JPH01132389A - 酵母中でｂ型肝炎ウイルス蛋白質を生産するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）は種種のヒト肝臓病の原
因となる感染因子である。ＨＢＶの感染した多くの個体
は病気の急性期を経て回復に至る。

しかし、多数の個体では感染を除去することができず慢
性のキャリアとなる。ＨＢＶ感染は世界の多くの地域で
風土病となっており、周産期に慢性的に感染している母
親から新生児に高頻度に感染する。世界の慢性キャリア
の数は３億以上と算定されている。このキャリアの中か
ら年間数十万が慢性Ｂ型肝炎感染後長期間の経過後に肝
硬変または肝細胞癌に至り死亡する。

ＨＢピリオンは２群の構造蛋白質、コア蛋白質および外
皮または表面（“Ｓ”）蛋白質からなる。Ｓ”蛋白質は
、ピリオンすなわちゾーン（Ｄａｎｅ）粒子の主要表面
蛋白質であるのに加えて、オーストラリア抗原あるいは
２２ｎｍ粒子の唯一の成分である。該“Ｓパ蛋白質は３
８９アミノ酸をコードする大開放読み取り枠（ＯＲＦ）
の翻訳産物である。このＯＲＦは、各々細胞内で翻訳ザ
始部位として機能することのできるＡＴＧコドンで始ま
る３つのドメインに分離される。これらドメインは、そ
れぞれ遺伝子中で５’−３’の順序で、プレ５ｌ（１０
８アミノ酸）、プレ５２（５５アミノ酸）および５（２
２６アミノ酸）とされる。従って、これらドメインはＳ
またはＨＢｓＡｇ　［２２６アミノ酸（ａａ）］、プレ
Ｓ２＋Ｓ　（２８１ａａ）、およびプレｓ１＋プレＳ２
＋Ｓ　（３８９ａａ）とされる３種のポリペプチドを規
定する。現在入手可能な血漿由来のワクチンは実質的に
Ｓドメインのみを含む蛋白質からなっており、一方今日
までに成功裡に開発された酵母由来のワクチンは専らＳ
ポリペプチドからなでいる。

該２２ｎｍ粒子、またはＨＢ表面抗Ｊｉ（ＨＢｓＡｇ）
粒子は慢性キャリアの血漿から精製されてきた。その血
漿が粒子陽性であるが故にこれらキャリアはＨＢｓ・と
参照される。これらキャリアが十分な免疫反応を与えれ
ば感染を解除することができＨＢｓ−となる。彼らがＨ
Ｂｓにたいする抗体を形成することから、これら個体は
抗−ＨＢ　ｓ”　と表示される。このように、抗−ＨＢ
　ｓ’は病気からの回復と関連する。したがって、ＨＢ
ワクチンによる抗−ＨＢｓ・の促進あるいは形成はＨＢ
Ｖ感染にたいする防御を与えると期待されてきた。

この仮説は実験的に検討可能である。ヒト以外では、Ｈ
Ｂｓ・のような定量可能な指標、および血清中の肝臓酵
素レベルの上昇に反映されるようにＨｎｖ略染に完全に
感受性な種はチンパンジーのみである。チンパンジーを
３回投与量の精製ＨＢｓＡｇ粒子でワクチン処理し、つ
いで大量の感染性ＨＢＶを与えた。偽−ワクチン処理し
た動物は急性ＨＢＶ感染の兆候を示したが、ＨＢｓＡｇ
　−ワクチン処理した動物は感染の如何なる兆候からも
保護されていた。従ってこの実験系で、ｇｐ２７および
ｐ２４（Ｓドメインのみ）からなるＨＢｓＡｇ粒子は保
護免疫を誘起するのに十分であった。これらの観察に刺
激されて、いくつかの製造者がＨＢｓＡｇ粒子からなる
ＨＢワクチンを生産した。

最近、いつくかの独立した系の証拠がプレＳ配列がＨＢ
Ｖにたいする免疫に重要であるかも知れないことを示唆
している。ビールス感染の過程でプレ抗原が免疫的に消
失することはビールスの除去および感染の解除の前兆と
思われる［ブドコウスカ（Ｂｕｄｋｏｗｓｋａ）ほか、
アナーレ　ド　アンスチツート　パスツール／イムノロ
ジー（Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ。

Ｐａ５ｔ、／Ｉｒｘｍｎ、）第１３６Ｄ巻、５Ｂ−６５
頁、１９８５年］。急性Ｂ型肝炎の間、プレＳにたいす
る抗体がしばしばＳにたいする抗体より早く生じる［ブ
チ（Ｐｅｔｉｔ）ほか、モレキュラー　イムノロジー（
Ｍｏ１．　Ｉｍｍｎ、）第２３巻、５１１−５２３頁、
１９８６年］。近親交配マウスにおいて、Ｓおよびプレ
Ｓにたいする免疫応答は独立に制御されているようであ
り、プレＳの存在はＳにたいする免疫応答に影響する［
ミリヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）ほか、プロシージンゲス　イン
　ザ　ナシ甘ナル　アカデミーイン　サイエンセズ　米
国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第８２巻、８１６８−８１７２頁、
１９８５年、ジャーナル　イン　イムノロジー（Ｊ、　
Ｉｍｍｎｏｌ、）第１３７巻、３１５−３２２頁、１９
８６年；ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ほか、ジャーナル
　イン　メヂ力ル　ピロロジー（Ｊ、　Ｗｅｄ。

Ｖｉｒｏｌ、）第１７巻、１１９−１２５頁、１９８５
年］。さらにプレＳ抗体は試験管内でビールスの感染性
を中和［ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ほか、ワクチン（
Ｖａｃｃｉｎｅ）第４巻、３５−３７頁、１９８６年］
し、プレＳ抗原は免疫したチンパンジーを防御する［イ
ト−（Ｉｔｏｈ）ほか、プロシージンゲス　オン　ザ　
ナショナル　アカデミ−インサイエンセズ　米国、第８
３巻、９１７４−９１７８頁、１９８６年］。これらの
観察を基に、またＨＢワクチン生産における組換え体酵
母の有用性の故に［ヒルマン（Ｈｉｌｌｅｍａｎ）ほか
、ワクチン、第４巻、７５−７６頁、１９８６年］、我
々は、組換え体Ｓ．セレビシエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｊｓ
ｉａｅ）から実験的なプレーＳ含有ＨＢワクチンを処方
した。

入手可能なＨＢワクチン供給を増加させるために製造者
は゛°Ｓ°゛蛋白質の発現をもたらす組換え体ＤＮＡ技
術に目を向けた。微生物システムの中で、ニジエリシア
　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）およびサツ
カロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が多くの組換え体由来蛋白質の
発現のために最も普通に用いられてきた。Ｅ、コリ（≧
、蝦）中で免疫的に活性なＨＢｓＡｇ粒子を発現しよう
とする多くの試みは成功していない。

しかし、Ｓ．セレビシエは免疫的に活性なＨＢｓＡｇ粒
子発現に非常に有能であることを示した。

これら粒子は、ワクチンに処方されると、生ＨＢ■の投
与にだいしチンパンジーを完全に保護することが出来る
ことを証明した。さらに、酵母由来ＨＢｓＡｇはヒト臨
床試験において血漿由来ＨＢｓＡｇと同じに有効である
免疫的に活性なＨＢｓＡｇ粒子を発現する能力があるこ
とを示した［スコルニク（Ｓｃｏｌｎｉｃｋ）ほか、ジ
ャマ（Ｊ　Ａ　Ｍ　Ａ　）、第２５１巻、２８１２−２
８１５頁、１９８４年］。従って、組換え体ＨＢｓＡｇ
の合成を指示するための宿主としてのＳ．セレビシエの
有用性はしっかりと確立されている。さらに、酵母は内
毒素を持たず、ヒトに非感染性であり、工業的規模で発
酵させ得、そして連続哺乳類細胞系（その多くはウィル
スで形質転換しており、マウスにおいて腫瘍原性があり
そしてその全てがプロトオンコジーン（ｐｒｏｔｏｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ）に纏わる安全性の問題の多くを欠いてい
ることから、酵母におけるヒト治療剤およびワクチンの
発現は製品開発にとって非常に有用である。

従って、酵母においてプレＳ２＋Ｓを免疫原性のある粒
子として効果的に高収率で発現させるための発現ベクタ
ーおよび方法を与えることが本発明の目的である。本発
明の他目的は、該ポリペプチドの精製のためにプレＳ　
２＋Ｓの最高収率がより大容量でより高濃度で得られる
ように、そのように最適化されたベクターで形質転換さ
れた組換え体宿主細胞の生育の大規模化のための条件を
特定することである。本発明のこれらおよび他の目的は
以下の記載から明らかになろう。

プレＳ２＋Ｓ遺伝子が酵母中で最適化された高収率で発
現された。発現した蛋白質は、血漿由来のプレＳ２＋Ｓ
によりコードされる主要抗原部位を表現する微粒状に凝
集し、それによりこの遺伝子の発現に酵母が有用である
ことを明らかにした。この蛋白質は試験管内診断システ
ムに、そしてＨＢＶによりひきおこされる感染の回避の
ためのワクチンとして有用である。

本発明は酵母種におけるプレＳ２＋Ｓの発現のための方
法を意図したものである。

プレＳ２＋Ｓの開放読み取り枠（ＯＲＦ）単離のための
ＨＢＶ核酸原としてゾーン（Ｄａｎｅ）粒子が用いられ
る。ＨＢピリオン中に生来存在するニックおよびギャッ
プのある核酸形からＨＢＶゲノムの共有結合で閉環し２
本鎖ＤＮＡを生産するために内在性のポリメラーゼ反応
が用いられる。該ＤＮＡが単離され、制限酵素…Ｒ１で
完全消化され、プラスミドｐＢＲ３２２の…ＲＩ部位に
クローン化されプラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を生成
する。このように創られたプラスミドは、プレＳ領域の
ＥｃｏＲＩ部位でＨＢＶゲノムを環状に入れ換えた形で
含むものが選択される。プレＳ２望城の５５アミノ酸お
よびＳ領域の２２６アミノ酸をコードする完全ＯＲＦ　
ハ先ずｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を…ＲＩおよびＡｃｃＩで
消化して得られた０、８キロ塩基対（ｋｂｐ）断片を精
製することにより構築された。この断片は、開始コドン
、アミノ末端３アミノ酸、カルボキシル末端３アミノ酸
および翻訳終結コドンのみを欠くプレＳ２＋Ｓポリペプ
チドをコードする。オリゴヌクレオチドが合成されこの
断片に連結されて、この断片を１０ｂｐの酵母由来の非
翻訳５′隣接配列および完全プレｓ２＋Ｓ　　ＯＲＦを
含むＨｉｎｄＩＩＩ断片に変換した。外来遺伝子ＨＢＶ
プレＳ　２＋Ｓ生産のための高収率の発現系がこの発明
の最初の目的である。発現ベクター（特にプロモーター
および翻訳ターミネータ−（終結情報））と挿入された
ＯＲＦとの相互作用によって、酵母宿主細胞中で最も高
レベルでの外来遺伝子産物が得られる。発現された外来
蛋白質産物の全酵母細胞蛋白質に対するこの割合が“比
活性”と参照される。最初の比活性が高いと、高純度、
高効率でそして同時にヒトワクチンとして高い安全性を
有する産物として、迅速にそして経済的に単離すること
が可能となる。

挿入された外来遺伝子ＯＲＦ　（ＨＢＶプレＳ２＋Ｓ）
を含むこの酵母発現ベクター［ＧＡＰ４９１（グリセロ
アルデヒド燐酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよび
ＡＤＨＩ　（アルコールデヒドロゲナーゼ）転写ターミ
ネータ−からなる］の構築において以下の論法が適用さ
れた。高度に発現される天然酵母蛋白質をコードする遺
伝子においては進化的に最適化が生じているはずである
と推論された。従って、そのような遺伝子の５′および
３′隣接領域から得られた共通配列または特異配列は、
転写速度、メツセージの安定性、そして翻訳速度を高め
ることにより、外来遺伝子の発現にも最適である筈であ
る。

プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの３′側配列が選択され、ＡＤ
Ｈ１転写ターミネータ−中にある天然のＨｉｎｄＩ１１
部位に直接結合され、その結果介在塩基の付加のない完
全な天然の酵母由来の連結部を生み出すこととなった。

当業者にとっては、プレＳ２＋Ｓ（または他の外来遺伝
子）の最適化された高レベルでの発現のために、どのよ
うな適当な酵母転写ターミネータ−でもＡＤＨＩと置き
換え得ることは自明である。最適な構築のための５′隣
接配列（ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡ）が高度に発現される
グリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ＧＡＰ８３）［ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ジャーナ
ル　イン　バイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｗ、）第２２５巻、２５９６頁、１９８０
年］の非翻訳リーダー（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ
　１ｅａｄｅｒ（ＮＴＬ））のためのものに対応するよ
うに選択された。この配列はＧＡＰ遺伝子ファミリーに
とっても共通である。このｍ築は、如何なる介在塩基も
付加しないようにプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの開始コドン
に直接ＮＴＬを連結するような方式でなされた。従って
、当業者にとって、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの最適化し
た高レベル発現のためには、非翻訳リーダー配列の選択
はＧＡＰ４９１、ＧＡＰＩＩ、エノラーゼ、ＡＤＨｌ、
ＡＤＨ２、ＰＨ０５、および類似のものを含むがそれに
限定されない他の高度に発現される酵母遺伝子にまで拡
張されることは自明である。

ＤＮＡ配列の解析の結果、プラスミドｐＨＢｐｒｅｓＧ
ＡＰ３４７／１９Ｔ　（Ｅ−ロッパ特許出願第０１７４
４４４号中でｐＨＢｐｒｅＳ５６ＧＡＰ３４７／３３と
記載されている）によりコードされるプレＳ　２＋Ｓ配
列とアミノ酸が異なることになる２塩基置換が示された
。両構築について同一のポリペプチドで評価するために
、これら置換、塩基６４のＣの変わりにＴ（Ｌｅｕでな
くＰｈｅをコードする）そして塩基３５２のＡの代わり
にＣ（ＧｉｎでなくＨｉｓをコードする）は、部位指定
変異［シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ほか、ヌクレイツク　ア
シッヅ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
ｅａｒｃｈ）第１０巻、６４８７−６５００頁、１９８
２年］により変えられた。最適化した構築でのコードさ
れたアミノ酸配列が確認された。

変異処理に続いて、上述の断片は以前に記載［クニスケ
ルン（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ）ほか、ジーン（Ｇｅｎｅ）第
４６巻、１３５−１４１頁、１９８６年コされたように
、（ａ）ＧＡＰ４９１プロモーターの約１０５０ｂｐ、
（ｂ）酵母由来隣接配列１０ｂｐ、（Ｃ）ウィルス隣接
配列を欠いたＨＢＶプレＳ２＋Ｓ遺伝子（血清型ａｄｗ
）の８４６ｂｐそして、（ｄ）酵母ＡＤＨＩターミネー
タ−の約３５０ｂｐからなる発現カセットを構築するの
に用いられた。この発現カセットは、酵母シャトルベク
ターｐｃｉ／１　　［ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）　、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７５巻、１０４頁、１９
７８年；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ほか、
第３１２巻、７７頁、１９８４年］中に挿入され、酵母
ＣＦ４２株を形質転換するのに用いられた。（形質転換
体ｐＹＧｐｒｅＳ２５−１を生成しり）。平行した実験
で、プラスミドｐＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／１９Ｔが
同じ親酵母ＣＦ４２株の新鮮な形質転換体を調製するの
に用いられた（形質転換体ｐＧｐｒｅｓ２ｓ−２を生成
した）。これら形質転換体は評価ならびに以下の実験の
ために凍結保存試料とされた。親株ＣＦ４２は以下のよ
うに得られた：酵母２１５０−２−３株（ワシントン大
学のり、ハートウェル（Ｌ、　Ｈａｒｔｗｅｌｌ）から
の供与）の自然史３変異が選択された（ボーク（Ｂｏｅ
ｋｅ）ほか、モレキュラー　ジェネラル　ジエネチック
ス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ）第１９７巻、３
４５〜３４６頁、１９８４年）。得られた菌株（ＭＡＴ
ａ　、　ａｄｅｌ、Ｉｅｕ２−０４、−３、士０）はプ
ラスミドＹＣＰ５０−ＨＯで形質転換することにより倍
数化された［ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ほか、プロシ
ージンゲス　イン　ザ　ナショナル　アカデミ−オン　
サイエンセズ（Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、）米国（ＵＳＡ
）、第８０巻、３０３５−３０３９頁、１９８３年］。

機能している酵母ＨＯ遺伝子により細胞の接合型が変換
する。従って、一つの細胞の形質転換体からの子孫は接
合型“ａ”および“α”両方の混合物であり集落形成の
間に接合する。２媒体のクローン分離体はプラスミドで
キュアされ、ＣＦ４２　（川ａ／ａ、ａｄｅｌ、奥２−
０４　、　ｕｒａ３）と命名された。これら形質転換体
は評価ならびに以下の実験のために凍結保存試料とされ
た。

上記凍結保存資料からの組換え体酵母はＹＥ）（Ｄ培地
中で生育された。定常期まで生育の後、酵母細胞は収穫
され、溶菌液が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム　ゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析されモしてＨＢ
ｓＡｇに対する抗体でイムノプロットされた。プレＳ２
＋Ｓ　　ＯＲＦの翻訳産物の予想された分子量およびそ
の糖鎖付加誘導体と一致して分子量３０−および３４−
キロダルトン（ｋＤ）を示す２つの主要ポリペプチドが
認められた。さらに、組換え体の溶菌液はラジオイムノ
アッセイによりプレＳ２＋Ｓ陽性であったが親株溶菌液
は陰性だった。部分的に精製された酵母溶菌液を電子顕
微鏡で観察すると高密度の典型的な２２ｎｍプレＳ２＋
Ｓ粒子が示される。

酵母由来プロモーターがプレＳ　２＋３遺伝子の転写を
開始する。従って、当業者にとっては如何なる酵母のプ
ロモーターもＧＡＰ４９１プロモーターと置き換え得る
ことは自明である。当業者にとりては、最高収率を得る
ために培養を収穫する時間が最適となるように、この系
におけるプレＳ２＋Ｓポリペプチドの発現を検定するた
めに適当な検定システム例えばイムノプロットまたはラ
ジオイムノアッセイまたは酵素結合イムノアッセイ（Ｅ
　Ｉ　Ａ）が利用されるべきであることも自明である。

ＧＡＰ４９１プロモーターは酵母中でＨＢｓＡｇを含む
いくつかの外来性蛋白質を発現するのに有用であった［
ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ほか、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第
３２巻、２６３−２７４頁、１９８４年、ワンブラー（
Ｗａｍｐｌｅｒ）ほか、プロシーヂングス　才ブ　ザ　
ナショナル　アカデミ−インサイエンセズ　米国第８２
巻、６８３０−６８３４年、１９８５年］、ＨＢｃＡｇ
を可溶性酵母蛋白質の約４０％迄発現させるという我々
の以前の結果（クニスケルン（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ）ほか
、前出）に基づいて、このプロモーターからのプレＳ　
２＋Ｓ抗原の発現を最適化しようとした。プレＳ２＋Ｓ
のための２つの発現ベクターｐＹＧｐｒｅｓ２ｓ−１お
よびｐＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／１９Ｔは同一のアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする。両者は、前者が
最適化した５′配列を含み、ビールス５′または３′配
列および酵母のＡＤＨ１転写ターミネータ−を含まない
のに対し、後者は約１３０ｂｐのＨＢＶ−由来の３′隣
接配列およびＧＡＰ４９１転写ターミネータ−を含むと
いうことで、非翻訳隣接配列が異なっている。両方のベ
クターが酵母ＣＦ４２株を形質転換するのに用いられ、
その形質転換体は平行して振盪フラスコ実験で検定され
た。ｐ　Ｙ　Ｇ　ｐ　ｒ　ｅ　Ｓ　２−１により形質転
換された酵母中でのプレＳ２＋Ｓの量は、ｐＨＢｐｒｅ
ｓＧＡＰ３４７／１９Ｔによる形質転換体のものより再
現性良く４から５−倍であった。

開始シグナルの隣接するＤＮＡ配列［即ち５′非翻訳リ
ーダー（ＮＴＬ）］は、転写速度、メッセイジの安定性
そして翻訳速度に影響することにより遺伝子の発現程度
に重大な影響を与えると考えられる。高レベルでの発現
が生存上の有利さをもたらすことにより、天然の選択を
経た進化がおそらく本来の酵母遺伝子（たとえばグリコ
シド酵素）の５　’　ＮＴＬ配列を最適化した。ここに
記載された構築のために、ＧＡＰ遺伝子群の５’ＮＴＬ
配列から由来する共通ＮＴＬ配列、ＡＣＡＡＡＡＣＡＡ
ＡＡ、がＨＢＶブレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの発現レベルを
高め最適化するために用いられた。

そして当業者にとっては、高度に発現されている本来の
酵母遺伝子の５’ＮＴＬから由来する共通性を有するど
のような５　’　ＮＴＬも有用であることは自明であろ
う。

サツカロミセス属は種々の種からなっている。

種々の外来遺伝子の組換えＤＮＡ−仲介発現のための宿
主として最も普通に用いられるのはサツカロミセス　セ
レビシェ、或はパン酵母である。しかし、サツカロミセ
ス属の他の種の間での分別は必ずしも明確なものではな
い。これら種の多くはＳ．セレビシエと交配可能であり
、Ｓ．セレビシエのプロモーターと類似或は同一のプロ
モーターを持っているようである。従って、当業者にと
つては、プレＳ　２＋Ｓポリペプチドの発現のための宿
主株の選択が、カルルスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅ
ｒｇｅｎｓｉｓ）、ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）、ルキシ
（ｒｏｕｘｉｉ）、モンタヌス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、
クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、エロンギスポラス（
ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂ
ｅｎｓｉｓ）　、オビフォルミス（ｏｖｉｆｏｒｎ＋ｉ
ｓ）およびヂアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）
を含むがそれに限定されないサツカロミセス属の他の種
にまで拡張されることは自明であろう。

ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）　、カンヂダ（Ｇａ
ｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）
、そしてピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のようないくつかの酵
母症が、生育のための唯一炭素源としてメタノールを利
用するための同じような代謝経路を含むことが示されて
いる。この代謝経路に関係する酵素であるアルコール　
オキシダーゼの遺伝子がピキア　パストリス（Ｐｉ＋Ｊ
ｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）から単離されている。該Ｐ。

パストリスのアルコール　オキシダーゼ　プロモーター
が単離され、メタノール誘導発現に感受性であることが
示されている。このような誘導可能なプロモーターは、
酵母中でのポリペプチドの発現のために有用である。特
に、このプロモーターはＰ、パストリス中でＨＢＶ　”
Ｓ”ドメインを微粒状に誘導発現させるのにプラスミド
上で活性であることが示されている。この観察は、ポリ
ペプチドを免疫的に活性な形で組換えＤＮＡ−仲介発現
させるための宿主として他の酵母症が機能し得ることを
明らかにした。従って、当業者にとってはブレＳ２＋Ｓ
発現のためには、宿主種の選択はサツカロミセス科およ
びクリプトコカス科から、ピキア、カンヂダ、ハンセヌ
ラ、トルロプシス、クルイベロミセス、そしてサツカロ
ミセスを含みそれに限定されない他の酵母種に拡張され
得ることは自明であろう。

以下の実施例は本発明を説明するが、それだけに限定す
るものではない。以下の実施例中に指摘されている参考
例の開示はここに参考として取り入れられている。

実施例　Ｉ ＨＢＶ　ＤＮＡのｐＢＲ３２２中へのクローニングＨＢ
Ｖゾーン粒子（血清シル）がヒト血漿（キャリア）から
単離精製され、ランダース（Ｌａｎｄｅｒｓ）ほか、［
ジャーナル　イン　ピロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）　、第２３巻、３６８−３７６頁、１９７７年］お
よびルスヵ（Ｈｒｕｓｋａ）ほか、［ジャーナル　イン
　ピロロジー、第２１巻。

１９７７年］の方法に従ってゾーン粒子中の内在性ポリ
メラーゼにより２本鎖ＤＮＡが合成された。ＤＮＡは、
ＳＯ３中でプロティナーゼに消化後フェノール／クロロ
フォルム抽出およびエタノール沈殿を経て単離された。

該ＨＢＶゲノム性ＤＮＡは陸ＲＩで消化され、単一の３
．２ｋｂｐ断片を生成し、ｐＢＲ３２２の…ＲＩ部位に
クローン化された。ＨＢＶ　　ＤＮＡの存在は…ＲＩ消
化、ニトロセルロースへのサザン　トランスファーそし
て［３２ｐｌ−標識特異オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションにより確認された。このプラ
スミドはｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１とされる（第１図）。

実施例　２ ブレＳ２＋Ｓ遺伝子のｐＧＡＰ−ｔＡＤＨ−２発現ベク
ター中へのクローニング 第１図に示されるように、プラスミドＰＨＢＶ／ＡＤＷ
−１（実施例１に記載された）がＥｃｏＲＩおよびＡｃ
ｃＩにより消化され、０．８　ｋｂｐ断片が調製用アガ
ロースゲル電気泳動により精製された。

ブレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの５′部分を再構築するために
、…ＲＩ部位上流のＡＴＧに至るＯＲＦから、■庭ＩＩ
Ｉ末端に至る１０ｂｐ　　ＮＴＬ配列までを再構築する
オリゴヌクレオチドペアが合成された。このオリゴヌク
レオチドの配列は：ＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡ
ＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＣ
ＡＣＣＴＴＡＡである。

プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの３′部分を再構築するために
、ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネータ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ
ターミナスまでのＯＲＦを再構築するオリゴヌクレオチ
ドペアが合成された。このオリゴ９Ｉ：＋ ヌクレオチドの配列は二 ＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡ ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＡ である。

ｐＢＲ３２２中に、ＧＡＰ４９１プロモーター［ホーラ
ンド（Ｈａ　ｌ　１ａｎｄ）ほか、ジャーナル　インバ
イオロジカル　ケミストリー　第２５５巻、２５９６頁
、１９８０年］とＡＤ旧転写ターミネータ−を含むプラ
スミドｐＧＡＰ−ｔＡＤＨ−２（第１図参照）は、唯一
のＨｉｎｄＩＩＩクローン化部位を有し上部位上述のプ
レＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦが連結され、ｐＥＧＣ−１（第１
図）をもたらした。

ＨＢｓＡｇ　　ＤＮＡの存在と方向性は制限エンドヌク
レアーゼ解析およびサザン　プロットトランスファーに
より確認された。プレＳ２＋５ＯＲＦを含む発現カセッ
トはｐＥＧＣ−１からｓｐｈ　Ｉ消化により除去され、
調製用アガロースゲル電気泳動により単離された。該カ
セットはついで、（１）■で前もって消化されたシャト
ルベクターｐＧ１／１中にクローンされた。その結果で
きた発現カセットを含むプラスミドは、以下のように創
られたＳ、セレビシー１−ＣＦ４２株（ＭＡＴａ／ｃｘ
、ａｄｅｌ　Ｉｅｕ２−０４、■す）を形質転換するの
に用いられた。

酵母２１５０−２−３株（ワシントン大学り、ハートウ
ェルの供与）　ｕｒａ３変異が選択された。（ボークは
か、前出）。出来た株 （ＭＡＴａ、　ａｄｅｌ、　１ｅｕ２−０４、ｕｒａ３
、…０）はプラスミドＹＣ：ｐ５０・ＨＯで形質転換す
ることにより倍数化された。倍数体株はプラスミドをキ
ュアされＣＦ４２（ＭＡＴａ／α、ａｄｅｌ、１ｅｕ２
−０４、旺す）と命名された。

クローンが選択され、実施例３に記載されたような評価
のために凍結保存試料（１７％グリセロール中）として
確立された。

実施例　３ 生育とプレＳ２＋Ｓ遺伝子の発現 実施例２に記載された発現ベクターを含む酵母のクロー
ンは０．２−０．３ｍｌ　　Ｈ２０中に懸濁され、ロイ
シン欠選択寒天平板上に展開され、３０°で２−３日イ
ンキュベートされた。これら酵母は５−７　ｍ　ｌの複
合ＹＥＨＤ培地に植菌され３０°で通気のもとで１２−
１８時間インキュベートされた。５０ｍ１の複合ＹＥＨ
Ｄ培地を含むフラスコが上述の培養物を１：２５希釈で
植菌され、３０℃で振＠（３５０ｒｐｍ）しつつ最終Ａ
６００が１０．０−１６．０になるまで４８−７２時間
インキュベートされた。１０　　Ａ６００単位の２つの
試料が試験管中に分は採られ酵母細胞は２０００ｘｇ　
　１０分間遠心でベレット化された。該ペレットは２ｍ
Ｍのフェニルメチル　スルフォニル　フルオダイドを含
む０　、４　ｍ　ｌの燐酸−緩衝生理食塩水中に懸濁さ
れ、１．５ｍ見のエッペンドルフ試験管に移された。酵
母細胞は、−２００−３００ｍ　ｇの洗浄したガラス　
ビーズ（０，４５ｍｍ）を加えポルテックス　ミキサー
で５−１５分攪拌することにより破壊された。細胞破片
およびガラス　ビーズは２０００ｘｇ　　１０分の遠心
により除去された。清澄化された上清か除かれ蛋白質［
ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）ほか、ジャーナル　イン　バイ
オロジカル　ケミストリー、第１９３巻、２６５頁、１
９５１年］ならびにプレＳ２＋Ｓに特異的なラジオイム
ノアッセイ［ハンソン（ＨａｎＳｓｏｎ）ほか、インフ
ェクチブ　イ　ムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ＋ｗ
ｎｏ＋、）第２６巻、１２５−１３０頁、１９７９年、
マチダ（Ｍａｃｈｉｄａ）ほか、ガストロエンテロロジ
ー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）第８６＠、９
１０−９１８頁、１９８４年］の検定にかけられた。発
現の程度は、プラスミドｐＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／
１９Ｔで形質転換した親酵母で得られたものの４−５倍
高いと評価された（第１表）。

第１表　　　゛ 異なる発現プラスミドを用いた酵母中でのプレＳ２＋Ｓ
の発現 プラスミド　　　　２１５０−２−３　　　　　　ＣＦ
４２ＰＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−Ｉ　　　　　　ＮＤＣ５，Ｂ
ａ　　清澄化した酵母細胞抽出物（クニスケルンほか、
前出）は、ラヂオイムノアッセイによるプレＳ２＋Ｓ抗
原および蛋白質含有量について検定された。各クローン
は培養され、溶解され、２つの試料について測定された
。相対値は８回の体積当りの生産性決定値の平均を示す
。

ｂ　　この形質転換体については、ＪＬｇ抗原／ｍｇ蛋
白質の生産性レベルが相対値１．０と標準化された。

ｃ　　　ＮＤ＝検定せず 酵母細胞は記載された（ワンブラーはか、前出）ように
培養されホロウ　ファイバー膜をもつアミコン（Ａｍｉ
ｃｏｎ）Ｄ　Ｃ３０を用いる濾過により収穫された。収
穫された細胞は利用するまで−７０００で凍結された。

プレＳ２＋Ｓポリペプチドを発現している凍結細胞は融
解され１０ｍＭエチレンデアミンチトラアセチックアシ
ド、１０ｍＭペンズアミヂン塩酸、１　ｍ　ｃ　ｇ　／
　ｍ　ＬペプスタチンＡ、０．１３）リプシン　インヒ
ビター単位／ｍ、Ｑとアプロチニンを含む０．１Ｍ　　
ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，５中に再懸濁された。破壊の
直前に、フェニルメチルスルフォニルフルオダイド（２
−プロパツール中２００ｍＭ）が最終濃度２ｍＭに添加
され、細胞はスタンステッド（Ｓｔａｎｓｔｅａ）プレ
ス（ワシントン特別［５”エネルギーサービス社（Ｅｎ
ｅｒｇｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｃａｒｐ、））を３回通
過することにより破壊され、酵母細胞溶菌液をもたらし
た。細胞破片はＰＥＧ　　３３５０とデキストランＴ５
００との間の２層抽出により除去された。

プレＳ２＋Ｓ抗原を含む上方のＰＥＧ層が回収され、以
前に記載された［ワンブラー（Ｗａｍｐｌｅｒ）ほか、
チャノックとラーナー（Ｇｈａｎｏｃｋ　ａｎｄ　Ｌｅ
ｒｎｅｒ）編：“モダーン　アプロチニン２ ズ（Ｍｏｄｅｒｒ＋　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖ
ａｃｃｉｎｅＳ）”、コールド　スプリング　ハーバ−
（Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）ニューヨー
ク、コールド　スプリング　ハーバ−プレス、２５１−
２５６頁、１９８４年］ように抗原は免疫アフィニチー
クロマトグラフィーにより単離された。残留するヤギＩ
ｇＧは、濃縮した抗原を３Ｍ　　ＮＨ４３ＧＮおよび０
　、５Ｍ　　Ｍａｉｌを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ
７、２で平衡化した２　、６Ｘ２８　ｃｍのセファクリ
ル８４００カラムを通すことにより除かれた。ＮＨ４Ｓ
ＣＮは燐酸緩衝生理食塩水にだいしダイアフィルター処
理することにより除かれた。精製されたプレＳ２＋Ｓ抗
原はｉｎ　ｖｉｖｏのテストのために水酸化アルミナに
吸着された。

【図面の簡単な説明】

第１図はプレＳ　２＋Ｓ発現プラスミド、ｐＹＧｐｒｅ
Ｓ２＋１の調製方法を模式化して示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サッカロミセス科またはクリプトコカス科から由来
   する酵母種中で選択および増幅するための酵母由来の配
   列、酵母プロモーター、最適化された５′非翻訳リーダ
   ー、プレＳ２＋Ｓコード領域、酵母転写終結配列、最適
   化された５′非翻訳リーダー末端に隣接する酵母プロモ
   ーターの３′末端およびプレＳ２＋Ｓコード領域の開始
   コドンに隣接する最適化された非翻訳リーダーの３′末
   端配列を含むプラスミド発現ベクター。 ２、プレＳ２＋Ｓコード領域の終結コドンが酵母転写終
   結配列に隣接する、請求項１によるベクター。 ３、最適化された５′非翻訳リーダーが、高度に発現さ
   れるまたは過剰に発現される生来の酵母遺伝子から選択
   されている、請求項１によるベクター。 ４、高度に発現されるまたは過剰に発現される酵母生来
   の遺伝子がグリセロアルデヒド燐酸デヒドロゲナーゼ遺
   伝子である、請求項３によるベクター。 ５、５′非翻訳リーダーがＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡであ
   る、請求項４によるベクター。 ６、サッカロミセス科またはクリプトコカス科に由来す
   る、請求項１のベクターを含む酵母種。 ７、種がサッカロミセス属からのものである請求項６に
   よる酵母種。 ８、種がサッカロミセスセレビシエである、請求項７に
   よる酵母種。 ９、種がＳ．セレビシエＣＦ４２株である、請求項８に
   よる酵母種。 １０、請求項１のプラスミド発現ベクターを含むサッカ
   ロミセス科またはクリプトコカス科からの酵母種および
   当該酵母から発現されたプレＳ２＋Ｓポリペプチドの組
   成物。 １１、種がサッカロミセス属からのものである、請求項
   １０による組成物。 １２、種がサッカロミセスセレビシエである、請求項１
   １による組成物。 １３、種がＳ．セレビシエＣＦ４２株である、請求項１
   ２による組成物。 １４、ａ、サッカロミセス科またはクリプトコカス科か
   ら選択された株の細胞を請求項１のプラスミド発現ベク
   ターで形質転換する、 ｂ、形質転換細胞を培養する、そして ｃ、培養後の細胞または生育培地より該ペプチドを回収
   する ことからなるプレＳ２＋Ｓポリペプチドを得る方法。 １５、種がサッカロミセス属からのものである、請求項
   １３による方法。 １６、種がＳ．セレビシエである、請求項１４による方
   法。 １７、種がＳ．セレビシエＣＦ４２株である、請求項１
   ５による方法。 １８、請求項１０のポリペプチドを生理的に受容可能な
   希釈液中に含むワクチン。 １９、請求項１０のポリペプチドを含む診断試薬。