JP2637877B2 - 宿主由来炭水化物成分を減少させたｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

【０００１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、幾種類か
のヒトの肝疾患の原因となる感染性の作因である。ＨＢ
Ｖに感染した多くの人は、急性疾患をおこし、その後回
復する。しかし、少数の感染者は、感染を完全に排除で
きず、感染の慢性キャリヤとなる。ＨＢＶ感染は、世界
の多くの場所で風土病であり、慢性感染した母体から、
新生児へと周生期に感染が起こるひん度が高くその新生
児も慢性感染へ移行することがしばしばある。その数
は、世界中で３億人以上と見積もられている。このキャ
リヤのうちから、長期にわたって慢性Ｂ型肝炎をわずら
った結果（硬変症及び／又は肝細胞ガンで）毎年何十万
人が死亡する。

【０００２】Ｂ型肝炎δウイルスは、ＨＢＶとともに感
染した場合には、一般に致命的となる急性で劇症の疾患
をひきおこす作因である。δウイルスは、（自分自身の
遺伝物質からは）ビリオンエンベロープとして働くタン
パク質をコードせずに、ともに感染したＨＢＶがコード
したエンベロープタンパク質を利用するため後述するＨ
ＢＶタンパク質と密接な構造的、免疫学的関係を共有す
る。現在まで、他の感染性作因が同様な関係をＨＢＶと
共有するかどうかわかっていない。しかし、幅広い血清
学的反応性又は高い免疫能力を持つタンパク質が、たと
えわずかであるか部分的であってもＨＢＶとの抗原交差
反応性を有する一群の作因によってひきおこされる疾患
（又は感染）の診断又は予防（又は治療）法において有
効なのは明らかである。

【０００３】ＨＢビリオンは、コアタンパク質、及びエ
ンベロープ即ち表面タンパク質の２種の構造タンパク質
から成る。この主要な表面タンパク質又はビリオン、つ
まりデーン粒子であるだけでなく、エンベロープタンパ
ク質はまた、オーストラリア抗原又は２２ｎｍ粒子の主
要成分でもある。これらのエンベロープタンパク質は、
少なくとも３８９アミノ酸（ａａ）をコードする大きな
ウイルスオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）
の翻訳生成物である。このＯＲＦは３つの部分に区分さ
れるが、いずれもインビボで翻訳開始部位として働き得
るＡＴＧコドンから始まる。これらの部分を、それらの
遺伝子内の５’−３’の順序で、ｐｒｅＳ１（１０８ａ
ａ）、ｐｒｅＳ２（５５ａａ）及びＳ（２２６ａａ）と
呼ぶ。つまり、これらの部分は、Ｓ又はＨＢｓＡｇ（２
２６ａａ）、ｐｒｅＳ２＋Ｓ（２８１ａａ）及びｐｒｅ
Ｓ１＋ｐｒｅＳ２＋Ｓ（３８９ａａ）と呼ばれる３つの
ポリペプチドを定義するが、これらは又、それぞれｐ２
４／ｇｐ２７、ｐ３０／ｇｐ３３／ｇｐ３６及びｐ３９
／ｇｐ４２と呼ばれる（又、主要（major）、中型（mid
dle）及び大型（large）タンパク質と呼ばれる）。

【０００４】ＨＢＶのエンベロープタンパク質は、Ｎ−
グリコシド結合によって限定されたペプチド認識部位に
結合した炭水化物側鎖を有する糖タンパク質である〔Ｈ
eermann ら、Ｊ. Ｖirol. ５２，３９６（１９８４）及
び Ｓtibbe ら、Ｊ. Ｖirol.４６，６２６（１９８
３〕。したがって、自然感染において生産されるＨＢＶ
ポリペプチドは、ｐ２４／ｇｐ２７（Ｓポリペプチドと
そのグリコシル化誘導体）、ｇｐ３３／ｇｐ３６（ｐｒ
ｅＳ２部分だけがグリコシル化したｐｒｅＳ２＋Ｓポリ
ペプチドと、ｐｒｅＳ２部位だけでなくＳ部位もグリコ
シル化された該ポリペプチド）及びｐ３９／ｇｐ４２
（ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２＋ＳペプチドとそのｐｒｅＳ
１部分がグリコシル化された誘導体）の各種から成る。
市販の血漿由来ワクチンは、実質的に（ｐ２４モノマー
とそのグリコシル化誘導体ｇｐ２７から成る）Ｓ部分だ
けを含むタンパク質から成り、一方、現在までに開発に
成功した酵母由来ワクチンは、（もっぱらグリコシル化
していないｐ２４種から成る）Ｓポリペプチドだけから
成る。

【０００５】２２ｎｍＨＢｓＡｇ粒子は、慢性キャリヤ
の血漿から精製されている。血漿が粒子に関し陽性であ
ることから、これらの慢性キャリヤをＨＢｓ⁺と呼ぶ。
感染した人が十分な免疫反応を得れば、感染をクリアし
てＨＢｓ^-となることができる。ＨＢｓに対する抗体を
形成したので、これらの人々を抗ＨＢｓ⁺と呼ぶ。この
ように抗ＨＢｓ⁺は、疾患からの回復と疾患の再発に対
する免疫性、そしてＨＢＶ再感染に対する免疫性に関係
している。したがって、ＨＢワクチンによる抗ＨＢｓ誘
導又は形成は、ＨＢＶ感染に対する防御をもたらすと考
えられる。

【０００６】この仮説は、実験的にテスト可能である。
ヒト以外では、ＨＢｓ⁺等の定量可能なマーカーや肝酵
素の高い血清中レベルが示すように、チンパンジーが完
全にＨＢＶ感染をおこす数少ない種の１つである。チン
パンジーに、精製ＨＢｓＡｇ粒子を３回ワクチン投与し
た後、感染性ＨＢＶを静脈注射して対抗させる。偽薬を
ワクチン投与をした動物が急性ＨＢＶ感染の兆候を示し
たのに対して、ＨＢｓＡｇ−ワクチン投与した動物は感
染の兆候を全く示さない。したがって、この実験で、ｐ
２４（又はｐ２４とｐ２７）から成るＨＢｓＡｇ粒子
は、防御免疫性の誘導に十分である。この結果にうなが
されて、ＨＢｓＡｇ粒子から成るＨＢワクチンを生産し
た製造業者がいくつかある。

【０００７】ＨＢワクチンの供給を拡大するために、製
造業者はウイルスエンベロープタンパク質を発現させる
組換えＤＮＡ技術へ向った。微生物系のうちで、大腸菌
（Ｅscherichia coli）と酵母（Ｓ. cerevisiae）が多
くの組み換え由来タンパク質の発現に最も広く用いられ
る。大腸菌（Ｅ．coli）中に免疫学的に活性なＨＢｓＡ
ｇ粒子を発現させる多くの試みは成功していない。しか
し、酵母（Ｓ．cerevisiae）は、免疫学的に活性なＨＢ
ｓＡｇ粒子を発現させる能力において大きな有用性を示
す。これらの（もっぱらｐ２４から成る）粒子は、ワク
チンに処方されると、多様な血清型の生きたＨＢＶの攻
撃からチンパンジーを完全に防御することがわかってい
る。さらに、ヒトの臨床試験においても酵母由来Ｓ粒子
は免疫学的に活性であり、血漿由来ＨＢｓＡｇと同じく
らい疾患又は感染の予防に効果がある。〔Ｓtevensら、
ＪＡＭＡ，２５７：２６１２〜２６１６（１９８
７）〕。したがって、組み換えＨＢｓＡｇ合成を司さど
るホスト種としての酵母（Ｓ．cerevisiae）の有用性
は、確立している。さらに、酵母におけるヒトの治療剤
とワクチンの発現は、生産物の開発に非常に有用であ
る。なぜなら、酵母は内毒素を持たず、人間に対して病
源性がないので工業的規模での発酵が行なえ、連続継代
性哺乳類細胞系統（その多くはウイルス的に形質転換さ
れて、マウスに腫瘍発生性があり、又、すべて原腫瘍遺
伝子（プロトオンコジーン）を持つ）の使用にまつわる
多くの安全性を考慮しなくてよいからである。

【０００８】パン酵母（Ｓ．cerevisiae）は、糖タンパ
ク質を合成できる真核生物である。酵母中のタンパク質
グリコシル化は、最近の多くの文献がとりあげている
〔とくに、Ｋukuruzinska ら、Ａnn. Ｒev. Ｂioche
m．，（１９８７）５６，９１５〜４４；Ｔannen ら、
ＢＢＡ，（１９８７）９０６，８１〜９９〕。このグリ
コシル化、即ちポリペプチド上の適当な受容体アミノ酸
（ａａ）へのグリカンの付加は、特定のセリン（Ｓｅ
ｒ）かスレオニン（Ｔｈｒ）残基（Ｏ−結合の場合）、
又は特定のアスパラギン（Ａｓｎ）残基（Ｎ−結合の場
合）のどちらでも起こる。Ｓｅｒ又はＴｈｒ残基でのＯ
結合付加の特異性はよくわかっておらず、ケースバイケ
ースで経験的に決定している。

【０００９】Ｎ結合グリコシル化のシグナル配列は、ア
ミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（式中Ｘはどのアミノ酸でもよい）のいずれかとして十
分に定義されている。多くの自己の、本来のグリコシル
化タンパク質（この中にはマンノプロテイン、又はマン
ノペプチドと呼ばれるタンパク質を含む）を合成するだ
けでなく、酵母は、（異種、又は外来のタンパク質がＮ
又はＯ結合グリコシル化のいずれかに対する適当なグリ
コシル化シグナル配列を有するかぎり）、組み換え技術
で発現させた異種のタンパク質のグリコシル化もでき
る。

【００１０】自然感染中に生成するｐｒｅＳ２＋Ｓポリ
ペプチドは、ちょうど２つの“コア”〔約３キロダルト
ン（ｋＤ）のサイズの〕Ｎ−結合グリカンを、１つはＳ
領域に、２つ目はｐｒｅＳ２領域のアミノ酸残基４のＡ
ｓｎに持つ。このＳ領域中の認識部位は、Ｒecombivax
ＨＢ（商標）でも酵母の合成する組み換えｐｒｅＳ２＋
Ｓでもグリコシル化されない。しかし、ｐｒｅＳ２領域
のアミノ酸残基４の部位は、酵母によって認識されてグ
リコシル化される。

【００１１】ｐｒｅＳ１領域は、ｐｒｅＳ１領域のアミ
ノ酸残基４にＮ結合グリコシル化部位を有し、血清型ａ
ｄｗではさらにアミノ酸残基２６に潜在的部位を有す
る。当業者には、ｐｒｅＳ２グリコシル化に関して示す
議論が、ｐｒｅＳ１及びＳ領域の各種の配列およびｐｒ
ｅＳ２領域の各種配列にもあてはまることは明らかであ
る。

【００１２】組み換えｐｒｅＳ２＋Ｓを合成する酵母
は、ウイルス感染時に固有ポリペプチドに付加されるも
のに似た“コア”グリカンを付加する。しかし、酵母ホ
スト細胞がグリコシル化に対して“野性型”である場合
（すなわち、ほとんどすべての広く用いられる酵母株が
そうであるように、固有なグリコシル化に必要な酵素の
完全なセットを持つ場合）、相当数のこれらのグリカン
は、酵母が自らの構造マンノプロテインを作るのに用い
るのと同じ方法で、多数のマンノース残基が付加して伸
長する。このグリカンの付加的伸長が、ｐｒｅＳ２＋Ｓ
ポリペプチド等の外来遺伝子生成物上で起こると、過グ
リコシル化と呼ばれる。当業者には、酵母について示す
議論が多種なグリコシル化パターンの対象となり得る他
のホスト細胞（たとえば、昆虫、菌類など）にもあては
まることは明らかである。

【００１３】さらに、野性型酵母ホスト細胞で発現され
たＨＢＶ表面タンパク質の組換え体２２ｎｍ粒子が、粒
子内にかなりの量の酵母細胞炭水化物（少なくとも一部
は酵母ホスト細胞の構造マンノプロテインとマンノペプ
チドに由来するもの）を取り込んでいることが示されて
いる。この取り込まれた炭水化物は、グリコシル化タン
パク質上の酵母炭水化物部分に対する抗体を発生させ
て、取り込んだ酵母炭水化物を含むワクチン免疫源がほ
とんどの哺乳類の種に存在する抗酵母抗体と反応してし
まい、免疫源及びワクチンとしての有効性を減じる可能
性があるという問題を生じる。過グリコシル化及び完全
なマンノプロテインとマンノペプチドの取り込みは、以
下のどの方法によっても、ふせぐことができて、ＨＢＶ
ｐｒｅＳとＳポリペプチド、及びこれに対応する粒子
においてグリコシル化を制限することができる。

【００１４】第１に、Ｎ結合過グリコシル化は、ホスト
の生育時に外因性物質（たとえばツニカマイシン）を成
長培地中に存在させることによって防止又は制限でき
る。第２に、組み換え、又は天然のポリペプチドは化学
的に（たとえば無水トリフルオロメタンスルホン酸、又
は無水フッ化水素）、あるいは酵素的に（たとえばＮ−
グリカナーゼ、Ｅｎｄｏ−Ｆ又はＥｎｄｏ−Ｈを用い
て）、あるいは物理的に（たとえば音波処理）処理して
脱グリコシル化できる。第３に、グリコシル化の認識部
位をＤＮＡレベルの突然変異誘発で変化させたり欠失さ
せたりして、コアグリコシル化と同時に過グリコシル化
をふせぐことができる。酵母中で活性の適当なプロモー
ターによって支配されるグリコシル化認識配列を変えた
修飾ｐｒｅＳ＋Ｓ ＯＲＦが、酵母ホスト細胞内に形質
転換されている。得られたｐｒｅＳ＋Ｓポリペプチドは
グリコシル化されていない。第４に、グリコシル化に必
要な決定的酵素を欠くホスト細胞が同定され得る。これ
は本発明を説明するものであるが、しかし本発明をこれ
に限定するものではない。このような酵母の１つ（ｍｎ
ｎ９突然変異体）が同定されているが〔Ｂａｌｌｏｕ，
Ｌ．ら（１９８０）Ｊ．Ｂiol. Ｃhem. ２５５，ｐｐ５
９８６〜５９９１〕、これは、Ｎ結合グリカンの伸長
（過グリコシル化）に必要なグリコシル化経路の決定的
酵素を欠いており、化学分析によって、この突然変異体
は外部鎖のマンノース残基がなく“コア”炭水化物だけ
を有するマンノプロテインを作ることが示されている
〔Ｂallou.Ｃ．Ｅ．ら、（１９８６）Ｐroc. Ｎatl. Ａ
cad. Ｓci. Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，ｐｐ３０８１〜３０
８３；Ｔsai，Ｐ．ら、（１９８４）Ｊ．Ｂiol. Ｃhe
m．２５９，ｐｐ３８０５〜３８１１〕。Ｓ又はｐｒｅ
Ｓ＋Ｓポリペプチドに対するＯＲＦ（酵母中で活性な適
当なプロモーターによる転写）を用いて、このようなｍ
ｎｎ９突然変異酵母を形質転換する。得られたｐｒｅＳ
＋Ｓポリペプチドは“コア”グリコシル化のみで過グリ
コシル化していない。

【００１５】酵母中で発現した場合、Ｓポリペプチドは
グリコシル化も過グリコシル化もされていないが、それ
らから成る粒子は酵母マンノペプチドに由来する取り込
んだ炭水化物を高いレベルで有している。したがって、
過グリコシル化しない酵母細胞中で、ｐｒｅＳを含むポ
リペプチドやＳポリペプチドを発現させると、発現した
２２ｎｍ粒子内の炭水化物のレベルは低くなる。酵母
（Ｓ．cerevisiae）は、免疫学的に活性な２２ｎｍ粒子
を発現する能力で大いに有用性を示す。これらの粒子は
ワクチンに処方されると、生きたＨＢＶによる攻撃から
チンパンジーを完全に防御できることがわかっている。
さらに、酵母由来のＨＢｓＡｇは、血漿由来のＨＢｓＡ
ｇのようにヒトの臨床試験において免疫学的に効果があ
る。したがって、組み換えＨＢｓＡｇの合成を司さどる
ホスト種としての酵母（Ｓ．cerevisiae）の有用性は十
分に確立している。多様な組み換え微生物発現システム
において、多くの異なったポリペプチドの合成はホスト
細胞にとって有害であることがわかっている。その結
果、このようなポリペプチドの発現に対する選択的圧力
があり、そのため大規模にこのような組み換え培養を行
うと、外来ポリペプチドの発現をしないか又はごく少量
の外来ポリペプチドしか発現しないので培養がそのポリ
ペプチドの源泉として不経済になってしまうような細胞
だけが蓄積してくる。場合によっては、悪影響が大きい
ために、発現が強力な構成プロモーターによって行なわ
れる場合には、新たに形質転換した細胞は選択プレート
上で増殖したりコロニーを形成したりしない。これらの
悪影響は、誘導プロモーターを用いてこのようなポリペ
プチドの合成を行なうことにより、ふせぐことができ
る。多くの誘導可能な遺伝子が酵母（Ｓ．cerevisiae）
には存在する。４つのよく特徴づけられた誘導可能な遺
伝子系は、ガラクトース（ＧＡＬ）利用遺伝子、アルコ
ール・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子、α交配因
子遺伝子、及びｐｈｏ５遺伝子である。

【００１６】酵母（Ｓ．cerevisiae）には生育の炭素源
としてガラクトースを利用するための酵素をコードする
５遺伝子がある。ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡ
Ｌ７及びＧＡＬ１０遺伝子は、それぞれ、ガラクトキナ
ーゼ、ガラクトースパーミアーゼ、ホスホグルコムター
ゼの主要アイソザイム、α−Ｄ−ガラクトース−１−リ
ン酸ウリジルトランスフェラーゼ及びウリジン・ジスホ
スホガラクトース−４−エピメラーゼをコードする。ガ
ラクトースが存在しない場合、これらの酵素の発現はほ
とんど検出されない。細胞がグルコースで成長した後に
ガラクトースが培養に加えられると、（ＧＡＬ５が約５
倍しか誘導されない他は）これらの３つの酵素はＲＮＡ
転写のレベルで同調的に少なくとも１０００倍誘導され
る。ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡ
Ｌ１０遺伝子は分子レベルでクローニングされて配列決
定されている。それぞれの解読領域の５’側に対する調
節及びプロモーター配列は、１ａｃＺ遺伝子の解読領域
に隣接して存在する。これらの実験は、ガラクトース誘
導に必要かつ十分なこれらのプロモーター及び調節配列
をあきらかにしている。

【００１７】酵母（Ｓ．cerevisiae）はまたそれぞれア
ルコール・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のイソ酵素をコ
ードする３遺伝子を有する。これら酵素のひとつＡＤＨ
ＩＩは、酵母の酸化的成長時に炭素源としてエタノール
を利用する能力を与える。ＡＤＨＩＩイソ酵素をコード
するＡＤＨ２遺伝子の発現は、グルコースによってカタ
ボライトレプレッションを受けるので、グルコースが
０．１％（ｗ／ｖ）のレベルで存在する発酵成長時には
ほとんどＡＤＨ２の転写はおこらない。グルコースが消
費されて抑制を行なわない炭素源が存在すると、ＡＤＨ
２遺伝子の転写は１００ないし１０００倍に誘導され
る。この遺伝子は分子レベルでクローニングされて配列
が決定しており、転写の脱抑制に必要かつ十分な調節及
びプロモーター配列が定義されている。

【００１８】α交配因子は、ＭＡＴαとＭＡＴａ細胞の
交配に必要な酵母（S.cerevisiae）の性フェロモンであ
る。このトリデカペプチドは、粗面小胞体内に導かれ
て、グリコシル化されてタンパク質分解的に処理されて
から最終的な完全な形態で細胞から分泌されるプレプロ
フェロモンとして発現する。この生化学的経路は、外来
ポリペプチドの発現方法として利用されている。α交配
因子は、分子レベルでクローニングされていて、そのプ
レプロリーダー配列は多様なポリペプチドの発現と分泌
に利用されている。同様に、ｐｈｏ５遺伝子が低リン酸
濃度で誘導可能なことがわかっており、これはまた、酵
母内で外来タンパク質を生理的に制御して発現するのに
有用である。粗面小胞体とゴルジ体を横断することから
予想されるように、外来タンパク質はＮ、Ｏどちらの結
合のグリコシル化も受けることができる。α交配因子プ
ロモーターは、表現型αの細胞内でのみ活性である。酵
母には（ＳＩＲとして知られる）４つの遺伝部位があ
り、他のａ及びα情報で通常はサイレントなコピーの抑
制に必要なタンパク質を合成する。この抑制作用をさま
たげる温度感受性（ｔｓ）突然変異が、これらの部位の
少なくとも１つの遺伝子生成物に存在する。この突然変
異体では３５℃で生育すると抑制が無効になって、α交
配因子プロモーターが不活性の表現型ａ／αの細胞が生
じる。温度を２３℃に変えると、細胞の表現型がαに戻
って、プロモーターは活性となる。ｔｓＳＩＲ突然変異
を有する株の使用が、数種の外来ポリペプチドの抑制発
現のために行なわれている。

【００１９】本発明の目的は、取り込まれる炭水化物成
分を十分に減少させた粒子を形成するＨＢＶ表面タンパ
ク質を提供することである。本発明のもう１つの目的
は、酵母ホスト内に、取り込んだ炭水化物成分が十分に
少ない粒子を形成するＨＢＶ表面タンパク質を生成する
方法を提供することである。さらに本発明の目的は、取
り込まれる炭水化物成分を十分に減少させたＨＢＶ表面
タンパク質から成り、ＨＢＶ又は他のＨＢＶに血清学的
に関連した因子によって生じる疾患及び／又は感染の能
動的及び受動的予防治療の双方に用いる抗ＨＢＶワクチ
ンを提供することである。さらに本発明の目的は、大規
模な組み換えホスト細胞の生育及び組み換えＨＢＶ表面
タンパク質の精製条件を提供することである。これら及
び他の本発明の目的は、以下の説明で明らかになるであ
ろう。

【００２０】ＨＢＶ表面タンパク質は、遺伝的にタンパ
ク質のグリコシル化能力を欠いた組み換え酵母細胞中で
高い収率で発現する。酵母細胞中でＨＢＶ表面タンパク
質が発現する結果、特徴的な粒子が形成される。酵母細
胞中のこの粒子の形成によって、粒子内に酵母細胞物質
が取り込まれる。“野性型”酵母ホスト細胞を用いる
と、かなりの量の酵母細胞炭水化物がＨＢｓＡｇ粒子に
取り込まれる。多量の炭水化物を含む粒子から成るＨＢ
Ｖワクチンの生成をさけるために、遺伝学的にタンパク
質のグリコシル化能力を欠く組み換え酵母ホスト中でＨ
ＢＶ表面タンパク質を生成させて精製した。このような
ホストが生成するＨＢＶ表面タンパク質は、野性型酵母
細胞が生成する粒子より相当に少ない炭水化物を含む粒
子を形成する。これらのＨＢＶ表面タンパク質は、ＨＢ
Ｖ関連感染の治療及び／又は予防用ワクチンとして、
又、天然抗酵母抗体との反応性が低い免疫学的診断用抗
体として有用である。

【００２１】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
抗ＨＢＶワクチンとして用いる、取り込まれた炭水化物
量が十分に減少したＨＢＶ表面タンパク質粒子の調製方
法を目的とする。デーン粒子（血清型ａｄｗ）をウイル
スＯＲＦ単離のためのＨＢＶ核酸源に利用した。当業者
には明らかなように、本発明は、ＨＢＶ株又はウイルス
の遺伝的多様性による他の血清学的反応性を持ったウイ
ルスの核酸の使用も含む。本来ＨＢビリオン中に存在す
る切れ目を持ち（nicked）、ギャップのある形態の核酸
からＨＢＶゲノムの共有結合して閉じた環状二重鎖ＤＮ
Ａを生成するために、生体内起源のポリメラーゼ反応を
用いた。ＤＮＡを単離して、ＥｃｏＲＩで完全に切断
し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位内へクローニングす
ることによって、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を作った。ｐｒ
ｅＳ領域のＥｃｏＲＩ部位で環状に組入れられたＨＢＶ
ゲノムを持つ組み換えプラスミドを選択した。ｐｒｅＳ
２領域の５５のアミノ酸、及びＳ領域の２２６のアミノ
酸をコードする完全なＯＲＦを構築するにはまずＥｃｏ
ＲＩとＡｃｃＩでｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を切断して得ら
れた０．８キロベース対（ｋｂｐ）フラグメントを精製
した。このフラグメントは、開始コドン、アミノ末端の
３つのアミノ酸、カルボキシ末端の３つのアミノ酸、及
び翻訳ターミネイターコドンを欠失しているｐｒｅＳ２
＋Ｓポリペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドを
合成してこのフラグメントと結合させて、酵母由来の１
０ｂｐの非翻訳５’隣接配列を含むＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントに変え、完全なｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦを選択
してターミネーションコドンを直接にＡＤＨ１転写ター
ミネーター中の固有Ｈiｎｄ III 部位に結合させた。こ
うして全く付加的な介在塩基のない完全な固有の酵母由
来の接合体を作った。当業者に明かなようにＨＢＶ表面
タンパク質および関連タンパク質を発現させるのには酵
母で活性のある転写ターミネーターならどれでもＡＤＨ
１のかわりに用いることができる。 ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１） １ 10 を、酵母遺伝子ＧＡＰ６３（ＧＡＰ）の非翻訳リーダー
（ＮＴＬ）配列に対応する５’隣接配列として選んだ
〔Ｈolland，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２２５，２５９６
（１９８０）〕が、これはまたＧＡＰ遺伝子ファミリー
のコンセンサス配列である。全く付加的な塩基の介在が
ないｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦの開始コドンにＮＴＬを直
接に結合するように構成を行なった。したがってこの当
業者には明らかなように、ＨＢＶ表面タンパク質の発現
のためのＮＴＬ配列の選択には適当な発現レベルをもた
らす他の配列も含まれる。ＤＮＡ配列分析で、ｐＨＢｐ
ｒｅＳＧＡＰ３４７／１９ＴのＤＮＡがコードするｐｒ
ｅＳ２＋Ｓ配列とはちがったアミノ酸をもたらす２つの
塩基の置換がわかった〔Ｖalenzuela ら、Ｂiotechnolo
gy, ３（４），３１７〜３２０（１９８５）〕。両方の
構成について同一のポリペプチドを評価するために、こ
れらの置換ヌクレオチド、すなわち、ＨＢＶ ｐｒｅＳ
２＋Ｓの８４６ｂｐ ＯＲＦの塩基６４におけるＣにか
わるＴ（ＬｅｕでなくＰｈｅをコードする）及び（Ｇｌ
ｕでなくＨｉｓをコードする）塩基３５２におけるＡの
かわりのＣを、部位特異的突然変異誘発で変化させた
〔Ｚoller ら、Ｎucleic Ａcids Ｒesearch １０：６４
８７〜６５００（１９８２）〕。ついで最適な構成でコ
ードされたアミノ酸配列を検定した。当業者には明らか
なように、本発明はこの配列に限定されるものではな
く、ＨＢＶ関連抗原性のあるポリペプチドをＤＮＡがコ
ードするようなすべての配列を含む。

【００２２】ｐＶＣ１９及びＨＢｓＡｇコード領域を含
む３．３ｋｂｐの大型ＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲ
ＩとＳｔｙＩで切断して分取アガロースゲル電気泳動で
精製しｐｒｅＳコードＤＮＡフラグメントから分離し
た。その後、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＶＣ１
９−ＨＢｓＡｇフラグメントに結合した。この合成ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、５’ＥｃｏＲＩと３’Ｓｔｙ
Ｉ粘着末端を持つと同時に５’ＥｃｏＲＩ部位につづい
てすぐＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つ。さらに、この合成Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＢｓＡｇ ＡＴＧコドン
に加えて、９つの上流ヌクレオチドとＳｔｙＩ部位を含
む２１の下流ヌクレオチドを持つ。このオリゴヌクレオ
チドはＨＢｓＡｇの完全なコード領域を再構成し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで切断することによりｐＶＣ１９ベースのベ
クターから、完全な形でとり出すことができる。

【００２３】前述の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを結
合したｐＶＣ１９−ＨＢｓＡｇ ＤＮＡフラグメントを
用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。完全な
再構成ＨＢｓＡｇコード領域を持つ組み換えプラスミド
を選択した。この完全なＨＢｓＡｇオープン・リーディ
ング・フレーム（ＯＲＦ）を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し
て組み換えプラスミドからとり出して単離して、分取ア
ガロース・ゲル電気泳動で０．７ｋｂｐのＨＢｓＡｇ
ＤＮＡを精製して、ＧＡＬ１０プロモーター発現ベクタ
ーの中にクローニングした。発現カセット（ｐＧＡＬ１
０−ｔＡＤＨ１）は、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プ
ロモーターから下流の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入
された外来遺伝子を発現できる。前記の（ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ末端を持つ）ＨＢｓＡｇ ＯＲＦを、ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位に結合した。この発現カセットを大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のシャトル・ベクターｐＣ１／１（前
出Ｂｅｇｇｓ）のＳｐｈＩ部位の間に挿入して、このベ
クターを酵母（Ｓ．cerevisiae）株ＣＦ５２又はＣＦ５
４に導入して、形質転換したクローンを選択した。

【００２４】突然変異誘発後に、前記のＳ又はｐｒｅＳ
＋Ｓのいずれかをコードするフラグメントを用いて、前
述のように発現カセットを構成した〔Ｋniskern ら、Ｇ
ene４６：１３５〜１４１，（１９８６）〕が、これ
は：（ａ）約１．１ｋｂｐのＧＡＰ４９１プロモータ
ー、（ｂ）１０ｂｐの酵母由来隣接配列、（ｃ）ｐｒｅ
Ｓ１＋ｐｒｅＳ２＋Ｓに対応する１２３０ｂｐのウイル
スＯＲＦ、又はｐｒｅＳ２＋Ｓに対応する８４６ｂｐの
ウイルスＯＲＦ、又はＳに対する６８１ｂｐのウイルス
ＯＲＦ、及び（ｄ）約０．４ｋｂｐの酵母ＡＤＨ１ター
ミネイター、から成る。

【００２５】３種の異なる発現ベクターを用いて、ＨＢ
ｓＡｇ発現カセットを構成した。前述のＧＡＰ４９１プ
ロモーター発現カセット〔Ｋniskernら、１９８６ Ｇen
e ４６，ｐｐ１３５〜１４１〕は、ｐＢＲ３２２骨格内
の約１．１ｋｂｐのグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターと約３５０
ｂｐの酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）
ターミネーターから成り、プロモーターとターミネータ
ーの間に唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つ。実施例２の
ＨＢｓＡｇ ＯＲＦを唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合
させその存在と方向を制限エンドヌクレアーゼ分析とサ
ザンブロット法で確認した。別の方法としては、前記構
成中の１．１ｋｂｐのＧＡＰプロモーターを（０．５ｋ
ｂｐの）ＧＡＬ１０プロモーター（Ｓchultz ら、１９
８７，Ｇene，５４，ｐｐ１１３〜１２３）に代えるか
もしくはこのＧＡＰプロモーターを（１．２５ｋｂｐ
の）ＡＤＨ２プロモーター（Ｋniskern ら、１９８８，
Ｈepatology，８，８２〜８７）に代えた（第１図参
照）。

【００２６】どちらの場合にも、特異的プロモーター、
ＨＢｓＡｇ ＯＲＦ、及びＡＤＨターミネーターを含む
発現カセットをシャトルベクターｐＣ１／１（Ｂeggs，
前出；Ｒosenbergら、前出）にクローニングして、酵母
発現ベクターを作り、これを後述するように酵母（Ｓ．
cerevisiae）の形質転換に用いた。これらの形質転換細
胞を評価と後の実験のために凍結保存して確保した。親
株ＣＦ５２を以下のように作った：ＹＥＨＯ完全培地プ
レート上で混合することにより、α交配型株ＣＺ５／Ｌ
Ｂ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ９^-、ＳＵＣＺ^-）をａ型株２１
５０−２−３（ｌｅｕ２^-、ａｄｅｌ^-）と交配させた。
倍数体を選択するために、唯一の炭素源として２％スク
ロースを含むｌｅｕ^- 最小培地に交配した株をレプリカ
平板法で植えつけた。シングルコロニーを単離した後、
倍数体を胞子形成させて、標準的技術で子嚢を切開し
た。ＫＨＹ−１０７株を単一胞子として単離して、ｃｉ
ｒ⁺、ａｄｅｌ⁺、ｌｅｕ２^- 及びｍｎｎ９^-として特徴
づけた（Ｓhiff 株技術）。ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ ０）
をＢroach 〔“Ｍethods in Ｅnzymology”１０１Ｐart
Ｃ，ｐｐ３０７〜３２５（１９８３）〕が述べるよう
にＫＨＹ１０７（ｃｉｒ⁺）株から取得した。キュアー
した株と切断したｕｒａ３遺伝子のくみ込みによってｕ
ｒａ３^-にした。こうして得た株ＫＨＹ−１０７ｕｒａ
３Δを栄養培地で生育させて、自然的突然変異を蓄積さ
せて、カナバニン耐性突然変異体を選択した。突然変異
株ＣＦ５５は、相補性テストによってｃａｎｌ^-とわか
った。ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４発現カセットをＣＦ５５の
ＨＩＳ３遺伝子にくみこんで（“Ｍethods in Ｅnzymol
ogy”，１９９０，１８５ ｐｐ２９７〜３０９）最終
的なホスト株ＣＦ５２（Ｍａｔａ、ｌｅｕ２−２、１１
２ ｕｒａ３Δ、ｃａｎｌ、ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０
ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を得る。形質転換細
胞は、評価と後の実験のために凍結保存して確保した。

【００２７】凍結保存しておいた組み換え酵母をＹＥＨ
Ｄ培地で生育させた〔Ｃartyら、Ｊ．Ｉndustrial Ｍic
ro.，２，１１７〜１２１（１９８７）〕。定常期まで
生育させた後に、細胞を回収した。溶菌液を調製して、
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離してＨＢｓＡｇに対する
抗体を用いて免疫ブロッティングした。Ｓ ＯＲＦの翻
訳生成物の予想される分子量と一致する約２４ｋＤの分
子量のポリペプチドが見つかった。さらに、組み換え酵
母の溶菌液は、ラジオイミュノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ
（商品名））によってＳに対して陽性だったが、親株は
陰性だった。部分的に精製した酵母溶菌液を電子顕微鏡
で調べると、高密度の典型的ＨＢｓＡｇ粒子が見られ
た。

【００２８】酵母由来プロモーターは、ＨＢｓＡｇ及び
関連遺伝子の転写を開始させる。したがって、当業者に
は明かであるが、どの酵母由来プロモーター配列も（た
とえば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、Ｐｈｏ５、
等。ただしこれらに限定されない）ＧＡＰ４９１プロモ
ーターを代替できる。又、この当業者には明かである
が、免疫学的、又はＲＩＡ、又はエンザイム イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）等の適当なアッセイ方法を用いて、こ
のシステムのＨＢｓＡｇ及び関連ポリペプチドの発現を
アッセイして、最大収量を得る培養の収穫時期を最適化
するべきである。

【００２９】ＧＡＰ４９１プロモーターは、ＨＢｓＡｇ
を含む数種の外来タンパク質の酵母内での発現に有用で
ある〔Ｂitterら、Ｇene，３２：２６３〜２７４，（１
９８４）；Ｗamplerら、Ｐroc. Ｎat. Ａcad. Ｓci. Ｕ
ＳＡ，８２；６８３０〜６８３４，（１９８５）〕。可
溶酵母タンパク質の約４０％までＨＢｓＡｇを発現する
という前述の我々の結果（Ｋniskern ら、前出）に基づ
き、我々は、適当な酵母ホスト細胞中のＨＢｓＡｇ及び
関連タンパク質の発現を行なうためにこのプロモーター
を用いた。当業者には明らかなように、ＨＢＶ表面タン
パク質発現に用いる適切な酵母株には多様なものが含ま
れる。適当な酵母株には、プロテアーゼ欠損等の遺伝的
及び表現型の特性を持ったものや異なったグリコシル化
能力を有するものなどが含まれるが、これに限定されな
い。

【００３０】組み換え酵母発現ＨＢＶタンパク質のグリ
コシル化を調整して限定するために、酵母株ＣＦ５２
（Ｍａｔａ、ｌｅｕ２−２、１１２ ｕｒａ３Δ ｃａ
ｎ１ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ｕｒａ３、
ｃｉｒ゜）を前述のように構成した。発現プラスミドｐ
ｃ１／１ｐＧＡＬ１０ＨＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ−１を用い
てＣＦ５２（Ｍａｔａ、ｌｅｕ２−２、１１２ ｕｒａ
３Δ ｃａｎ１ ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４
−ｕｒａ３、ｃｉｒ゜）を形質転換した。形質転換した
クローンを、１Ｍソルビトールを含む最少培地（ｌｅｕ
^-）上で選択した。クローニングした形質転換細胞を、
後の評価とあとにつづく実験のために１７％グリセロー
ル中に凍結保存して確保した。グリコシル化野性型コン
トロールを得るために、発現プラスミドを用いて酵母株
ＣＦ５４を形質転換した。これは確立している技術でＣ
Ｆ５２株から単離したもので、ｍｎｎ９⁺に対する自発
的復帰変異体である（したがって、グリコシル化に対し
ては野性型であり、他についてはＣＦ５２株と同一の遺
伝子型である）。形質転換してクローニングした単離株
を、後の評価やさらなる実験のために１７％グリセロー
ル中に凍結保存して確保した。

【００３１】発現プラスミドを持つ形質転換酵母のクロ
ーンを（ｍｎｎ９^- 形質転換細胞のため１Ｍソルビトー
ルを含む）ｌｅｕ^- 選択寒天プレートに植えつけて、３
０℃で２〜３日インキュベートした。０．１〜１Ｍソル
ビトールを含む複合ＹＥＨＤ（Ｃartyら、前出）にＧＡ
Ｌ１０ベースのプラスミドのための２％ガラクトースを
加えた５〜７ｍｌの培養液にこれら酵母を接種して、こ
の培養物を３０℃で通気しながら１２〜１８時間インキ
ュベートした。１Ｍソルビトールを含む５０ｍｌの複合
ＹＥＨＤ培地（以後ＹＥＨＤＳと呼ぶ）を入れたフラス
コに、前記培養物を（初期Ａ₆₀₀＝０.１となるよう）接
種して、３０℃で振とう（３５０ｒｐｍ）しながら最終
Ａ₆₀₀＝１０〜１６になるまで４８〜７２時間インキュ
ベートした。１０Ａ₆₀₀ 単位の試料を試験管に分配し
て、酵母細胞を２０００×ｇで１０分間遠心してペレッ
トにした。サンプルは直接アッセイするか、又は−７０
℃で凍結保存した。アッセイに際しては、ペレットを、
２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を
含むリン酸で緩衝した食塩水０．４ｍｌに再懸濁して、
１．５ｍｌエッペンドルフ管に移した。酵母細胞は１）
２００〜３００ｍｇの洗浄したガラスビーズ（０．４５
ｍｍ）を加えて１５分間ボルテックスミキサーで振とう
して、２）ＴＲＩＴＯＮＸ−１００を０．５％となるま
で加えて、３）ボルテックスミキサーで２分間振とうし
て、４）４℃で１０分間インキュベートして破壊した。
細胞片とガラスビーズをとりのぞいて、上澄みをタンパ
ク質に関して〔Ｌowryらの方法による、Ｊ．Ｂiol. Ｃh
em.,１９３ ２６５，（１９５１）〕、またｐｒｅＳ２
＋Ｓに特異的なＲＩＡで〔Ｈanssonら、Ｉnfect.Ｉmmun
o.２６：１２５〜１３０（１９７９，Ｍachidaら、Ｇas
troenterology ８６：９１０〜９１８，（１９８
４）〕、またはＳに関して（ＡＵＳＲＩＡ^R）アッセイ
した。

【００３２】発現プラスミドを含む形質転換した酵母ｍ
ｎｎ９^-のクローンを、１Ｍソルビトールを含む（ｌｅ
ｕ^-）選択寒天プレートに植えて、３０℃で２〜３日イ
ンキュベートした。これらの酵母を、ＧＡＬ１０プロモ
ータープラスミドのために２％ガラクトースを加えた複
合ＹＥＡＤＳ培地の５〜７ｍｌの培養に接種（初期Ａ
₆₀₀＝０．１）してから、振とう（３５０ｒｐｍ）しな
がら３０℃で、最終Ａ₆₀₀が１０〜１６になるまで４８
〜７２時間インキュベートした。３連の１０Ａ₆₀₀単位
の試料を試験管に分配して、酵母細胞を２０００×ｇで
１０分間遠心してペレットにした。試料は前述のように
直接アッセイするか−７０℃で凍結保存した。

【００３３】ｍｎｎ９^-表現型のホスト細胞内の前述の
すべての組み換えクローン由来のポリペプチドを免疫ブ
ロット分析すると、見かけの分子サイズ約２４ｋＤの１
つのバンドを示した。組み換えタンパク質に関して、定
性的及び定量的グリコシル化パターンは、ホスト細胞
種、そして種内の細胞系統の機能であり、大部分それら
に左右される。すなわち、当業者には明らかなように、
ホスト株の選択はグリコシル化経路の酵素の突然変異が
同定できる、酵母（Ｓ．cerevisiae）以外の種や細胞系
統が含まれる。又、当業者には明らかなように、酵母
（Ｓ．cerevisiae）のホスト株の選択には、グリコシル
化経路の酵素の突然変異が同定できるすべての株が含ま
れる。

【００３４】ついで形質転換クローンをＨＢｓＡｇ Ｄ
ＮＡの存在とｐ２４ＨＢｓＡｇの発現に関してスクリー
ニングした。細胞をＹＥＨＤＳ培地（グルコースの消費
後に発現を誘導するためＧＡＬ１０プロモータープラス
ミドのためのガラクトースも含む）で生育させた。溶菌
液を調製して、ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動とニトロセルロースに対するウエスタ
ン・ブロット法で分離した。ｐ２４生成物は、誘導した
形質転換細胞でのみ存在し、抗ｐ２４血清に反応性があ
るために、Ｓタンパク質に特異的であることがわかっ
た。クローンの１つを選んでさらに分析した。さらに、
形質転換酵母の溶菌液は、ラジオイミュノアッセイでＨ
ＢｓＡｇ陽性であったが、親株のＳ．cerevisiae では
陰性であった。

【００３５】このことは酵母（Ｓ．cerevisiae）内のＨ
ＢｓＡｇ及び関連表面タンパク質の発現を司さどるため
にＧＡＬ１０プロモーターを利用する発現ベクターの有
用性をはっきり示している。当業者には明らかなよう
に、調節可能なＧＡＬ１０プロモーター、あるいは互い
に区別できない機序で働くＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ
７又はＭＥＬ１プロモーターは、ホスト細胞への悪影響
を最少にして組み換えタンパク質の合成を開始する前の
組み換え酵母（Ｓ．cerevisiae）培養を生産規模の量ま
でスケールアップすることを可能にする。さらに、当業
者には明らかなように、別の調節プロモーター（ＡＤＨ
２とα交配因子を含むがこれに限定されない）を含む発
現ベクターは他の方法で生理学的に誘導又は脱抑制可能
であり、Ｓ及びｐｒｅＳを含むペプチドの発現の管理に
利用することができる。さらに当業者には明らかなよう
に、ＧＡＰＤＨほど強力でない構成プロモーター（ＣＹ
ＣＩを含むが、これに限定されない）は、Ｓ及びｐｒｅ
Ｓを含むタンパク質の細胞タンパク質に対するパーセン
テージをより低く発現させて、生理学的な悪影響である
過剰発現をふせぐ。この分野に通じる者には明らかなよ
うに、ウエスターン・ブロット法又はラジオイミュノア
ッセイ等の適切なアッセイ方法を用いて、このシステム
でのＳ及びｐｒｅＳを含むポリペプチドの発現をアッセ
イして、最大収量を得る培養の収穫時間を最適化しなけ
ればならない。

【００３６】粒子形態のＨＢｓＡｇを認識するヤギ抗体
と結合した免疫アフィニティー・カラムを用いて、形質
転換酵母（Ｓ．cerevisiae）からのＳ及び、Ｓ関連タン
パク質を精製する。溶出生成物はラジオイミュノアッセ
イでＨＢｓＡｇ陽性であり、電子顕微鏡観察では粒子形
態であった。ＨＢｓＡｇとｐｒｅＳ抗原の両方、又はＨ
ＢｓＡｇだけを含むこのような粒子形態は、ＨＢＶワク
チン及び診断用試薬として効果がある。

【００３７】Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質又はその
変異体をコードする発現ベクターで形質転換した酵母細
胞を生育させて収穫した。望ましければ、ＰＢＳ等のバ
ッファー溶液で細胞を洗浄して細胞ペーストを作成し、
通常は−７０℃で凍結して、細胞を保存できる。ＨＢｓ
Ａｇ及び関連タンパク質の精製は、通常以下のようには
じめる。形成した、又は凍結しておいた細胞ペーストの
バッチを、バッファーに、このましくはＴＲＩＳに、約
８．５ないし１１．０の高い範囲のｐＨで、好ましくは
約１０．５のｐＨで懸濁させる（バッファーは適当なプ
ロテアーゼ阻害剤を含んでいてよい）。その後、細胞
を、好ましくは機械的手段で摩砕する。大規模に用いる
にはビーズによるおだやかな破砕方法は不適当であるこ
とがわかっている。高圧ホモジナイザー（Ｇaulin 又は
Ｓtansted ホモジナイザーを用いた約１０，０００ない
し２０，０００ｐｓｉでの）摩砕は、操作が迅速で十分
であるために好ましい。酵母細胞の摩砕で未精製抽出物
を得る。次に未精製抽出物のｐＨを調整する。ｐＨは
８．０ないし１１．０の範囲、好ましくは１０．５に調
整する。この時点で未精製抽出物に界面活性剤を加えて
もよい。界面活性剤を加えることによって、不要な細胞
片から酵母細胞膜を分離しやすくなる。ｐｒｅＳ２＋Ｓ
タンパク質は、他の形態の表面タンパク質と同様に、酵
母細胞膜といっしょになっていることがわかっている。
多様な中性又は非イオン性界面活性剤を用いることがで
きるが、これにはＴＲＩＴＯＮ−Ｎ系、ＴＲＩＴＯＮ−
Ｘ系、ＢＲＩＪ系、ＴＷＥＥＮ系又はＥＭＡＳＯＬ系の
界面活性剤、デオキシコレート、オクチルグルコピラノ
シド又はＮＯＮＩＤＥＴ−Ｎｐ−４０が含まれるが、こ
れらに限定されない。ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯ等の
両性イオン界面活性剤も、適当な活性剤として利用でき
る。界面活性剤を用いる場合、好ましい界面活性剤は、
約０．５％の濃度のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００である。
強調しておかなければならないが、本発明の方法は、こ
の工程での界面活性剤の使用を必要とするものではな
く、界面活性剤の使用は任意である。

【００３８】次に、プロテアーゼ阻害剤が溶菌中に存在
しないならば、抽出物を熱処理してよい。熱処理は一定
範囲の温度と処理時間以上で有効である。通常、４５℃
ないし６０℃の温度範囲を用いるが、５０℃が好ましい
温度である。熱処理の時間は通常２０ないし４０分であ
るが、好ましくは３０分間である。抽出物を適当な容器
に入れて、この容器を熱浴に浸して熱処理するか、又は
熱交換器を用いる。次にこの物質を、好ましくは氷水浴
させるか熱交換器を用いるかして、約１０℃まで冷却す
る。この分野に通じる者には明らかなように、本発明の
方法によれば、熱処理と細胞片をとりのぞく工程の順序
をかえても、この方法の結果に大きな影響はない。別の
方法としては、全酵母細胞を中性ｐＨバッファー中で加
熱して、前述のように摩砕して界面活性剤を加えてもよ
い。

【００３９】熱処理した未精製抽出物から細胞片を取り
のぞくことは、後の精製工程での物理的吸収をふせぐた
めに必要である。遠心分離、精密濾過又は透明な抽出物
を与える濾過により細胞片を取りのぞくことができる。
遠心分離と精密濾過が最も好ましい。遠心分離は、いろ
いろな時間で、いろいろな遠心力で行なうことができ
る。４℃で３０００×ｇ、１５分間の遠心分離で十分な
ことがわかっている。また、遠心分離の前に抽出物を希
釈して未精製酵母細胞抽出物が通常持つ粘性を減少させ
るのも好ましい。希釈によって、この方法の後の工程は
全く変わらない。精密濾過は、濾過と透析を同時に行な
える利点がある。Ｍicrogen Ｉnc. 製のＫＲＯＳＦＬＯ
又はＡmicon あるいはＡ／Ｇ Ｔechnology 製のすべて
の中空繊維カートリッジ等、いくつかのタイプの精密濾
過ユニットがこの工程に適している。好ましい精密濾過
方法は、約０．１ないし０．２ミクロンの孔径のプレー
トとフレームから成る精密濾過キットであるＰrostak
Ｄurapore 膜（Ｍillipore）に、注入圧約２ないし７ｐ
ｓｉで、約０．１Ｍ ＴＲＩＳ、（ｐＨ約１０．４）と
約０．１％ ＴＲＩＴＯＮ×−１００を含むバッファー
を用いて抽出物を濾過することである。

【００４０】遠心分離の上清、又は精密濾過の濾液をこ
の方法の次の工程に入る前に濃縮してもよい。濃縮は、
透析、濾過、凍結乾燥、限外濾過及び透析濾過（diafil
tration）を含むいくつかの方法で行なうことができる
が、これらに限定されない。本発明の好ましい濃縮方法
は、透明にした抽出物を１０⁵分子量カットオフ中空糸
膜限外濾過システムに通すことである。透明化した抽出
物の体積は、精密濾過生成物に関しては約６．５倍（１
／６．５）、希釈して遠心分離した生成物に関しては約
２倍（１／２）に減少し、濃縮された残留物を与える。
濃縮後、保持物質を透析濾過してさらに低分子量の混入
物をとりのぞく。透析濾過は、１０⁵分子量カットオフ
中空糸膜システムを用いて行なう。

【００４１】ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を加えた場合、
透析、ある種の有機溶媒を加えること、凍結、クロマト
グラフィーによる分離、そしてＥxtractogel（Ｐierc
e）やＸＡＤ樹脂（Ｒomicon）等の界面活性剤に特異的
に結合するゲル又は樹脂との接触を含む、しかしこれら
に限定されないいくつかの従来の方法でＴＲＩＴＯＮＸ
−１００をとりのぞくことができる。本発明のＴＲＩＴ
ＯＮ Ｘ−１００を取りのぞく好ましい方法は、ＴＲＩ
ＴＯＮ Ｘ−１００を含む熱処理した抽出物をＸＡＤ−
２又はＸＡＤ−４樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼ
ン）のカートリッジ内を循環させることである。熱処理
した抽出物を約１０時間４℃でＸＡＤカートリッジ内を
循環させた後、適当な容器、たとえば密閉ガラスビンに
回収する。

【００４２】細胞を高いｐＨのバッファー中で摩砕した
場合、熱処理した、又はプロテアーゼ阻害剤を含む抽出
物のｐＨを約７．０ないし７．９、好ましくは約７．７
に調整する。本発明の方法による高ｐＨでの熱処理後に
ｐＨを約７．７に調整すると、次の工程で用いる大孔径
シリカへのエンベロープタンパク質の吸着が大変容易に
なる。熱処理した抽出物のｐＨ調整は、この方法の結果
に影響せずにＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の除去の前に行
なうことができる。したがって、この分野に通じる者に
は明らかなように、本発明の方法によれば、この方法の
結果に大きな影響を与えずに、ｐＨ調整とＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００除去の工程を順序を変えて行なうことがで
きる。

【００４３】それからＨＢｓＡｇを混入物から容易に分
離してほぼ純粋なＨＢｓＡｇを得る。好ましい混入物の
除去方法は、ＨＢｓＡｇを大孔径シリカに吸着させるこ
とである。本発明のもっとも好ましい方法は、ＨＢｓＡ
ｇを孔径約１０００ないし１５００オングストローム、
シリカ粒子径約３０ないし１３０ミクロンの範囲の大孔
径シリカ（Ａmicon）に吸着させることである。表面タ
ンパク質は容易にシリカの孔に入って保持される。した
がって、酵母細胞タンパク質混入物は容易に洗い流すこ
とができる。大孔径シリカへの表面タンパク質の吸着
は、クロマトグラフィー的やり方でも又、クロマトグラ
フィーを用いないバッチ単位のやり方でも行なえる。ク
ロマトグラフィーによる吸着は、ｐＨ調整した抽出物
を、カラムクロマトグラフィー装置内の大孔径シリカの
ベッドに通して行なう。通常、約１リットルの熱処理し
た抽出物を流速約２００ｍｌ／時で、約３００ｍｌ（乾
燥重量約１００ｇ）の大孔径シリカビーズを入れたジャ
ケット付カラム装置にかける。クロマトグラフィーを用
いない大孔径シリカへの吸着は、熱処理した抽出物を適
当な容器、たとえば密閉ガラスびん中でシリカと混合し
て行なう。好ましい方法は、ガラスびん中の熱処理抽出
物約１リットルに３００ｍｌの大孔径シリカを加えて、
たえず混合しながらインキュベートすることである。吸
着はいろいろな時間と温度で適切に行なえるが、好まし
くは約４〜８℃で約１．５時間行なう。

【００４４】未吸着物を除く表面タンパク質が吸着した
シリカの洗浄もまた、クロマトグラフィーを使わずに行
なうことができるが、前述のようにクロマトグラフィー
吸着用カラム装置にシリカを注入することができる。バ
ッチ単位の洗浄は、大孔径シリカから熱処理抽出物を排
出させてから、シリカに吸着したＨＢｓＡｇの遊離をひ
き起こさない数倍体積のバッファーを加えて行なう。好
ましいバッファーはＰＢＳである。シリカを水切りして
洗浄工程を３ないし５回くりかえす。表現タンパク質が
吸着したシリカのクロマトグラフィーによる洗浄は、２
８０ｎｍ吸収がなくなったことが確実となるまでＰＢＳ
をを流速約２００ｍｌ／時でシリカに通して行なう。ｐ
Ｈ約８．５ないし９．０のバッファー溶液を用いて、Ｈ
ＢｓＡｇを洗浄した大孔径シリカから溶離する。好まし
くは、約０．０５Ｍホウ酸塩から成るｐＨ約８．７のバ
ッファー溶液を用いて表面タンパク質を脱離させる。Ｈ
ＢｓＡｇの脱離は、広い範囲の加温で容易になる。約５
５℃での脱着が好ましい。クロマトグラフィーを用いな
い脱離は、ｐＨ８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッファー
１２００ｍｌと洗浄したＨＢｓＡｇが吸着した大孔径シ
リカ約７００ｍｌを混合して行なう。脱離は約２５分間
つづける。その後溶出液を集めて、この脱離工程を２回
くりかえし、溶出液を冷却する。

【００４５】クロマトグラフィーによる脱着は、洗浄し
たシリカを入れたジャケット付カラムを約５５℃にあた
ためて行なう。ｐＨ８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッフ
ァーを５５℃にあたためた後、流速５００ｍｌ／時でカ
ラムにかける。次に溶出液を回収して冷却する。溶出液
の体積は通常だいたい大孔径シリカに通じた熱処理抽出
物と同じである。溶出したＨＢｓＡｇは通常濃縮するの
が好ましい。好ましい濃縮方法は、ｐＨ８．７の０.０
５Ｍホウ酸塩バッファーを用いて、溶出液を１０⁵分子
量カットオフ中空糸膜透析濾過装置に通すことである。
溶出した表面タンパク質の体積は、一般にこの装置では
１６分の１に減少する。透析濾過保持物を、必要なら
ば、マイクロフィルター濾過で滅菌する。

【００４６】ＨＢｓＡｇの炭水化物成分をＤubois ら
（Ａnal. Ｃhem.，２８，ｐｐ３５０，１９５６）の方
法で決定する。この方法の一般的原理は、遊離もしくは
遊離し得る還元基を持つメチルエーテルを含む単糖、オ
リゴ糖、多糖及びそれらの誘導体が、フェノールと濃硫
酸で処理するとオレンジイェローに発色するということ
である。一定のフェノール濃度で生じる発色の度合は、
存在する糖の量に比例する。ＨＢＶ表面タンパク質の試
料の炭水化物成分を決定するために、１０ないし７０μ
ｇのタンパク質を含む１ｍｌの溶液を試験管に入れた。
一連の炭水化物のスタンダードとブランクの試薬を用意
する。５％フェノール溶液１ｍｌを各試験管に入れて、
試験管を混合し、９６％硫酸溶液５ｍｌを加えて混合す
る。試験管を室温で１０分間インキュベートして混合
し、２５ないし３０℃で２０分間インキュベートする。
試料を（ヘキソースとメチル化ヘキソースについてはＡ
₄₉₀、ペントース、ウロン酸及びそれらのメチル化誘導
体についてはＡ₄₈₀で）分光光度計にかけ、ＨＢｓＡｇ
試料中の炭水化物量を、炭水化物スタンダードとの比較
で決定する。

【００４７】“野性型”組み換え酵母細胞（ＣＦ５４）
が生成したＨＢｓＡｇとＣＦ５２組み換え酵母細胞が生
成したＨＢｓＡｇ両方の炭水化物成分を前記のように分
析した。この結果にもとづき、各試料中に存在するタン
パク質に対する炭水化物量の比を、炭水化物のマイクロ
グラム数を試料中のタンパク質のマイクログラム数で割
って計算した。この比の計算で、ｍｎｎ９^-組み換え酵
母細胞で生成したＨＢｓＡｇは、つねに組み換え“野性
型”酵母細胞で生成したＨＢｓＡｇの炭水化物成分の１
０分の１しか含まれないことがわかった。これらの結
果、ｍｎｎ９^-突然変異酵母細胞が生成するＨＢｓＡｇ
は、“野性型”酵母細胞が生成したＨＢｓＡｇにくらべ
て十分に減少した量の炭水化物を含むことがわかる。以
下の実施例は本発明を説明するものであり、これに制限
を加えるものではない。以下の実施例中で触れる各参考
文献の内容は、本明細書に引用されてその一部になって
いる。

【００４８】実施例１ ｐＢＲ３２２におけるＨＢＶ ＤＮＡのクローニング ＨＢＶデーン粒子（血清型ａｄｗ）をヒト（キャリア）
の血漿から単離生成し、二本鎖ＤＮＡをランダース（Ｌ
anders）ら〔ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖ
irology）、第２３巻、第３６８−３７６頁、１９７７
年〕及びルスカ（Ｈruska）ら（ジャーナル・オブ・バ
イロロジー、第２１巻、１９７７年）の方法に従いデー
ン粒子中の内在ポリメラーゼにより合成した。そのＤＮ
ＡはＳＤＳ中プロテイナーゼＫで切断し、フェノール／
クロロホルム抽出及びエタノール沈降を行って単離し
た。ＨＢＶゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して単一の
３．２ｂｐ断片を得、これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
部位に組込んでクローニングし、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１
を形成する。ＨＢＶ ＤＮＡの存在はＥｃｏＲＩ切断、
ニトロセルロースへのサザンブロットトランスファー及
び〔³²Ｐ〕標識特異的オリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリッド形成により確認した。

【００４９】実施例２ ｐＧＡＰ・ｔＡＤＨ−２発現ベクターにおけるｐｒｅＳ
２＋Ｓ遺伝子のクローニング プラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１（実施例１記載）をＥ
ｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断し、０．８ｋｂｐ断片をプ
レパラティブアガロースゲル電気泳動で精製した。更に
ｐＵＣプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断
し、直鎖ベクターをプレパラティブアガロースゲル電気
泳動で精製した。ｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦの５’部分を
再組立てするため、ＥｃｏＲＩ部位から上流へＡＴＧ、
１０ｂｐＮＴＬ配列、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を経てＥｃｏ
ＲＩ末端に至るＯＲＦを再構成する一対のオリゴヌクレ
オチドを合成した。これらオリゴヌクレオチドの配列は
下記である：

【化１】 ｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦの３’部分を再組立てするた
め、ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネーター、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を経てＢａｍＨＩ末端に至るＯＲＦを再構成す
る２番目の１対のオリゴヌクレオチドを合成した。これ
らオリゴヌクレオチドの配列は下記である：

【化２】 オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせてからｐＵＣ
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクターに結合させた。
得られたベクター（２．８ｋｂｐ）をプレパラティブア
ガロースゲル電気泳動で精製した。上記の０．８ｋｂｐ
ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片をこのベクターと結合させ
た。ｐｒｅＳ２＋Ｓ ＯＲＦの存在及び向きは制限エン
ドヌクレアーゼ分析及びサザンブロットにより確認し
た。ＤＮＡ配列分析（サンガーら、１９７７年）から、
２つの塩基置換があるためにプラスミドＨＢｐｒｅＳＧ
ＡＰ３４７／１９ＴのＤＮＡがコードする配列とアミノ
酸が違ってくることが判明した。両方の構築物において
同一のポリペプチドを評価するため、塩基６４がＣでな
くＴ（ＬｅｕではなくＰｈｅをコードする）となり塩基
３５２がＡでなくＣ（ＧｌｎではなくＨｉｓをコードす
る）となったこれらの置換を部位特定変異誘発で変化さ
せた〔ゾラー及びスミス、１９８２年、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、第１０巻、第６４８７−６５００
頁（Ｚoller and Ｓmith、１９８２、Ｎucleic Ａcids
Ｒesearch、１０、ｐｐ６４８７−６５００）〕。ｐｒ
ｅＳ２コード領域を含まないＨＢｓＡｇコード領域含有
プラスミドを下記のように組立てた：ｐＵＣＨＢｐｒｅ
Ｓ２＋Ｓプラスミド（前記）をＥｃｏＲＩ及びＳｔｙＩ
制限エンドヌクレアーゼで切断した。ｐＵＣ及びＨＢｓ
Ａｇコード領域を含む大ＤＮＡ断片（３．３ｋｂｐ）を
ｐｒｅＳ２コードＤＮＡ断片から分離し、プレパラティ
ブアガロースゲル電気泳動で精製した。次いで下記合成
ＤＮＡオリゴヌクレオチド対：

【化３】 をｐＵＣＨＢｓＡｇ断片と結合させた。この合成オリゴ
ヌクレオチド対は５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＳｔｙＩ付着
末端を含み、５’ＥｃｏＲＩ部位の直後にＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を有する。加えて、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド対はＨＢｓＡｇＡＴＧコドン、それより上流１０ｂｐ
の非翻訳リーダー配列及びそれより下流のＳｔｙＩ部位
含有２１ヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチド
対はＨＢｓＡｇの完全コード領域を再構成し、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断によりｐＵＣベースベクターからその領域を
無傷で取り出すことを可能にする。この結合ＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド対を有するｐＵＣ−ＨＢｓＡｇ ＤＮＡ
を大腸菌を形質転換するのに用いた。完全再組立てＨＢ
ｓＡｇコード領域を有する組換えプラスミドを選択し
た。発現ベクターにクローニングするために完全ＨＢｓ
Ａｇオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断した後プレパラティブアガロースゲル電
気泳動により（０．７ｋｂｐ）ＨＢｓＡｇ ＤＮＡを単
離・精製して組換えプラスミドから取り出した。

【００５０】実施例３ ３種の異なる発現ベクターにおけるＨＢｓＡｇ ＯＲＦ
のクローニング ３種の異なる発現ベクターを用いてＨＢｓＡｇ発現カセ
ットを組立てた。すでに述べたＧＡＰ４９１プロモータ
ー発現カセット〔ニスカーンら、１９８６年、ジーン、
第４６巻、第１３５−１４１頁（Ｋniskern et al.,１
９８６、Ｇene、４６、ｐｐ１３５−１４１）〕はｐＢ
Ｒ３２２を主体とし約１．１ｋｂｐのグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモ
ーター及び約３５０ｂｐの酵母アルコールデヒドロゲナ
ーゼＩ（ＡＤＨ１）ターミネーターから構成され、プロ
モーターとターミネーターとの間に唯一のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を有する。実施例２で得たＨＢｓＡｇ ＯＲＦを
唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位で結合させ、その存在及び向
きを制限エンドヌクレアーゼ分析及びサザンブロットで
確認した。一方（０．５ｋｂｐ）ＧＡＬ１０プロモータ
ー〔シュルツ（Ｓchultz）ら、１９８７年、ジーン、第
５４巻、第１１３−１２３頁〕を１.１ｋｂｐ ＧＡＰプ
ロモーターの代わりに用いて上記の組立てを行った。ま
た（１．２５ｋｂｐ）ＡＤＨ２プロモーター〔ニスカー
ンら、１９８８年、ヘパトロジー（Ｈepatology）、第
８巻、第８２−８７頁〕をＧＡＰプロモーターの代わり
に用いて組立てを行った（図１参照）。各ケースとも、
特定プロモーター、ＨＢｓＡｇ ＯＲＦ及びＡＤＨ１タ
ーミネーター含有発現カセットをシャトルベクターｐＣ
１／１（ベッグス、前掲；ローゼンバーグら、前掲）に
組込んでクローニングし、酵母発現ベクターを得、これ
を用いて下記のようにＳ．セレビシアエを形質転換させ
た。

【００５１】実施例４ 酵母Ｓ．セレビシアエ（ＣＦ５２（ｍｎｎ９ ^- ）変異酵
母株の作成 酵母Ｓ．セレビシアエ株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ⁺、ａｄ
ｅ１⁺、ｌｅｕ２^-及びｍｎｎ９^-）は下記のように作成
した：α接合型株ＣＺ５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ９
^-、ＳＵＣＺ^-）をＹＥＨＤ完全培地プレート上でａ型株
２１５０−２−３（ｌｅｕ２^-、ａｄｅ１^-）と混合して
その株と接合させた。二倍体を選択するため、接合株を
唯一の炭素源として２％スクロースを含むｌｅｕ^-最少
培地上にレプリカし培養した。シングルコロニーを単離
し、二倍体に胞子形成させ、子嚢を標準技術で切開し
た。ＫＨＹ−１０７株は単一胞子として単離され、ｃｉ
ｒ⁺、ａｄｅＩ⁺、ｌｅｕ２^-及びｍｎｎ９^-と性質が同定
された（シッフ染色技術による）。ＫＨＹ１０７（ｃｉ
ｒ０）をブローチ（Ｂroach）〔メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍethods in Ｅnzymology）第１０１
巻、パートＣ、第３０７−３２５頁、１９８３年の記載
したように株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ⁺）から誘導した。
修正された株は破壊されたｕｒａ３遺伝子を組込むこと
でｕｒａ３^-とした。得られた株ＫＨＹ−１０７ｕｒａ
３Δは自然変異を蓄積させるため栄養培地で増殖させ、
カナバニン耐性変異株を選択した。変異株ＣＦ５５は相
補性試験によりｃａｎ１^-であることが示された。ＧＡ
Ｌ１０ｐＧＡＬ４発現カセットをＣＦ５５のＨＩＳ３遺
伝子に組込み、最終宿主株ＣＦ５２（Ｍａｔａ、ｌｅｕ
２−２、１１２ｕｒａ３Δ ｃａｎ１ ｈｉｓ３Δ：：
ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を得た。

【００５２】実施例５ ＣＦ５２ｍｎｎ９ ^- 変異酵母におけるＨＢｓＡｇの酵母
形質転換及び種菌確立 実施例３で記載されたｐＣ１／１ｐＧＡＬ１０ＨＢｓＡ
ｇ−ｔＡＤＨ−１プラスミドを用いてＳ．セレビシアエ
株ＣＦ５２を形質転換させた。クローンを最少培地（１
Ｍソルビトール含有ｌｅｕ^-）で選択し、凍結ストック
（１７％グリセロール中）として確立し、下記のように
評価した。

【００５３】実施例６ 酵母ＣＦ５２（ｍｎｎ９^-）におけるＧＡＬ１０プロモ
ーターに続くＨＢｓＡｇ遺伝子の増殖及び発現 実施例５に記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンを１Ｍソルビトール含有ｌｅｕ^- 選択寒天プレート上
におき、３０℃で２〜３日間インキュベートした。これ
らの酵母を複合ＹＥＨＤＳ（ＹＥＨＤ＋１Ｍソルビトー
ル）５〜７ｍｌに接種し、培養物を通気下３０℃で１２
〜１８時間インキュベートした。５０ｍｌＹＥＨＤＳ＋
２％ガラクトース培地含有フラスコに初期Ａ₆₀₀が０.１
となるよう上記培養物を接種し、振盪下（３５０ｒｐ
ｍ）最終Ａ₆₀₀＝１０〜１６まで３０℃で７２時間イン
キュベートした。１０Ａ₆₀₀ 単位のサンプルを管内にい
れ、酵母細胞を２０００×ｇで１０分間遠心してペレッ
トにした。そのペレットは直接調べるか又は将来のアッ
セイのために−７０℃で貯蔵した。アッセイ時には、そ
のペレットを２ｍＭ ＰＭＳＦ含有リン酸緩衝液０．４
ｍｌに再懸濁した。酵母細胞は：１）洗浄されたガラス
ビーズ（０．４５ｍｍ）２００〜３００ｍｇを添加、
２）渦巻式ミキサーで１５分間攪拌、３）０．５％（ｖ
／ｖ）となるようトリトンＸ−１００を添加、４）渦巻
式ミキサーで２分間攪拌及び５）４℃で１０〜１５分間
のインキュベートにより破壊した。細胞砕片及びガラス
ビーズを１３，０００×ｇで１０分間の遠心により除去
した。清澄化された上澄液をとり、タンパク質〔ローリ
ーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第１９３巻、第２６５頁、１９５１年（Ｌowry et
al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.,１９３，２６５（１９５
１））の方法による〕及びＨＢｓＡｇについてはＡＵＳ
ＲＩＡアッセイ〔アボット（Ａbbott）〕により分析し
た。典型的なアッセイ結果を以下に示す。

【表１】 表 Ｉ ｐ２４レベル サンプルの説明 AUSRIAμg/mgタンパク質 破 壊 （免疫ブロット） 振盪フラスコ ｍｎｎ９^-変異体 （0.55, 0.61 0.53） ガラスビーズ ＋＋＋ 野 生 型 （１.８） ガラスビーズ ＋ （ｍｎｎ９⁺）

【００５４】実施例７ 発酵槽におけるＨＢｓＡｇ産生Ｓ.セレビシアエ（ｍｎ
ｎ９ ^- ）の大規模培養 凍結された組換え酵母培養物を１Ｍソルビトール含有ｌ
ｅｕ^-プレート上に接種した。プレートを２８℃で２〜
３日間にわたり下を向けてインキュベートした。プレー
ト上の増殖物をＹＥＨＤＳに再懸濁し、再懸濁された増
殖物を５００ｍｌＹＥＨＤＳ及び２％ガラクトース含有
２Ｌエーレンマイヤーフラスコ中に移した。フラスコを
制御環境振とうインキュベーター中２８℃及び３５０ｒ
ｐｍで１８〜２２時間インキュベートした。次いでこれ
らの種培養物を用いて、産生段階容器に接種した。１以
上のフラスコからの接種原（１〜５％ｖ／ｖ）を各々Ｙ
ＥＨＤＳ１０Ｌ又は２００Ｌ含有の１６Ｌ又は２５０Ｌ
発酵槽中に移した。１６Ｌ発酵槽は５００ｒｐｍ、空気
５Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で操作した。２５０Ｌ発酵槽は１
６０ｒｐｍ、空気６０Ｌ／ｍｉｎ、２８℃で操作した。
種培養物を接種後４０〜４６時間目に発酵槽から回収し
た。通常 １５.０ Ａ₆₆₀単位の光学密度値が得られた。
中空繊維濾過装置を用いて細胞を濃縮した後緩衝塩溶液
により細胞を洗浄して回収した。細胞スラリーは下記の
ように調べるか又は次の処理及び分析のために−７０℃
で凍結貯蔵した。２０％洗浄細胞スラリーの少量サンプ
ル（０．６ｍｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフ管中でガ
ラスビーズ（０．４５〜０．５２ｍｎ）を用いて破壊し
た。ＰＭＳＦ（２００ｍＭストック６．５μｌ）をプロ
テアーゼ阻害剤として加えた。破壊後に一部を管から取
出し、免疫ブロット分析用に−７０℃で凍結した。管内
の残留サンプルにトリトンＸ−１００を最終濃度０．５
％まで加え、サンプルをしばらく混ぜ、４℃で２０〜４
０分間インキュベートした。細胞破片を遠心により除去
し、清澄化された細胞抽出物の抗原（ＡＵＳＲＩＡ）及
びタンパク質（ローリー法）を調べた。

【００５５】実施例８ 免疫アフィニティクロマトグラフィーによる粒子形Ｓタ
ンパク質の精製 実施例５で記載されたように得られた組換えＳ．セレビ
シアエをフラスコ又は発酵槽で増殖させた。酵母細胞を
アミコン（Ａmicon）ＤＣ−１０ユニットで精密濾過し
て回収し、緩衝液Ａ（ｐＨ７.２の０.１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ
₄、０.５Ｍ ＮａＣｌ）３０ｍｌに懸濁し、スタンステ
ッド（Ｓtansted）圧力セル中５．２〜５．９ｋｇ／ｃ
ｍ²（７５〜８５ポンド／平方インチ）で数回通過させ
て破壊した。破壊細胞懸濁液（３１ｇ湿細胞重量）を緩
衝液Ａ１２０ｍｌで希釈し、トリトンＸ−１００を最終
濃度０．５％（ｗ／ｖ）まで加え、懸濁液を１０，００
０ｘｇ、４℃で２０分間の遠心により清澄化させた。清
澄化されたブロスをデカントし、ＨＢｓＡｇに対する抗
体〔マクアリーアら、ネーチャー、第３０７巻、第１７
８頁、１９８４年（ＭcＡleer et al., Ｎature，３０
７：１７８（１９８４）」とカップリングさせたセファ
ロース４Ｂと共に４℃で１９時間インキュベートし、抗
原を樹脂に吸着させた。インキュベーション後、スラリ
ーを室温に戻し、後の工程はすべて室温で行った。スラ
リーを減圧下で１５分間にわたり脱気した。脱気したス
ラリーを２．５×４０ｃｍカラムに注いだ。カラムを十
分に充填した後、未結合タンパク質を緩衝液Ａで洗い出
した。抗原は緩衝液Ａ中３ＭＫＳＣＮで溶出させた。抗
原含有分画を４℃でｐＨ７．２の０．００７Ｍ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄、０.１５Ｍ ＮａＣｌに対して透析し、プール
して、２０ｍｌ中にタンパク質１．０８ｍｇを含む「透
析されたアフィニティプール」を得た。透析アフィニテ
ィプール１６ｍｌをｐＨ７．２の０．００６Ｍ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄、０.１５Ｍ ＮａＣｌに５．６ｍｌで４０μｇ
／ｍｌに希釈した。生成物をミレックス（Ｍillex）−
ＧＶ０．２２μ膜で濾過して滅菌した。透析アフィニテ
ィプール中における生成物の素姓はＡＵＳＲＩＡ反応に
よるＨＢｓＡｇの検出で確認した。

【表２】 表 II サンプルの説明 AUSRIAμg/mgタンパク質 破 壊 発 酵 槽 ｍｎｎ９^- （1.13、 1.10、 1.06） ガラス ビーズ ｍｎｎ９^- （3.1、 4.4） マントン−ゴーリン 野 生 型 （3.3） マントン−ゴーリン

【００５６】実施例９ 組換えＨＢｓＡｇの大規模精製 凍結細胞ペースト（組換えＳタンパク質産生細胞）約２
５０ｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１７％湿重量／容量
（約１５００ｍｌ）に再懸濁した。細胞を水浴に浸して
４５℃に加熱した。細胞を４５℃で１５分間保ち、しか
る後氷で約１０℃に冷却した。次いで細胞をゴーリン
（Ｇaulin）ホモジナイザーに２回通して破壊した。ホ
モジナイズ後、１０％トリトンＸ−１００を最終濃度
０．３％まで加え、約１５分間混ぜた。次いで細胞抽出
物を３６００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、上清を集め
た。次いで上清をＸＡＤ−２樹脂約２００ｇ含有カラム
に通してトリトンＸ−１００を除去した。次いで流出液
を孔径約１５００オングストローム及び粒径約５０ミク
ロンの広孔シリカ約１５０ｇ含有のカラムに直接通過さ
せた。用いたカラムは５ｃｍ径〔ファルマシア（Ｐharm
acia）〕であり、流速約２００ｍｌ／ｈｒで行った。シ
リカカラムはＡ₂₈₀がベースラインに戻るまでＰＢＳで
洗浄した。Ｓタンパク質を溶出させるにはまずＡ₂₈₀の
上昇が観察されるまで流速約５００ｍｌ／ｈｒで冷ホウ
酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．７、４℃）を流した。Ａ
₂₈₀が上昇し始めたら、カラムを５５℃に加熱し、５５
℃緩衝液をカラムに約５００ｍｌ／ｈｒで流した。Ｓタ
ンパク質含有溶出液（約１Ｌ）を氷上で集めた。次いで
溶出液を分子分画量１０⁵の中空糸膜透析濾過ユニット
を用いてｐＨ８.７の５０ｍＭホウ酸緩衝液に対して透
析濾過し約２００ｍｌまで濃縮した。次いでＳタンパク
質を０．２ミクロンフィルターで濾過し、貯蔵した。生
成物は安定であることがわかり、ウェスターンブロット
分析で観察される有意の分解はなかった。

【００５７】実施例１０ 組換えＨＢＶ表面タンパク質の炭水化物含有率のアッセ
イ 組換えＨＢＶ表層タンパク質の炭水化物含有率はデュボ
ワ、Ｍら、アナライティカル・ケミストリー、第２８
巻、第３５０巻、１９５６年（Ｄubois, Ｍ. etal., Ａ
nal. Ｃhem.，２８，ｐｐ．３５０，１９５６）の方法
により調べた。この操作の一般的原理は、遊離又は潜在
的な遊離還元基のあるメチルエーテルを含め、単糖、オ
リゴ糖、多糖及びそれらの誘導体がフェノールと濃硫酸
で処理された場合に橙黄色を呈することにある。一定フ
ェノール濃度で生じた色の量は存在する糖の量に比例す
る。野生型酵母株で産生されたＨＢｓＡｇ及びｍｎｎ９
^-酵母株で産生されたＨＢｓＡｇの炭水化物含有率を調
べるため、タンパク質１０乃至７０μｇ含有溶液１ｍｌ
を試験管にいれた。様々な量の炭水化物を含有する一連
の炭水化物標準品及びブランクサンプルを調製した。５
％フェノール溶液１ｍｌを各管に加え、管を混ぜ、９６
％硫酸溶液５ｍｌを加えて、混ぜた。管を室温で１０分
間インキュベートして混合し、２５〜３０℃で２０分間
インキュベートした。サンプルを分光光度計で（ヘキソ
ース及びメチル化ヘキソースの場合Ａ₄₉₀で並びにペン
トース、ウロン酸及びそれらのメチル化誘導体の場合Ａ
₄₈₀で）読取り、ＨＢＶ表層タンパク質サンプル中の炭
水化物量を炭水化物標準との比較により調べた。これら
の結果に基づき、各サンプル中に存在する炭水化物対タ
ンパク質の量の比率はサンプル中における炭水化物μｇ
をタンパク質μｇで割ることにより計算され、以下で示
される。

【表３】 ＨＢｓＡｇの炭水化物対タンパク質 酵母株 炭水化物／タンパク質 ｍｎｎ９^- ０.０５ グリコシル化に関して ０.５６ 野生型（ｍｎｎ９⁺） この比率計算では、ｍｎｎ９^-組換え酵母細胞で産生さ
れたＨＢｓＡｇが組換え“野生型”酵母細胞で産生され
たＨＢｓＡｇの炭水化物含有率の１／１０を一貫して含
有することを証明した。これらの結果は、ｍｎｎ９^-変
異酵母細胞で産生されたＨＢｓＡｇが“野生型”酵母細
胞で産生されたＨＢｓＡｇと比較して相当に少量の炭水
化物を含有していたことを示す。

【配列表】

【００５８】 配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ

【００５９】 配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴ ＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡ ＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧ

【００６０】 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＧＴＴＣＧＡＡＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣ ＧＴＣＡＣＣＴＴＡＡ

【００６１】 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡ ＡＧＣＴＴＧ

【００６２】 配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣ ＧＡＡＣＣＴＡＧ

【００６３】 配列番号：６ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG GATTC

【００６４】 配列番号：７ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA GGATC

【００６５】 配列番号：８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣ ＡＧＣＴＡＧＣＴＧＡ ＡＴＴＣＣＣＧＧＧ

【００６６】 配列番号：９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧ ＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡ ＧＣＴＧＴＣＧＡＣ

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＨＢｓＡｇＯＲＦの転写を司さどるｐＧＡＬ
１０プロモーター、それに続くｔＡＤＨ１ターミネータ
ーおよび選択可能なマーカーＬｅｕ⁺ を有するプラスミ
ドｐＣ１／１ｐＧＡＬ１０ＨＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ−１の
模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アーピ ハゴピアン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァ ニア，ランスデール，ハートレイ ドラ イヴ 771 (56)参考文献 特開 平２−150292（ＪＰ，Ａ) 欧州公開415565（ＥＰ，Ａ１)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｍｎｎ９遺伝子に欠損があるためグリコ
   シル化能が欠損した酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
   ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅを宿主に用い、Ｂ型肝炎ウイルス
   表面抗原Ｓタンパク質（ｒＨＢｓＡｇ）遺伝子を発現さ
   せることを包含する、粒子中に取り込まれる（entrappe
   d）炭水化物のレベルが減少した、Ｓ蛋白からなる組換
   えＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質（ｒＨＢｓＡ
   ｇ）粒子を生産する方法。
2. 【請求項２】 グリコシル化されていないＳ蛋白からな
   る組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質（ｒＨＢ
   ｓＡｇ）粒子であって、粒子中に取り込まれる（entrap
   ped）酵母宿主由来の炭水化物が実質的に減少している
   ｒＨＢｓＡｇ粒子。
3. 【請求項３】 ｍｎｎ９遺伝子に欠損があるためタンパ
   ク質のグリコシル化能を遺伝的に欠損している組換え酵
   母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ
   細胞によって生産される、請求項２のｒＨＢｓＡｇ粒
   子。
4. 【請求項４】 精製ｒＨＢｓＡｇ粒子中のタンパク質に
   対する炭水化物の比が、０．５未満である請求項２のｒ
   ＨＢｓＡｇ粒子。
5. 【請求項５】 グリコシル化されていないＳ蛋白からな
   る組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質（ｒＨＢ
   ｓＡｇ）粒子であって粒子中に取り込まれる（entrappe
   d）酵母宿主由来の炭水化物が実質的に減少しているｒ
   ＨＢｓＡｇ粒子からなる、ヒトに用いる抗Ｂ型肝炎ウイ
   ルスワクチン。
6. 【請求項６】 酵母宿主細胞がｍｎｎ９遺伝子に欠損を
   有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉ
   ａｅである請求項５のワクチン。
7. 【請求項７】 ｒＨＢｓＡｇ粒子中のタンパク質に対す
   る炭水化物の比が、０．５未満である請求項５のワクチ
   ン。
8. 【請求項８】 グリコシル化されていないＳ蛋白からな
   る組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質（ｒＨＢ
   ｓＡｇ）粒子であって粒子中に取り込まれる（entrappe
   d）酵母宿主由来の炭水化物が実質的に減少しているｒ
   ＨＢｓＡｇ粒子からなり、天然に存在する酵母抗体との
   反応性が低い免疫学的診断試薬。
9. 【請求項９】 精製ｒＨＢｓＡｇ粒子中のタンパク質に
   対する炭水化物の比が、０．５未満である請求項８の免
   疫学的診断試薬。