JP2603312B2 - 酵母中でｂ型肝炎ウイルス蛋白質を生産するための方法 - Google Patents
酵母中でｂ型肝炎ウイルス蛋白質を生産するための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）は種種のヒト肝臓病の原因
となる感染因子である。HBVの感染した多くの個体は病
気の急性期を経て回復に至る。しかし、多数の個体では
感染を除去することができず慢性のキャリアとなる。HB
V感染は世界の多くの地域で風土病となっており、周産
期に慢性的に感染している母親から新生児に高頻度に感
染する。世界の慢性キャリアの数は３億以上と算定され
ている。このキャリアの中から年間数十万が慢性Ｂ型肝
炎感染後長期間の経過後に肝硬変または肝細胞癌に至り
死亡する。
となる感染因子である。HBVの感染した多くの個体は病
気の急性期を経て回復に至る。しかし、多数の個体では
感染を除去することができず慢性のキャリアとなる。HB
V感染は世界の多くの地域で風土病となっており、周産
期に慢性的に感染している母親から新生児に高頻度に感
染する。世界の慢性キャリアの数は３億以上と算定され
ている。このキャリアの中から年間数十万が慢性Ｂ型肝
炎感染後長期間の経過後に肝硬変または肝細胞癌に至り
死亡する。
HBビリオンは２群の構造蛋白質、コア蛋白質および外
皮または表面（“S"蛋白質からなる。“S"蛋白質は、ビ
リオンすなわちデーン（Dane）粒子の主要表面蛋白質で
あるのに加えて、オーストラリア抗原あるいは22nm粒子
の唯一の成分である。該“S"蛋白質は389アミノ酸をコ
ードする大開放読み取り枠（ORF）の翻訳産物である。
このORFは、各々細胞内で翻訳開始部位として機能する
ことのできるATGコドンで始まる３つのドメインに分離
される。これらドメインは、それぞれ遺伝子中で５′−
３′の順序で、プレS1（108アミノ酸）、プレS2（55ア
ミノ酸）およびＳ（226アミノ酸）とされる。従って、
これらドメインはＳまたはHBsAg［226アミノ酸（a
a）］、プレS2＋Ｓ（281aa）、およびプレS1＋プレS2＋
Ｓ（389aa）とされる３種のポリペプチドを規定する。
現在入手可能な血漿由来のワクチンは実質的にＳドメイ
ンのみを含む蛋白質からなっており、一方今日までに成
功裡に開発された酵母由来のワクチンは専らＳポリペプ
チドからなている。
皮または表面（“S"蛋白質からなる。“S"蛋白質は、ビ
リオンすなわちデーン（Dane）粒子の主要表面蛋白質で
あるのに加えて、オーストラリア抗原あるいは22nm粒子
の唯一の成分である。該“S"蛋白質は389アミノ酸をコ
ードする大開放読み取り枠（ORF）の翻訳産物である。
このORFは、各々細胞内で翻訳開始部位として機能する
ことのできるATGコドンで始まる３つのドメインに分離
される。これらドメインは、それぞれ遺伝子中で５′−
３′の順序で、プレS1（108アミノ酸）、プレS2（55ア
ミノ酸）およびＳ（226アミノ酸）とされる。従って、
これらドメインはＳまたはHBsAg［226アミノ酸（a
a）］、プレS2＋Ｓ（281aa）、およびプレS1＋プレS2＋
Ｓ（389aa）とされる３種のポリペプチドを規定する。
現在入手可能な血漿由来のワクチンは実質的にＳドメイ
ンのみを含む蛋白質からなっており、一方今日までに成
功裡に開発された酵母由来のワクチンは専らＳポリペプ
チドからなている。
該22nm粒子、またはHB表面抗原（HBsAg）粒子は慢性
キャリアの血漿から精製されてきた。その血漿が粒子慢
性であるが故にこれらキャリアはHBs+と参照される。こ
れらキャリアが十分な免疫反応を与えれば感染を解除す
ることができHBs-となる。彼らがHBsにたいする抗体を
形成することから、これら個体は抗−HBs+と表示され
る。このように、抗−HBs+は病気からの回復と関連す
る。したがって、HBワクチンによる抗−HBs+の促進ある
いは形成はHBV感染にたいする防御を与えると期待され
てきた。
キャリアの血漿から精製されてきた。その血漿が粒子慢
性であるが故にこれらキャリアはHBs+と参照される。こ
れらキャリアが十分な免疫反応を与えれば感染を解除す
ることができHBs-となる。彼らがHBsにたいする抗体を
形成することから、これら個体は抗−HBs+と表示され
る。このように、抗−HBs+は病気からの回復と関連す
る。したがって、HBワクチンによる抗−HBs+の促進ある
いは形成はHBV感染にたいする防御を与えると期待され
てきた。
この仮説は実験的に検討可能である。ヒト以外では、
HBs+のような定量可能な指標、および血清中の肝臓酵素
レベルの上昇に反映されるようにHBV感染に完全に感受
性な種はチンパンジーのみである。チンパンジーを３回
投与量の精製HBsAg粒子でワクチン処理し、ついで大量
の感染性HBVを与えた。偽−ワクチン処理した動物は急
性HBV感染の兆候を示したが、HBsAg−ワクチン処理した
動物は感染の如何なる兆候からも保護されていた。従っ
てこの実験系で、gp27およびp24（Ｓドメインのみ）か
らなるHBsAg粒子は保護免疫を誘起するのに十分であっ
た。これらの観察に刺激されて、いくつかの製造者がHB
sAg粒子からなるHBワクチンを生産した。
HBs+のような定量可能な指標、および血清中の肝臓酵素
レベルの上昇に反映されるようにHBV感染に完全に感受
性な種はチンパンジーのみである。チンパンジーを３回
投与量の精製HBsAg粒子でワクチン処理し、ついで大量
の感染性HBVを与えた。偽−ワクチン処理した動物は急
性HBV感染の兆候を示したが、HBsAg−ワクチン処理した
動物は感染の如何なる兆候からも保護されていた。従っ
てこの実験系で、gp27およびp24（Ｓドメインのみ）か
らなるHBsAg粒子は保護免疫を誘起するのに十分であっ
た。これらの観察に刺激されて、いくつかの製造者がHB
sAg粒子からなるHBワクチンを生産した。
最近、いつくかの独立した系の証拠がプレＳ配列がHB
Vにたいする免疫に重要であるかも知れないことを示唆
している。ビールス感染の過程でプレ抗原が免疫的に消
失することはビールスの除去および感染の解除の前兆と
思われる［ブドコウスカ（Budkowska）ほか、アナーレ
ド アンスチツート パスツール／イムノロジー（An
n.Inst.Past./Immn.）第136D巻、56−65頁、1985年］。
急性Ｂ型肝炎の間、プレＳにたいする抗体がしばしばＳ
にたいする抗体より早く生じる［プチ（Petit）ほか、
モレキュラー イムノロジー（Mol.Immn.）第23巻、511
−523頁、1986年］。近親交配マウスにおいて、Ｓおよ
びプレＳにたいする免疫応答は独立に制御されているよ
うであり、プレＳの存在はＳにたいする免疫応答に影響
する［ミリヒ（Milich）ほか、プロシージングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンセズ
米国（proc.Nat.Acad.Sci.USA）第82巻、8168−8172
頁、1985年、ジャーナル オブ イムノロジー（J.Immn
ol.）第137巻、315−322頁、1986年；ノイラス（Neurat
h）ほか、ジャーナル オブ メヂカル ビロロジー
（J.Med.Virol.）第17巻、119−125頁、1985年］。さら
にプレＳ抗体は試験管内でビールスの感染性を中和［ノ
イラス（Neurath）ほか、ワクチン（Vaccine）第４巻、
35−37頁、1986年］し、プレＳ抗原は免疫したチンパン
ジーを防御する［イトー（Itoh）ほか、プロシージング
ス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンセズ 米国、第83巻、9174−9178頁、1986年］。これ
らの観察を基に、またHBワクチン生産における組換え体
酵母の有用性の故に［ヒルマン（Hilleman）ほか、ワク
チン、第４巻、75−76頁、1986年］、我々は、組換え体
S.セレビシエ（S.cerevisiae）から実験的なプレーＳ含
有HBワクチンを処方した。
Vにたいする免疫に重要であるかも知れないことを示唆
している。ビールス感染の過程でプレ抗原が免疫的に消
失することはビールスの除去および感染の解除の前兆と
思われる［ブドコウスカ（Budkowska）ほか、アナーレ
ド アンスチツート パスツール／イムノロジー（An
n.Inst.Past./Immn.）第136D巻、56−65頁、1985年］。
急性Ｂ型肝炎の間、プレＳにたいする抗体がしばしばＳ
にたいする抗体より早く生じる［プチ（Petit）ほか、
モレキュラー イムノロジー（Mol.Immn.）第23巻、511
−523頁、1986年］。近親交配マウスにおいて、Ｓおよ
びプレＳにたいする免疫応答は独立に制御されているよ
うであり、プレＳの存在はＳにたいする免疫応答に影響
する［ミリヒ（Milich）ほか、プロシージングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンセズ
米国（proc.Nat.Acad.Sci.USA）第82巻、8168−8172
頁、1985年、ジャーナル オブ イムノロジー（J.Immn
ol.）第137巻、315−322頁、1986年；ノイラス（Neurat
h）ほか、ジャーナル オブ メヂカル ビロロジー
（J.Med.Virol.）第17巻、119−125頁、1985年］。さら
にプレＳ抗体は試験管内でビールスの感染性を中和［ノ
イラス（Neurath）ほか、ワクチン（Vaccine）第４巻、
35−37頁、1986年］し、プレＳ抗原は免疫したチンパン
ジーを防御する［イトー（Itoh）ほか、プロシージング
ス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンセズ 米国、第83巻、9174−9178頁、1986年］。これ
らの観察を基に、またHBワクチン生産における組換え体
酵母の有用性の故に［ヒルマン（Hilleman）ほか、ワク
チン、第４巻、75−76頁、1986年］、我々は、組換え体
S.セレビシエ（S.cerevisiae）から実験的なプレーＳ含
有HBワクチンを処方した。
入手可能なHBワクチ供給を増加させるために製造者は
“S"蛋白質の発現をもたらす組換え体DNA技術に目を向
けた。微生物システムの中で、エシェリシア コリ（Es
cherichia coli）およびサッカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）が多くの組換え体由来蛋
白質の発現のために最も普通に用いられてきた。E.コリ
（E.coli）中で免疫的に活性なHBsAg粒子を発現しよう
とする多くの試みは成功していない。しかし、S.セレビ
シエは免疫的に活性なHBsAg粒子発現に非常に有能であ
ることを示した。
“S"蛋白質の発現をもたらす組換え体DNA技術に目を向
けた。微生物システムの中で、エシェリシア コリ（Es
cherichia coli）およびサッカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）が多くの組換え体由来蛋
白質の発現のために最も普通に用いられてきた。E.コリ
（E.coli）中で免疫的に活性なHBsAg粒子を発現しよう
とする多くの試みは成功していない。しかし、S.セレビ
シエは免疫的に活性なHBsAg粒子発現に非常に有能であ
ることを示した。
これら粒子は、ワクチンに処方されると、生HBVの投
与にたいしチンパンジーを完全に保護することが出来る
ことを証明した。さらに、酵母由来HBsAgはヒト臨床試
験において血漿由来HBsAgと同じに有効である免疫的に
活性なHBsAg粒子を発現する能力があることを示した
［スコルニク（Scolnick）ほか、ジャマ（JAMA）、第25
1巻、2812−2815頁、1984年］。従って、組換え体HBsAg
の合成を指示するための宿主としてのS.セレビシエの有
用性はしっかりと確立されている。さらに、酵母は内毒
素を持たず、ヒトに非感染性であり、工業的規模で発酵
させ得、そして連続哺乳類細胞系（その多くはウイルス
で形質転換しており、マウスにおいて腫瘍原性がありそ
してその全てがプロトオンコジーン（protooncogene）
に纏わる安全性の問題の多くを欠いていることから、酵
母におけるヒト治療剤およびワクチンの発現は製品開発
にとって非常に有用である。
与にたいしチンパンジーを完全に保護することが出来る
ことを証明した。さらに、酵母由来HBsAgはヒト臨床試
験において血漿由来HBsAgと同じに有効である免疫的に
活性なHBsAg粒子を発現する能力があることを示した
［スコルニク（Scolnick）ほか、ジャマ（JAMA）、第25
1巻、2812−2815頁、1984年］。従って、組換え体HBsAg
の合成を指示するための宿主としてのS.セレビシエの有
用性はしっかりと確立されている。さらに、酵母は内毒
素を持たず、ヒトに非感染性であり、工業的規模で発酵
させ得、そして連続哺乳類細胞系（その多くはウイルス
で形質転換しており、マウスにおいて腫瘍原性がありそ
してその全てがプロトオンコジーン（protooncogene）
に纏わる安全性の問題の多くを欠いていることから、酵
母におけるヒト治療剤およびワクチンの発現は製品開発
にとって非常に有用である。
従って、酵母においてプレS2＋Ｓを免疫原性のある粒
子として効果的に高収率で発現させるための発現ベクタ
ーおよび方法を与えることが本発明の目的である。本発
明の他目的は、該ポリペプチドの精製のためにプレS2＋
Ｓの最高収率がより大容量でより高濃度で得られるよう
に、そのように最適化されたベクターで形質転換された
組換え体宿主細胞の生育の大規模化のための条件を特定
することである。本発明のこれらおよび他の目的は以下
の記載から明らかになろう。
子として効果的に高収率で発現させるための発現ベクタ
ーおよび方法を与えることが本発明の目的である。本発
明の他目的は、該ポリペプチドの精製のためにプレS2＋
Ｓの最高収率がより大容量でより高濃度で得られるよう
に、そのように最適化されたベクターで形質転換された
組換え体宿主細胞の生育の大規模化のための条件を特定
することである。本発明のこれらおよび他の目的は以下
の記載から明らかになろう。
プレS2＋Ｓ遺伝子が酵母中で最適化された高収率で発
現された。発現した蛋白質は、血漿由来のプレS2＋Ｓに
よりコードされる主要抗原部位を表現する微粒状に凝集
し、それによりこの遺伝子の発現に酵母が有用であるこ
とを明らかにした。この蛋白質は試験管内診断システム
に、そしてHBVによりひきおこされる感染の回避のため
のワクチンとして有用である。
現された。発現した蛋白質は、血漿由来のプレS2＋Ｓに
よりコードされる主要抗原部位を表現する微粒状に凝集
し、それによりこの遺伝子の発現に酵母が有用であるこ
とを明らかにした。この蛋白質は試験管内診断システム
に、そしてHBVによりひきおこされる感染の回避のため
のワクチンとして有用である。
本発明は酵母種におけるプレS2＋Ｓの発現のための方
法を意図したものである。
法を意図したものである。
プレS2＋Ｓの開放読み取り枠（ORF）単離のためのHBV
核酸原としてデーン（Dane）粒子が用いられる。HBビリ
オン中に生来存在するニックおよびギャップのある核酸
形からHBVゲノムの共有結合で閉環し２本鎖DNAを生産す
るために内在性のポリメラーゼ反応が用いられる。該DN
Aが単離され、制限酵素EcoR Iで完全消化され、プラス
ミドpBR322のEcoR I部位にクローン化されプラスミドpH
BV/ADW−１を生成する。このように創られたプラスミド
は、プレＳ領域のEcoR I部位でHBVゲノムを環状に入れ
換えた形で含むものが選択される。プレS2領域の55アミ
ノ酸およびＳ領域の226アミノ酸をコードする完全ORFは
先ずpHBV/ADW−１をEcoR IおよびAcc Iで消化して得ら
れた0.8キロ塩基対（kbp）断片を精製することにより構
築された。この断片は、開始コドン、アミノ末端３アミ
ノ酸、カルボキシル末端３アミノ酸および翻訳終結コド
ンのみを欠くプレS2＋Ｓポリペプチドをコードする。オ
リゴヌクレオチドが合成されこの断片に連結されて、こ
の断片を10bpの酵母由来の非翻訳５′隣接配列および完
全プレS2＋Ｓ ORFを含むHind III断片に変換した。外
来遺伝子HBVプレS2＋Ｓ生産のための高収率の発現系が
この発明の最初の目的である。発現ベクター（特にプロ
モーターおよび翻訳ターミネータ（終結情報））と挿入
されたORFとの相互作用によって、酵母宿主細胞中で最
も高レベルでの外来遺伝子産物が得られる。発現された
外来蛋白質産物の全酵母細胞蛋白質に対するこの割合が
“比活性”と参照される。最初の比活性が高いと、高純
度、高効率でそして同時にヒトワクチンとして高い安全
性を有する産物として、迅速にそして経済的に単離する
ことが可能となる。
核酸原としてデーン（Dane）粒子が用いられる。HBビリ
オン中に生来存在するニックおよびギャップのある核酸
形からHBVゲノムの共有結合で閉環し２本鎖DNAを生産す
るために内在性のポリメラーゼ反応が用いられる。該DN
Aが単離され、制限酵素EcoR Iで完全消化され、プラス
ミドpBR322のEcoR I部位にクローン化されプラスミドpH
BV/ADW−１を生成する。このように創られたプラスミド
は、プレＳ領域のEcoR I部位でHBVゲノムを環状に入れ
換えた形で含むものが選択される。プレS2領域の55アミ
ノ酸およびＳ領域の226アミノ酸をコードする完全ORFは
先ずpHBV/ADW−１をEcoR IおよびAcc Iで消化して得ら
れた0.8キロ塩基対（kbp）断片を精製することにより構
築された。この断片は、開始コドン、アミノ末端３アミ
ノ酸、カルボキシル末端３アミノ酸および翻訳終結コド
ンのみを欠くプレS2＋Ｓポリペプチドをコードする。オ
リゴヌクレオチドが合成されこの断片に連結されて、こ
の断片を10bpの酵母由来の非翻訳５′隣接配列および完
全プレS2＋Ｓ ORFを含むHind III断片に変換した。外
来遺伝子HBVプレS2＋Ｓ生産のための高収率の発現系が
この発明の最初の目的である。発現ベクター（特にプロ
モーターおよび翻訳ターミネータ（終結情報））と挿入
されたORFとの相互作用によって、酵母宿主細胞中で最
も高レベルでの外来遺伝子産物が得られる。発現された
外来蛋白質産物の全酵母細胞蛋白質に対するこの割合が
“比活性”と参照される。最初の比活性が高いと、高純
度、高効率でそして同時にヒトワクチンとして高い安全
性を有する産物として、迅速にそして経済的に単離する
ことが可能となる。
挿入された外来遺伝子ORF（HBVプレS2＋Ｓ）を含むこ
の酵母発現ベクター［GAP491（グリセロアルデヒド燐酸
デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびADH1（アルコー
ルデヒドロゲナーゼ）転写ターミネーターからなる］の
構築において以下の論法が適用された。高度に発現され
る天然酵母蛋白質をコードする遺伝子においては進化的
に最適化が生じているはずであると推論された。従っ
て、そのような遺伝子の５′および３′隣接領域から得
られた共通配列または特異配列は、転写速度、メッセー
ジの安定性、そして翻訳速度を高めることにより、外来
遺伝子の発現にも最適である筈である。
の酵母発現ベクター［GAP491（グリセロアルデヒド燐酸
デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびADH1（アルコー
ルデヒドロゲナーゼ）転写ターミネーターからなる］の
構築において以下の論法が適用された。高度に発現され
る天然酵母蛋白質をコードする遺伝子においては進化的
に最適化が生じているはずであると推論された。従っ
て、そのような遺伝子の５′および３′隣接領域から得
られた共通配列または特異配列は、転写速度、メッセー
ジの安定性、そして翻訳速度を高めることにより、外来
遺伝子の発現にも最適である筈である。
プレS2＋Ｓ ORFの３′側配列が選択され、ADH1転写
ターミネーター中にある天然のHind III部位に直接結合
され、その結果介在塩基の付加のない完全な天然の酵母
由来の連結部を生み出すこととなった。当業者にとって
は、プレS2＋Ｓ（または他の外来遺伝子）の最適化され
た高レベルでの発現のために、どのような適当な酵母転
写ターミネーターでもADH1と置き換え得ることは自明で
ある。最適な構築のための５′隣接配列（ACAAAACAAA
A）が高度に発現されるグリセロアルデヒド−３−燐酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子GAP63）［ホーランド（Hollan
d）ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（J.Biol.Chem.）第225巻、2596頁、1980年］の非翻訳
リーダー（non−translated leader（NTL））のための
ものに対応するように選択された。この配列はGAP遺伝
子ファミリーにとっても共通である。この構築は、如何
なる介在塩基も付加しないようにプレS2＋Ｓ ORFの開
始コドンに直接NTLを連結するような方式でなされた。
従って、当業者にとって、プレS2＋Ｓ ORFの最適化し
た高レベル発現のためには、非翻訳リーダー配列の選択
はGAP491、GAP11、エノラーゼ、ADH1、ADH2、PHO5、お
よび類似のものを含むがそれに限定されない他の高度に
発現される酵母遺伝子にまで拡張されることは自明であ
る。
ターミネーター中にある天然のHind III部位に直接結合
され、その結果介在塩基の付加のない完全な天然の酵母
由来の連結部を生み出すこととなった。当業者にとって
は、プレS2＋Ｓ（または他の外来遺伝子）の最適化され
た高レベルでの発現のために、どのような適当な酵母転
写ターミネーターでもADH1と置き換え得ることは自明で
ある。最適な構築のための５′隣接配列（ACAAAACAAA
A）が高度に発現されるグリセロアルデヒド−３−燐酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子GAP63）［ホーランド（Hollan
d）ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（J.Biol.Chem.）第225巻、2596頁、1980年］の非翻訳
リーダー（non−translated leader（NTL））のための
ものに対応するように選択された。この配列はGAP遺伝
子ファミリーにとっても共通である。この構築は、如何
なる介在塩基も付加しないようにプレS2＋Ｓ ORFの開
始コドンに直接NTLを連結するような方式でなされた。
従って、当業者にとって、プレS2＋Ｓ ORFの最適化し
た高レベル発現のためには、非翻訳リーダー配列の選択
はGAP491、GAP11、エノラーゼ、ADH1、ADH2、PHO5、お
よび類似のものを含むがそれに限定されない他の高度に
発現される酵母遺伝子にまで拡張されることは自明であ
る。
DNA配列の解析の結果、プラスミドpHBpreSGAP347/19T
（ヨーロッパ特許出願第0174444号中でpHBpreS56GAP347
/33と記載されている）によりコードされるプレS2＋Ｓ
配列とアミノ酸が異なることになる２塩基置換が示され
た。両構築について同一のポリペプチドで評価するため
に、これら置換、塩基64のＣの変わりにＴ（LeuでなくP
heをコードする）そして塩基352のＡの代わりにＣ（Gln
でなくHisをコードする）は、部位指定変異［ゾラー（Z
oller）ほか、ヌクレイック アシッヅ リサーチ（Nuc
leic Acids Research）第10巻、6487−6500頁、1982
年］により変えられた。最適化した構築でのコードされ
たアミノ酸配列が確認された。
（ヨーロッパ特許出願第0174444号中でpHBpreS56GAP347
/33と記載されている）によりコードされるプレS2＋Ｓ
配列とアミノ酸が異なることになる２塩基置換が示され
た。両構築について同一のポリペプチドで評価するため
に、これら置換、塩基64のＣの変わりにＴ（LeuでなくP
heをコードする）そして塩基352のＡの代わりにＣ（Gln
でなくHisをコードする）は、部位指定変異［ゾラー（Z
oller）ほか、ヌクレイック アシッヅ リサーチ（Nuc
leic Acids Research）第10巻、6487−6500頁、1982
年］により変えられた。最適化した構築でのコードされ
たアミノ酸配列が確認された。
変異処理に続いて、上述の断片は以前に記載［クニス
ケルン（Kniskern）ほか、ジーン（Gene）第46巻、135
−141頁、1986年］されたように、（ａ）GAPS491プロモ
ーターの約1050bp、（ｂ）酵母由来隣接配設10bp、
（ｃ）ウイルス隣接配列を欠いたHBVプレS2＋Ｓ遺伝子
（血清型adw）の846bpそして、（ｄ）酵母ADH1ターミネ
ーターの約350bpからなる発現カセットを構築するのに
用いられた。この発現カセットは、酵母シャトルベクタ
ーpC1/1［ベッグス（Beggs）、ネイチャー（Nature）、
第275巻、104頁、1978年；ローゼンバーグ（Rosenber
g）ほか、第312巻、77頁、1984年］中に挿入され、酵母
CF42株を形質転換するのに用いられた。（形質転換体pY
GpreS25−１を生成した）。平行した実験で、プラスミ
ドpHBpreSGAP347/19Tが同じ酵母CF42株の新鮮な形質転
換体を調製するのに用いられた（形質転換体pGpreS2S−
２を生成した）。これら形質転換体は評価ならびに以下
の実験のために凍結保存試料とされた。親株CF42は以下
のように得られた：酵母2150−２−３株（ワシントン大
学のL.ハートウエル（L.Hartwell）からの供与）の自然
Ura３変異が選択された（ボーク（Boeke）ほか、モレキ
ュラー ジェネラル ジェネチックス（Mol.Gen.Gent）
第197巻、345〜346頁、1984年）。得られた菌株（MAT
ａ、ade１、leu２−04、Ura３、cir ０）はプラスミドYC
p50−HOで形質転換することにより倍数化された［ジェ
ンセン（Jensen）ほか、プロシージングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンセズ（P.N.A.
S.）米国（USA）、第80巻、3035−3039頁、1983年］。
機能している酵母HO遺伝子により細胞の結合型が変換す
る。従って、一つの細胞の形質転換体からの子孫は結合
型“a"および“α”両方の混合物であり集落形成の間に
接合する。２媒体のクローン分離体はプラスミドでキュ
アされ、CF42（MATa/α、ade１、leu２−04、ura３）と
命名された。これら形質転換体は評価ならびに以下の実
験のために凍結保存試料とされた。
ケルン（Kniskern）ほか、ジーン（Gene）第46巻、135
−141頁、1986年］されたように、（ａ）GAPS491プロモ
ーターの約1050bp、（ｂ）酵母由来隣接配設10bp、
（ｃ）ウイルス隣接配列を欠いたHBVプレS2＋Ｓ遺伝子
（血清型adw）の846bpそして、（ｄ）酵母ADH1ターミネ
ーターの約350bpからなる発現カセットを構築するのに
用いられた。この発現カセットは、酵母シャトルベクタ
ーpC1/1［ベッグス（Beggs）、ネイチャー（Nature）、
第275巻、104頁、1978年；ローゼンバーグ（Rosenber
g）ほか、第312巻、77頁、1984年］中に挿入され、酵母
CF42株を形質転換するのに用いられた。（形質転換体pY
GpreS25−１を生成した）。平行した実験で、プラスミ
ドpHBpreSGAP347/19Tが同じ酵母CF42株の新鮮な形質転
換体を調製するのに用いられた（形質転換体pGpreS2S−
２を生成した）。これら形質転換体は評価ならびに以下
の実験のために凍結保存試料とされた。親株CF42は以下
のように得られた：酵母2150−２−３株（ワシントン大
学のL.ハートウエル（L.Hartwell）からの供与）の自然
Ura３変異が選択された（ボーク（Boeke）ほか、モレキ
ュラー ジェネラル ジェネチックス（Mol.Gen.Gent）
第197巻、345〜346頁、1984年）。得られた菌株（MAT
ａ、ade１、leu２−04、Ura３、cir ０）はプラスミドYC
p50−HOで形質転換することにより倍数化された［ジェ
ンセン（Jensen）ほか、プロシージングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンセズ（P.N.A.
S.）米国（USA）、第80巻、3035−3039頁、1983年］。
機能している酵母HO遺伝子により細胞の結合型が変換す
る。従って、一つの細胞の形質転換体からの子孫は結合
型“a"および“α”両方の混合物であり集落形成の間に
接合する。２媒体のクローン分離体はプラスミドでキュ
アされ、CF42（MATa/α、ade１、leu２−04、ura３）と
命名された。これら形質転換体は評価ならびに以下の実
験のために凍結保存試料とされた。
上記凍結保存資料からの組換え体酵母はYEHD培地中で
生育された。定常期まで生育の後、酵母細胞は収穫さ
れ、溶菌液が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム、ゲル
電気泳動（SDS−PAGE）で解析されそしてHBsAgに対する
抗体でイムノブロットされた。プレS2＋Ｓ ORFの翻訳
産物の予想された分子量およびその糖鎖付加誘導体と一
致して分子量30−および34−キロダルトン（kD）を示す
２つの主要ポリペプチドが認められた。さらに、組換体
の溶菌液はラジオイムノアッセイによりプレS2＋Ｓ陽性
であったが親株溶菌液は陰性だった。部分的に精製され
た酵母溶菌液を電子顕微鏡で観察すると高密度の典型的
な22nmプレS2＋Ｓ粒子が示される。
生育された。定常期まで生育の後、酵母細胞は収穫さ
れ、溶菌液が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム、ゲル
電気泳動（SDS−PAGE）で解析されそしてHBsAgに対する
抗体でイムノブロットされた。プレS2＋Ｓ ORFの翻訳
産物の予想された分子量およびその糖鎖付加誘導体と一
致して分子量30−および34−キロダルトン（kD）を示す
２つの主要ポリペプチドが認められた。さらに、組換体
の溶菌液はラジオイムノアッセイによりプレS2＋Ｓ陽性
であったが親株溶菌液は陰性だった。部分的に精製され
た酵母溶菌液を電子顕微鏡で観察すると高密度の典型的
な22nmプレS2＋Ｓ粒子が示される。
酵母由来プロモーターがプレS2＋Ｓ遺伝子の転写を開
始する。従って、当業者にとっては如何なる酵母のプロ
モーターもGAP491プロモーターと置き換え得ることは自
明である。当業者にとっては、最高収率を得るために培
養を収穫する時間が最適となるように、この系における
プレS2＋Ｓポリペプチドの発現を検定するために適当な
検定システム例えばイムノブロットまたはラジオイムノ
アッセイまたは酵素結合イムノアッセイ（EIA）が利用
されるべきであることも自明である。
始する。従って、当業者にとっては如何なる酵母のプロ
モーターもGAP491プロモーターと置き換え得ることは自
明である。当業者にとっては、最高収率を得るために培
養を収穫する時間が最適となるように、この系における
プレS2＋Ｓポリペプチドの発現を検定するために適当な
検定システム例えばイムノブロットまたはラジオイムノ
アッセイまたは酵素結合イムノアッセイ（EIA）が利用
されるべきであることも自明である。
GAP491プロモーターは酵母中でHBsAgを含むいくつか
の外来性蛋白質を発現するのに有用であった［ビター
（Bitter）ほか、ジーン（Gene）、第32巻、263−274
頁、1984年、ワンプラー（Wampler）ほか、プロシーヂ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブサイ
エンセズ 米国第82巻、6830−6834年、1985年］。HBcA
gを可溶性酵母蛋白質の約40％迄発現させるという我々
の以前の結果（クニスケルン（Kniskern）ほか、前出）
に基づいて、このプロモーターからのプレS2＋Ｓ抗原の
発現を最適化しようとした。プレS2＋Ｓのための２つの
発現ベクターpYGpreS2S−１およびpHBpreSGAP347/19Tは
同一のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする。両者
は、前者が最適化した５′配列を含み、ビールス５′ま
たは３′配列および酵母のADH1転写ターミネーターを含
まないのに対し、後者は約130bpのHBV−由来の３′隣接
配列およびGAP491転写ターミネーターを含むということ
で、非翻訳隣接配列が異なっている。両方のベクターが
酵母CF42株を形質転換するのに用いられ、その形質転換
体は平行して振盪フラスコ実験で検定された。pYGpreS2
−１により形質転換された酵母中でのプレS2＋Ｓの量
は、pHBpreSGAP347/19Tによる形質転換体のものより再
現性良く４から５−倍であった。
の外来性蛋白質を発現するのに有用であった［ビター
（Bitter）ほか、ジーン（Gene）、第32巻、263−274
頁、1984年、ワンプラー（Wampler）ほか、プロシーヂ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブサイ
エンセズ 米国第82巻、6830−6834年、1985年］。HBcA
gを可溶性酵母蛋白質の約40％迄発現させるという我々
の以前の結果（クニスケルン（Kniskern）ほか、前出）
に基づいて、このプロモーターからのプレS2＋Ｓ抗原の
発現を最適化しようとした。プレS2＋Ｓのための２つの
発現ベクターpYGpreS2S−１およびpHBpreSGAP347/19Tは
同一のアミノ酸配列のポリペプチドをコードする。両者
は、前者が最適化した５′配列を含み、ビールス５′ま
たは３′配列および酵母のADH1転写ターミネーターを含
まないのに対し、後者は約130bpのHBV−由来の３′隣接
配列およびGAP491転写ターミネーターを含むということ
で、非翻訳隣接配列が異なっている。両方のベクターが
酵母CF42株を形質転換するのに用いられ、その形質転換
体は平行して振盪フラスコ実験で検定された。pYGpreS2
−１により形質転換された酵母中でのプレS2＋Ｓの量
は、pHBpreSGAP347/19Tによる形質転換体のものより再
現性良く４から５−倍であった。
開始シグナルの隣接するDNA配列［即ち５′非翻訳リ
ーダー（NTL）］は、転写速度、メッセイジの安定性そ
して翻訳速度に影響することにより遺伝子の発現程度に
重大な影響を与えると考えられる。高レベルでの発現が
生存上の有利さをもたらすことにより、天然の選択を経
た進化がおそらく本来の酵母遺伝子（たとえばグリコシ
ド酵素）の５′NTL配列を最適化した。ここに記載され
た構築のために、GAP遺伝子群の５′NTL配列から由来す
る共通NTL配列、ACAAAACAAAA、がHBVプレS2＋Ｓ ORFの
発現レベルを高め最適化するために用いられた。そして
当業者にとっては、高度に発現されている本来の酵母遺
伝子の５′NTLから由来する共通性を有するどのような
５′NTLも有用であることは自明であろう。
ーダー（NTL）］は、転写速度、メッセイジの安定性そ
して翻訳速度に影響することにより遺伝子の発現程度に
重大な影響を与えると考えられる。高レベルでの発現が
生存上の有利さをもたらすことにより、天然の選択を経
た進化がおそらく本来の酵母遺伝子（たとえばグリコシ
ド酵素）の５′NTL配列を最適化した。ここに記載され
た構築のために、GAP遺伝子群の５′NTL配列から由来す
る共通NTL配列、ACAAAACAAAA、がHBVプレS2＋Ｓ ORFの
発現レベルを高め最適化するために用いられた。そして
当業者にとっては、高度に発現されている本来の酵母遺
伝子の５′NTLから由来する共通性を有するどのような
５′NTLも有用であることは自明であろう。
サッカロミセス属は種々の種からなっている。種々の
外来遺伝子の組換えDNA−仲介発現のための宿主として
最も普通に用いられるのはサッカロミセス セレビシ
エ、或はパン酵母である。しかし、サッカロミセス属の
他の種の間での分別は必ずしも明確なものではない。こ
れら種の多くはS.セレビシエと交配可能であり、S.セレ
ビシエのプロモーターと類似或は同一のプロモーターを
持っているようである。従って、当業者にとっては、プ
レS2＋Ｓポリペプチドの発現のための宿主株の選択が、
カルルスベルゲンシス（carlsbergensis）、ウバルム
（uvarum）、ルキシ（rouxii）、モンタヌス（montanu
s）、クルイベル（kluyveri）、エロンギスポラス（elo
ngisporus）、ノルベンシス（norbensis）、オビフォル
ミス（oviformis）およびヂアスタチカス（diastaticu
s）を含むがそれに限定されないサッカロミセス属の他
の種にまで拡張されることは自明であろう。
外来遺伝子の組換えDNA−仲介発現のための宿主として
最も普通に用いられるのはサッカロミセス セレビシ
エ、或はパン酵母である。しかし、サッカロミセス属の
他の種の間での分別は必ずしも明確なものではない。こ
れら種の多くはS.セレビシエと交配可能であり、S.セレ
ビシエのプロモーターと類似或は同一のプロモーターを
持っているようである。従って、当業者にとっては、プ
レS2＋Ｓポリペプチドの発現のための宿主株の選択が、
カルルスベルゲンシス（carlsbergensis）、ウバルム
（uvarum）、ルキシ（rouxii）、モンタヌス（montanu
s）、クルイベル（kluyveri）、エロンギスポラス（elo
ngisporus）、ノルベンシス（norbensis）、オビフォル
ミス（oviformis）およびヂアスタチカス（diastaticu
s）を含むがそれに限定されないサッカロミセス属の他
の種にまで拡張されることは自明であろう。
ハンセヌラ（Hansenula）、カンヂダ（Candida）、ト
ルロプシス（Torulopsis）、そしてピキア（Pichia）の
ようないくつかの酵母属が、生育のための唯一炭素源と
してメタノールを利用するための同じような代謝経路を
含むことが示されている。この代謝経路に関係する酵素
であるアルコール オキシダーゼの遺伝子がピキア パ
ストリス（Pichia pastoris）から単離されている。該
P.パストリスのアルコール オキシダーゼ プロモータ
ーが単離され、メタノール誘導発現に感受性であること
が示されている。このような誘導可能なプロモーター
は、酵母中でのポリペプチドの発現のために有用であ
る。特に、このプロモーターはP.パストリス中でHBV
“S"ドメインを微粒状に誘導発現させるのにプラスミド
上で活性であることが示されている。この観察は、ポリ
ペプチドを免疫的に活性な形で組換えDNA−仲介発現さ
せるための宿主として他の酵母属が機能し得ることを明
らかにした。従って、当業者にとってはプレS2＋Ｓ発現
のためには、宿主種の選択はサッカロミセス科およびク
リプトコカス科から、ピキア、カンヂダ、ハンセヌラ、
トルロプシス、クルイベロミセス、そしてサッカロミセ
スを含みそれに限定されない他の酵母種に拡張され得る
ことは自明であろう。
ルロプシス（Torulopsis）、そしてピキア（Pichia）の
ようないくつかの酵母属が、生育のための唯一炭素源と
してメタノールを利用するための同じような代謝経路を
含むことが示されている。この代謝経路に関係する酵素
であるアルコール オキシダーゼの遺伝子がピキア パ
ストリス（Pichia pastoris）から単離されている。該
P.パストリスのアルコール オキシダーゼ プロモータ
ーが単離され、メタノール誘導発現に感受性であること
が示されている。このような誘導可能なプロモーター
は、酵母中でのポリペプチドの発現のために有用であ
る。特に、このプロモーターはP.パストリス中でHBV
“S"ドメインを微粒状に誘導発現させるのにプラスミド
上で活性であることが示されている。この観察は、ポリ
ペプチドを免疫的に活性な形で組換えDNA−仲介発現さ
せるための宿主として他の酵母属が機能し得ることを明
らかにした。従って、当業者にとってはプレS2＋Ｓ発現
のためには、宿主種の選択はサッカロミセス科およびク
リプトコカス科から、ピキア、カンヂダ、ハンセヌラ、
トルロプシス、クルイベロミセス、そしてサッカロミセ
スを含みそれに限定されない他の酵母種に拡張され得る
ことは自明であろう。
以下の実施例は本発明を説明するが、それだけに限定
するものではない。以下の実施例中に指摘されている参
考例の開示はここに参考として取り入れられている。
するものではない。以下の実施例中に指摘されている参
考例の開示はここに参考として取り入れられている。
実施例 １ HBV DNAのpBR322中へのクローニング HBVデーン粒子（血清型adw）がヒト血漿（キャリア）
から単離精製され、ランダース（Landers）ほか、［ジ
ャーナル オブ ビロロジー（J.Virology）、第23巻、
368−376頁、1977年］およびルスカ（Hruska）ほか、
［ジャーナル オブ ビロロジー、第21巻、1977年］の
方法に従ってデーン粒子中の内在性ポリメラーゼにより
２本鎖DNAが合成された。DNAは、SDS中でプロティナー
ゼｋ消化後フェノール／クロロフォルム抽出およびエタ
ノール沈澱を経て単離された。該HBVゲノム性DNAはEcoR
Iで消化され、単一の3.2kbp断片を生成し、pBR322のEc
oR I部位にクローン化された。HBV DNAの存在はEcoR I
消化、ニトロセルロースへのサザン トランスファーそ
して［32P］−標識特異オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションにより確認された。このプラ
スミドはpHBV/ADW−１とされる（第１図）。
から単離精製され、ランダース（Landers）ほか、［ジ
ャーナル オブ ビロロジー（J.Virology）、第23巻、
368−376頁、1977年］およびルスカ（Hruska）ほか、
［ジャーナル オブ ビロロジー、第21巻、1977年］の
方法に従ってデーン粒子中の内在性ポリメラーゼにより
２本鎖DNAが合成された。DNAは、SDS中でプロティナー
ゼｋ消化後フェノール／クロロフォルム抽出およびエタ
ノール沈澱を経て単離された。該HBVゲノム性DNAはEcoR
Iで消化され、単一の3.2kbp断片を生成し、pBR322のEc
oR I部位にクローン化された。HBV DNAの存在はEcoR I
消化、ニトロセルロースへのサザン トランスファーそ
して［32P］−標識特異オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションにより確認された。このプラ
スミドはpHBV/ADW−１とされる（第１図）。
実施例 ２ プレS2＋Ｓ遺伝子のpGAP−tADH−２発現ベクター中への
クローニング 第１図に示されるように、プラスミドpHBV/ADW−１
（実施例１に記載された）がEcoR IおよびAcc Iにより
消化され、0.8kbp断片が調製用アガロースゲル電気泳動
により精製された。
クローニング 第１図に示されるように、プラスミドpHBV/ADW−１
（実施例１に記載された）がEcoR IおよびAcc Iにより
消化され、0.8kbp断片が調製用アガロースゲル電気泳動
により精製された。
プレS2＋Ｓ ORFの５′部分を再構築するために、Eco
R I部位上流のATGに至るORFから、Hind III末端に至る1
0bp NTL配列までを再構築するオリゴヌクレオチドペア
が合成された。このオリゴヌクレオチドの配列は： AGCTTACAAAACAAAATGCAGTGG ATGTTTTGTTTTACGTCACCTTAA である。
R I部位上流のATGに至るORFから、Hind III末端に至る1
0bp NTL配列までを再構築するオリゴヌクレオチドペア
が合成された。このオリゴヌクレオチドの配列は： AGCTTACAAAACAAAATGCAGTGG ATGTTTTGTTTTACGTCACCTTAA である。
プレS2＋Ｓ ORFの３′部分を再構築するために、Acc
I部位から翻訳ターミネーターHind IIIターミナスまで
のORFを再構築するオリゴヌクレオチドペアが合成され
た。このオリゴヌクレオチドの配列は： ATACATTTAA TGTAAATTTCGA である。
I部位から翻訳ターミネーターHind IIIターミナスまで
のORFを再構築するオリゴヌクレオチドペアが合成され
た。このオリゴヌクレオチドの配列は： ATACATTTAA TGTAAATTTCGA である。
pBR322中に、GAP491プロモーター［ホーランド（Holl
and）ほか、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー 第255巻、2596頁、1980年］とADH1転写ター
ミネーターを含むプラスミドpGAP−tADH−２（第１図参
照）は、唯一のHind IIIクローン化部位を有しそこに上
述のプレS2＋Ｓ ORFが連結され、pEGC−１（第１図）
をもたらした。HBsAg DNAの存在と方向性は制限エンド
ヌクレアーゼ解析およびサザン ブロット トランスフ
ァーにより確認された。プレS2＋Ｓ ORFを含む発現カ
セットはpEGC−１からSph I消化により除去され、調製
用アガロースゲル電気泳動により単離された。該カセッ
トはついで、Sph Iで前もって消化されたシャトルベク
ターpC1/1中にクローンされた。その結果できた発現カ
セットを含むプラスミドは、以下のように創られたS.セ
レビシエCF42株（MATa/α、ade1 leu２−04、ura３）を
形質転換するのに用いられた。
and）ほか、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー 第255巻、2596頁、1980年］とADH1転写ター
ミネーターを含むプラスミドpGAP−tADH−２（第１図参
照）は、唯一のHind IIIクローン化部位を有しそこに上
述のプレS2＋Ｓ ORFが連結され、pEGC−１（第１図）
をもたらした。HBsAg DNAの存在と方向性は制限エンド
ヌクレアーゼ解析およびサザン ブロット トランスフ
ァーにより確認された。プレS2＋Ｓ ORFを含む発現カ
セットはpEGC−１からSph I消化により除去され、調製
用アガロースゲル電気泳動により単離された。該カセッ
トはついで、Sph Iで前もって消化されたシャトルベク
ターpC1/1中にクローンされた。その結果できた発現カ
セットを含むプラスミドは、以下のように創られたS.セ
レビシエCF42株（MATa/α、ade1 leu２−04、ura３）を
形質転換するのに用いられた。
酵母2150−２−３株（ワシントン大学L.ハートウェル
の供与）ura３変異が選択された。（ボークほか、前
出）。出来た株（MATa、ade１、leu２−04、ura３、cir
０）はプラスミドYCp50・HOで形質転換することにより
倍数化された。倍数体株はプラスミドをキュアされCF42
（MATa/α、ade１、leu２−04、ura３）と命名された。
の供与）ura３変異が選択された。（ボークほか、前
出）。出来た株（MATa、ade１、leu２−04、ura３、cir
０）はプラスミドYCp50・HOで形質転換することにより
倍数化された。倍数体株はプラスミドをキュアされCF42
（MATa/α、ade１、leu２−04、ura３）と命名された。
クローンが選択され、実施例３に記載されたような評
価のために凍結保存試料（17％グリセロール中）として
確立された。
価のために凍結保存試料（17％グリセロール中）として
確立された。
実施例 ３ 生育とプレS2＋Ｓ遺伝子の発現 実施例２に記載された発現ベクターを含む酵母のクロ
ーンは0.2−0.3ml H2O中に懸濁され、ロイシン欠選択
寒天平板上に展開され、30゜で２−３日インキュベート
された。これら酵母は５−7mlの複合YEHD培地に植菌さ
れ30゜で通気のもとで12−18時間インキュベートされ
た。50mlの複合YEHD培地を含むフラスコが上述の培養物
を1:25希釈で植菌され、30゜で振盪（350rpm）しつつ最
終A600が10.0−16.0になるまで48−72時間インキュベー
トされた。10 A600単位の２つの試料が試験管中に分け
採られ酵母細胞は2000xg 10分間遠心でペレット化され
た。該ペレットは2mMのフェニルメチル スルフォニル
フルオダイドを含む0.4mlの燐酸−緩衝生理食塩水中
に懸濁され、1.5mlのエッペンドルフ試験管に移され
た。酵母細胞は、200−300mgの洗浄したガラス ビーズ
（0.45mm）を加えボルテックス ミキサーで５−15分撹
拌することにより破壊された。細胞破片およびガラス
ビーズは2000xg 10分の遠心により除去された。清澄化
された上清が除かれ蛋白質［ローリー（Lowry）ほか、
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
193巻、265頁、1951年］ならびにプレS2＋Ｓに特異的な
ラジオイムノアッセイ［ハンソン（Hansson）ほか、イ
ンフェクチブ イムノロジー（Infect.Immnol.）第26
巻、125−130頁、1979年、マチダ（Machida）ほか、ガ
ストロエンテロロジー（Gastroenterology）第86巻、91
0−918頁、1984年］の検定にかけられた。発現の程度
は、プラスミドpHBpreSGAP347/19Tで形質転換した親酵
母で得られたものの４−５倍高いと評価された（第１
表）。
ーンは0.2−0.3ml H2O中に懸濁され、ロイシン欠選択
寒天平板上に展開され、30゜で２−３日インキュベート
された。これら酵母は５−7mlの複合YEHD培地に植菌さ
れ30゜で通気のもとで12−18時間インキュベートされ
た。50mlの複合YEHD培地を含むフラスコが上述の培養物
を1:25希釈で植菌され、30゜で振盪（350rpm）しつつ最
終A600が10.0−16.0になるまで48−72時間インキュベー
トされた。10 A600単位の２つの試料が試験管中に分け
採られ酵母細胞は2000xg 10分間遠心でペレット化され
た。該ペレットは2mMのフェニルメチル スルフォニル
フルオダイドを含む0.4mlの燐酸−緩衝生理食塩水中
に懸濁され、1.5mlのエッペンドルフ試験管に移され
た。酵母細胞は、200−300mgの洗浄したガラス ビーズ
（0.45mm）を加えボルテックス ミキサーで５−15分撹
拌することにより破壊された。細胞破片およびガラス
ビーズは2000xg 10分の遠心により除去された。清澄化
された上清が除かれ蛋白質［ローリー（Lowry）ほか、
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
193巻、265頁、1951年］ならびにプレS2＋Ｓに特異的な
ラジオイムノアッセイ［ハンソン（Hansson）ほか、イ
ンフェクチブ イムノロジー（Infect.Immnol.）第26
巻、125−130頁、1979年、マチダ（Machida）ほか、ガ
ストロエンテロロジー（Gastroenterology）第86巻、91
0−918頁、1984年］の検定にかけられた。発現の程度
は、プラスミドpHBpreSGAP347/19Tで形質転換した親酵
母で得られたものの４−５倍高いと評価された（第１
表）。
実施例 ４ 大量培養とプレS2＋Ｓの精製 酵母細胞は記載された（ワンプラーほか、前出）よう
に培養されホロウ ファイバー膜をもつアミコン（Amic
on）DC30を用いる濾過により収穫された。収穫された細
胞は利用するまで−70℃で凍結された。プレS2＋Ｓポリ
ペプチドを発現している凍結細胞は融解され10mMエチレ
ンヂアミンテトラアセチックアシド、10mMベンズアミヂ
ン塩酸、1mcg/mLペプスタチンＡ、0.13トリプシン イ
ンヒビター単位/mlとアプロチニンを含む0.1M HEPES緩
衝液pH7.5中に再懸濁された。破壊の直前に、フェニル
メチルスルフォニルフルオダイド（２−プロパノール中
200mM）が最終濃度2mMに添加され、細胞はスタンステッ
ド（Stansted）プレス（ワシントン特別区エネルギーサ
ービス社（Energy Services Corp.））を３回通過する
ことにより破壊され、酵母細胞溶菌液をもたらした。細
胞破片はPEG 3350とデキストランT500との間の２層抽
出により除去された。プレS2＋Ｓ抗原を含む上方のPEG
層が回収され、以前に記載された［ワンプラー（Wample
r）ほか、チャノックとラーナー（Chanock and Lerne
r）編：“モダーン アプローチズ ツー ワクチンズ
（Modern Approaches to Vaccines）”、コールド ス
プリング ハーバー（Cold Spring Harbor）ニューヨー
ク、コールド スプリング ハーバー プレス、251−2
56頁、1984年］ように抗原は免疫アフィニチークロマト
グラフィーにより単離された。残留するヤギIgGは、濃
縮した抗原を3M NH4SCNおよび0.5M NaClを含む0.1M燐
酸緩衝液、pH7.2で平衡化した2.6×28cmのセファクリル
S400カラムを通すことにより除かれた。NH4SCNは燐酸緩
衝生理食塩水にたいしダイアフィルター処理することに
より除かれた。精製されたプレS2＋Ｓ抗原はin vivoの
テストのために水酸化アルミナに吸着された。
に培養されホロウ ファイバー膜をもつアミコン（Amic
on）DC30を用いる濾過により収穫された。収穫された細
胞は利用するまで−70℃で凍結された。プレS2＋Ｓポリ
ペプチドを発現している凍結細胞は融解され10mMエチレ
ンヂアミンテトラアセチックアシド、10mMベンズアミヂ
ン塩酸、1mcg/mLペプスタチンＡ、0.13トリプシン イ
ンヒビター単位/mlとアプロチニンを含む0.1M HEPES緩
衝液pH7.5中に再懸濁された。破壊の直前に、フェニル
メチルスルフォニルフルオダイド（２−プロパノール中
200mM）が最終濃度2mMに添加され、細胞はスタンステッ
ド（Stansted）プレス（ワシントン特別区エネルギーサ
ービス社（Energy Services Corp.））を３回通過する
ことにより破壊され、酵母細胞溶菌液をもたらした。細
胞破片はPEG 3350とデキストランT500との間の２層抽
出により除去された。プレS2＋Ｓ抗原を含む上方のPEG
層が回収され、以前に記載された［ワンプラー（Wample
r）ほか、チャノックとラーナー（Chanock and Lerne
r）編：“モダーン アプローチズ ツー ワクチンズ
（Modern Approaches to Vaccines）”、コールド ス
プリング ハーバー（Cold Spring Harbor）ニューヨー
ク、コールド スプリング ハーバー プレス、251−2
56頁、1984年］ように抗原は免疫アフィニチークロマト
グラフィーにより単離された。残留するヤギIgGは、濃
縮した抗原を3M NH4SCNおよび0.5M NaClを含む0.1M燐
酸緩衝液、pH7.2で平衡化した2.6×28cmのセファクリル
S400カラムを通すことにより除かれた。NH4SCNは燐酸緩
衝生理食塩水にたいしダイアフィルター処理することに
より除かれた。精製されたプレS2＋Ｓ抗原はin vivoの
テストのために水酸化アルミナに吸着された。
第１図はプレS2＋Ｓ発現プラスミド、pYGpreS2＋１の調
製方法を模式化して示す図面である。
製方法を模式化して示す図面である。
フロントページの続き (72)発明者 アーピ ハゴピアン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴア ニア，ランスデール，ハートレイ ドラ イヴ 771 (72)発明者 ペーター ジエー． クニスカーン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴア ニア，ランスデール，パターソン スト リート 841 (72)発明者 ドンナ エル． モンゴメリー アメリカ合衆国，18914 ペンシルヴア ニア，チヤルフオント，ヒツコリー レ ーン ９ (56)参考文献 特開 昭62−208288（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 52（1984）, Ｐ．396−402
Claims (14)
- 【請求項１】（ａ）サッカロミセス科またはクリプトコ
ッカス科から由来する酵母種中で選択及び増幅するため
の酵母由来の配列、 （ｂ）高度に発現されるまたは過剰に発現される酵母本
来の構成遺伝子から選択される酵母プロモーター、 （ｃ）高度に発現されるまたは過剰に発現される酵母本
来の遺伝子から選択されたものであるACAAAACAAAという
ヌクレオチド配列を有する、５′非翻訳リーダー配列、 （ｄ）Ｂ型肝炎ウイルスのpreS2＋Ｓコード領域、 （ｅ）酵母転写終結配列、 を含むプラスミド発現ベクターであって、 酵母プロモーターの３′未満は５′非翻訳リーダー配列
末端にじかに連結され、最適化された５′非翻訳リーダ
ーの３′末端はpreS2＋Ｓコード領域の開始コドンにじ
かに連結され、 preS2＋Ｓの終止コドンに酵母転写終結配列がじかに連
結されていることを特徴とする、preS2＋Ｓ蛋白高度発
現プラスミドベクター。 - 【請求項２】高度に発現されるまたは過剰に発現される
酵母本来の構成遺伝子がグリセロアルデヒドリン酸デオ
ドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１のベクター。 - 【請求項３】サッカロミセス科またはクリプトコッカス
科に由来する、請求項１のベクターを含む組換体酵母。 - 【請求項４】種がサッカロミセス属からのものである、
請求項３の組換体酵母。 - 【請求項５】種がサッカロミセス・セレビシエである、
請求項４の組換体酵母。 - 【請求項６】種がS.セレビシエCF42株である、請求項５
の組換体酵母。 - 【請求項７】細胞中に請求項１のプラスミド発現ベクタ
ーとそれから発現されたpreS2＋Ｓポリペプチドとを含
んでいる、サッカロミセス科またはクリプトコッカス科
に由来する組換体酵母細胞。 - 【請求項８】酵母種がサッカロミセス属に属するもので
ある、請求項７の組換体酵母細胞。 - 【請求項９】酵母種がサッカロミセス・セレビシエであ
る、請求項８の組換体酵母細胞。 - 【請求項１０】酵母種がS.セレビシエCF42株である、請
求項９の組換体酵母細胞。 - 【請求項１１】a.サッカロミセス科またはクリプトコッ
カス科から選択された株の細胞を請求項１記載のpreS2
＋Ｓ発現プラスミドベクターで形質転換する、 b.形質転換細胞を培養する、 c.培養後の細胞または生育培地より該ペプチドを回収す
ることからなるpreS2＋Ｓポリペプチドを得る方法。 - 【請求項１２】種がサッカロミセス属からのものである
請求項11の方法。 - 【請求項１３】種がサッカロミセス・セレビシエである
請求項12の方法。 - 【請求項１４】種がサッカロミセス・セレビシエCF42株
である請求項13の方法。
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| GB8927480D0 (en) * | 1989-12-05 | 1990-02-07 | Delta Biotechnology Ltd | Mutant fungal strain detection and new promoter |
| SG122738A1 (en) * | 1990-06-15 | 2006-06-29 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| JP3026029B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2000-03-27 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 組換え水痘ウイルスとその作製法 |
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| CN1073604A (zh) * | 1991-12-01 | 1993-06-30 | 高真南 | 制备高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法 |
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| EP1256804B1 (en) * | 2001-05-09 | 2012-09-26 | Bio Merieux | HBcAg expression and diagnostic and therapeutic uses |
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| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| IE59389B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-12-23 | Merck & Co Inc | Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast |
-
1987
- 1987-10-13 US US07/107,812 patent/US4963483A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
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- 1988-10-13 JP JP63256062A patent/JP2603312B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９８４），Ｐ．３９６−４０２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01132389A (ja) | 1989-05-24 |
| EP0312159A2 (en) | 1989-04-19 |
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| EP0312159A3 (en) | 1991-04-24 |
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