗｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｕｃ
ｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｓｐ
ｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓな
どの属を含む。好ましい属は、これらの酵母のＤＮＡを
操作する能力が、現在のところ上述の他の属よりも高度
に開発されているために、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒ
ｒｏｗｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａからなるグループ
から選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの例は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃ
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｉｔａｌｉｃｕｓお
よびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉである。 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの例は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ　　ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ　　ｌａｃｔｉｓである。Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａの例は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ａｎｏｍａｌａおよびＨ
ａｎｓｅｎｕｌａ　　ｃａｐｓｕｌａｔａである。Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ　　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは適当なＹａｒ
ｒｏｗｉａ種の例である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　
ｎｉｇｅｒは繊維状真菌の例である。

【００２７】Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａお
よびＨａｎｓｅｎｕｌａ属の真菌細胞が細胞壁の酵素消
化によりスフェロプラストをつくることにより形質転換
されることが示された；スフェロプラストは形質転換Ｄ
ＮＡと混合され、カルシウムイオンおよびポリエチレン
グリコール存在下でインキュベートされた後、形質転換
されたスフェロプラストは再生培地で再生される。

【００２８】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換の方
法は、ここで参考文献として全てあげられている、ＥＰ
　　２５１　　７４４、ＥＰ　　２５８　　０６７およ
びＷＯ　　９０／０１０６３の中で、一般的に教えられ
る。ハイブリッドベクターを用いた酵母の形質転換は、
Ｈｉｎｎｅｎらにより述ベられた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７５，１９２９（
１９７８））に従って実施される。この方法は３段階に
分けられる：

【００２９】（１）カタツムリの消化管の
ジュースのようなグルコシダーゼの各種標品（例えば、
グルスラーゼＰ．またはヘリカーゼＲ）または微生物か
ら得られる酵素の混合物（例えば、ザイモリアーゼＲ）
を浸透圧を安定させる溶液（例えば、１Ｍソルビトール
）中で用いた酵母細胞壁またはその部分の除去。

【００３０】（２）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）
およびＣａ２＋存在下でのＤＮＡベクターを用いた「裸
の」酵母細胞の処理。

【００３１】（３）寒天の固層での細胞壁の再生および
形質転換細胞の選択。この再生は、都合の良いことには
、寒天中にスフェロプラストを埋め込むことにより行わ
れる。例えば、融解した寒天（約５０℃）がスフェロプ
ラストと混合される。酵母の生育温度（約３０℃）まで
溶液を冷却することにより固層が得られる。この寒天層
はスフェロプラストからの必須の巨大分子の急速な拡散
および損失を妨げるためであり、それにより細胞壁の再
生が容易になる。しかし、細胞壁の再生はまた、（低効
率ではあるが）スフェロプラストを予め形成しておいた
寒天層の表面にプレートすることにより得られる。

【００３２】好ましくは、再生寒天は形質転換細胞の再
生および選択が同時になされるような方法で調製される
。アミノ酸生合成経路の酵素をコードする酵母の遺伝子
は、一般に選択マーカーとして用いられるので（−ｓｕ
ｐｒａ）、再生は好ましくは酵母の最少寒天培地で行わ
れる。非常に高い効率の再生が必要とされるならば、次
の２段階の方法が有利である：（１）栄養豊富な合成培
地での細胞壁の再生、および（２）細胞層の選択寒天培
地へのレプリカプレートによる形質転換細胞の選択。

【００３３】ＤＮＡベクターが真核生物宿主細胞を形質
転換するために用いられる直鎖状ＤＮＡベクターである
場合、形質転換は好ましくは酵母の選択マーカーを含む
第２のベクターの存在下で行われる。このコトランスフ
ォーメーションは、直接的に選択されないＤＮＡを取り
込む宿主細胞を豊富にさせる。コンピテント細胞がどの
ような型のＤＮＡも取り込むので、選択ベクターで形質
転換された細胞の高パーセンテージのものもまた（上記
の直鎖状ＤＮＡベクターのような）付加的なＤＮＡをも
つ。形質転換された宿主細胞は、目的のポリペプチドの
生産に関して、技術的に知られた方法を用いた突然変異
および選択により改良される。突然変異は、例えばＵＶ
照射または適当な化学試薬によりもたらされる。プロテ
アーゼＡおよびＢを欠損した菌株が特に好ましい；その
ような菌株は一般に入手可能である。

【００３４】転写終了シグナルは転写終了およびポリア
デニレーションの適当なシグナルを含む真核生物遺伝子
の３′隣接配列である。適当な３′隣接配列は、例えば
発現コントロール配列に天然に連結した遺伝子のものが
ある。代わりになるものとして、それらは異なるもので
ある。好ましくは、終了シグナルはＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＡＤＨ１遺伝子
のものである。

【００３５】本発明の第二の性状は、外来ポリペプチド
を発現、分泌できる真菌の菌株を得る過程を供給する。 この過程は（１）変異株を作製するために、真菌細胞を
変異原物質にさらすこと、（２）請求項１から６までの
いずれかに従った方法により、外来ペプチドの分泌の相
対的レベルを決定すること、および（３）前記真菌細胞
以上のレベルの発現での目的レベルの外来ポリペプチド
を発現する菌株を分離することからなる。

【００３６】本発明の第三点は改良された真菌の菌株を
発酵させ、それにより発現されるペプチドを得る過程を
供給する。（用語はオリゴペプチドおよびポリペプチド
を含む）ペプチドは菌株選択段階で発現されるポリペプ
チドと同一または異なる。異なる場合、明らかに適当な
発現手段（適当なプロモーターおよびコーディング領域
等）が良く知られているように存在する。通常、元来の
ポリペプチドの発現手段が、新規の発現手段の前、間、
または後に除去される。

【００３７】外来ペプチドは、フィブロネクチンまたは
その部分（例えば、ＥＰ２０７　　７５１に述べられて
いるコラーゲンまたはフィブリン結合部分）、ウロキナ
ーゼ、ブロウロキナーゼ、ＣＤ４の１から３６８の部分
（Ｄ．Ｓｍｉｔｈら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　　
３２８，１７０４−１７０７）、血小板由来成長因子（
Ｃｏｌｌｉｎｓら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　　３１
６，７４８−７５０）、形質転換成長因子β（Ｄｅｒｙ
ｎｃｋら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　　３１６，７０
１−７０５）、Ｖｏｎ　　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の
１から２７２の部分（Ｂｏｎｔｈａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．１４５　　７１２５−７１２７）
、フィブロネクチンのカテプシンＤ断片（５８５−１５
７８）、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲンア
クチベーター阻害剤、第ＶＩＩＩ因子、α−グロビン、
β−グロビン、ミオグロビン、神経生長因子ＬＡＣＩ（
リポタンパク質付随凝固阻害剤）、ラクトフェリンまた
は血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤＥＣＧＦ）または
これらのいずれかの保存性の変種である。ポリペプチド
はまた、ＨＳＡまたはそのＮ末端部分の融合および上記
のようなその他のポリペプチドである。

【００３８】ペプチドは好ましくは最初は、分泌リーダ
ー配列をもった融合体として発現される。これは例えば
、天然のＨＡリーダー、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＭＦα−１のリーダー、Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　　ｌａｃｔｉｓのキラー毒
素のリーダー、天然ＨＡリーダーおよびＭＦα−１リー
ダー配列の融合、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　
　ｌａｃｔｉｓのキラーリーダーおよびＭＦα−１リー
ダー配列の融合である。それ故、少なくとも酵母では、
リーダーは次のリーダー配列のいずれかである：

【００
３９】

【表１】

【００４０】

【表２】 またはＷＯ　　９０／０１０６３に述べられているよう
にどちら下の配列の保存的な修飾された変種。

【００４１】形質転換真菌の発酵および目的ペプチド産
物の分離は、例えば「酵母のバイオテクノロジー」（Ｄ
．Ｒ．Ｂｅｒｒｙ，Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌｌ　　＆　　Ｇ．
Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ編、Ａｌｌｅｎ　　＆　　Ｕｎｗｉ
ｎ）に述べられいる既知の手段により実施される。

【００４２】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｐｏｍｂｅまたはＫｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　　ｌａｃｔｉｓのような他の
酵母、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｓｐｐ．のよ
うな他の真菌を用いた発明および新規プロモーターの変
異の検出方法が用いられる。

【００４３】発明の好ましい点は例および次の図に述べ
られている：

【００４４】図１から７は、ｐＡＹＥ３３３、ｐＡＹＥ
３３４、ｐＡＹＥ３２８、ｐＡＹＥ３３５、ｐＡＹＥ３
０９、ｐＳＡＣ３５およびｐＡＹＥ３１６のそれぞれの
プラスミド地図である。

【００４５】図８は２菌株、ＤＢ１　　ｐＡＹＥ３１６
およびＤＳ６５　　ｐＡＹＥ３１６の振とうフラスコ培
養で観察されたＨＡ　　ｍＲＮＡの蓄積を述べたノーザ
ンプロットで、ＲＮＡはＡ）対数増殖期中期およびＢ）
対数増殖期後期の細胞から抽出された。

【００４６】図９はプラスミドｐＤＢＰ１およびｐＤＢ
Ｐ２の構築を示す。

【００４７】図１０から１４は、ｐＤＢＰ５、ｐＤＢＰ
６、ｐＤＢＰ７、ｐＤＢＡ１およびｐＤＢＡ２のそれぞ
れのプラスミド地図である。

【００４８】標準的な組換えＤＮＡの方法は、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓらにより述べられた「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｍａ
ｎｕａｌ」（コールドスプリングハーバー研究所、コー
ルドスプリングハーバー、ニューヨーク）およびその第
２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）による。

【００４９】

【実施例】

例１：ＨＡ分泌プラスミドの調製

【００５０】プロテアーゼＢプロモーターを含有する１
．４４０ｋｂｐ　　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ　　Ｄ
ＮＡ　　フラグメント（ＳＥＱ１）を、Ｍ１３バクテリ
オファージｍｐ１８のポリリンカー中にクローン形成さ
せ、（Ｙａｎｉｓｈ・Ｐｅｒｒｏｎ等による（１９８５
）Ｇｅｎｅ３３、１０３〜１１９）、プラスミドｐＡＹ
Ｅ３３３を生じさせる（図１）。プラスミドｐＡＹＥ３
３３を、ＳｎａＢ１による部分的消化によって、線状に
し、次いで二重鎖オリゴヌクレオチド　　リンカー１を
、このＰＲＢ１プロモーター内のＳｎａＢ１部位で、連
結反応によって挿入する。

【００５１】

【表３】

【００５２】これによって、プロテアーゼＢプロモータ
ーの５′末端に、ＮｏｔＩ制限部位が生じる。このプロ
モーター要素を、製造者用説明書に従い、特定部位の突
然変異誘発によって、（オリゴヌクレオチド直接インビ
トロ突然変異誘発システム−バージョン２，Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）、さらに修飾する。 ３１−ｍｅｒオリゴペプチド

【００５３】

【表４】 による突然変異誘発は、ＡＴＧ翻訳開始コドン：

【００
５４】

【表５】 に近い、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。

【００５５】プラスミドｐＡＡＨ５（Ｇｏｏｄｅｙ等に
よる、Ｉｎ　　ＹｅａｓｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，４０１〜４２９頁（１９８７），Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．Ｒ
．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｉ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ｇ．
Ｇ．編集，Ａｌｌｅｎ　　ａｎｄ　　Ｕｎｗｉｎ出版）
を、ＢａｍＨＩによる部分的消化によって線状にした。 その５′突出末端を、Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼおよ
びｄＮＴＰｓでブラント末端形成させ、二重鎖オリゴヌ
クレオチド　　リンカー１と連結させた。ＡＤＨＩター
ミネーターの３′末端で、ＢａｍＨＩ部位がＮｏｔＩ制
限部位で置き換えられている組換えプラスミドｐＡＹＥ
３３４（図２）を選択した。

【００５６】プラスミドｐＡＴ１５３［Ｔｗｉｇｇ　　
＆　　ＳｈｅｒｒａｔｔによるＮａｔｕｒｅ　　２８３
，２１６〜２１８頁（１９８０）］を、ＥｃｏＲＩ／Ｂ
ａｍＨＩで消化させ、その大きい方の３．３６ｋｂｐＤ
ＮＡフラグメントを精製した。５′突出末端は、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓでブラント末端形成
し、次いで二重鎖オリゴヌクレオチドリンカー１で再び
環形成し、プラスミドｐＡＹＥ３２８（図３）を生成さ
せた。

【００５７】０．８ｋｂｐ　　ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ修飾プロテアーゼＢプロモーター配列を、プラスミド
ｐＡＹＥ３２８に由来するｐＡＴ１５３上で、０．４５
ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ　　ＡＤＨＩ転写ター
ミネーターの上流に配置し、ｐＡＹＥ３３５（図４）を
生成させた。

【００５８】プラスミドｐＡＹＥ３０９（図５）は、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ線状ｐＡＹＥ３３５（図４）と二重鎖オリ
ゴヌクレオチド　　リンカー２（その５′−３′鎖はＳ
ＥＱ５を構成している）

【００５９】

【表６】

【００６０】とＸｈｏＩ線状ｍｐ１９．７（ＥＰ−Ａ・
２０１２３９）から遊離された１．９ｋｂｐ　　ＨＡ　
　ｃＤＮＡ　　フラグメントとの間で、３種連結させ、
Ｓ１ヌクレアーゼでブラント末端形成し、次いでＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化させた。印を付けられているＡＴＧは、
融合リーダー分泌配列のためのオープンリーデングフレ
ームの開始点を示している。

【００６１】プラスミドｐＡＹＥ３０９で作り出された
３．２ｋｂｐ　　ＮｏｔＩ制限フラグメントを次いで、
ユニークなＮｏｔＩ制限部位を含有する、適当な酵母菌
複製性ベクター（たとえば、ｐＳＡＣ３５、図６）に転
移し、プラスミドｐＡＹＥ３１６を作り出した（図７）
。

【００６２】プラスミドｐＳＡＣ３５は、Ｃｈｉｎｅｒ
ｙおよびＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅにより記載された（Ｃｕ
ｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，２１〜２５頁（１９８９）お
よびＥＰ２８６４２４）、ｐＳＡＣ３の誘導体である。 ＬＥＵ２選択性マーカーは、ｐＳＡＣ３のＳｎａＢＩ部
位に挿入された、ＹＥｐ１３［Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．
等によるＣｅｌｌ　　１６、８２７〜８３９頁（１９７
９）］からの、１．９５ｋｂｐ　　ＳａｌＩ−ＨｐａＩ
フラグメントである。ＬＥＵ２遺伝子は、ユニークなＴ
ｔｈＩＩＩ　　Ｉ部位を有する。この酵素による消化の
後に、５′突出部位はＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼＩで
処理することによって満される。ＮｏｔＩ認識部位の挿
入によるｐＳＡＣ３５の生成は、このブラント末端線状
ＤＮＡを二重鎖オリゴヌクレオチド　　リンカー１を連
結することによって達成される。

【００６３】プラスミドｐＡＹＥ３１６を、Ｈｉｎｎｅ
ｎ等によりＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７５，１９２９頁（１９７
８）に記載された方法によって、サッカロマイセス　　
セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）株ＤＢ１（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２，［ｃ
ｉｒ゜］）中に導入した。形質転換体は、ロイシンを含
有していない最小培地で選択した（酵母窒素基剤、Ｄｉ
ｆｃｏ）。形質転換体を、複合液状培地［ＹＥＰ１％（
ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトンお
よび２％（ｗ／ｖ）ショ糖］、あるいは規定液状培地［
０．１５％（ｗ／ｖ）のアミノ酸および硫酸アンモニウ
ムを含有していない酵母窒素基剤、０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸アンモニウム、０．１Ｍクエン酸／Ｎａ２ＨＰＯ４
・１２Ｈ２Ｏ．ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）ショ糖］の
どちらかを１０ｍｌ含有する５０ｍｌフラスコ中で、３
０℃、２００ｒｐｍで、７２時間、増殖させると、細胞
を含有していない培養物上澄液中に、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって、および（または）ロ
ケット免疫ゲル電気泳動によって、ＨＡを検出すること
ができた。

【００６４】例２：ＨＳＡを使用する超分泌性菌株の調
製 ＤＢＩ　　ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ３１６）の突然変異株を
、当技術で既知の方法によって調製した。要約すると、
ＤＢＩ　　ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ３１６）を、規定培地に
おいて、光学濃度ＯＤ６００　　０．５〜１．０（中間
対数増殖期）まで増殖させた。この培養物２０ｍｌを、
遠心処理し、上澄液を捨て、細胞を、ショ糖を含有して
いない規定培地２０ｍｌ中に再懸濁した。この細胞を次
いで、利用できる多くの化学的突然変異誘発物質のうち
の一種で、１０〜３０％の生存率が得られるように処理
した。 この突然変異した細胞を次いで、２．５％（ｖ／ｖ）ウ
サギ抗ＨＡ抗体（Ｃａｍｂｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
英国）を含有するＹＥＰ、２％ショ糖、１％（ｗ／ｖ）
アガロース板上に展延し、３０℃で少なくとも７２時間
インキュベートした。各培養板に適用した各細胞の数を
１ｃｍ２当りで１〜２個のコロニイが発現するように調
節した。コロニイの大きさが大きくなるに従い、コロニ
イの周囲に、不透明な沈降素の輪が生じた。培地中に、
高められたレベルでＨＡを分泌するＤＢＩ　　ｃｉｒ゜
（ｐＡＹＥ３１６）の突然変異株を、この沈降素の輪の
大きさの増加によって、直接に検出した。最大の輪を生
じるコロニイを同定し、規定培地寒天板上で継代培養し
、次いで上記の複合液状培地および規定液状培地でＨＡ
を分泌する、それらの能力に関して評価した。

【００６５】超産生性の菌株を同定する場合には、この
プラスミドの株を固定し、次いでこの［ｃｉｒ゜］突然
変異株をプラスミドｐＡＹＥ３１６により、ロイシン原
栄養株に戻す再形質転換を行なうことによって、この突
然変異の場所（染色体対エピソーム）を確立した。この
突然変異がゲノム中に局限化されている場合には、この
再形質転換された菌株は、高められたレベルでＨＡを分
泌する能力を保有する。

【００６６】発現する沈降素の輪は一般に、淡く、かつ
またぼんやりしている。従って、好ましくは、清明な培
地を使用する。従って、アガロースは寒天よりも好まし
い。固形培地（清明でない場合）の濃度およびそこに沈
着した細胞の密度は、最も明確な結果が得られるように
選択することができる。

【００６７】異種ポリペプチドが分泌されない場合でも
、細胞を機械的に、化学的に、または酵素的に、慎重に
溶解させることによって、あるいは自己消化を生起させ
ることによって、検出することができる。

【００６８】別の態様においては、細胞をアガロースま
たは他の適当な培地上で、平板培養し、次いで「Ｇｅｌ
ｂｏｎｄ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン国）な
どの親水性プラスティックシート上で乾燥させる。この
方法は、低レベルの発現が得られる場合に特に有用であ
る。この抗体−ＨＡ複合体は次いで、たとえばＣｏｏｍ
ａｓｓｉｅ　　Ｂｌｕｅで染色して、青色輪が見られる
ように、可視化することができる。

【００６９】超分泌性の菌株は、再度、突然変異させる
ことができる。突然変異を継続的に繰返すと、この菌株
の生産性は増大する。この方法で、一連の突然変異菌株
を発現させた（表１）。これらの突然変異の起源はいず
れも染色体にあった。ＤＳ３７ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ３１
６）は、元来、ＤＢＩ　　ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ３１６）
の超分泌性突然変異株であることが見い出された。しか
しながら、この結果は、上記の複合液状培地中で評価し
た場合に、この菌株がＤＢＩ　　ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ３
１６）よりも有意に高いレベルでは、ＨＡを分泌しなか
ったことを示している。

【００７０】

【表７】

【００７１】この突然変異の正確な遺伝子座は知られて
いない。しかしながら、２回の突然変異の表現型効果は
部分的に特徴付けされている。親菌株ＤＢＩ　　ｃｉｒ
゜（ｐＡＹＥ３１６）におけるＨＡ　　ｍＲＮＡの安定
状態レベルは、振盪フラスコ培養で増殖する間に見られ
るプロテアーゼＢ　　ｍＲＮＡのレベルに反映する［Ｍ
ｏｅｈｌｅによるＧｅｎｅｔｉｃｓ　　１１５，２５５
〜２６３頁（１９８７）］。株ＤＳ６５ｃｉｒ゜（ｐＡ
ＹＥ３１６）の増大した産生性をもたらす突然変異は明
らかに、対数増殖期間中のプロテアーゼＢ　　プロモー
ターからのＨＡｍＲＮＡの本質的な発現を可能にする（
図８）。

【００７２】２回目の突然変異は明らかに、活性プロテ
アーゼＡの合成を壊滅させる。この突然変異で最初に同
定された菌株、ＤＳ２１２ｐｅｐ−ｃｉｒ゜（ｐＡＹＥ
３１６）は、その親の菌株ＤＳ２１２　　ｃｉｒ゜（ｐ
ＡＹＥ３１６）と区別できないレベルでＨＡを分泌する
。

【００７３】例３：ＰＡＩ−２の細胞内発現ヒト単球様
組織球リンパ腫セルライン　　Ｕ９３７（これは、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　Ｉｎｃ
．から得られる）の４−ホルボール−１２−ミリステー
ト−１３−アセテート刺激された細胞から単離された、
ｍＲＮＡから構築されたラムダｇｔ１１　　ｃＤＮＡラ
イブラリイを、プラスミノーゲン　　アクチベーター　
　インヒビター　　タイプ２（ＰＡＩ−２）ｃＤＮＡ源
として使用した。このライブラリイを、ＰＡＩ−２タン
パク質のＮ−末端（オリゴ１）およびＣ−末端（アミノ
酸４００−４１０）をそれぞれコードするＤＮＡ配列に
相当する放射能ラベルを付けたオリゴヌクレオチド　　
プローブを用いて、スクリーニングした。

【００７４】

【表８】

【００７５】

【表９】

【００７６】推定上でポジティブのクローンから、完全
ＰＡＩ−２コード領域を含有するものと見做される１個
のクローン（ラムダｇｔ１１−１８６）を選択した。こ
れは、このクローン（ＳＥＱ８）中の挿入ＤＮＡの配列
を分析し、次いでＭ１３ｍｐ１９に移し、ｐＤＢＰ１を
形成することによって確認した（図９）。ＳＥＱ８にお
いては、位置４２でＡＴＧがコード領域の開始を示し、
位置１２８７でＴＡＡが停止コドンである。

【００７７】発現ベクター中への挿入を容易にするため
に、制限酵素認識部位を、このＰＡＩ−２遺伝子の５′
末端および３′末端に作り出した。ＢｇｌＩＩ部位は、
オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、この遺伝子の
５′末端に作り出し、

【００７８】

【表１０】

【００７９】下記に示すように、第二のコドンの第三の
位置で突然変異を生じさせた：

【００８０】

【表１１】 を、

【００８１】

【表１２】

【００８２】に変えた（ＳＥＱ１１は、示されているタ
ンパク質配列の開始点である）。ＡｆｌＩＩ部位は、オ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して生じさせ：

【０
０８３】

【表１３】

【００８４】下記に示すように、最後のコドン（プロリ
ン）の三番目の位置と停止コドンの後の１番目の塩基で
、突然変異を生じさせた（ＳＥＱ１５は示されているＣ
−末端領域によってコードされるペプチドである）：

【
００８５】

【表１４】 を、

【００８６】

【表１５】 に変える。

【００８７】これらの２種のオリゴヌクレオチドを、一
重鎖ｐＤＢＰ１にアニーリングし、次いで製造者用説明
書に従って行なわれた、インビトロ突然変異誘発法（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍｐｌｃ）に使用した。この方法から誘導
され、正しい変化を有しているクローンを、ｐＤＢＰ２
と命名した（図９）。

【００８８】酵母Ｅ．ｃｏｌｉ　　シャトル　　ベクタ
ー　　ｐＪＤＢ２０７［Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．によるＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｙ
ｅａｓｔ，Ａｌｆｒｅｄ　　Ｂｅｎｚｏｎ　　Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ　　１６，３８３〜３９５頁（１９８１）］
からの大型６．３８ｋｂｐ　　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＤＮＡ　　ポリ
メラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、ブラン
ト末端を作り出し、次いで二重鎖オリゴヌクレオチドリ
ンカー１を連結させ（例１）、プラスミドｐＤＢＰ５を
生成させた（図１０）。プラスミドｐＡＹＥ３３５（図
４）からの１．２５ｋｂｐ　　ＮｏｔＩプロテアーゼＢ
　　プロモーター／ＡＤＨ１ターミネーターカセットを
、プラスミドｐＤＢＰ５の独特のＮｏｔＩ部位中に導入
し、ｐＤＢＰ６を生成させた（図１１）。

【００８９】ヒトＰＡＩ−２ｃＤＮＡを、発現プラスミ
ドｐＤＢＰ６中に挿入するために、２種の二重鎖オリゴ
ヌクレオチドリンカーを使用した。

【００９０】

【表１６】

【００９１】

【表１７】

【００９２】リンカー３とリンカー４とを、ｐＤＢＰ２
（図９）からの１．３４ｋｂｐ　　ＢｇｌＩＩ−Ａｆｌ
ＩＩ　　ＰＡＩ−２　　ｃＤＮＡとともに、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ線状ｐＤＢＰ６中に連結させ、プラスミドｐＤＢＰ
７（図１０）を生成させた。

【００９３】Ｓ．セレビシアエ株ＤＢ１　　ｃｉｒ゜お
よびＤＳ５６９ｃｉｒ゜によるｐＤＢＰ７の安定性の維
持は、生の状態の２μプラスミド［Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ａ
．Ｂ．によるＹｅａｓｔ４，２７〜４０頁（１９８８）
］上に存在するトランス作用機能が導入されるまで得る
ことはできない。これは、ＤＢ１　　ｃｉｒ゜およびＤ
Ｓ５６９ｃｉｒ゜をｐＳＡＣ３［Ｃｈｉｎｅｒｙ，Ｓ．
Ａ．およびＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅ，Ｅ．によるＣｕｒｒ
ｅｎｔ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６，２１〜２５頁（１９
８９）］およびｐＪＤＢ２０７で、同時に形質転換させ
、次いでロイシンを含有していない最小培地上で形質転
換体に関して選択することによって、達成された。ｐＪ
ＤＢ２０７プラスミドのＤＳ５６９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ
３／ｐＪＤＢ２０７）およびＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ
３／ｐＪＤＢ２０７）を固定すると、元の菌株のｃｉｒ
＋誘導体が効果的に得られる。

【００９４】ＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３）およびＤＳ
５６９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３）を、プラスミドｐＤＢＰ
７で、ロイシン原栄養株に、再−形質転換させ、次いで
形質転換体を、ロイシンを含有していない最小培地で選
択した。ＤＳ５６９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３）、ＤＳ５６
９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＰ７）、ＤＢ１ｃｉｒ
゜（ｐＳＡＣ３）およびＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／
ｐＤＢＰ７）を、振盪フラスコ内の複合培地１０ｍｌ［
１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）バクトペプ
トンおよび２％（ｗ／ｖ）ショ糖］中で、２００ｒｐｍ
、３０℃において、７２時間増殖させた。細胞を遠心処
理により採取し、溶解させ、次いで可溶性タンパク質エ
キスを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って分析した。ＰＡＩ−２発現性プラスミドｐＤＢＰ７
（図１２）を含有する培養物中の可溶性タンパク質エキ
ス中にだけ、４６ＫＤの特別のタンパク質バンドが見い
出された。この特別のタンパク質バンドは、完全な長さ
のヒトＰＡＩ−２に関する推定分子量のバンドであり、
抗−ＰＡＩ−２抗体との反応によるＷｅｓｔｅｒｎブロ
ット分析法によって、ＰＡＩ−２としてのその正体が証
明された。培養上澄液中に、高められたレベルでヒト　
　アルブミンを分泌するということにもとづいて、初め
に選択された、ＤＳ５６９ｃｉｒ゜株（ｐＳＡＣ３／ｐ
ＤＢＰ７）は、その先祖の菌株ＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡ
Ｃ３／ｐＤＢＰ７）に比較して、少なくとも１０倍高い
レベルで、ヒトＰＡＩ−２を蓄積する。

【００９５】例４：α１ＡＴの細胞内発現Ｇｅｎｂａｎ
ｋデータベースに、受け入れ番号Ｋ０１３９６遺伝子座
ＨＵＭＡ１ＡＴＭで記載されている配列と同一の配列を
有する、ヒトα１−アンチトリプシンｃＤＮＡを、製造
者用説明書に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ　　Ｃｈａｉｎ　　Ｒｅａｃｔｉｏｎ＝ＰＣ
Ｒ）によって、増幅させた。

【００９６】この配列をここで、ＳＥＱ１９として再生
成させる。

【００９７】２種の初めのＰＣＲオリゴヌクレオチドの
ＤＮＡ配列は下記のとおりであった：

【００９８】

【表１８】

【００９９】

【表１９】

【０１００】このα１−アンチトリプシン配列の５′末
端および３′末端を両方ともに、増幅させると、下記の
とおりに修飾された：

【０１０１】

【表２０】

【０１０２】

【表２１】

【０１０３】コードされたアミノ酸領域はそれぞれ、Ｓ
ＥＱ２３およびＳＥＱ２５であると見做す。

【０１０４】

【表２２】

【０１０５】

【表２３】

【０１０６】（上記Ｃ末端領域は、ＳＥＱ２７と見做す
）。これらの修飾は、２３アミノ酸シグナル配列を除き
、そしてｃＤＮＡの３′末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部
位を導入する。

【０１０７】１．１８ｋｂｐ修飾ｃＤＮＡを精製し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化させ、ＢａｍＨＩを挿入し、次いで
Ｍ１３ｍｐ１９［Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等による
Ｇｅｎｅ３３，１０３〜１１９頁（１９８５）］のＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローン形成させ、ｐ
ＤＢＡ１（図１３）を生成させた。そのヒトα１−アン
チトリプシンの完全性は、ジデオキシヌクレオチド配列
によって確認した。

【０１０８】このヒトα１−アンチトリプシンｃＤＮＡ
を酵母発現プラスミドｐＤＢＰ６（図１１）中に挿入す
るためには、二重鎖オリゴヌクレオチド　　リンカーを
使用した。

【０１０９】

【表２４】

【０１１０】リンカー５を、１．１８Ｋｂｐ　　Ｂａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩヒトα１−アンチトリプシンｃＤ
ＮＡとともにＨｉｎｄＩＩＩ線状ｐＤＢＰ６中に連結さ
せ、プラスミドｐＤＢＡ２（図１４）を生成させた。

【０１１１】ＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３）およびＤＳ
５６９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３）をプラスミドｐＤＢＡ２
でロイシン原栄養株に形質転換させ、形質転換体を、ロ
イシンを含有していない最小培地で選択した。ＤＢ１ｃ
ｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）およびＤＳ５６９ｃ
ｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）を、振盪フラスコ培
養で、複合培地１０ｍｌ［１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、
２％（ｗ／ｖ）バクトペプトンおよび２％（ｗ／ｖ）シ
ョ糖］中において、２００ｒｍｐ、３０℃で７２時間、
増殖させた。細胞を遠心処理によって採取し、溶解させ
、次いで可溶性タンパク質エキスを、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって分析した。

【０１１２】ＤＳ５６９ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢ
Ａ２）の可溶性タンパク質エキス中に、α１−アンチト
リプシンの強いタンパク質バンドが見い出される。この
特別のバンドは、α１−アンチトリプシンに関する推定
分子量のバンドに相当する。α１−アンチトリプシンは
また、ＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）の可
溶性タンパク質エキス中でも検出される。ＤＳ５６９ｃ
ｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）は、その先祖の菌株
ＤＢ１ｃｉｒ゜（ｐＳＡＣ３／ｐＤＢＡ２）に比較して
、少なくとも１０倍高いレベルで、α１−アンチトリプ
シンを蓄積する。

【０１１３】

【表２５】 ＳＥＱ１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　　　　　　：１４４０塩基対（Ｂ）型　　
　　　　　　：核酸 （Ｃ）鎖の数　　　　：２本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型　　　　：ＤＮＡ（ケツム）（ｉｉｉ
）ハイポセテイカル配列：Ｎｏ　　（ｉｖ）アンチセン
ス：Ｎｏ 　　（ｖｉ）起源 （Ａ）生物名：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ （ｘｉ）ＳＥＱ１の配列

【０１１４】

【表２６】 ＳＥＱ８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　　　　　　：１４１２塩基対（Ｂ）型　　
　　　　　　：核酸 （Ｃ）鎖の数　　　　：２本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｉｉｉ
）ハイポセティカル配列：Ｎｏ　　（ｉｖ）アンチセン
ス：Ｎｏ 　　（ｖｉ）起源 （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：エクソン （Ｂ）位置　　　　　　：１．．１４１２（Ｄ）他の情
報 （ｘｉ）ＳＥＱ８の配列

【０１１５】

【表２７】 ＳＥＱ１９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　　　　　　：１３５２塩基対（Ｂ）型　　
　　　　　　：核酸 （Ｃ）鎖の数　　　　：２本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｉｉｉ
）ハイポセティカル配列：Ｎｏ　　（ｉｖ）アンチセン
ス：Ｎｏ 　　（ｖｉ）起源 （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｘｉ）ＳＥＱ１９の配列

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
３を示す模式図である。

【図２】図２は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
４を示す模式図である。

【図３】図３は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
８を示す模式図である。

【図４】図４は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３３
５を示す模式図である。

【図５】図５は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３０
９を示す模式図である。

【図６】図６は、例１に記載のプラスミドｐＳＡＣ３５
を示す模式図である。

【図７】図７は、例１に記載のプラスミドｐＡＹＥ３１
６を示す模式図である。

【図８】図８は、例２に記載の、突然変異がプロテアー
ゼＢプロモーターからのＨＡ　　ｍＲＮＡの本質的発現
を可能にすることを示すものである。

【図９】図９は、例３に記載のクローンλｇｔ１１−１
８６の確認方法およびそこで形成されるｐＤＢＰ１およ
びｐＤＢＰ２を示す模式図である。

【図１０】図１０は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
５を示す模式図である。

【図１１】図１１は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
６を示す模式図である。

【図１２】図１２は、例３に記載のプラスミドｐＤＢＰ
７を示す模式図である。

【図１３】図１３は、例４に記載のプラスミドｐＤＢＡ
１を示す模式図である。

【図１４】図１４は、例４に記載のプラスミドｐＤＢＡ
２を示す模式図である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　異種ポリペプチドを発現することがで
   きる菌類のコロニイにおける、上記異種ポリペプチドの
   相対産生レベルを測定する方法であって、上記菌類の細
   胞を固形培地上に適用し、上記異種ポリペプチドを、こ
   の異種ポリペプチドに選択的に結合する手段と相互反応
   させ、次いで生成する複合体を目で見ることよりなる測
   定方法。
2. 【請求項２】　　上記手段が、当該ポリペプチドに対す
   る抗体であり、そして上記可視化工程が、沈殿した抗体
   ／ポリペプチド複合体の輪を観測することよりなる、請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】　　上記固形培地が、菌類細胞を平板培養
   する以前から、抗体を含有している、請求項２に記載の
   方法。
4. 【請求項４】　　上記培地が、アガロースからなる、請
   求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】　　菌類が、サッカロマイセス　　セレビ
   シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
   ｓｉａｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載
   の方法。
6. 【請求項６】　　異種ポリペプチドが、ヒトアルブミン
   、ヒトＰＡＩ−２またはヒトα１−アンチトリプシンで
   ある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】　　ポリペプチドが、菌類細胞から分泌さ
   れるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の
   方法。
8. 【請求項８】　　第一の異種ポリペプチドを産生するこ
   とができる菌類株を得る方法であって、（１）菌類細胞
   を、突然変異誘発物質にさらし、突然変異体を生じさせ
   、（２）第二の異種ペプチドの相対産生レベルを、請求
   項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって測定し、
   次いで（３）所望のレベルの第一の異種ポリペプチドを
   産生する菌株を単離することを包含し、この所望の産生
   レベルは、上記菌類細胞よりも高いレベルであり、そし
   てこの方法において、第一のポリペプチドを第二のポリ
   ペプチドとは、同一または異なることができる方法。
9. 【請求項９】　　請求項８の方法によって得られる菌類
   株。
10. 【請求項１０】　　異種ポリペプチドの調製方法であっ
    て、請求項９に記載の菌類株を培養し、次いで第一のポ
    リペプチドを精製することを包含する方法。
11. 【請求項１１】　　上記菌類株を、上記第一のポリペプ
    チドを発現させるための手段により、先ず形質転換させ
    、この第一のポリペプチドが請求項８の第二のポリペプ
    チドとは異なるものである、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】　　上記第一の異種ポリペプチドが、当
    該菌類から分泌されるものである、請求項１０または１
    １に記載の方法。
13. 【請求項１３】　　請求項１２に記載の方法によって得
    られるポリペプチド。